CN103665168A - 抗cd14抗体融合蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗CDl4抗体融合蛋白质。本发明公开了一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CDl4抗体或其活性片段或所述抗体的衍生物或片段和(II)能够抑制蛋白酶的物质或其活性片段或所述物质的衍生物或片段。

Description

抗CD14抗体融合蛋白质

本申请是国际申请日为2006年6月5日的国际申请PCT／JP2006／311255进入中国、申请号为200680019201.X的题为“抗CD14抗体融合蛋白质”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及包含抗CD14抗体和蛋白酶抑制剂的新型蛋白质；编码所述新型蛋白质的多核苷酸；所述新型蛋白质的制造方法；和所述新型蛋白质对于败血症等的医疗应用。

背景技术

败血症被定义为具有感染性病因并显示全身炎症反应综合征(SIRS)的病理学的疾病(参见非专利文献1)。发现的初期症状包括寒颤、出汗、发烧和血压降低，当各种炎性介素和凝血因子在整个身体内增多时，微循环发生紊乱，这会造成包括组织和器官衰竭的各种病理学状况的恶化，从而常常引起导致死亡的多种器官衰竭或败血病性休克的连续发作。

败血症的发作由构成感染菌的成分，例如革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)或革兰氏阳性细菌中的脂磷壁质酸(LTA)与白细胞(单核细胞／巨噬细胞和嗜中性白细胞)或血管内皮细胞的作用引发，而该作用又会导致生成各种不同的炎性介素。最近的研究显示首次被发现作为白细胞的分化抗原(参见非专利文献2)的CD14和被认为是先天免疫系统中的模式识别分子的Toll样受体(TLR)(参见非专利文献3)在细菌构成成分对所述靶细胞的该激活作用中扮演重要角色。

CD14以两种形式存在，即，膜结合形式和可溶性形式。所述膜结合形式的CD14通过糖基磷脂酰基肌醇固定于细胞膜，所述可溶性形式的CD14包括在肝脏中合成的一种CD14和在通过磷脂酰肌醇特异性磷脂酶分裂白细胞之后存在于血液中的一种CD14(参见非专利文献4)。例如，所述靶细胞被LPS如下激活：利用血液中的LPS结合蛋白(LBP)的催化作用促进LPS与CD14结合，随后与细胞膜上的TLR结合，由此将活化信号转导至所述靶细胞。接收到活化信号的靶细胞制造并表达各种与炎症反应有关的介素，例如，诸如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8等细胞因子和组织因子。作为典型介素的细胞因子激活嗜中性白细胞和巨噬细胞，由此导致与血管内皮粘合，在组织内迁移，释放诸如中心粒细胞弹性蛋白酶等中性蛋白酶并制造活性氧种类。凝结与纤维蛋白溶解系统的激活、补体系统的激活和激肽释放酶的激活也促进该过程。如上所述，大量介素分子和效应分子在分子水平和细胞水平涉及病理的形成，过度促进这些反应会导致系统受损，从而造成如上所述的从微循环紊乱至组织衰竭和器官关衰竭的病理学恶化。

为解决显示出如此复杂的病理学的败血症，对各种治疗剂进行了许多研究。在研发各种治疗剂时采用的方法可以分为两个主要范畴，即，抑制作为导致败血症发作的物质的细菌构成成分的作用的方法，和抑制被表达为对于导致败血症发作的物质的信号的生物感应的各种因子的方法。

抑制来自革兰氏阴性细菌的内毒素的治疗方法包括(1)使用抗内毒素抗体的方法(参见非专利文献5和6)；(2)使用内毒素拮抗物的方法(参见非专利文献7)；(3)使用多粘菌素的方法(参见非专利文献8)；和(4)使用BPI的方法(参见非专利文献9)。内毒素是构成革兰氏阴性细菌的成分，未在导致败血症的革兰氏阳性细菌和真菌中发现。因此，以内毒素为目标的败血症试剂与这样的问题联系在一起：它们不能对付除了革兰氏阴性细菌之外的细菌和真菌。

此外也已经提出了靶向作为用于LPS的受体的CD14的败血症试剂，所述LPS是构成革兰氏阴性细菌的物质。由于CD14已经被发现不仅是用于LPS的受体，而且还是用于细菌构成成分(如作为革兰氏阳性细菌构成成分的脂磷壁质酸和肽聚糖)的受体(参见非专利文献10)，因此靶向CD14的败血症试剂不仅仅适用于革兰氏阴性败血症。已经提出的各种试剂包括抗CD14抗体(参见专利文献1和2)，和可溶性CD14(参见非专利文献11和专利文献3和4)。然而这些试剂仍未进行实际应用。据估计败血症的病理学是从由病原体的构成成分引发炎症反应的阶段至更为严重的阶段的相继的复杂发展。CD14靶向剂的缺陷在于由于这些试剂的作用集中在病理形成的早期引发阶段，因此对于所述病理的更为严重的后期的效果仍然值得怀疑。

同时，在靶向过度生成的因子的治疗方法中，抑制细胞因子或其他炎性介素的方法包括(1)使用抗TNF抗体的方法(参见非专利文献12)，(2)使用可溶性TNF受体的方法(参见非专利文献13)，(3)使用IL-1受体拮抗体的方法(参见非专利文献14)，(4)使用PAF抑制剂的方法(参见非专利文献15)，和(5)使用NO抑制剂的方法(参见非专利文献16)。尽管这些方法已经证明了它们在动物实验阶段中或在小型临床试验中的疗效，但是其在大规模临床试验阶段中所展示的疗效和有用性仍不明确。如上所述，细胞因子和其他炎性介素均具有多种活性，这些介素构成复杂网络，各种不同的事件在该网络中发生，其中的每一种介素与其他的介素互补并诱发其他介素的表达。因此，通过抑制一种因子进行的治疗据估计存在一定的局限性(参见非专利文献17)。

此外还提出了靶向凝血因子的治疗方法，所述凝血因子的生成在与败血症的病理学的发生有关的介素相互作用的过程中得到增强。凝血因子被认为包括在治疗剂的重要目标之列，这是因为血液凝固的增强会引发血液微循环系统中的紊乱，而该紊乱又会引发供应至周围组织的氧的含量下降、组织衰竭甚至多种器官衰竭。示例性方法包括(1)使用活化蛋白C的治疗方法(参见非专利文献18)，(2)使用抗凝血酶III的治疗方法(参见非专利文献19)，和(3)使用TFPI的治疗方法(参见非专利文献20)。在这些方法中，使用活性蛋白C治疗严重败血症已经被证明在大规模的临床试验中具有显著疗效(参见非专利文献21)，并且该治疗已经用于临床应用。然而，该治疗存在很大的临床局限性，即其限于具有出血倾向的患者。

[专利文献1]JP2744130B

[专利文献2]WO02／42333

[专利文献3]JP10-512142A

[专利文献4]WO01／72993

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发明内容

本发明解决的问题

考虑到该状况，本发明的发明人注意到通过将抗CD14抗体与蛋白酶抑制剂结合而制造的一种新型蛋白质将解决与现有技术有关的各种问题，并通过制造这样新型蛋白质确认其效果。本发明的目的是提供包含抗CD14抗体和蛋白酶抑制剂的新型蛋白质；编码所述新型蛋白质的多核苷酸；所述新型蛋白质的制造方法；和包含所述新型蛋白质的用于败血症的预防和／或治疗剂。

解决问题的手段

然后，以下将描述本发明的典型方面。本发明的第一方面是一种新型蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(II)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物。更具体的是，该方面的新型蛋白质是

(1)一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(II)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物，

(2)如(1)所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是蛋白质抑制剂，

(3)如(1)或(2)所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是多价酶抑制剂，

(4)如(1)～(3)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血因子(凝血蛋白酶)或炎性蛋白酶，

(5)如(1)～(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是FXa和／或FXIa，

(6)如(1)～(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血酶，

(7)如(1)～(6)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI，

(8)如(1)～(6)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白，

(9)如(1)～(6)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI结构域2，

(10)如(1)～(8)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白的功能结构域，尤其是EGF样结构域，

(11)如(1)～(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是弹性蛋白酶，

(12)如(1)～(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂，

(13)如(1)～(11)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是具有1～4个氨基酸取代的UTI结构域2的突变体，

(14)如(1)～(13)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是具有中和活性的抗体，

(15)如(1)～(14)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是识别人类CD14的氨基酸序列269～315的至少一部分的抗体，

(16)如(1)～(15)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是嵌合抗体，

(17)如(1)～(16)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是人源化抗体，或

(18)如(1)～(17)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是下述抗体：该抗体包含表2中所描述的重链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3，或包含表2中所描述的轻链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3。

本发明的第二方面是一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据第一方面的蛋白质的至少一部分。更具体的是，该方面的多核苷酸是

(19)一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如(1)～(18)中任一项所述的蛋白质的至少一部分。

本发明的第三方面是一种载体，所述载体包含根据本发明第二方面的多核苷酸，更具体的是，该方面的载体是

(20)一种载体，所述载体包含如(19)所述的多核苷酸。

本发明的第四方面是一种细胞，所述细胞包含根据本发明第二方面的多核苷酸或根据本发明第三方面的载体。更具体的是，该方面的细胞是

(21)一种细胞，所述细胞包含如(19)所述的多核苷酸或如(20)所述的载体。

本发明的第五方面是一种方法，所述方法用于制造根据本发明第一方面的蛋白质，该方法使用根据本发明第二方面的多核苷酸、根据本发明第三方面的载体和根据本发明第四方面的细胞中的至少一种。更具体的是，该方面的方法是

(22)一种方法，所述方法用于制造如(1)～(18)中任一项所述的蛋白质，该方法使用如(19)所述的多核苷酸、如(20)所述的载体和如(21)所述的细胞中的至少一种。

本发明的第六方面是一种用于疾病的预防和／或治疗剂，所述用于疾病的预防和／或治疗剂包含根据本发明第一方面的蛋白质、根据本发明第二方面的多核苷酸、根据本发明第三方面的载体和根据本发明第四方面的细胞中的至少一种。更具体的是，该方面的所述预防和／或治疗剂是

(23)一种用于疾病的预防和／或治疗剂，所述用于疾病的预防和／或治疗剂包含如(1)～(18)中任一项所述的蛋白质，如(19)所述的多核苷酸、如(20)所述的载体和如(21)所述的细胞中的至少一种，或

(24)如(23)中所述的预防和／或治疗剂，其中，所述疾病是败血症、严重败血症或败血病性休克、SIRS相关疾病、内毒素休克或ARDS。

发明效果

本发明的新型蛋白质对于疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标有效，而对于所述情况单独使用抗CD14抗体或蛋白酶抑制剂是无效的或效果不充分。所述蛋白质同时显示出稳定的体内消炎作用、抗凝血作用和／或弹性蛋白酶的抑制作用，因此，所述蛋白质可以用作用于败血症的预防和／或治疗剂。

附图说明

图1显示了抗体F1024的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。

图2显示了抗体F1024的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。

图3显示了抗体F1031-13-2的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。

图4显示了抗体F1031-13-2的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。

图5显示了抗体F1031-13-2的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。

图6显示了抗体F1031-13-2的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。

图7是显示融合蛋白质F1024D-D1D2的全部氨基酸序列的结构的视图。

图8是显示融合蛋白质F1024D-D2的全部氨基酸序列的结构的视图。

图9是显示融合蛋白质F1024D-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。

图10是显示融合蛋白质F1024S-D1D2的全部氨基酸序列的结构的视图。

图11是显示融合蛋白质F1024S-D2的全部氨基酸序列的结构的视图。

图12是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。

图13是显示融合蛋白质F1024D-SLP1(D1D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。

图14是显示融合蛋白质F1024D-SLP1(D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。

图15是显示融合蛋白质F1024S-SLP1(D1D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。

图16是显示融合蛋白质F1024S-SLP1(D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。

图17是显示融合蛋白质F1031-13S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。

图18是显示F1024(抗CD14抗体)或抗体融合蛋白质对于通过LPS诱导的U373MG细胞的IL-6的合成的抑制性活性的视图。

图19是显示F1024(抗CD14抗体)或抗体融合蛋白质对于通过LPS诱导的U373MG细胞的IL-6的合成的抑制活性的视图。

图20是显示抗体融合蛋白质对IL-6的合成的抑制活性的视图。

图21是显示UTI及抗CD14抗体融合蛋白质的蛋白质胰蛋白酶抑制活性的视图。

图22是显示抗CD14抗体融合蛋白质的因子Xa的抑制活性的视图。

图23是显示抗CD14抗体融合蛋白质因子Xia的抑制活性的视图。

图24是显示抗CD14抗体融合蛋白质的弹性蛋白酶抑制活性的视图。

图25是显示抗CD14抗体融合蛋白质的血浆激肽释放酶抑制活性的视图。

图26是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于改善LPS诱导型家兔败血症样本的存活率的效果的视图。

图27是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的白细胞计数(初次施用LPS后28小时LPS诱导型家兔败血症样本的白细胞计数)的效果的视图。

图28是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的血小板计数(首次施用LPS后26小时LPS诱导型家兔败血症样本的血小板计数)的效果的视图。

图29是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的抗凝血酶(AT)III活性减小(首次施用LPS后28小时LPS诱导型家兔败血症样本的抗凝血酶(AT)III活性的减小)的效果的视图。

图30是显示通过融合蛋白质F1024S-D2(3)对LPS诱导型家兔败血症样本的血压降低的改善的视图。

图31是显示与抗体F1024的竞争性结合的实验结果的视图。

图32显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。

图33显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。

图34显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。

图35显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。

图36是显示融合蛋白质F1024S-D2(4)的全部氨基酸序列(R11S／R15T／Q19K／Y46D)的视图。

图37显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。

图38显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。

图39显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。

图40显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。

图41显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。

图42显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。

图43显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。

图44显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。

图45是显示融合蛋白质F1024S-TM23456L的全部氨基酸序列的结构的视图。

图46是显示融合蛋白质F1024S-TM中TM的修饰功能结构域的凝血调节蛋白活性的视图。

图47是显示人源化F1024S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。

图48是显示F1024-1-3大鼠抗体的重链及轻链可变区的氨基酸序列的视图；和具有与人源化F1024S-D2(3)的重链及轻链可变区的高度同源性的人类抗体的氨基酸序列的视图。

图49是显示能够表达人源化抗体的重链并维持结合活性的氨基酸序列的视图。

图50是显示APTT试剂诱导的人血浆中舒缓激肽的合成的抑制的视图。

图51是显示APTT试剂诱导的兔血浆中舒缓激肽的合成的抑制的视图。

图52是显示促凝血酶原激酶诱导的人血浆中凝血酶的合成的抑制的视图。

图53是显示促凝血酶原激酶诱导的兔血浆中凝血酶的合成的抑制的视图。

图54是显示施用F1024S-D2(3)后F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔全血中的TNF-α合成的抑制作用的时间进程的视图。

图55是显示对家兔施用F1024S-D2(3)后APTT的时间进程的视图。

图56是显示对家兔盲肠结扎穿孔(CLP)样本施用F1024S-D2(3)后的存活率的时间进程的视图。

图57是显示对家兔盲肠结扎穿孔(CLP)样本施用F1024S-D2(3)后血浆中的D二聚物水平的视图。

具体实施方式

下面，将对本发明进行更详细的描述。

根据本发明第一方面的蛋白质并不特别限定其类型。示例性蛋白质包括单纯蛋白质(或多肽)和复合蛋白质(如糖蛋白)。

在根据本发明第一方面的蛋白质中，(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物与(II)蛋白酶的抑制剂或其活性片段，或其衍生物之间的结合不受特别限制。尽管(I)和(II)通常通过共价键连接，不过它们也可以通过例如化学手段(化学合成或化学结合)或遗传工程连接。根据本发明第一方面的蛋白质优选是由遗传工程制造的融合蛋白质。

蛋白酶抑制剂(II)可以是与抗体的重链及轻链中的一个或两个结合的蛋白酶抑制剂。典型地，所述蛋白酶抑制剂(II)与重链融合，尤其是抗体重链的C端侧。对抗体连接的蛋白酶抑制剂(II)分子的数目不受特别限制，一个或两个或两个以上的分子可以与抗体连接。如果需要，所述连接可以通过使用适宜的连接物或间隔物完成。这样的方法、连接物、间隔物等等对于本领域的技术人员是公知的，其典型例在实施例中进行描述。

在本发明的蛋白质中，抗CD14抗体(I)或蛋白酶抑制剂(II)的活性片段是下述片段：其包含能够表达或保持抗CD14抗体(I)或蛋白酶抑制剂(II)中固有的各活性或功能中的至少一种的部分，并包含活性区或功能结构域。在本发明的蛋白质中，抗CD14抗体(I)、蛋白酶抑制剂(II)、或其活性片段的衍生物是包括某些修饰、突变或添加的抗CD14抗体(I)、蛋白酶抑制剂(II)、或其活性片段，例如，包含其他化学物质(如聚乙二醇)的种类，或与突变有关的种类，如添加、删除、插入或取代至少一个，优选一个至数个氨基酸。换言之，(I)、(II)及其活性片段的衍生物包括(I)、(II)及其活性片段的突变体、修饰型和修饰产物，并且它们能够表达或保持抗CD14抗体(I)、蛋白酶抑制剂或其活性片段中固有的各活性或功能中的至少一种，优选为全部。

根据本发明第一方面的蛋白质表达或保持抗CD14抗体(I)和蛋白酶抑制剂(II)中固有的各活性中的至少一种，优选为全部。由于根据本发明第一方面的蛋白质具有抗CD14抗体(I)和蛋白酶抑制剂(II)中固有的各活性中的至少一种，优选为全部，因此其对于疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标有效，而对于所述情况单独使用抗CD14抗体或蛋白酶抑制剂是无效的或效果不充分。

在根据本发明第一方面的蛋白质中，蛋白酶抑制剂(II)不受特别限制，其可以为非蛋白质抑制剂或低分子量化合物。不过所述蛋白酶抑制剂(II)优选为蛋白质抑制剂。

尽管所述蛋白酶抑制剂(II)也可以为对于特定酶具有特异性的种类，但所述蛋白酶抑制剂(II)优选为抑制两个或两个以上酶的多价酶抑制剂。具有多价酶抑制作用的示例性物质包括Kunitz型蛋白酶抑制剂，如尿道胰蛋白钠抑制剂(UTI)、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、组织因子途径抑制剂(TFPI)和抑肽酶，其中，优选UTI、SLPI和TFPI。

UTI是与比库宁或乌司他丁相同的蛋白酶抑制剂，是用于诸如胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和中心粒细胞弹性蛋白酶等蛋白酶的抑制剂。

SLPI是用于中心粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶等蛋白酶的抑制剂。

TFPI是也被称为脂蛋白相关凝结抑制物(LACI)或外源性途径抑制物(EPI)的蛋白酶抑制剂。TFPI与凝血因子Xa(FXa)结合从而抑制因子VIIa一组织因子(factor III)复合体，由此抑制外源性凝血的开始。

其他的多价酶抑制剂包括α2-巨球蛋白(α2-MG)、抗凝血酶III(ATIII)和α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)。α2-MG是具有约为770,000的巨大分子量的血浆蛋白质，并抑制凝血酶、FXa、血纤维蛋白熔酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等。ATIII与诸如FXa或凝血酶等丝氨酸蛋白酶以1∶1的比率形成复合体，由此控制凝结。ATIII在其N端具有肝素结合域，并在其C端具有与凝血酶反应的反应活性位，ATIII的抗凝血酶活性通过与肝素结合而增大约1000倍。α1-AT是包含394个氨基酸的糖蛋白，其分子量为51000。α1-AT抑制包括凝血酶、血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等各种丝氨酸蛋白酶。

本发明的蛋白质中的蛋白酶抑制剂(II)优选为对包括诱发抗凝血剂作用或舒缓激肽和成的因子的凝血因子(凝血蛋白酶)具有抑制作用，尤其是对活化凝血因子具有抑制作用，或对于炎性蛋白酶具有消炎作用或抑制作用的抑制剂。典型的凝血因子包括激肽释放酶、凝血酶、Fva、FVIIa、FVIIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa和FXIIIa，其中，激肽释放酶、凝血酶、Fva、FVIIIa、FIXa、FXa、FXIa是重要因子，凝血酶或FXa和FXIa是最重要的靶标酶。典型的炎性蛋白酶包括弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和caphepsin，其中，弹性蛋白酶，特别是中心粒细胞弹性蛋白酶和胰弹性蛋白酶，尤其是中心粒细胞弹性蛋白酶是最重要的靶标酶。本发明的蛋白质或本发明的蛋白质中的抑制剂(II)的蛋白酶抑制活性可通过各种已知材料和方法进行测定，其典型例在实施例中描述。

具有抗凝血作用或对于凝血因子的抑制作用的抑制剂可以是本领域中已知的物质。其实例包括TFPI、ATIII、α1-AT和α2-MG；以及UTI和凝血调节蛋白(TM)；它们的活性片段及其衍生物，并优选TM或UTI、它们的活性片段或其衍生物，更优选对于FXa和／或FXIa具有抑制活性的TM的功能结构域或UTI结构域2(UTI-D2)，或它们的修饰型，尤其是具有3个氨基酸取代(UTI-D2(3))的突变体。UTI、UTI-D2和UTI-D2(3)的氨基酸序列及核苷酸序列以及它们的制造方法描述在JP5-84083A，JP5-308988A，JP6-25289A和JP6-321989A中，它们可以通过参考这些文献而制造。

凝血调节蛋白(TM)是通过血管内皮细胞制造的抗凝血剂中的一种，当TM与细胞膜上的凝血酶形成复合物时，蛋白质C将随后被激活，血液凝固受到抑制。TM在1981年被发现，存在于血管内皮细胞上的该物质将凝血酶由凝结酶转化为抗凝酶。TM也可以直接抑制凝血酶的活性，并促进蛋白质C(PC)的活化，所得的活化蛋白质C(APC)通过钝化被激活的凝血因子V(FVa)和因子VIII(FVIIIa)而促成凝血级联的负反馈，从而抑制凝血酶的生成。换言之，TM以取决于凝血酶的方式同时抑制凝结活性和纤维蛋白溶解活性。与肝素的情况相反，由于该作用不需要抗凝血酶III，因此可以认为该过程对于促进出血倾向的风险较低。

由于TM的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列，以及TM的结构域的结构和功能是已知的(例如，Kurosawa，S，Supplementaryvolume of Progress in Medicine(in Japanese)，“Blood Disease-State ofArts(Vet.2)”，1998，第205-207页)，因此用于本发明的TM、其活性片段及衍生物的制备，和它们的活性评价可以通过参考如JP1-6219A和WO88／5053等公报而进行。TM包含5个结构域，即，凝集素样结构域、上皮生长因子(EGF)样结构域、O连接糖基化结构域、横跨膜样结构域和来自细胞外N端的细胞质结构域(Kurosawa，S.et al.，J.Biol.Chem.，263，5993，1988)，其中，EGF样结构域包含6个重复单元(该结构域在本发明中有时也称为EGF1-6或TM123456)。最小活性单元被假定为EGF样结构域的四至六个重复单元，即EGF4-6。

TM的优选活性片段、衍生物和功能结构域的实例包括EGF样结构域；包含EGF样结构域的TM的活性片段或其衍生物；EGF样结构域的活性片段或其衍生物，其优选EGF4-6，更优选为EGF3-6，最优选为EGF2-6；包含这样的部分的TM的活性片段或其衍生物，例如，在各实施例中制备的TM的活性片段或其衍生物，尤其是TM23456M、TM234567M、或它们的活性片段或衍生物。衍生物的优选例包括其中TM的氨基酸No.388的蛋氨酸被亮氨酸取代的突变体(M388L)，它们是TM23456L和TM234567L。这些衍生物的制造和评价可以通过本领域中已知的方法完成，其典型例在实施例中描述。

各种抑制剂已知对炎性蛋白酶具有消炎作用或抑制作用。尽管可以使用各种已知的抑制剂，不过最优选的是弹性蛋白酶抑制剂。其典型例包括UTI、UTI-D2、SLPI、α1-AT和α2-MG及其活性片段或衍生物；优选例是UTI，尤其是具有弹性蛋白酶抑制活性的修饰UTI结构域2，例如具有3个氨基酸取代的UTI-D2的突变体、具有4个氨基酸取代的UTI-D2的突变体(也称为UTI-D2(4))和SLPI，特别是SLPI的下游部分(C端的多肽)。SLPI和下游部分(C端的多肽)的氨基酸序列、核苷酸序列和及其制造方法在JP6-80697A等中进行了描述，所述公报可用作参考。

具有3或4个氨基酸取代的UTI-D2的突变体的典型例显示在实施例7的表9中，最优选UTI-D2(4)(R11S／R15T／Q19K／Y46D)。

具有对于FXa和／或FXIa的抑制活性和弹性蛋白酶抑制活性的修饰UTI结构域2是最优选的。

在根据本发明第一方面的蛋白质中，抗CD14抗体不受特别限制，只要其与CD14结合，优选与人类CD14结合即可。在本发明的蛋白质中，所述抗CD14抗体(I)与蛋白酶抑制剂协同作用，并改善所述蛋白质或抑制剂的功能或效果。根据本发明第一方面的蛋白质中的抗CD14抗体(I)不受是否存在CD14抑制作用所限。不过，所述抗CD14抗体(I)优选为具有CD14抑制作用的抗体。此处使用的术语“CD14抑制作用”是抑制CD14的功能的至少一种功能的作用，例如，与LPS的结合能力、与TLR的相互作用和TLR表达细胞的活化，更具体地，NF-κB的活化、IL-8的合成或通过内皮细胞对诸如IL-6等细胞因子的合成；优选地为抑制CD14与TLR之间的结合，尤其是CD14与TLR2或TLR4之间的结合的作用。

示例性优选抗体包括已知的抗CD14抗体，尤其是在WO02／42333等中公开的抗体，和通过已知方法，例如，在WO02／42333等中公开的方法制造的那些抗体。由这样的抗体制造的嵌合抗体和人源化抗体也包括在本发明的蛋白质的抗CD14抗体中。

在本发明的蛋白质中，对所述抗CD14抗体的识别区或结合区不做特别限制，只要该抗体与CD14结合，优选与人类CD14结合即可。不过，所述抗CD14抗体优选是识别或结合人类CD14的C端区，尤其是氨基酸序列No.269～315，更优选氨基酸序列No.285～307，最优选氨基酸序列No.294～296的至少一部分的抗体。更具体地，所述抗CD14抗体是识别或结合CD14的所述部分或CD14上的抗原定子的抗体。在表5中所述的CD14的CD14氨基酸取代型突变体(以下有时称为氨基酸取代产物、氨基酸取代修饰型或氨基酸修饰型)中，优选的是相较于与人类CD14的结合能力来说，与P294H、Q295A、P296H和P294／296A中的至少一个并优选全部的结合能力明显下降的抗体，更优选的是其与其他突变体的结合能力并未因该下降的结合能力而实质上发生改变的抗体。本发明的蛋白质中的抗CD14抗体(I)可以通过使用已知的物质和方法，例如，在WO02／42333中描述的物质和方法确认。不过优选例在实施例中进行描述。

此外，在表5中所示的突变体中，利用这点：即相较于用于所述指标的与人类CD14的结合能力来说，与P294H、Q295A、P296H和P294／296A中的至少一个且优选为全部的结合能力明显下降，更优选地，利用这点：即除了用于所述指标的与特定突变体的结合能力下降之外与其他突变体的结合能力缺乏实质变化，易于检测、识别或制备具有CD14抑制活性的抗CD14抗体。本发明也提供这样的方法。

在根据本发明第一方面的蛋白质中，所述抗体(I)优选是单克隆抗体，尽管该抗体也可以为多克隆抗体，其来源并不限于特定种类。考虑到制造所述抗体的容易性时，所述来源优选是小鼠或大鼠。考虑到构成药物组合物时，所述抗体优选为嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体或人类抗体。所述人类抗体也可以包括通过将表达人类抗体基因的基因转录过的小鼠免疫而制造的人类抗体。本发明的抗体还包括噬菌体抗体等。所述人源化抗体是其中的恒定区和框架区(FR)来自人类，互补决定区(CDR)来自非人类的CDR移植抗体，或在其FR中具有引入的其他突变体的抗体。噬菌体抗体是通过将抗体与丝状噬菌体的病毒外壳蛋白融合而制造的抗体用以表达噬菌体颗粒上的抗体，主要使用单链Fv(scFv)形或Fab形。嵌合抗体是包含来自人类之外的哺乳动物，例如大鼠或小鼠的单克隆抗体的可变区，和人类抗体的恒定区的抗体。在根据本发明第一方面的蛋白质中，对抗体(I)的分子物种不作特别限定，所述抗体可以为属于任何纲(例如IgG、IgM和IgA，尤其是IgG)、亚纲(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，尤其是IgG4)或同种型的抗体。关于所述抗体的轻链，可以使用卡巴链和拉姆达链中的任何一种。本发明中还包括活性片段或衍生物，如具有生物活性的Fab(抗原结合段)、Fab’、(Fab’)2、通过连接物等连接的抗体活性片段，如单链抗体(单链Fv：scFv)(Bird，R.E.et al.，Science，1988；242：423-426)、二硫化物稳定抗体(二硫化物稳定Fv：dsFv)(Reiter et al.，Protein Engineering，1994；7：697)和双价小抗体(Holliger P.et al.，ProcNatl Acad Sci USA1993；90：6444-8)，单结构域抗体(dAb)(Ward E.S.etal.，Nature.，1989；341∶544-6)等。这些抗体可以通过本领域中已知的技术如遗传工程技术和利用适宜的蛋白酶对抗体的处理而制造。

嵌合抗体是通常利用遗传工程手段制造的抗体，其中的轻链基因和重链基因由属于不同物种的抗体基因段构成。例如，来自大鼠或小鼠单克隆抗体的基因中的可变(V)段可以与人类恒定(C)段，如γ1和γ4连接。因此，用于治疗目的的典型嵌合抗体是包含来自大鼠或小鼠抗体的V或抗原结合域和来自人类抗体(也可以使用其他的哺乳动物种类)的C或效应结构域的杂化蛋白质。

根据本发明的第一方面中的抗体(I)可变区序列的优选例显示在图1和2中(SEQ ID NO：123～126)，其中的抗体是嵌合抗体的融合蛋白质的优选例是图7～17中和实施例中所示的嵌合抗体。

尽管抗体在与抗原结合时通常为多价(在IgG的情况中为二价)，但本发明的蛋白质中的抗体(I)在一些阶段中优选为单价。典型的这种抗体是如下制造的单价抗体：将氨基酸突变引入Fab中，或抗体的恒定区中，尤其是重链的恒定区(CH)中，从而防止重链之间的二硫键的常规形成，典型地，用另一种氨基酸残基取代Cys残基，尤其是抗体重链的铰链区中的Cys残基。其优选例在实施例中进行描述。

已经报道了关于“互补决定区(CDR)”的多种定义和确定其位置的方法，在本发明中可以采用任何一种。典型例包括Kabat的定义(Sequences of proteins of i mmunol ogical interest，5th ed.，U.S.Departmentof Health and Human Services，1991)和Chothia的定义(Chothia andLesk，J.Mol.Biol.，1987；196：901-917)。在本发明中，优选的CDR是根据Kabat的定义的CDR，不过CDR并不限于这样的类型。在一些情况中，CDR可以通过同时考虑Kabat的定义和Chothia的定义而确定。例如，CDR可以是根据两种定义的CDR的重叠区或涵盖根据两种定义的CDR的区域。所述方法的典型例是使用Oxford Molecular’sAbM的抗体模型软件的Martin等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989；86：9268-9272)，这种方法是Kabat的定义和Chothia的定义的折衷方法。

“框架区”是轻链及重链可变区中的区域，正如在由Kabat等定义的区域的情况中其可以显著地保存在单一物种的各种抗体中(即，不同于CDR的区域)。在本发明中，“人类框架区”是指基本上与天然存在的人类抗体或者某些这样的抗体之间的公共序列的框架区相同(同源性约为85％以上)的框架区。

“人源化抗体”是包含人类框架和来自非人类抗体的至少一个CDR的抗体，人源化抗体的恒定区基本上与人类抗体的恒定区相同，即，同源性水平为至少约85％～90％，优选至少95％。因此，除CDR之外的人源化抗体每一部分有可能基本上与至少一个天然人类抗体序列的对应部分相同。例如，所述人源化抗体不包括包含小鼠可变区／人类恒定区的嵌合抗体。

该人源化抗体，更具体地，本发明的抗体(I)是包含来自人类受体抗体，优选来自单一人类受体抗体的框架区(FRs)的一个链，更优选为全部(对于每个链为4)的至少一个，优选全部(4)；和来自抗体F1024的互补决定区(CDRs)的至少一个，优选全部(对于每个链为3)的人源化抗体。该抗体可以包含2对轻链／重链复合物，并且至少一个链，尤其是重链包含至少一个，优选全部(3)来自施主抗体(如大鼠或小鼠抗体，其适用于下列说明)的互补决定区，这些互补决定区与人类框架区段功能性连接。例如，施主的互补决定区可以被引入具有或不具有天然伴随的氨基酸残基的人类框架区中。更具描述性地，本发明的人源化抗体是包含表2中所示的任一种CDRs的氨基酸序列或由其构成的CDRs的至少一个，优选全部(对于每个链为3)的抗体，在人源化抗体中，每一个CDR和所述框架优选位于相当于它们在原始施主抗体中的位置的位置。

用作本发明的抗体(I)的人源化抗体在人源化抗体的重链可变区的框架与施主抗体的重链可变区的框架之间具有的同源性(序列一致性的百分数)为65％～95％，优选为70％～90％。在标准过程中，所述框架序列来源于同一人类抗体的重链和轻链，从而降低在将两种链组合时的不相容的风险。然而，所述框架序列也可以来源于两种或两种以上不同的人类抗体。

关于所述人类框架区，所述序列可以通过将由其获得CDRs的非人类抗体的框架或可变区的氨基酸序列与人类抗体序列集合中的对应序列进行比较，并选择具有高同源性的序列而获得。优选地，框架氨基酸序列的同源性为至少60％，更优选至少65％。另外，受体抗体的重链可变区的氨基酸序列选自人类抗体的重链可变区的典型集合中的5个，更优选为3个序列，这些序列与施主抗体的重链可变区的氨基酸序列具有最高同源性。人源化抗体的设计可以如下述完成。

1)当特定氨基酸序列与下列范畴(a)～(c)相应时，人类抗体(受体抗体)的框架中该特定氨基酸可以由来自非人类抗体(施主抗体)的氨基酸取代。

(a)所述受体抗体的人类框架区中的特定氨基酸很少在人类抗体的位置被发现，而施主抗体中的该对应氨基酸通常在人类抗体的位置被发现；

(b)所述特定氨基酸临近或接近一级序列中的CDRs之一；或

(c)所述特定氨基酸在施主抗体或人源化抗体的三维模型中在约5埃，优选4埃，更优选3埃的距离具有一个原子(Co et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991；88：2869)。

2)当受体抗体的人类框架区中的特定氨基酸和施主抗体中的对应氨基酸在人类抗体的相应位置罕见时，所述氨基酸可由通常在人类框架的相应位置被发现的氨基酸取代。

对于人源化抗体的制造的详细描述，可以参考Queen et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，1989；86：10029，WO90／07861，WO92／11018、Co et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，1991；88：2869，Co and Queen，Nature，1991；351：501和Co et al.，J.Immunol.，1992；148：1149，此处通过引用而引入。

通常希望所有的或绝大部分的氨基酸取代达到上述标准。然而，由于不确定性与关于单个氨基酸是否实际上与上述标准相一致的判断有关，并且所制造的各种抗体包括具有和不具有特定位置的取代的抗体，因此CDR和FR的最优化可通过计算机模拟进行。

当具有高同源性的人类抗体的V区被发现时，施主抗体的CDR序列，尤其是抗体F1024被移入该V区的框架部分，并且可以通过计算机分子模型来模拟所述构造。在该步骤中使用的程序包括ABMOD和ENCAD(Biochemistry，1990；29：10032)。通过该构造模拟，最优化可如下完成：用其他氨基酸取代CDR附近的FR中的氨基酸，从而使CDR区的氨基酸排列实现与CD14的最优化的结合活性。

作为选择，CDR和FR的最优化也可以通过使用施主抗体，尤其是抗体F1024的FR的一部分的氨基酸序列(该序列中没有任何变化)，并将该序列移入人类抗体的V区中而实现。在这种情况中，抗体F1024的CDR和FR的一部分的序列被移入人类抗体的V区，并利用计算机分子模型模拟构造。可用于该步骤的示例性程序包括Modeler和QUANTA／CHARMm(Molecular Simulations)。

当轻链中的3～4个部位和重链中的7～8个部位以来自施主，例如大鼠的氨基酸取代时，FR将具有与大鼠抗体相似的结构，CDR区中的氨基酸排列有助于优化与CD14的结合活性。

只要抗CD14抗体的结合活性保持，单个或2个或2个以上的氨基酸的删除、取代、插入或添加就可以在CDR区的氨基酸中进行。在这种情况中，当取代发生在被分为同组的氨基酸之间，例如在Gly和Ala之间；Val、Leu和Ile之间；Asn和Gln之间；Cys和Met之间；或Lys和Arg之间，则抗CD14抗体的结合活性更有可能保持。另外，在框架区的某些位置的氨基酸涉及与抗原的直接相互作用，例如，以共价结合的方式与抗原接触，而且这样的位置也会经历上述取代。尤其是，在重链的第26个～第30个氨基酸根据其构造被描述为超变环的一部分(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.，1987；196：901-917)，并且这样的区域也可以如CDR的情况中一样被移植。

人源化抗体基于所得的氨基酸序列制备。例如，人源化抗体的核苷酸序列可以根据由此确定的氨基酸序列确定，并由此制造编码该人源化单克隆抗体的基因。更具体地，编码CDR的DNA由编码人类V区的基因中删除，取代地插入编码来自诸如大鼠等施主的CDR的DNA。根据基于分子模型结果的变化的氨基酸，相应的DNA序列可通过例如使用PCR的定位诱变而改变，由此制造重组人类V基因。该基因被克隆为包含人类抗体的重链及轻链的C区的载体，从而制造表达载体。通过改变用于该阶段的来自人类的序列，可以制造所需亚纲的抗体，例如人类IgG1或IgG3，优选IgG4等。所述表达载体可以被引入小鼠骨髓瘤细胞Sp2／O-Ag14(ATCC CRL1581)或仓鼠卵巢细胞CHO中并在其中被表达。

所述人源化抗体用于人类的治疗处理时，与非人类抗体，如小鼠或大鼠抗体，在一些情况中为嵌合抗体相比具有至少三个潜在优点。

1)由于有效部分来源于人类，因此抗体与人类免疫系统的其他部分的相互反应更好(例如，通过补体依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)可以更有效地破坏靶细胞)。

2)人类免疫系统不识别作为异物的人源化抗体的框架或C区，因此，与完全是外来的小鼠抗体或部分外来的嵌合抗体相比，使用所述抗体时的该抗体的响应下降。

3)据报道被施用的大鼠和小鼠抗体在人类的血液循环中具有的体内半衰期比正常抗体短得多(Shaw，D.et al.，J.Immunol.，1987；138：4534-4538)。所述人源化抗体在施用后可能具有或多或少与天然存在的人类抗体的半衰期相似的半衰期，有效施用通过使用较少的量或通过以较低的频率施用就可完成。

抗CD14抗体(I)可包括各种抗体，尤其是各种人源化抗体，其具有在实施例中描述的抗体，尤其是F1024的CDRs中的至少一个，所描述的抗体在该抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)中优选具有位于相应位置的3个CDR，更优选具有该抗体的全部6个CDR。更具体地，抗CD14抗体(I)是包含表2中所描述的重链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3，或包含表2中所描述的轻链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的抗体，尤其是人源化抗体。

当抗CD14抗体(I)是人源化抗体时，用于制造的示例性方法包括其中的杂交瘤通过利用体外免疫作用导致人类淋巴细胞的活化而制造的方法；通过施用人类抗体噬菌体库执行的方法；和其中的杂交瘤通过使用具有重组人类抗体基因的非人类动物，尤其是诸如KM小鼠等转基因小鼠而制造的方法(WO2002／070648(JP2005-504507A)和WO2002／043478(JP2004-515230A))。

人类抗体噬菌体库是如下生成的文库：将由人类B细胞制备的抗体基因插入噬菌体基因中，从而促进诸如Fab和单链抗体等抗体的活性片段在噬菌体表面上的表达。本发明的抗体还可以通过筛查该文库而获得。这些和其他方法对于本领域的技术人员是公知的(Huse et al.，Science，246：1275-1281(1989)，Winter and Harris，Immunol.Today14：243-246(1993)，Ward et al.，Nature341：544-546(1989)，Harlow andLane(1988)，supra)，Hilyard et al.，Protein Engineering：A practicalapproach(IRL Press1992)，Borrabeck，Antibody Engineering，2nded.(Oxford University Press1995)，Barbas，C.F.I.，Burton，D.R.，Scott，J.K.，and Silverman，G.J.2001.Phage display：a laboratory manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，New York，USA.736pp.)。表达具有所需抗原结合活性的抗体的活性片段的噬菌体可以通过利用与其上固定有抗原的基质的用于所述指标的结合活性而由所述库收集。所述抗体的活性片段也可以通过基因工程转化为包含两个完整H链和两个完整L链的人类抗体分子。

根据本发明第二方面的多核苷酸可以为包含核苷酸的任何分子种类。所述多核苷酸可包括DNA和RNA以及多聚脱氧核苷酸和多聚核糖核苷酸。所述多核苷酸可以为混合物或其修饰产物，只要其编码根据本发明的第一方面的蛋白质的至少一部分即可。根据本发明第二方面的多核苷酸可以通过本领域中已知的方法，特别是通过基因工程由合成的上述(I)和／或(II)的细胞而制造。其典型例描述在实施例中。

本发明的第二方面是编码所述蛋白质，优选所述融合蛋白质，更具体地是包含第一方面的抗体的融合蛋白质的多核苷酸。然而，由于所述抗体是固有地包含多种多肽链的蛋白质，因此本发明的多核苷酸包括其中的单分子多核苷酸编码本发明的蛋白质的情况，和其中的2分子或更多分子，例如2分子或3分子多核苷酸编码本发明的蛋白质的情况。典型例描述在实施例中。关于根据本发明第一方面的蛋白质的至少一部分，典型的多核苷酸是编码抗体的重链，尤其是其重链可变区(VH)部分，或重链部分和抑制部分，或优选它们的融合蛋白质的多核苷酸；或编码抗体的轻链，尤其是其轻链可变区(VL)部分，或轻链部分和抑制部分，或优选它们的融合蛋白质的多核苷酸。所述多核苷酸的优选例包括在序列表中以SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25所示的那些。

根据本发明第三方面的载体包括其中的根据本发明第二方面的多核苷酸存在于单个载体上的情况，和其中的多核苷酸存在于2个或2个以上载体，例如2个或3个载体上的情况。根据本发明第三方面的载体除了包含根据第二方面的多核苷酸之外，还可以包含复制所述载体所需的成分和控制根据本发明第二方面的多核苷酸的表达的成分。这样的其他成分对于本领域的技术人员是公知的。

用于与根据第二方面的多核苷酸结合的载体不受特别限制。不过所述载体优选为通常用于表达蛋白质基因的载体，尤其是适合于表达抗体或包含抗体的融合蛋白质的载体，或用于过表达的载体。示例性的优选载体包括包含人类延伸因子(EF)1α启动子和／或CMV增强子的载体，例如，pEF-BOS或用于实施例的载体。尽管惯例是分别制备其中结合有编码VH部分，或VH部分与抑制部分，并优选VH部分和抑制部分的融合蛋白质的多核苷酸的表达载体，和其中结合有编码VL部分，或VL部分与抑制部分，并优选VL部分和抑制部分的融合蛋白质的多核苷酸的表达载体，且将这些载体在宿主细胞中协同转染，不过也可以将两种多核苷酸并入单个表达型造体中。上述过程可以通过使用已知的物质和方法进行，其典型例描述在实施例中。

根据本发明第四方面的细胞可以通过本领域中的已知方法将根据本发明第三方面的载体引入适宜的宿主细胞中而制备。这样的细胞的实例包括杂种细胞、转化细胞和其中引入有本发明的多核苷酸或载体的基因修饰细胞。所用的宿主细胞不受特别限制，优选通常用于蛋白质基因等的表达的宿主细胞，尤其是适宜用于表达抗体、包含抗体的融合蛋白质等的细胞。示例性宿主细胞包括细菌(如E.coli)、放线菌、酵母、昆虫细胞(如SF9)和哺乳动物细胞(如COS-1、CHO和骨髓瘤细胞)，并优选哺乳动物细胞。上述过程可以通过使用已知的物质和方法进行，其典型例描述在实施例中。

根据本发明第一方面的蛋白质可以通过使用根据本发明第二方面的多核苷酸或根据本发明第三方面的载体进行体外翻译而制造，或通过在适当的条件(本发明的第五方面)下培养根据本发明第四方面的细胞而制造。制得的蛋白质可以通过组合适宜的已知纯化方法而分离。其优选例描述在实施例中。

根据本发明第六方面的用于疾病的预防和／或治疗剂是包含根据本发明第一方面的蛋白质、本发明第二方面的多核苷酸、根据本发明第三方面的载体和根据本发明第四方面的细胞中的至少一种作为其有效成分的药物组合物，本发明的多核苷酸和载体可用于例如基因疗法，所述转化细胞选可用于细胞疗法，其中可以选择性地加入药学上可接受的添加剂。

根据本发明第六方面的用于疾病的预防和／或治疗剂可应用于各种疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标。尽管这些疾病、病状和特定的疗效指标不限于任何特定类型，但其优选为与CD14的分布或功能、蛋白酶的分布或功能或细菌感染有关的疾病。因此，本发明的预防和／或治疗剂可用于败血症及其相关疾病、全身疾病或心血管疾病、传染病、炎性疾病、呼吸道疾病或呼吸衰竭、自身免疫性疾病、多器官功能障碍综合征(MODS)或单个器官的衰竭或功能障碍。更具体地，本发明的预防和／或治疗剂可用于败血症及其相关疾病，如严重败血病、败血性ARDS和败血病性休克；SIRS相关疾病；休克如内毒素休克、外毒素休克、出血性休克和外科手术进行时或手术后休克；全身或心血管疾病如缺血再灌注器官衰竭、局部缺血性脑病，急性缺血性发作、急性期脑血栓、急性冠状微脉管栓塞、由休克导致的血管栓塞、弥漫性血管内凝血(DIC)、心肌梗塞及其后效应和低血压；感染性疾病如牙周病急性细菌性脑膜炎、侵袭性葡萄球菌感染症、传染性心内膜炎、极性病毒性脑炎和AIDS；炎性疾病如牛皮癣、胃炎、消化性溃疡、胰腺炎、肾炎、心肌炎、肺炎、肝炎、肝硬化、脑炎、骨关节炎、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、过敏性鼻炎、反流性食管炎和强直性脊柱炎；呼吸疾患或呼吸衰竭如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合症(IRDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿和哮喘；自身免疫性疾病如慢性风湿性关节炎、难治疗性结肠炎、克罗恩氏病、肾小球肾炎、SLE、硬皮病、多发性硬化和Sjoegren氏综合症；多器官功能衰竭；器官移植后的器官衰竭或排异；和单器官的功能障碍如心力衰竭、不稳定心绞痛、瓣炎、肾衰竭、心肌病、肾弛缓、肝衰竭和暴发性肝衰竭。

可应用本发明的预防和／或治疗剂的优选疾病是诸如败血症、严重败血病、败血性ARDS或败血病性休克、SIRS、内毒素休克和ARDS等疾病。

本发明的预防和／或治疗剂还可用于改善或预防与炎性细胞因子增加，尤其是血液TNF浓度增加有关的状况。此外，本发明的所述试剂预期将具有对其中涉及LPS的革兰氏阴性细菌感染、其中涉及LTA或肽聚糖的革兰氏阳性细菌感染和与支原体感染有关的败血症的治疗及预防效果，即，在与这些疾病有关的状况出现或发展后的治疗效果，以及对于显示出高血液LPS值、LTA值或支原体值的患者，对于显示出特定CD14分子种类的高血液浓度的患者(参见WO01／22085和WO2004／44005)，和被预料将显示这些状况的患者的预防效果。

可根据需要结合的示例性药学上可接受的添加剂包括载体、赋形剂、稳定剂、润滑剂、着色剂、崩解剂、杀菌剂、等渗剂、稳定剂、分散剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、通常用于本领域的适宜溶剂(例如，无菌水和植物油)以及生理学上可接受的助溶剂。

本发明的药物组合物还可以包含抗生素、类固醇、各种细胞因子抗体或抗凝血剂。这些试剂将关于本发明的蛋白质显示相加效应或协同效应，且所述药物组合物将具有改善的效果。

本发明的药物组合物作为试剂施用时的剂量不受特别限制，所述剂量可以通过考虑患者的状况、体重、年龄、性别等而适当的确定。在施用作为有效成分的本发明的蛋白质的典型情况中，所述剂量优选至少微0.1mg／kg，更优选1mg／kg～10mg／kg。

用于施用作为试剂的本发明的药物组合物的剂型不受特别限制，优选剂型包括片剂、注射剂、粉末、栓剂、吸入剂，更优选注射剂和吸入剂。尽管可以使用各种给药途径，不过优选肠胃外给药。肠胃外给药利用注射剂通常以下列给药方式进行：静脉给药(大丸剂给药、连续灌输、间歇灌输)、动脉内给药、皮下施用和肌内给药，同样优选使用吸入。其他给药途径包括直肠内给药、经皮吸收、关节内给药、经鼻给药和穿粘膜给药。给药方法可包括预防性给药、单独给药和连续给药，同时给药实时和给药频率取决于患者的状况。

此外还提供了使用包含本发明的药物组合物作为其主要成分的试剂用于可对其应用根据本发明第六方面的预防和／或治疗剂的疾病或病征的治疗方法。

实施例

下面，将参考决非限制本发明的范围的实施例对本发明进行更详细的描述。

(实施例1)嵌合抗体和抗体融合蛋白质的构建

1-1)嵌合抗体和抗体融合蛋白质(F1024)的构建

(1)材料

使用的主要材料和装置如下所述。

引物：表1中所示的引物(由Sigma Genosys Japan，K.K.合成)，

用于PCR的酶：Ex Taq(TAKARA BIO INC.)，

限制酶：EcoRI、BamHI、NotI、NheI、EcoRV、StuI、BglII及其他(TAKARA BIO INC.)，

基因组DNA：HeLa基因组(lot.N34707-1，BD BiosciencesClontech)，

PCR装置：DNA Engine(MJ RESEARCH，INC.)，

琼脂糖电泳凝胶：SeaKem GTG Agarose(TAKARA BIO INC.)，

50x TAE(2mol／L Tris-乙酸酯，0.05mol／L EDTA)(NIPPON GENECO.，LTD.)，

分子量标记(以StyI消化的λDNA片段)，

用于由凝胶提取DNA片段的试剂盒(QIAEX II，QIAGEN K.K.)，

用于哺乳动物细胞的表达载体：pEF2cew(由改进的pEF-BOS制造的载体)，

包含人类IgG4重链恒定区(Cγ4)基因的质粒：pTK-2232，

TA克隆载体：pT7B1ueT(NOVAGEN)和连接剂：TaKaRa ligation Kitver.2(TAKARA BIO INC.)，

E.coli感受态细胞：JM109(TAKARA BIO INC.)，

质粒DNA和基因组DNA纯化试剂盒(QIAGEN K.K.)，

测序试剂盒：DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Premix Kitlot.1767(Amersham Biosciences)和分析仪：ABI3100geneticanalyzer(Applied Biosystems)，

总RNA分离试剂：TRIzol(GIBCO BRL)，

5’RACE kit：用于快速扩增cDNA端的5’RACE系统，v.2.0(Invitrogen Corporation)，

Dulbecco’s MEM(SIGMA)，

转染试剂：FuGENE6(Roche Diagnostics K.K.)

[表1]

表1：引物序列

引物名	碱基序列	SEQ ID
			M4	5’-GTTTTCCCAGTCACGACG-3’	135
T7	5’-CTGTTGTTTCAGCTGAGGACAC-3’	136
			rIgH-b	5’-CTGTTGTTTCAGCTGAGGACAC-3’	137
rIgH-c	5’-AGGGTCACCATGGAGTTACTT-3’	138
			rIgK-a	5’-AGATACAGTTGGTGCAGCATCAGC-3’	139
rIgK-b	5’-GACACTGATGTCTCTGGGATAGA-3’	140
			1024H-a	5’-GAATTCCATGGATTGGTTGTGGAACTT-3’	141

1024K-a	5’-GAATTCCATGGAGTCACATACTAG-3’	142
			HchainEco47NheI	5’-CCCCCGCTAGCGCTGGAGACGGTGACC-3’	143
rIgK-BsiWI	5’-CGTACGTTTCAATTCCAGCTTGGT-3’	144
			IgG4-m	5’-AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTC-3’	145
IgG4-v	5’-GGATCCTTTACCCAGAGACAGGGA-3’	146
			IgG4-s	5’-TTACCTGGGCCTGATGGGCCTGGGGGACCA-3’	147
IgG4-r	5’-TGGTCCCCCAGGCCCATCAGGCCCAGGTAA-3’	148
			IgK-e	5’-GCACTTCTCCCTCTAACACT-3’	149
BsiWI-hIgK	5’-CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTC-3’	150
			UTI-a	5’-GGATCCGCTGTGCTACCCCAAGAA-3’	151
UTI-b	5’-GGATCCACTGTGGCGGCCTGCAAT-3’	152
			UTI-c	5’-GCGGCCGCTCAGTTGGAGAAGCGCAGCAG-3’	153
UTI-f	5’-GATATCACCACCACCACCGTTGGAGAAGCGCAGCA-3’	154
			UTI-g	5’-AGGCCTACCACCACCACCGTTGGAGAAGCGCAGCA-3’	155
UTI-h	5’-GATATCGGAGGAGGAGGAGCTGTGCTACCCCAAGA-3’	156
			UTI-i	5’-GATATCGGAGGAGGAGGAACTGTGGCGGCCTGCAA-3’	157
SLPI-a	5’-CAGAGTCACTCCTGCCTTCA-3’	158
			SLPI-c	5’-AGATCTGGAAAGTCCTTCAAAGCTGGAGTC-3’	159
SLPI-d	5’-ACACCCCAAACCCAACAAGGAGGAAGCCTG-3’	160
			SLPI-e	5’-CAGGCTTCCTCCTTGTTGGGTTTGGGGTGT-3’	161
SLPI-g	5’-GCGGCCGCTCAAGCTTTCACAGGGGAAACG-3’	162
			1031H-a	5’-GGGGAATTCCATGGGATGGAGCCGGATC-3’	163
mIgG2b-c	5’-TGAACACAGACCACTCACCATG-3’	164
			mIgG2b-a	5’-GGGCCAGTGGATAGACTGATG-3’	165
IGKV4-1-a	5’-GCATTGTGAACTGAGCTACAAC-3’	166
			IgK-d	5’-GACATCGTGATGACCCAGTCTC-3’	167
rIgK-a	5’-AGATACAGTTGGTGCAGCATCAGC-3’	168
			13HcS-EcoR	5’-GGAATTCCATGGAATGTAACTGGATACTTC-3’	169
13HcA-Nhe	5’-CTAGCTAGCGCTGGAGACGGTGACTGAGGT-3’	170
			13LcS-EcoR	5’-GGAATTCCATGGAGACAGACACACTCCTG-3’	171
13LcA-BsiW	5’-CACCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTCCC-3’	172

(2)实验方法

采用的主要实验方法如下所述。

-PCR

PCR根据酶的说明书进行。

-琼脂糖凝胶电泳

制备浓度为0.8％的琼脂糖凝胶，并将该凝胶放入充满1x TAE的电泳槽中，在将5μL样品施用至槽孔后，电泳在135V进行15分钟。完成电泳后，所述凝胶用溴化乙锭染色，并用UV检测条带。

-由凝胶提取DNA片段

将所关心的条带用剃刀切割，DNA片段根据所附说明书使用QIAEX II试剂盒从凝胶中提取。由此提取的DNA片段溶解在20μL无菌水中。

-连接反应

将1μL提取的DNA片段、1μL克隆载体(pT7BlueT)与2μL连接试剂盒ver.2的I溶液混合，使混合物在室温下静置15分钟以促进连接。

-E.coli的转化

50μL感受态E.coli被允许在冰上解冻，然后加入4μL制得的连接物。允许在冰上静置30分钟后，热冲击(heat shock)在42℃应用45秒，将溶液涂布在含有氨苄青霉素的LB板上(最终浓度为50μg／mL)，将所述板在37℃下培养一夜。

-质粒的纯化和测序反应

所述步骤根据试剂盒所附的说明书进行。

-总RNA由杂交瘤和5’RACE的分离

所述步骤根据试剂盒所附的说明书进行。使用的杂交瘤细胞的数目为5x10⁷。

-转染

转染根据FuGENE6所附的说明书进行。在6孔板的情况中，在进行转染前-天2mL COS-1细胞以1.5x10⁵细胞／mL的密度在各孔中接种。在第二天，将3μL FuGENE6和1μg表达质粒加入至97μL的Dulbecco’s MEM中，在允许该混合物静置至少15分钟后，将2mL该混合物滴加至无血清的Dulbeeco’s MEM中。所述转染通过替换培养介质(culture medium)完成。

(3)杂交瘤抗体基因可变区的克隆和序列的确定(F1024)

将通过WO02／42333中描述的方法制造的杂交瘤F1024(1x10⁷细胞)用PBS^-(SIGMA)洗涤，总RNA通过使用TRIzol(GIBCO BRL)提取。然后，5μg的总RNA通过使用用于快速扩增cDNA端的5’RACE系统，v.2.0(Invitrogen Corporation)经历5’RACE，并分别扩增编码重链及轻链可变区的基因片段。所述步骤根据试剂盒所附说明书中的描述进行，重链可变区使用rIgH-c引物经历反转录，使用末端脱氧核苷酸转移酶在末端上进行dC添加，并使用rIgH-c引物和AAP引物(附于试剂盒)进行第一PCR。轻链可变区类似的经历使用rIgK-b引物的反转录，和使用rIgK-b引物和AAP引物的第一PCR。随后，第二PCR通过使用用于重链可变区的rIgH-b引物和AUAP引物(附于试剂盒)，及用于轻链可变区的rIgH-a引物和AUAP引物(附于试剂盒)，利用用于模板的反应产物而进行，由此特别扩增的DNA片段中的每一个通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。由所述凝胶提取DNA片段后，确定核苷酸序列，相应区域的氨基酸序列也被确定(图1和2)。根据Kabat的定义的CDR序列显示在表2中。表2中所示的序列在SEQ ID NO：173～178中描述。

[表2]

表2：抗体F1024的CDR氨基酸序列

F1024	CDR1	CDR2	CDR3
				重链	DYAMN	WINTQTGKPTYADDFKQ	STFYYSSYIYGWYFDF
轻链	KASQNVGSNVD	KASNRYT	MQSNTNPPWT

(4)嵌合抗体融合蛋白质的表达质粒的构建

制造下述嵌合抗体能够提供具有对于人类的抗原性下降的抗体：

在所述嵌合抗体中，其具有抗原结合活性的可变区是来自杂交瘤抗体的区域，即，来自大鼠抗体的区域，其恒定区是来自人类抗体的区域。自从Morrison et al.in1984(Proc，Natl.Acad.Sci.USA，81：6851，1984)的报道后已经研发了大量的嵌合抗体。

分别设计了下述的5’引物和3’引物：所述5’引物在可变区的起始密码子(1024H-a用于重链，1024K-a用于轻链)的直接上游连有用于限制酶EcoRI的识别序列，所述3’引物(HchainEco47NheI用于重链，rIgK-BsiWI用于轻链)连接有能够与人类恒定区连接而不会改变可变区的3’侧序列的氨基酸序列的限制酶(NheI识别序列用于重链，BsiWI识别序列用于轻链)。使用这些引物，在模板的反转录之后，PCR通过使用在实施例1-1)-(3)中制备的重链和轻链样品而再次进行。将由此扩增的PCR产物与pT7BlueT载体(NOVAGEN)混合，连接反应使用TaKaRa Ligation Kit ver.2(TAKARA BIO INC.)在室温下进行15分钟。感受态细胞E.coli(JM109，TAKARA BIO INC.)通过使用反应溶液而被转化。

将形成的菌落取出，通过使用Ex Taq聚合酶(TAKARA BIOINC.)、M4引物和T7引物，利用菌落的直接PCR确认插入物插入载体中。

接着，已被证实插入物被插入的菌落在LB培养基中培养一夜，质粒通过使用QIAGEN plasmid midi kit(QIAGEN)进行纯化(具有编码重链可变区的基因片段的质粒被指定为pT7-1024H，具有编码轻链可变区的基因片段的质粒被指定为pT7-1024K)。所述纯化质粒的核苷酸序列通过使用M4引物和T7引物检查。

pT7-1024H用限制酶EcoRI和NheI切割以制备编码重链可变区的基因片段A。类似地，pT7-1024K用限制酶EcoRI和BsiWI切割以制备编码轻链可变区的基因片段B。

PCR通过使用包含人类IgG4重链恒定区(Cγ4)的基因用作模板的质粒pTK-2232(参见WO2005／7800)和引物对(IgG4-m and IgG4-v)进行，从而扩增在Cγ4的5’端具有限制酶NheI的识别序列，并具有代替已经被删除的终止密码子的Cγ43’端限制酶BamHI识别序列的基因片段。该片段用限制酶NheI和BamHI切割以制备基因片段C。

PCR通过使用用作模板的pTK-2232和引物对(IgG4-m和IgG4-s)及(IgG4-r和IgG4-v)进行，由此扩增各基因片段。这些基因片段被混合以用作模板，PCR通过使用另一引物对(IgG4-m和IgG4-v)而再次进行以扩增下述基因片段：该基因片段具有由甘氨酸残基取代的重链二聚所需的2个半胱氨酸残基，并具有5’端的限制酶NheI的识别序列以及取代终止密码子的3’端的限制酶BamHI识别序列。该片段用限制酶NheI和BamHI切割以制备基因片段D。

PCR通过使用用于模板的HeLa基因组DNA和引物(BsiWI-hIgK和IgK-e)进行，由此扩增人类轻链恒定区(Cκ)，该扩增产物被克隆进pT7BlueT载体中以构建pT7-hIgK。然后通过使用能够由所述质粒切割人类轻链恒定区的适宜的限制酶(BsiWI和BamHI)制造片段E。

PCR通过使用包含人类UTI结构域1和结构域2(D1D2)的用于模板的质粒pM1213及引物对(UTI-a和UTI-c)进行，以扩增具有D1D25’端用于限制酶BamHI的识别序列，和3’端终止密码子直接相邻的下游用于限制酶NotI的识别序列的基因片段。该片段用限制酶BamHI和NotI切割以制备基因片段F。

PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-b和UTI-c)进行以扩增具有D25’端的限制酶BamHI识别序列和3’端终止密码子直接相邻的下游用于限制酶NotI的识别序列的基因片段。该片段用限制酶BamHI和NotI切割以制备基因片段G。

PCR通过使用包含人类UTI结构域2的3个氨基酸修饰形(modifiedform){D2(3)}(参见JP6-321989A)的用于模板的质粒pM765和引物对(UTI-b和UTI-c)进行，以扩增具有D2(3)的5’端的用于限制酶BamHI的识别序列和3’端的终止密码子的直接相邻的下游用于限制酶NotI的识别序列的基因片段。该片段用限制酶BamHI和NotI切割以制备基因片段H。

PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-a和UTI-f)进行以扩增具有D1D2的5’端的用于限制酶BamHI的识别序列，并具有包含在除去3’端的终止密码子之后加入的包含4个甘氨酸残基的连接物，此外还具有所述连接物直接相邻的下游的用于限制酶EcoRV的识别序列的基因片段。该片段用限制酶BamHI和EcoRV切割以制备基因片段I。

PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-b和UTI-f)进行以扩增具有D2的5’端的用于限制酶BamHI的识别序列，并具有包含在除去3’端的终止密码子之后加入的包含4个甘氨酸残基的连接物，此外还具有所述连接物直接相邻的下游的用于限制酶EcoRV的识别序列的基因片段。该片段用限制酶BamHI和EcoRV切割以制备基因片段J。

PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-h和UTI-c)进行以扩增具有在D1D2的5’端加入的包含4个甘氨酸残基的连接物和具有所述连接物直接相邻的上游的用于限制酶EcoRV的识别序列，以及具有在3’端的终止密码子的直接相邻的下游的用于限制酶NotI的识别序列的基因片段。该片段用限制酶EcoRV和NotI切割以制备基因片段K。

PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-i和UTI-c)进行以扩增具有在D2的5’端加入的包含4个甘氨酸残基的连接物和所述连接物直接相邻的前方的用于限制酶EcoRV的识别序列，并具有在3’端的终止密码子的直接相邻的下游的用于限制酶NotI的识别序列的基因片段。该片段用限制酶EcoRV和NotI切割以制备基因片段L。

PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-h和UTI-g)进行以扩增具有包含在D1D2的5’端加入的4个甘氨酸残基的连接物和所述连接物直接相邻的前方的用于限制酶EcoRV的识别序列，并具有在除去3’端的终止密码子之后加入的包含4个甘氨酸残基的连接物以及所述连接物直接相邻的下游的用于限制酶StuI的识别序列。在pT7BlueT载体中克隆该片段后，所述载体用EcoRV和BamHI切割，并连接基因片段I以构建包含D1D2D1D2序列的中间质粒。该质粒用BamHI和StuI切割以制备基因片段M。

PCR通过使用用于模板的pM1213和引物对(UTI-i和UTI-g)进行以扩增具有在D2的5’端加入的包含4个甘氨酸残基的连接物和具有所述连接物直接相邻的上游的用于限制酶EcoRV的识别序列，并具有包含在除去3’端的终止密码子后加入的4个甘氨酸残基的连接物以及所述连接物直接相邻的下游的用于限制酶StuI的识别序列的基因片段。在pT7BlueT载体中克隆该片段后，所述载体用EcoRV和BamHI切割，并连接基因片段J以构建包含D2D2序列的中间质粒。该质粒用BamHI和StuI切割以制备基因片段N。

PCR通过使用用于模板的HeLa基因组DNA和下列引物对进行。结果，PCR扩增产物O通过SLPI-c和SLPI-e获得，PCR扩增产物P通过SLPI-d和SLPI-g获得，PCR扩增产物R通过SLPI-a和SLPI-g获得。

当PCR通过使用引物SLPI-c和SLPI-g以及作为模板的O与P的混合物而再次进行时，获得作为两个片段的连接产物的扩增产物Q。

扩增产物Q和R分别在pT7BlueT载体中克隆，且Q和R被证实是编码人类SLPI的Ser¹-Ala¹⁰⁷(也称为SLPI(D1D2))和人类SLPI的Arg⁵⁸-Ala¹⁰⁷(也称为SLPI(D2))的序列，它们被分别指定为pT7-SLPI(DlD2)和pT7-SLPI(D2)。二者均被如此的构建以使用于限制酶BglII的识别序列位于SLPI的5’侧，NotI识别序列位于3’侧的终止密码子的直接相邻的下游。这些质粒分别用限制酶BglII和NotI切割，以制备SLPI(D1D2)片段S和SLPI(D2)片段T。

将上述基因片段连接在通过用适当组合的EcoRI和NotI，或EcoRI和BamHI切割而制备的表达载体pEF2cew的EF1α启动子的下游以构建各自的表达质粒。表达质粒的名字和结合在所述载体中的基因片段的名字共同显示在表3中。表达嵌合抗体轻链的同一质粒pTK-2344用于各种类型的重链。各融合蛋白质的结构、核苷酸序列和推演的氨基酸序列显示在图7～17及序列表(SEQ ID NO：1～26)中。在SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和24的各氨基酸序列中，氨基酸Nos.1～19相当于信号肽序列，在氨基酸序列SEQ ID NOS：22和26中，氨基酸Nos.1～20相当于信号肽序列。因此，本发明的融合蛋白质的推演氨基酸序列是信号肽已由其中排除的氨基酸序列。

[表3]

表3：嵌合抗体-重链融合蛋白质和表达嵌合抗体轻链的质粒

抗体融合蛋白质	质粒名	插入片段	附图编号	SEQ ID
					F1024D-D1D2	pTK-2348	A+C+F	7	1～2
F1024D-D2	pTK-2349	A+C+G	8	3～4
					F1024D-D2(3)	pTK-2368	A+C+H	9	5～6
F1024S-D1D2	pTK-2354	A+D+F	10	7～8
					F1024S-D2	pTK-2355	A+D+G	11	9～10
F1024S-D2(3)	pTK-2370	A+D+H	12	11～12
					F1024D-D1D2D1D2	pTK-2356	A+C+I+K	-	-
F1024D-D2D2	pTK-2357	A+C+J+L	-	-
					F1024S-D1D2D1D2	pTK-2360	A+D+I+K	-	-
F1024S-D2D2	pTK-2361	A+D+J+L	-	-
					F1024D-D1D2D1D2D1D2	pTK-2362	A+C+M+K	-	-
F1024D-D2D2D2	pTK-2363	A+C+N+L	-	-
					F1024S-D1D2D1D2D1D2	pTK-2366	A+D+M+K	-	-
F1024S-D2D2D2	pTK-2367	A+D+N+L	-	-
					F1024D-SLPI(D1D2)	pTK-2397	A+C+S	13	13～14
F1024D-SLPI(D2)	pTK-2394	A+C+T	14	15～16
					F1024S-SLPI(D1D2)	pTK-2399	A+D+S	15	17～18
F1024S-SLPI(D2)	pTK-2396	A+D+T	16	19～20
					嵌合抗体的F1024轻链	pTK-2344	B+E	7to16	21～22
F1031-13S-D2(3)	pF31-13HU		17	23～24
					嵌合抗体的F1031-13-2轻链	pF31-13L		17	25～26

(5)各融合蛋白质的小规模表达和被表达的融合蛋白质的纯化

COS-1细胞在补充有10％胎牛血清的Dulbecco’s MEM中进行传代培养，并在转染的前一天，将所述细胞在培养容器中以1.5x10⁵细胞／mL的密度进行接种。在第二天，将轻链表达质粒(pTK-2344)与各重链表达质粒以1：1的重量比混合，然后再与足够量的转染剂(FuGENE6，Rosch Diagnostics)混合。将该混合物逐滴加入无血清的Dulbecco’s MEM中，通过用培养介质代替该介质进行细胞转染。所述细胞在5％CO₂的存在下在37℃培养2～3天，并收集上清液。纯化使用Prosep-A柱子(MILLIPORE)进行，以PBS(pH7.4)渗析后由280nm处的吸光率计算浓度。

1-2)嵌合抗体和抗体融合蛋白质的构建(F1031)

(1)杂交瘤抗体基因可变区的克隆和序列的确定(F1031)

作为与CD14结合但不具有CD14抑制活性的抗人CD14抗体的抗体F1031-13-2(小鼠IgG2b／κ)的CDR序列通过下述步骤确定。

首先，总RNA通过使用TRIzol由表达F1031-13-2的杂交瘤制备，单链cDNA通过使用用于RT-PCR的SuperScript III First-StrandSynthesis System(Invitrogen Corporation)合成。

同时，正向引物1031H-a和mIgG2b-c及反向引物mIgG2b-a被合成以用于小鼠IgG2b重链可变区的扩增，正向引物IGKV4-1-a和IgK-d和反向引物rIgK-a被合成以用于κ链可变区的扩增(参见表1)。

其次，PCR通过使用用于模板的由此合成的杂交瘤的单链cDNA而进行。使用的引物是用于重链(i)的1031H-a和mIgG2b-a的组合，用于重链(ii)的mIgG2b-c和mIgG2b-a的组合，用于轻链(i)的IGKV4-1-a和rIgK-a的组合，和用于轻链(ii)的IgK-d和rIgK-a的组合。PCR如下进行：在96℃加热反应溶液2分钟，然后重复在96℃加热30秒、在55℃加热30秒以及在72℃加热30秒的25次循环。

所得产物直接确定其序列，结果发现重链(i)(ii)，和轻链(i)(ii)分别具有相同序列。关于轻链，其5’端不完全，翻译起始密码子不能被鉴别。因此，在其序列已经被报道的小鼠κ链中寻找在框架区中显示同源性的序列。图3和4(SEQ ID NOS：127～130)显示了抗体F1031-13-2的可变区的重链和轻链的序列(核苷酸序列和氨基酸序列)。在所述序列中，下划线部分是来自引物的序列。

(2)表达嵌合抗体(F1031)的质粒构建

表达嵌合抗体F1031-13-2的质粒通过与实施例1-1)的方法(表达F1024嵌合抗体的质粒构建)相似的方法构建。更具体地，通过参考在1-2)(1)中获得的序列，合成用于构建表达重链的质粒的引物，即，具有在可变区的起始密码子的直接相邻的上游加入的用于限制酶EcoRI的识别序列的5’侧引物13HcS-EcoR，和具有可与加入的人类恒定区连接而不会改变可变区的3’侧的氨基酸序列的用于限制酶NheI的识别部位的3’侧的引物13HcA-Nhe。尽管轻链5’侧的序列未被鉴别，但5’端侧的序列可通过同源性搜寻而推测，并合成具有在可变区的起始密码子的直接相邻的上游加入的用于限制酶EcoRI的识别序列的5’侧的引物13LcS-EcoR，和具有可与加入的人类恒定区连接而不会改变可变区的3’侧的氨基酸序列的用于限制酶BsiW的识别部位的3’侧的引物13LcA-BsiW(参见表1)。

然后，PCR通过使用用于模板的在1-2)(1)中合成的单链cDNA进行。反应如下进行：在90℃加热2分钟，然后重复(1)在94℃加热30秒，(2)在50℃加热30秒，和(3)在72℃加热1分钟的30次循环。所得的用于构建重链的PCR产物用EcoRI和NheI消化，用于构建轻链的PCR产物用EcoRI和BsiWI消化，并由各消化产物收集约为0.4kb的片段。

接着，用于表达重链的质粒pTK-2370和用于表达实施例1-1)中构建的F1024嵌合抗体的轻链的质粒pTK-2344分别用EcoRI和NheI，及EcoRI和BsiWI消化，以收集约为5.7kb和4.8kb的片段。然后将来自PCR产物的片段插入这些片段中，E.coli感受态细胞JM109通过标准方法转化从而获得表达重链的质粒pF31-13H，和用于表达F1031-13-2的轻链的质粒pF31-13L。由于F1031-13-2的轻链的5’端序列包含在本发明的构建中新近证实的序列，因此表达质粒的重链可变区和轻链可变区的序列再次显示在图5和6中(SEQ ID NOS：131～134)。在所述序列中，下划线部分是来自构建引物的序列。

(3)嵌合抗体融合蛋白质的表达的证实

在1-2)(2)中构建的重链表达质粒和轻链表达质粒被引入COS-1细胞中以证实嵌合抗体融合蛋白质的表达。

首先，COS-1细胞以2.0～2.4x10⁵细胞／孔接种入6孔板中的补充有10％失活的FBS的DMEM，所述细胞在37℃和5％CO₂的存在下培养过夜。第二天，将6μL FuGENE6与1μg重链表达质粒和1μg轻链表达质粒混合，混合物根据FuGENE6所附方案逐滴加至COS-1细胞。在上述过程中，在将FuGENE／质粒混合物逐滴加至所述细胞之前进行下列处理以防止免疫球蛋白被FBS污染。即，在培养COS-1细胞整夜并除去细胞上清液之后，所述细胞用生产培养基(杂交瘤-SFM(Invitrogen Corporation)或Cellgro Complete Serum FreeMedium(Mediatech))洗涤两次，随后，将生产培养基以2mL／孔加入板中。FuGENE／质粒混合物然后逐滴加至所述细胞。在37℃和5％CO₂的存在下培养所述细胞3～4天后，将上清液回收，上清液中嵌合抗体融合蛋白质的量由与实施例2中描述的EIA步骤相似的步骤确定，不同之处在于用于检测的HRP标记抗体是HRP标记的抗人κ轻链抗体(DAKO)而不是过氧化物酶标记的UTI抗体。于是发现所述嵌合抗体以约为10～20μg／mL被表达。在该试验中生成的培养物上清液用于检测实施例1-3)(1)中的IL-6生产的抑制活性的试验。

1-3)活性的确定测试

(1)IL-6生产的抑制活性的确定测试

进行下列试验以检测在实施例1-1)和1-2)中制备的抗体融合蛋白质的抗体结构功能域的活性。

将来自于人神经胶质瘤的细胞系U-373MG以1×10⁴细胞／孔接种入96孔板中的含有2％失活FBS的MEM(SIGMA)中，所述细胞在37℃和5％CO₂的存在下培养整夜。下列溶液在第二天制备。

1)含有0.2％人血清白蛋白(SIGMA)的生理盐水(OtsukaPharmaceutical Co.，Ltd.)(以下称为0.2％HSA／生理盐水)

2)含有0.2％人血清白蛋白(SIGMA)的MEM(以下称为0.2％HSA／MEM)

3)通过将0.2％HAS／生理盐水与0.2％HAS／MEM以1∶1的比率混合而制备的溶液(以下称为0.1％HSA／1／2MEM)

4)含有4％人血清的MEM(以下称为4％HS／MEM)

5)通过用生理盐水将LPS(E.coli0111：B4，SIGMA)稀释至1mg／mL，超声处理10分钟，并用0.2％HSA／MEM稀释至200ng／mL而制备的溶液(也称为200ng／mL LPS B4)

6)通过将4％HS／MEM与200ng／mL LPS B4以9∶1的比率混合而制备的溶液(也称为2x(HS+LPS))

分析物样品用0.2％HAS／生理盐水稀释至两倍目标浓度以制备样品。将U-373MG细胞的整夜培养的培养物上清液丢弃，所述细胞用0.1％HSA／1／2MEM洗涤两次。向这些细胞中加入100μL／孔的等量的分析物样品与2x(HS+LPS)的混合物，所述细胞在5％CO₂的存在下在37℃培养约18小时。然后使用人类IL-6检测盒(Eli-PAIR hIL-6；Invitorgen Corporation)检测培养物上清液中的IL-6的量。图18～20显示出典型的测试结果。

因此可证明，在展示CD14抑制活性的抗体的情况中在嵌合抗体融合蛋白质中维持了抗体活性，而未展示CD14抑制活性的F1031-13-2抗体在以嵌合抗体融合蛋白质的形式被制造时则没有显示抑制活性。在图20中，显示的结果涉及未添加样品的对照组的IL-6的生成(100％)。

(2)酶抑制活性的确定测试

测定胰蛋白酶抑制活性以确定实施例1-1)和1-2)中制造的抗体融合蛋白质的具有酶抑制功能的结构域的活性。

分析物样品用0.1mol／L NaCl／5mmol／L CaCl₂／20mmol／L Tris-HCl(pH7.4)(以下称为稀释溶液)稀释至10倍的目标浓度。同时，将1μg／mL来自人的胰腺的胰蛋白酶(Athens Research and Technology)用0.1重量／体积％BSA／1mmol／L HCl制备，合成基质S2222(TESTZYM，Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)用水稀释至4mmol／L。

制备各试剂后，将70μL稀释溶液、10μL1μg／mL的人胰蛋白酶溶液和10μL分析物样品溶液放入96孔微量滴定板(Nunc)中，溶液在37℃培养3分钟。然后，将10μL合成基质S2222溶液加入孔中，溶液在37℃另外培养60分钟。然后反应用20体积／体积％的乙酸水溶液终止，测定405nm处的反应溶液的吸光率。图21显示典型结果。因此发现酶抑制活性基本上保持在嵌合抗体融合蛋白质中。

(实施例2)抗体融合蛋白质的大量生产

(1)F1024S-D2(3)和F1031-13S-D2(3)的大量生产

为进行F1024S-D2(3)的大量生产，采用使用COS-1细胞的短暂表达系统。更具体地，1700mL含有10％失活FBS和10mM HEPES(pH7.0～7.6)的DMEM添加至CellsTACK-10Chamber(Corning)，并将21x10⁶COS-1细胞植入该介质。CellsTACK-10Chamber的内部用含有5％CO₂的气体混合物置换，并将容器密封后在37℃培养该介质。

在通过下列步骤在接种后4天进行转染。

首先，2.12mL FuGENE转染试剂(Rosch Diagnostics K.K.)加入63.6mL DME中，并搅拌。5分钟后，将530μg在实施例1中制备的编码重链的质粒pTK2370和编码轻链的质粒pTK2344加入，搅拌后使培养物在室温下静置15分钟。同时，CellsTACK-10Chamber的介质用1300mL包含10mM HEPES(pH7.0～7.6)的Hybridoma-SFM(InvitrogenCorporation)(以下称为生产用介质)替换，并加入由此制备的转染试剂和质粒的混合物。在37℃培养3天后，收集生产培养基。将1300mL新的生产培养基加入CellsTACK-10Chamber中，4天后再次收集生产培养基。

F1031-13S-D2(3)的制造通过使用在实施例1中制备的编码重链的质粒pF31-13HU和编码轻链的质粒F31-13L类似地进行。

(2)F1024S-D2(3)和F1031-13S-D2(3)的分析系统(EIA)

F1024S-D2(3)的浓度通过夹心EIA测定。

夹心EIA系统是通过使用包含人类CD14的全长356个氨基酸的通过与实施例6中用于固相化蛋白质的类似的步骤制备的重组人类CD14，和通过在JP2002-14104A中描述的用于标记抗体的步骤制备的过氧化物酶标记的UTI抗体而制备。

实施例1中制备的F1024S-D2(3)用作标准。更具体地，重组人类CD14用PBS(pH7.4)稀释至4μg／mL，并将50μL加入NUNC-Immunoplate Maxisorp(NUNC)的各孔中。允许在4℃反应整夜后，孔用0.05％Tween20／0.9％氯化钠溶液洗涤三次，并将100μL含有2％StabilGuard(SurModics，Inc.)的PBS(pH7.4)加入孔中用于封闭。然后，使用用于稀释液的包含0.1％BSA的PBS(pH7.4)制备稀释的分析物样本和标准。同时，制备用包含10％兔血清的PBS(pH7.4)稀释的过氧化物酶标记的UTI抗体。25μL稀释的过氧化物酶标记抗体和25μL稀释样本加入孔中，反应被允许在37℃进行1小时。反应终止后，孔用0.05％Tween20／0.9％氯化钠溶液洗涤三次，并将50μL四甲基联苯胺溶液加入各孔中。允许反应在室温下发生约20分钟后，反应通过加入50μL1mol／L盐酸溶液而终止，用平板分光光度计测定450nm处的吸光率。

以相同方式测定F1031-13S-D2(3)的浓度。测定时，具有已知浓度的F1031-13S-D2(3)用作标准。

(3)F1024S-D2(3)的大量生产

除非另作说明，下列步骤在4℃进行。

将实施例2(1)中制造的COD培养物上清液应用于与0.22μmFluorodyne II DFLP Filter(Nihon Pall Ltd.)连接的1μm囊式过滤筒(Advantec Toyo Kaisha，Ltd.)，由此除去培养物上清液中的不溶物。滤液应用于已经预先由PBS(SIGMA)平衡的ProSep-vA柱(NihonMillipore K.K.)，非吸附物用PBS洗去。然后，非特异吸附物用10xPBS(SIGMA)洗去，并用25mM Glycine-HCl(pH2.5)洗脱以回收F1024S-D2(3)。所得的洗脱部分通过添加MacIlvaine缓冲液而将pH调节至5。洗脱部分中的沉淀通过离心分离除去，离心分离后的上清液流过具有的截止分子量为10,000的渗析管(SPECTRUM)以用于生理盐水进行的渗析。渗析液用作纯化标准。

(4)F1031-13S-D2(3)的大量生产

除非另作说明，下列步骤在4℃进行。

将实施例2(1)中制造的COD培养物上清液应用于与0.22μmFluorodyne II DFLP Filter(Nihon Pall Ltd.)连接的1μm囊式过滤筒(Advantec Toyo Kaisha，Ltd.)，由此除去培养物上清液中的不溶物。滤液应用于已经预先由PBS(SIGMA)平衡的ProSep-vA柱(NihonMillipore K.K.)，未吸附物用PBS洗去。然后，非特异吸附物用1M氯化钠溶液洗去，并用100mM Glycine-HCl(pH2.7)洗脱以回收F1031-13S-D2(3)。所得的洗脱部分通过添加1M Tris-盐酸(pH8.0)中和，使该溶液流过具有的截止分子量为3,500的渗析管(SPECTRUM)以用于生理盐水进行的渗析。渗析液用YM10超滤膜(Nihon MilliporeK.K.)浓缩，浓缩物用作纯化标准。

(实施例3)功效(体外)的评价

3-1)抗体活性的确认

(1)对于LPS诱导的人血管内皮细胞中的IL-6的合成的抑制活性的确认

将通过包含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS(-)分离的人脐带静脉的内皮细胞(HUVEC，Sanko Junyaku Co.，Ltd.)悬浮在含有10％人血清(TENNESSEE BLOOD SERVICE CORPORATION)的RPMI1640介质(SIGMA)中，并以2×10⁴细胞／孔植入96孔板。所述细胞在37℃和5％CO₂的存在下培养一夜。培养后，LPS(WE.coli055：B5，DIFCO)被加入至最终浓度10ng／mL，同时，F1024S-D2(3)被加入至最终浓度为0.03μg／mL、0.1μg／mL、0.3μg／mL、1μg／mL、3μg／mL和10μg／mL。在37℃和5％CO₂的存在下培养6小时后，使用人IL-6EIA试剂盒(Diaclone Research)根据所附方案测定培养物上清液中的IL-6。表示通过F1024S-D2(3)抑制IL-6生成的IC₅₀值为0.38μg／mL。该结果表明F1024S-D2(3)抑制了由作为构成革兰氏阴性细菌成分的LPS诱导的人血管内皮细胞的细胞因子的生成。

F1031-13S-D2(3)和F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)或F1024S-SLPI(D2)的抑制活性利用类似的分析系统进行评价。

(2)对于LPS诱导的人血管内皮细胞中的E选择素(selectin)的表达的抑制活性的确认

人脐带静脉的内皮细胞(HUVEC，Sanko Junyaku Co.，Ltd.)通过实施例3-1)(1)中描述的步骤被接种，接种后，LPS(WE.coli055：B5，DIFCO)被添加至最终浓度为10ng／mL，同时加入F1024S-D2(3)至最终浓度为0.03μg／mL、0.1μg／mL、0.3μg／mL、1μg／mL、3μg／mL和10μg／mL。在37℃和5％CO₂的存在下培养6小时后，除去培养介质，所述细胞用PBS(-)洗涤两次。用干燥剂干燥后，加入100μL／孔的含有2％低聚甲醛的PBS(-)。在室温下培养20分钟后，所述细胞用PBS(-)洗涤三次，加入100μL／孔的用包含1％人血清的RPMI1640稀释的生物素化抗人E选择素抗体(Cosmo Bio Co.，Ltd.)，所述细胞在室温下培养60分钟。该细胞然后再用PBS(-)洗涤三次，加入100μL／孔的过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素溶液(Dako Cytomation)后，所述细胞在室温下另外再培养30分钟。洗涤后，加入100μL／孔的发色底物(TMB)，并使反应在室温下进行30分钟，通过加入100μL／孔的2N硫酸终止反应。吸光率在波长为450nm和650nm处测定，ΔOD(450nm～650nm)用于被表达的E选择素的量。表示通过F1024S-D2(3)抑制E选择素表达的IC₅₀值为0.43μg／mL。该结果表明LPS诱导的人血管内皮细胞中的粘附分子的表达被F1024S-D2(3)抑制。

F1031-13S-D2(3)和F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)或F1024S-SLPI(D2)的抑制活性利用类似的分析系统进行评价。

(3)对于LPS诱导的人外周血单核细胞中的TNF-α的合成的抑制活性的确认

将正常人外周血单核细胞(hPBMC，BioWhittaker Inc.)悬浮在包含10％人血清和25mM HEPES(SIGMA)的RPMI1640中，并以2.5x10⁵细胞／孔接种在96孔板中。加入F1024S-D2(3)至最终浓度为0.1μg／mL、0.3μg／mL、1μg／mL、3μg／mL、10μg／mL和30μg／mL，在室温下静置20分钟后，加入LPS(WE.coli055：B5，DIFCO)至最终浓度为0.1ng／mL。在37℃和5％CO₂的存在下培养6小时后，培养物上清液中的TNF-α使用人TNF-αEIA试剂盒(Diaclone Research)根据该盒所附方案测定。

表示通过F1024S-D2(3)抑制TNF-α合成的IC₅₀值为0.58μg／mL。该结果表明LPS诱导的人白细胞中的细胞因子的合成被F1024S-D2(3)抑制。

F1031-13S-D2(3)和F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)或F1024S-SLPI(D2)的抑制活性利用类似的分析系统进行评价。

(4)对于LPS诱导的人外周血单核细胞中的促凝血活性(procoagulant activity，PCA)增强的抑制活性的确认

正常人外周血的单核细胞(hPBMC，BioWhittaker Inc.)通过实施例3-1)(3)中描述的步骤接种，并加入F1024S-D2(3)至最终浓度为0.1μg／mL、0.3μg／mL、1μg／mL、3μg／mL、10μg／mL和30μg／mL，在使细胞在室温下静置20分钟后，加入LPS(WE.coli055：B5，DIFCO)至最终浓度为0.1ng／mL。在37℃和5％CO₂的存在下培养6小时后，细胞悬浮液的PCA通过使用正常人血浆(DADE BEHRING INC.)进行测定。更具体地，在用包含0.15M NaCl和0.1％BSA的50mM Tris-HCl(pH7.4)溶液将所述悬浮液稀释2.5倍后，所述细胞通过20秒超声波作用(SIMAZ)而溶胞。将该样品放置在血液凝固时间计(AMAXCS190，MC Medical，Inc.)中。将20μL该样品由血液凝固时间计收集，加入20μL25mM CaCl₂后，样品在37℃培养3分钟。凝固反应通过添加90μL正常人血浆开始，测定凝固时间。表示通过F1024S-D2(3)抑制PCA的根据凝固时间计算的IC₅₀值为20.86Vg／mL。该结果表明F1024S-D2(3)抑制人白细胞中的LPS诱导的PCA的增强。

F1031-13S-D2(3)和F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)或F1024S-SLPI(D2)的抑制活性利用类似的分析系统进行评价。

(5)对于LPS诱导的家兔全血中的TNF-α的合成的抑制活性的确认

从雄兔(New Zealand white，3.4kg，Kitayama Labes Co.，Ltd.)的耳动脉收集血液，将10单位／mL肝素(Mochida Pharmaceutical Co.，Ltd.)加入收集的全血中后，将其转移至微管中，并加入F1024S-D2(3)至最终浓度为0.3μg／mL、1μg／mL、3μg／mL、10μg／mL和30μg／mL。在室温下培养30分钟后，加入LPS(WE.coli055：B5，DIFCO)至最终浓度为0.1ng／mL。

在37℃培养6小时后，通过在4℃和8000rpm(TOMY)下离心分离10分钟对血浆进行分离，血浆中的TNF-α通过夹心ELISA使用抗兔TNF-α抗体测定。更具体地，用包含1％BSA的PBS(-)稀释的100μL血浆被移至其上固定有4μg/mL抗兔TNF-α抗体(BD Biosciences)的板上，所述板在室温下培养2小时。板孔用包含0.05％Tween20的400μL／孔的PBS(-)洗涤三次，并加入100μL／孔的生物素化抗兔TNF-α抗体溶液(2μg／mL，BD Biosciences)。在室温下培养1小时并洗涤后，将100μL／孔的过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素溶液(InvitrogenCorporation)加入，孔在室温下培养30分钟。洗涤后，加入100μL／孔的发色底物(TMB)，并使反应在室温下进行30分钟，通过加入100μL／孔的2N硫酸终止反应。吸光率在波长为450nm和650nm处测定，计算样品中合成的TNF-α的量。表示F1024S-D2(3)抑制TNF-α生成的IC₅₀值为0.83μg／mL。该结果表明LPS诱导的兔全血中的细胞因子的合成被F1024S-D2(3)抑制。

F1031-13S-D2(3)和F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)或F1024S-SLPI(D2)的抑制活性利用类似的分析系统进行评价。

3-2)酶抑制活性的确认

为证实F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)的酶抑制功能结构域的活性，对各种酶的抑制活性的测定如下所述。在分析系统中，分析物样品的蛋白质浓度通过使用用作标准的牛γ球蛋白(Nippon Bio-RadLaboratories K.K.)并使用蛋白质分析染色液(Nippon Bio-RadLaboratories K.K.)进行测定，摩尔浓度由推导出的抗体融合蛋白质的分子量计算。测试结果显示在图22～25中，其中y轴表示酶的残留活性，x轴表示反应液中的分析物样品的蛋白质浓度。

(1)对于因子Xa的抑制活性

F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)用通过将0.14M氯化钠／5mM氯化钙／20mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)和10％BSA以99：1的比率混合而制备的稀释溶液(以下称为稀释液)连续稀释以制备用于测定抑制活性的样品。同时，人因子Xa(Enzyme Research Laboratories Ltd.)用所述稀释液稀释至0.1U／mL，该溶液用作因子Xa溶液。人工合成底物S-2222(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)也用所述稀释液稀释至2mM，该溶液用作S-2222溶液。制备各试剂后，将10μL用于测定抑制活性的样品、50μL稀释液和20μL因子Xa溶液放入96孔微量滴定板(Nunc)的孔中。在37℃培养5分钟后，S-2222溶液以20μL／孔加入，培养在37℃继续进行另外30分钟。然后通过向各孔加入50μL20％的乙酸溶液而终止反应，测定波长为405nm的吸光率。

对照物通过将20μL因子Xa溶液与60μL稀释液混合，混合物在37℃培养5分钟，加入20μL S-2222溶液，混合物在37℃培养30分钟，加入50μL20％的乙酸溶液。图22中显示的结果证实保留了FXa抑制活性。

F1031-13S-D2(3)的抑制活性通过使用类似的分析系统评价。

(2)对于因子XIa的抑制活性

F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)用稀释液(如上所述)连续稀释以制备用于测定抑制活性的样品。同时，人因子XIa(American DiagnosticaInc.)用所述稀释稀释至750ng／mL，该溶液用作因子XIa溶液。人工合成底物S-2366(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)也用水稀释至5mM，该溶液用作S-2366溶液。

制备各试剂后，将10μL用于测定抑制活性的样品、60μL稀释液和10μL因子XIa溶液放入96孔微量滴定板(Nunc)的孔中。在37℃培养5分钟后，将20μL S-2366溶液加入孔中，培养在37℃继续进行另外30分钟。然后通过将100μL20％的乙酸溶液加入孔中而终止反应，测定波长为405nm的反应液的吸光率。

使用的对照物通过以下来制备：将70μL稀释液与10μL因子XIa溶液混合，混合物在37℃培养5分钟，将20μL S-2366溶液加入混合物中，在37℃培养30分钟，加入100μL20％的乙酸溶液。

图23中显示的结果展示了D2(3)的FXIa抑制活性。

F1031-13S-D2(3)的抑制活性通过使用类似的分析系统评价。

(3)对于弹性蛋白酶的抑制活性

F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)用稀释液(如上所述)连续稀释以制备用于测定抑制活性的样品。同时，已经溶解在500mM氯化钠／50mM乙酸钠(pH5.5)中并被冷藏的Elastase，Human Neutrophil(AthensResearch&Technology)用所述稀释液稀释至20μg／mL，该溶液用作弹性蛋白酶溶液。人工合成底物S-2484(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)用二甲亚砜稀释并在低温下保存，在用作S-2484溶液之前立即用水稀释至2mM。

制备各试剂后，将10μL用于测定抑制活性的样品、70μL稀释液和10μL弹性蛋白酶溶液放入96孔微量滴定板(Nunc)的孔中。在37℃培养3分钟后，将10μL S-2484溶液加入孔中，培养在37℃准确进行10分钟。然后通过将50μL20％的乙酸溶液加入孔中而终止反应，测定波长为405nm的反应液的吸光率。

对照物通过以下制备：将10μL弹性蛋白酶溶液与80μL稀释液混合而制备，混合物在37℃培养3分钟，加入10μLS-2484溶液，培养在37℃精确进行10分钟，加入50μL20％的乙酸溶液。图24中显示的结果证实保留了弹性蛋白酶的抑制活性。

融合蛋白质F1031-13S-D2(3)和F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)或F1024S-SLPI(D2)的抑制活性通过使用类似的分析系统评价。

(4)血浆激肽释放酶

F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)用稀释液(如上所述)连续稀释以制备用于测定抑制活性的样品。同时，来自人血浆的Kalliklein(Sigma-Al drich Co.)用所述稀释液稀释至20mU／mL，该溶液用作血浆激肽释放酶溶液。人工合成底物S-2302(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)用水也稀释至4mM，该溶液用作S-2302溶液。

制备各试剂后，将10μL用于测定抑制活性的样品、70μL稀释液和10μL血浆激肽释放酶溶液放入96孔微量滴定板(Nunc)的孔中。在37℃培养3分钟后，将10μL S-2302溶液加入孔中，培养在37℃继续进行另外30分钟。然后通过将50μL20％的乙酸溶液加入孔中而终止反应，测定波长为405nm的反应液的吸光率。

对照物通过以下制备：将10μL血浆激肽释放酶溶液与80μL稀释液混合，混合物在37℃培养3分钟，加入10μL S-2302溶液，在37℃培养30分钟，加入-50μL20％的乙酸溶液。结果显示在图25中。

F1031-13S-D2(3)的抑制活性通过使用类似的分析系统评价。

3-3)对于凝固的抑制活性的确认

(1)活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)在人和兔中的延长的确认

使用的正常人血浆是Dade Ci-Trol Level1(DADE BEHRINGINC.)。兔血浆如下获得：使用含有1／10体积3.8％柠檬酸钠(用于测定红细胞沉降率的柠檬酸钠，Iwaki Seiyaku Co.，Ltd.)的注射器由雄兔(New Zealand white，2.6～2.7kg，Kitayama Labes Co.，Ltd.)的耳动脉采集血液，并在4℃和3000rpm(05PR-22，Hitachi)下离心分离10分钟。

向113μL人血浆或兔血浆中，加入20μL F1024S-D2(3))溶液至最终浓度为0μg／mL、1.56μg／mL、3.13μg／mL、6.25μg／mL、12.5μg／mL、25μg／mL、50μg／mL和100μg／mL，将血浆放入血液凝固时间计(AMAXCS190，MC Medical，Inc.)中。由血液凝固时间计收集50μL，并在加入50μL APTT测定用试剂(DADE BEHRING INC.)且培养2分钟后，加入50μL25mM CaCl₂以测定凝固时间。结果发现F1024S-D2(3)浓度依赖性地延长了人和兔的APTT，并分别在浓度为9.06μg／mL和40.96μg／mL时将人和兔的APTT延长了1.5倍。

F1031-13S-D2(3)对于APTT的延长通过使用类似的分析系统进行评价。

(实施例4)体内功效的评价

4-1)融合蛋白质对于改善LPS诱导的家兔败血症模型的存活率的效果

准备LPS诱导的家兔败血症致死模型，并检验通过融合蛋白质的后施用对存活率的改善。

LPS诱导的家兔败血症模型根据Schimke等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：13875，1998)，通过以15μg／kg的剂量在0、5和24小时对家兔(New Zealand white，1.8～2.6kg，Kitayama Labes Co.，Ltd.)的耳静脉施用LPS(Salmonella Minnesota Re595，SIGMA)而准备。F1024S-D2(3)以1mg／kg的剂量在2、8和23小时施用于耳静脉。对照组被施用人免疫球蛋白而不是融合蛋白质。在施用后的48小时内监测存活率，绘制Kaplan-Meier存活曲线。结果发现相较于对照组施用F1024S-D2(3)改善了存活率。

在同一分析系统中，施用F1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)和F1024S-SLPI(D2)也具有改善存活率的作用。

4-2)融合蛋白质对于改善LPS诱导的家兔败血症模型的炎症及凝固参数的效果

准备LPS诱导的家兔败血症模型，并检验融合蛋白质的后施用对于炎症及凝固参数的效果。

LPS诱导的家兔败血症模型根据Schimke等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：13875，1998)，通过以10μg／kg的剂量在0、5和24小时对家兔(New Zealand white，1.8～2.6kg，Kitayama Labes Co.，Ltd.)的耳静脉施用LPS(Salmonella Minnesota Re595，S IGMA)而准备。F1024S-D2(3)以0.1mg／kg、1mg／kg和3mg／kg的剂量在2、8和23小时施用于耳静脉。对照组被施用3mg／kg的人免疫球蛋白而不是融合蛋白质。

在施用LPS之前和施用后1.5、25、26、28小时由耳动脉采集血液(添加柠檬酸)以测定炎症及凝固参数。

使用的炎症参数是白细胞计数和血浆TNF浓度，使用的凝固参数是血小板计数和血浆抗凝血酶III的活性。

白细胞计数通过Sysmex F-820(Sysmex Corporation)测定。TNF-α浓度通过夹心ELISA使用纯化的山羊抗兔TNF多克隆抗体(BDBiosciences)和生物素化的小鼠抗兔TNF-α单克隆抗体(BD Biosciences)测定。

抗凝血酶III的活性通过TESTZYM ATIII2试剂盒(Daiichi PureChemicals Co.，Ltd.)测定。

当测定的浓度等于或高于0.4ng／mL(夹心ELISA的检测限)时血浆中的TNF-α浓度评价为“阳性”，当测定值小于0.4ng／mL时为“阴性”。结果发现与对照组相比，被施用F1024S-D2(3)的组显示出对于白细胞计数降低(图27)、血浆中的TNF-α浓度增大(表4)、血小板计数降低(图28)和抗凝血酶III的活性降低(图29)的剂量依赖性的改善。这些结果证明通过F1024S-D2(3)改善了炎症及凝固参数。

在同一分析系统中，与对照组相比，施用F1031-13S-D2(3)的组显示对于白细胞计数降低、血浆中的TNF-α浓度增大、血小板计数降低和抗凝血酶III的活性降低的改善效果。

[表4]

表4：首次施用LPS后25小时在LPS诱导的家兔败血症模型的血浆中的TNF-α浓度

F1024S-D2(3)的剂量(mg/kg)	阳性率
		对照组	4/6
0.3	3／6
		1	1／／6
3	0／6

4-3)融合蛋白质对于改善LPS诱导的家兔败血症模型的血压降低的效果

准备LPS诱导的家兔败血症模型，并检验融合蛋白质的后施用对于改善血压降低的效果。

LPS诱导的家兔败血症模型根据Schimke等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：13875，1998)，通过以5μg／kg的剂量在0和5小时对家兔(New Zealand white，1.8～2.6kg，Kitayama Labes Co.，Ltd.)的耳静脉施用LPS(Salmonella Minnesota Re595，SIGMA)而准备。F1024S-D2(3)以1mg／kg的剂量在LPS的首次施用后2小时施用至耳静脉。对照组被施用1mg／kg的人免疫球蛋白而不是融合蛋白质。

在施用LPS之前和施用后4、6和8小时，插入颈动脉的导管与血压传感器(DT-XX，Japan BD Medical Systems)连接以测定平均动脉血压。结果发现，与对照组相比，施用F1024S-D2(3)的组显示出对血压降低的改善。

在同一分析系统中，与对照组相比，施用F1031-13S-D2(3)的组显示出对于血压降低的改善效果。

(实施例5)稳定制造抗体融合蛋白质的菌株的建立

5-1)表达用于制造F1024S-D2(3)或F1024D-D2(3)的菌株的质粒的构建

用于建立能够稳定制造F1024S-D2(3)或F1024D-D2(3)的菌株的表达质粒通过下述步骤构建。

实施例1中构建的表达F1024S-D2(3)的重链的质粒pTK-2370和表达F1024D-D2(3)的重链的质粒pTK-2368用EcoRI和KpnI分别消化以回收约为1.7kb的片段。具有小鼠DHFR表达单位和EF1α启动子的表达质粒pM1103(参见WO97／42319)也用EcoRI和KpnI消化以回收具有约7.9kb的片段。将通过消化表达重链的质粒获得的片段与通过消化pM1103获得的片段连接，用于制造生产菌的表达F1024S-D2(3)的重链的质粒pEFD2370和表达F1024D-D2(3)的重链的质粒pEFD2368通过本领域中常用的方法转化JM109感受态细胞而制造。同时，轻链表达质粒对F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)是相同的，该质粒通过下述步骤构建。用于短暂表达的质粒pTK-2344被BamHI消化，变为平末端，并用EcoRI进一步消化以回收0.7kb的片段。pM1103用KpnI消化，并在末端变平后用EcoRI消化以回收约7.9kb的片段。将通过消化pTK-2344获得的片段与通过消化pM1103获得的片段连接，用于制造生产菌的表达轻链的质粒pEFD2344通过本领域中常用的方法转化JM109感受态细胞而制造。

5-2)制造F1024S-D2(3)和F1024D-D2(3)的转化株的建立

实施例5-1)中构建的表达重链和轻链的质粒在DHFR基因缺失型CHO细胞中共转染以建立用于合成嵌合抗体融合蛋白质的CHO转化体。更具体地，来自包含HT培养基补充物(50x)Hybri-Max(SIGMA，在最终浓度为1x下使用)和200mM L-Glutamine(SIGMA，在最终浓度为4mM下使用)的EX-CELL325PF CHO(JRH Bioscience)的条件培养基的CHO DXB11在转染当天进行离心分离，并在培养瓶中以8x10⁶细胞／150Roux的浓度接种。12.5μg表达重链的质粒和12.5μg表达轻链的质粒(即，pEFD2370+pEFD2344，或pEFD2368+pEFD2344)根据FuGENE6所附方案通过使用125μLFuGENE6(Roche DiagnosticsK.K.)制备，并且它们如上所述在CHO DXB11中共转染。在37℃和5％CO₂的存在下培养2天后，收集细胞，并用包含4mM L-Glutamine的无HT的EX-CELL325PF CHO培养基(以下称为EX-CELL(HT-))洗涤所述细胞一次，然后用PBS^-洗涤一次，并再次悬浮在EX-CELL(HT-)中。接着，所述细胞以3,000细胞／孔～48,000细胞／孔重新接种在96孔板中，在37℃和5％CO₂的存在下培养所述细胞，培养基的一半用新的EX-CELL(HT-)以3天或4天的间隔置换。培养约1个月后，其中已经形成菌落的孔的细胞被移至新板，培养物上清液中嵌合抗体的量通过实施例2中描述的EIA步骤测定。获得上清液中嵌合抗体的表达已被确认的细胞作为制造嵌合抗体融合蛋白质的转化株。

5-3)使用氨甲喋呤的基因扩增

通过在包含氨甲喋呤(以下称为MTX)的EX-CELL(HT-)培养基上选择性地培养实施例5-2)中制造的表达嵌合抗体融合蛋白质的CHO转化株来进行基因扩增从而选择以高产率制造所关心的嵌合抗体融合蛋白质的克隆。

(1)CHO-F1024SC93t3L1的建立

在上述5-2)中制造的用于合成F1024S-D2(3)的转化株悬浮在包含1D0nM MTX的EX-CELL(HT-)培养基中，并接种在96孔板中，培养基的一半用包含100nM MTX的新鲜的EX-CELL(HT-)每3天或4天更换。培养在37℃和5％CO₂的存在下持续进行直至形成菌落。所得菌落通过EIA评价其表达，并选择不断合成的克隆。选定的克隆随后悬浮在包含300nM MTX的EX-CELL(HT-)培养基中，并植入96孔板以用于选择性培养。进行与使用100nM MTX的选择性培养类似的过程以由此获得具有约20倍高的生产率的转化株。通过使用具有3～10倍高的MTX浓度的培养物以重复进行选择性培养过程也可以获得具有更高生产率的克隆。

(2)CHO-F1024DC78u l的建立

上述5-2)中制造的用于合成F1024D-D2(3)的转化株以与实施例5-2)的步骤类似的步骤进行处理以制造具有更高生产率的菌株。使用MTX的选择性培养首先在MTX的浓度为100nM下进行，然后在浓度为1000nM下进行以由此获得制造F1024D-D2(3)的克隆，其浓度以EIA测定为约60μg／mL。

(实施例6)与F1024抗体结合所需的序列的分析

6-1)表达氨基酸取代型可溶性人类CD14的质粒的构建

为分析由F1024抗体识别的区域，制备表5中显示的31种氨基酸取代型可溶性人类CD14。应当注意具有的由可溶性CD14分子的N端计算的263rd Asn被Gln取代的1氨基酸取代型CD14被指定为“N263Q”，其他的1氨基酸取代型CD14以相同的方式指定。同时，294th Pro和296th Pro均被Ala取代的2氨基酸取代型CD14被指定为“P294／296A”。表达这些取代型CD14的质粒通过下述步骤构建。

首先，表达具有氨基酸取代型修饰sCD14(1～307)的质粒通过与在WO02／42333或US2004／0092712中描述的用于构建表达氨基酸取代型多肽的质粒时的方法类似的方法构建。例如，表达具有引入其中的P294H、P294／296A、Q295A或P296H的氨基酸取代型修饰sCD14(1～307)如下构建：设计表6中显示且编码氨基酸替代序列的引物组，并将该引物组用于PCR。编码氨基酸取代部位的密码子以粗体(下划线)显示(表6)。

然后，其中引入有氨基酸取代的DNA片段通过使用重组PCR而制造以构建表达可溶性人类氨基酸取代型CD14的质粒。更具体地，P294H、P294／296A、Q295A和P296H表达质粒通过下述步骤构建。合成正向引物S1(5’-GCG GCA GTA TGC TGA CAC GG-3’)、正向引物S2(5’-GAT AAC CTG ACA CTG GAC GGG AAT CCC TTC-3’)和正向引物S3(5’-GCC ATC CAG AAT CTA GCG CT-3’)；以及反向引物A1(5’-GAA GGG ATT CCC GTC CAG TGT CAG GTT ATC-3’)，反向引物A2(5’-ATT AGC CAG AAG TCA GAT GCT C-3’)和反向引物A3(5’-GGG CAT TGG CCA CAC CAG C-3’)。PCR通过使用用于模板的上述表达氨基酸取代型修饰sCD14(1～307)的质粒中的每一种并使用正向引物S1和A1进行。扩增产物通过电泳分离并纯化(PCR产物A)。PCR也可以通过使用用于模板的pCAG356，并使用正向引物S2和A2进行，扩增产物通过电泳分离并纯化(PCR产物B)。PCR还可以通过使用用于模板的PCR产物A与PCR产物B的混合物并使用正向引物S3和A3进行，PCR产物通过电泳分离并纯化(PCR产物C)。接着，PCR产物C用PvuII和KpnI消化，约为0.2kb的片段通过电泳分离并收集。同时，pCAG356用PvuII和KpnI被类似地消化，约为5.8kb的片段通过电泳收集，该片段与上述约为0.2kb的片段连接。E.coliXL1-Blue(STRATGENE)通过本领域中的普通方法转化，以制造所需的表达质粒。应当注意pCAG356是通过将来自在WO02／42333中描述的sCD14表达质粒pM1656的CD14基因(具有在GRI锚定部位引入的突变)插入pCAGGS中而制造的质粒(GENE，第15卷(1989)，第269-277页)。

[表5]

表5：氨基酸取代的可溶性人类CD14

[表6]

表6：引物序列

6-2)氨基酸取代型可溶性人类CD14的表达

将上面7-1)中制备的表达质粒通过下述步骤引入COS-1细胞。50μL FuGENE6(Roche Diagnostics K.K.)与12.5μg各种质粒DNA根据所附方案混合，将混合物加入在150cm²培养瓶中生长至semiconfluency的COS-1细胞中。所述细胞在37℃和5％CO₂的存在下培养3～4天，以用于表达上清液中的人类氨基酸取代型CD14。所述表达通过EIA使用WO02／42333中描述的CD14抗体确认。然后对表5中描述的除了N263Q、L276A、L283A、N288A和L290A之外的全部取代产物的表达进行确认。

6-3)氨基酸取代型可溶性人类CD14的纯化

可溶性人类氨基酸取代型CD14通过下述步骤纯化。上面6-2)中制造的培养物上清液流经固定有用于选择性吸附的抗人CD14抗体(3C10)的亲合性纯化柱(NHS-activated Sepharose4Fast Flow；AmershamBiosciences)，所述柱用10mM HCl洗脱。洗脱部分通过加入10xPBS^-(SIGMA)而立即中和至高于最终浓度两倍的浓度。所述溶液随后用生理盐水进行渗析，渗析液用作纯化样本。

6-4)用于F1024抗体的对比试验

对比试验通过下述步骤进行以确认各种可溶性人类氨基酸取代型CD14与F1024抗体的反应性。首先，可溶性CD14分子(356(CHO)；制造方法描述在下面的6-5)中)用PBS^-稀释至4μg／mL，并以50μL／孔放入96孔板(F8MaxiSorp；NUNC)中。在允许其在4℃静置一夜并用包含0.05％Tween20的PBS^-洗涤三次后，将包含2％StabilGuard的PBS^-(SurModics，Inc.)以200μL／孔加入孔中，溶液在37℃培养30分钟并在4℃储藏。同时，已在实施例6-3)中纯化的氨基酸取代型可溶性人类CD14用包含0.1％BSA的PBS^-稀释至2μg／mL～0.02μg／mL，HRP标记的F1024抗体用包含0.1％BSA的PBS^-稀释至2μg／mL，将稀释的HRP标记的F1024抗体与等量的人类氨基酸取代型CD14混合(25μL+25μL)。然后，将溶液由固定有可溶性CD14的板的各孔中排出，加入50μL／孔的氨基酸取代型CD14与HRP标记的F1024的混合溶液。在37℃培养2小时后，所述板用包含0.05％Tween20的PBS^-洗涤5次，并将50μL／孔的TMB溶液(BioFX)加入孔中作为发色底物。使反应在室温下进行5分钟，并通过添加50μL／孔的1M盐酸溶液而终止反应。用平板分光光度计测定450nm处的吸光率。

结果显示在图31中，其中涉及不添加氨基酸取代型CD-14的吸光率(100％)。在图31中，356(CHO)显示加入固定用可溶性CD14分子时的吸光率。

吸光率在氨基酸取代型CD14的许多情况中浓度依赖地下降，这证实它们与F1024抗体的结合可与356(CHO)竞争。然而，在P294H、P294／296A、Q295A和P296H的情况中，吸光率的下降并未被证实与其浓度无关，可以确定与F1024抗体的结合没有发生(图31)。这些结果证明CD14中的294th、295th和296th的Pro、Gln及Pro是与F1024抗体结合时的关键区域。

6-5)可溶性人类CD14分子(356(CHO))的制备

可溶性人类CD14分子(356(CHO))通过使用CHO细胞由下述步骤制备。

(1)表达质粒的构建

WO02／42333中描述的pM1656用HindIII消化，所述片段通过DNABlunting Kit(TAKARA BIO INC.)使末端变平。然后用XbaI消化，约为1.4kb的片段通过电泳分离并回收。具有小鼠DHFR表达单位和EF1α启动子的表达质粒用NotI消化，所述片段通过DNA BluntingKit(TAKARA BIO INC.)使末端变平。该片段随后用XbaI消化，约为8.0kb的片段通过电泳分离并回收。将来自pM1656的约为1.4kb的片段插入约为8.0kb的片段以用于连接，该片段然后用于转化E.coliJM109以由此制造表达质粒356(CHO)。

(2)表达356(CHO)的转化株的建立

该表达质粒被引入DHFR基因缺失型CHO细胞中以建立表达356(CHO)的转化株。更具体地，将50μL FuGENE6(Roche DiagnosticsK.K.)与12.5μg质粒DNA根据FuGENE6所附方案混合，并将混合物添加至在150cm²培养瓶中已通过使用包含10％失活的FBS的Ham’sF-12培养基(Invitrogen Corporation)而生长至semiconfluency的CHODXB11细胞。在37℃和5％CO₂的存在下培养一夜后，所述细胞在第二天通过使用胰蛋白酶进行分离和回收，并通过使用包含10％失活的渗析FBS的α-MEM(不包含核糖核苷或脱氧核糖核苷)(InvitrogenCorporation)(以下称为选择性培养基)将所述细胞再次植入96孔板中。培养。在37℃和5％CO₂的存在下持续进行，培养基的一半用新鲜的选择性培养基每3天或4天更换。连续培养3～4周后，将观察到菌落发育的孔中的细胞移至新板中，培养物上清液中制造的可溶性CD14的量通过使用WO02／42333中描述的CD14抗体的EIA分析。显示大量表达的编号为P3的克隆被建立为表达可溶性CD14的菌株。

(3)使用氨甲喋呤(MTX)的基因扩增

为增强356(CHO)的表达，在包含MTX的选择性培养基中进行P3克隆的选择性培养，由此通过基因扩增以增大其产量。更具体地，在实施例6-5)(2)中制造的P3克隆悬浮在包含15nM MTX的选择性培养基中，并将所述细胞植入10cm的培养皿中。所述培养基的一半每3天或4天用包含15nM MTX的新鲜的选择性培养基替换，培养在37℃和5％CO₂的存在下进行直至观察到菌落形成。所得菌落在板中进行传代培养，上清液中的356(CHO)的量通过EIA确认从而获得表达量增大的克隆P3-54。

(4)356(CHO)的制造和纯化

在上面的6-5)(3)中制造的P3-54克隆在选择性培养基中进行培养，上清液中表达的356(CHO)通过重复实施例6-3)的步骤被纯化。

(实施例7)抗体融合蛋白质(F1024S-D2)的UTI结构域2的修饰

7-1)F1024S-D2的UTI结构域2的修饰型的制备

例如，在用丙氨酸取代UTI结构域中15th精氨酸(表示为R15A)的情况中，设计并合成用于编码将引入突变的部位及其近旁的部位的约10个氨基酸的引物。

表7

[0134]

然后，通过使用用于模板的pTK-2355并使用每种引物对[IgG4-w和D2-R15A-s]及[pEF2ce-27和D2-R15A-a]再次进行PCR。将所得扩增产物混合并通过使用引物对[IgG4-w和pEF2ce-27](表8)再次进行PCR。

扩增产物用限制酶BamHI和NotI切割，并进行琼脂糖凝胶电泳。提取各片段后，通过T4DNA连接酶将它们与已由BamHI和NotI进行类似切割的pTK-2355的载体部分连接，以由此构建能够表达其中引入R15A突变的修饰F1024S-D2的重链的质粒(pTK-2730)。该质粒与轻链表达质粒(pTK-2344)在COS-1细胞中进行共转染以用于表达培养物上清液中的F1024S-D2(R15A)。确认上清液中的表达之后，表达产物用Prosep-A柱纯化。

通过使用类似的步骤，制备表9中显示的80个F1024S-D2的UTI结构域2的修饰型，并确认它们保留了与CD14抗原的结合能力。表9中显示的修饰UTI结构域2的氨基酸序列显示在图32～35中。

表8

引物名	碱基序列	SEQ ID
			IgG4-w	5’AATGTCTTCTCATGCTCCGTG3’	189
pEF2ce-27	5’CATCAATGTATCTTATCATCTCT3’	190

表9

经修饰的F1024S-D2的UTI结构域2	附图编号	SEQ ID
			pTK-2730(R15A)	32	27
pTK-2731(R15C)	32	28
			pTK-2732(R15D)	32	29
pTK-2733(R15E)	32	30
			pTK-2734(R15F)	32	31
pTK-2735(R15G)	32	32
			pTK-2736(R15H)	32	33
pTK-2737(R15I)	32	34
			pTK-2738(R15K)	32	35
pTK-2739(R15L)	32	36
			pTK-2740(R15M)	32	37

pTK-2741(R15N)	32	38
			pTK-2742(R15P)	32	39
pTK-2743(R15Q)	32	40
			pTK-2744(R15S)	32	41
pTK-2745(R15T)	32	42
			pTK-2746(R15V)	32	43
pTK-2747(R15W)	32	44
			pTK-2748(R15Y)	32	45
pTK-2824(R11S／R15I／Q19K／Y46D)	32	46
			pTK-2825(R11S／R15L／Q19K／Y46D)	32	47
pTK-2826(R11S／R15T／Q19K／Y46D)	32	48
			pTK-2827(R11S／R15V／Q19K／Y46D)	32	49
pTK-2866(R11S／R15T／Q19A／Y46D)	33	50
			pTK-2867(R11S／R15T／Q19C／Y46D)	33	51
pTK-2868(R11S／R15T／Q19D／Y46D)	33	52
			pTK-2869(R11S／R15T／Q19E／Y46D)	33	53
pTK-2870(R11S／R15T／Q19F／Y46D)	33	54
			pTK-2871(R11S／R15T／Q19G／Y46D)	33	55
pTK-2872(R11S／R15T／Q19H／Y46D)	33	56
			pTK-2873(R11S／R15T／Q19I／Y46D)	33	57
pTK-2874(R11S／R15T／Q19L／Y46D)	33	58
			pTK-2875(R11S／R15T／Q19M／Y46D)	33	59
pTK-2876(R11S／R15T／Q19N／Y46D)	33	60
			pTK-2877(R11S／R15T／Q19P／Y46D)	33	61
pTK-2878(R11S／R15T／Y46D)	33	62
			pTK-2879(R11S／R15T／Q19R／Y46D)	33	63
pTK-2880(R11S／R15T／Q19S／Y46D)	33	64

表10

经修饰的F1024S-D2的UTI结构域2	附图编号	SEQ ID
			pTK-2881(R11S／R15T／Q19T／Y46D)	33	65

pTK-2882(R11S／R15T／Q19V／Y46D)	33	66
			pTK-2883(R11S／R15T／Q19W／Y46D)	33	67
pTK-2884(R11S／R15T／Q19Y／Y46D)	33	68
			pTK-2889(R11S／R15T／F17A／Y46D)	34	69
pTK-2890(R11S／R15T／F17C／Y46D)	34	70
			pTK-2891(R11S／R15T／F17D／Y46D)	34	71
pTK-2892(R11S／R15T／F17E／Y46D)	34	72
			pTK-2893(R11S／R15T／F17G／Y46D)	34	73
pTK-2894(R11S／R15T／F17H／Y46D)	34	74
			pTK-2895(R11S／R15T／F17I／Y46D)	34	75
pTK-2896(R11S／R15T／F17K／Y46D)	34	76
			pTK-2897(R11S／R15T／F17L／Y46D)	34	77
pTK-2898(R11S／R15T／F17M／Y46D)	34	78
			pTK-2899(R11S／R15T／F17N／Y46D)	34	79
pTK-2900(R11S／R15T／F17P／Y46D)	34	80
			pTK-2901(R11S／R15T／F17Q／Y46D)	34	81
pTK-2902(R11S／R15T／F17R／Y46D)	34	82
			pTK-2903(R11S／R15T／F17S／Y46D)	34	83
pTK-2904(R11S／R15T／F17T／Y46D)	34	84
			pTK-2905(R11S／R15T／F17V／Y46D)	34	85
pTK-2906(R11S／R15T／F17W／Y46D)	34	86
			pTK-2907(R11S／R15T／F17Y／Y46D)	34	87
pTK-2932(R11A／R15T／Y46D)	35	88
			pTK-2933(R11C／R15T／Y46D)	35	89
pTK-2934(R11D／R15T／Y46D)	35	90
			pTK-2935(R11E／R15T／Y46D)	35	91
pTK-2936(R11F／R15T／Y46D)	35	92
			pTK-2937(R11G／R15T／Y46D)	35	93
pTK-2938(R11H／R15T／Y46D)	35	94
			pTK-2939(R11I／R15T／Y46D)	35	95
pTK-2940(R11K／R15T／Y46D)	35	96

pTK-2941(R11L／R15T／Y46D)	35	97
			pTK-2942(R11M／R15T／Y46D)	35	98
pTK-2943(R11N／R15T／Y46D)	35	99
			pTK-2944(R11P／R15T／Y46D)	35	100
pTK-2945(R11Q／R15T／Y46D)	35	101
			pTK-2946(R15T／Y46D)	35	102
pTK-2947(R11T／R15T／Y46D)	35	103
			pTK-2948(R11V／R15T／Y46D)	35	104
pTK-2949(R11W／R15T／Y46D)	35	105
			pTK-2950(R11Y／R15T／Y46D)	35	106

7-2)经修饰的F1024S-D2的弹性蛋白酶抑制活性

通过重复实施例3-2)(3)中的步骤对如上制备的F1024S-D2的80个修饰型和F1024-D2(3)评价其弹性蛋白酶抑制活性，不同之处在于在加入S-2484溶液后在37℃培养5分钟。结果确认来自下列表达质粒的融合蛋白质(经修饰的F1024S-D2)显示出与F1024S-D2(3)的弹性蛋白酶抑制活性相同的弹性蛋白酶抑制活性。

pTK-2730(R15A)，pTK-2737(R15I)、pTK-2739(R15L)、pTK-2740(R15M)、pTK-2745(R15T)、pTK-2746(R15V)、pTK-2866(R11S／R15T／Q19A／Y46D)、pTK-2867(R11S／R15T／Q19C／Y46D)、pTK-2868(R11S／R15T／Q19D／Y46D)、pTK-2869(R11S／R15T／Q19E／Y46D)、pTK-2870(R11S／R15T／Q19F／Y46D)、pTK-2871(R11S／R15T／Q19G／Y46D)、pTK-2872(R11S／R15T／Q19H／Y46D)、pTK-2873(R11S／R15T／Q19I／Y46D)、pTK-2874(R11S／R15T／Q19L／Y46D)、pTK-2875(R11S／R15T／Q19M／Y46D)、pTK-2876(R11S／R15T／Q19N／Y46D)、pTK-2877(R11S／R15T／Q19P／Y46D)、pTK-2878(R11S／R15T／Y46D)、pTK-2879(R11S／R15T／Q19R／Y46D)、pTK-2880(R11S／R15T／Q19S／Y46D)、pTK-2881(R11S／R15T／Q19T／Y46D)、pTK-2882(R11S／R15T／Q19V／Y46D)、pTK-2883(R11S／R15T／Q19W／Y46D)、pTK-2884(R11S／R15T／Q19Y／Y46D)、

pTK-2889(R11S／R15T／F17A／Y46D)、pTK-2890(R11S／R15T／F17C／Y46D)、pTK-2891(R11S／R15T／F17D／Y46D)、pTK-2892(R11S／R15T／F17E／Y46D)、pTK-2932(R11A／R15T／Y46D)、pTK-2893(R11S／R15T／F17G／Y46D)、pTK-2933(R11C／R15T／Y46D)、pTK-2895(R11S／R15T／F17H／Y46D)、pTK-2934(R11D／R15T／Y46D)、pTK-2896(R11S／R15T／F17I／Y46D)、pTK-2935(R11E／R15T／Y46D)、pTK-2897(R11S／R15T／F17L／Y46D)、pTK-2936(R11F／R15T／Y46D)、pTK-2898(R11S／R15T／F17M／Y46D)、pTK-2937(R11G／R15T／Y46D)、pTK-2899(R11S／R15T／F17N／Y46D)、pTK-2938(R11H／R15T／Y46D)、pTK-2900(R11S／R15T／F17P／Y46D)、pTK-2939(R11I／R15T／Y46D)、pTK-2901(R11S／R15T／F17Q／Y46D)、pTK-2940(R11K／R15T／Y46D)、pTK-2902(R11S／R15T／F17R／Y46D)、pTK-2941(R11L／R15T／Y46D)、pTK-2903(R11S／R15T／F17S／Y46D)、pTK-2942(R11M／R15T／Y46D)、pTK-2904(R11S／R15T／F17T／Y46D)、pTK-2943(R11N／R15T／Y46D)、pTK-2905(R11S／R15T／F17V／Y46D)、pTK-2944(R11P／R15T／Y46D)、pTK-2906(R11S／R15T／F17W／Y46D)、pTK-2945(R11Q／R15T／Y46D)、pTK-2907(R11S／R15T／F17Y／Y46D)、pTK-2946(R15T／Y46D)、pTK-2947(R11T／R15T／Y46D)、pTK-2948(R11V／R15T／Y46D)、pTK-2949(R11W／R15T／Y46D)、pTK-2950(R11Y／R15T／Y46D)、pTK-2824(R11S／R15I／Q19K／Y46D)、pTK-2825(R11S／R15L／Q19K／Y46D)、pTK-2826(R11S／R15T／Q19K／Y46D)、pTK-2827(R11S／R15V／Q19K／Y46D)

特别是，来自表达质粒pTK-2826(R11S／R15T／Q19K／Y46D)的融合蛋白质显示的50％抑制浓度为4.43μg／mL，与F1024S-D2(3)的50％抑制浓度8.90μg／mL形成对比，证明通过用苏氨酸取代D2(3)蛋白质的15th精氨酸可提供增强的蛋白酶抑制活性。

图36是描述融合蛋白质F1024-D2(4)(R11S／R15T／Q19K／Y46D)的全部氨基酸序列的视图。

(实施例8)抗体融合蛋白质(F1024S-凝血调节蛋白(TM)功能结构域)

8-1)F1024S-TM表达质粒的构建

为制造具有TM的各种功能结构域的抗CD14抗体(F1024S)的融合蛋白质，PCR通过使用用于模板的HeLa基因组DNA和引物对(TM-b和TM-g)进行，以扩增全部基因长度的人凝血调节蛋白(以下称为TM)，扩增产物通过TA克隆法在pT7-Blue载体中进行克隆。确认所述序列后，该质粒被制定为pT7-TM。

然后，PCR通过使用用于模板的pT7-TM和引物对(TMD123456和TM结构域2-Not1Bgl2)进行，在用限制酶BamHI和BglII切割由此扩增的片段并与预先制备的载体(通过用限制酶BamHI切割实施例1、表3中描述的pTK-2354，随后脱磷酸而制备)混合后，使用T4DNA连接酶连接所述片段以由此制造能够表达包含在其上添加的TM的氨基酸序列中具有227th半胱氨酸至462nd半胱氨酸的区域(Cys^227～Cys⁴⁶²)的F1024S的融合蛋白质(指定为F1024S-TM123456M)的重链的质粒pTK-2754。该步骤通过使用引物对(TMD123456和TM结构域3-Not1Bgl2)进行重复以制备能够表达具有其上添加的氨基酸序列的227th半胱氨酸至497th丝氨酸的区域(Thr²⁶³～Ser⁴⁹⁷)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM1234567M)的重链的质粒pTK-2755；通过使用引物对(TMD23456和TM结构域2-Not1Bgl2)以制备能够表达具有其上添加的氨基酸序列的263rd苏氨酸至462nd半胱氨酸的区域(Thr²⁶³～Cys⁴⁶²)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM23456M)的重链的质粒pTK-2756；通过使用引物对(TMD23456和TM结构域3-Not1Bgl2)以制备能够表达具有其上加入的263rd苏氨酸至497th丝氨酸的区域(Thr²⁶³～Ser⁴⁹⁷)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM234567M)的重链的质粒pTK-2757；通过使用引物对(TMD3456和TM结构域2-Not1Bgl2)以制备能够表达具有其上加入的306th谷氨酰胺～462nd半胱氨酸(Glu³⁰⁶～Cys⁴⁶²)的区域的融合蛋白质(指定为F1024S-TM3456M)的重链的质粒pTK-2758；通过使用引物对(TMD3456和TM结构域3-Not1Bgl2)以制备能够表达具有其上添加的306th谷氨酰胺～497th丝氨酸的区域(Glu³⁰⁶～Ser⁴⁹⁷)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM34567M)的重链的质粒pTK-2759；通过使用引物对(TMD456和TM结构域2-Not1Bgl2)以制备能够表达具有其上添加的345th缬氨酸～462nd半胱氨酸的区域(Val³⁴⁵～Cys⁴⁶²)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM456M)的重链的质粒pTK-2760；以及通过使用引物对(TMD456和TM结构域3-Not1Bgl2)以制备能够表达具有其上添加的345th缬氨酸～497th丝氨酸的区域(Val³⁴⁵～Ser⁴⁹⁷)的融合蛋白质(指定为F1024S-TM4567M)的重链的质粒pTK-2761。

同时，为防止由于TM的氧化而导致的活性下降，其中氨基酸序列中的388th蛋氨酸(Met³⁸⁸)已经被亮氨酸(Leu)取代的突变体(M388L)也可通过下述步骤(Clarke，JH.et al.，J.Biol.Chem.268，6309-6315(1993))制造，即，使用用于模板的pT7-TM和各引物对[TMD123456和TM(M388L)-a]及[TM结构域2-Not1Bgl2和TM(M388L)-s]进行PCR，将各扩增产物混合，并使用引物对(TMD123456和TM结构域2-NotlBgl2)再次进行PCR。编码包含M388L突变体的227th半胱氨酸～462nd半胱氨酸的区域(Cys²²⁷to Cys⁴⁶²)的基因片段由此扩增。如上所述，该片段用限制酶BamHI和BglII切割，并使用连接酶与载体连接以构建能够表达包含抗体分子F1024S(具有其上添加的包含M388L突变体的由227th半胱氨酸至462nd半胱氨酸的TM的区域(Cys²²⁷～Cys⁴⁶²))的融合蛋白质(指定为F1024S-TM123456L)的重链的质粒pTK-2762。最终构建的质粒是能够表达包含引入pTK-2755中的突变体M388的融合蛋白质的重链(F1024S-TM1234567L)的pTK-2763；能够表达包含引入pTK-2756中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM23456L)的重链的pTK-2764；能够表达包含引入pTK-2757中的突变体M388L的融合蛋白质指定为F1024S-TM234567L)的重链(的pTK-2765；能够表达包含引入pTK-2758中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM3456L)的重链的pTK-2766；能够表达包含引入pTK-2759中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM34567L)的重链的pTK-2767；和能够表达包含引入pTK-2760中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM456L)的重链的pTK-2768；以及能够表达包含引入pTK-2761中的突变体M388L的融合蛋白质(指定为F1024S-TM4567L)的重链的pTK-2769。

使用的引物序列显示在表10中，抗CD14抗体的融合蛋白质和表达质粒显示在表11中。

抗CD14抗体(F1024S)的融合蛋白质的氨基酸序列显示在图37～44以及序列表中。

图45是说明融合蛋白质F1024-TM23456L的全部氨基酸序列的视图。

[表11]

表10

[表12]

表11

F1024S融合蛋白质名称	质粒名称	附图编号	SEQ ID
				F1024S-TM123456M	pTK-2754	37	107
F1024S-TM123456L	pTK-2762	37	108
				F1024S TM1234567M	pTK-2755	38	109
F1024S-TM1234567L	pTK-2763	38	110
				F1024S-TM23456M	pTK-2756	39	111
F1024S TM23456L	pTK-2764	39	112
				F1024S-TM234567M	pTK-2757	40	113
F1024S-TM234567L	pTK-2765	40	114
				F1024S-TM3456M	pTK-2758	41	115
F1024S-TM3456L	pTK-2766	41	116
				F1024S-TM34567M	pTK-2759	42	117
F1024S-TM34567L	pTK-2767	42	118
				F1024S-TM456M	pTK-2760	43	119
F1024S-TM456L	pTK-2768	43	120
				F1024S-TM4567M	pTK-2761	44	121
F1024S-TM4567L	pTK-2769	44	122

这些质粒与轻链表达质粒(pTK-2344)在COS-1细胞中共转染以表达培养物上清液中的F1024S-TM。该上清液使用Prosep-A柱纯化以用于随后的分析。

使用EIA进行的结合测试确认所述融合蛋白质具有对于CD14抗原的结合活性。

8-2)凝血调节蛋白(TM)活性的测定

利用凝血调节蛋白(TM)与血液中的凝血酶形成复合体以激活作为用于该活性指标的凝血抑制因子的蛋白质C的作用可测定TM活性。测定如下进行。

用于活性测定的反应在复式管中进行。所述融合蛋白质用包含0.14mol／L氯化钠、10mmol／L氯化钙和1mg／mL牛血清白蛋白(pH7.4)的25mmol／L Tris-HCl缓冲液稀释。向40μL样品中加入10μL6U／mL人凝血酶(SIGMA)，并在37℃预培养10分钟。然后，加入10μL24μg／mL蛋白质C(American Diagnostica Inc.)，所得混合物在37℃培养5分钟。加入40μL0.15U／mL抗凝血酶III(Green Cross Corporation)与15U／mL肝素(Mochida Pharmaceutical Co.，Ltd.)的混合物，并将该混合物在37℃培养10分钟。加入100μL3.2mmol／L活化蛋白质C底物S-2366(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)，将混合物在37℃培养10分钟后，所述反应通过添加200μL50％的乙酸而终止。将300μL反应溶液转移至96孔平板中，使用平板读取器(Molecular DevicesCorporation)测定405nm处的吸光率。人凝血调节蛋白MR-33(MochidaPharmaceutical Co.，Ltd.)用于正控制。结果发现所有的F1024S-TM融合蛋白质均具有促进蛋白质C活化的活性，而且F1024S-TM23456M、F1024S-TM234567M、F1024S-TM23456L和F1024S-TM234567L具有促进促进蛋白质C活化的高活性。M388L突变体也显示了相对高的活性(图46)。

(实施例9)抗体融合蛋白质(F1024S-SLPI)中的连接蛋白质的变化

9-1)表达质粒的构建

将连接物SG-4-s(5’pGATCTGGAGGTGGAG3’，具有磷酸化的5’端)与连接物SG-4-a(5’pGATCCTCCACCTCCA3’，具有磷酸化的5’端)混合，并将混合物在96℃培养2分钟。温度逐渐降至室温以用于退火。将足够量的混合物与预先制备的载体片段(通过用限制酶BglII切割实施例1中描述的pT7-SLPI(D2)，脱去磷酸，进行琼脂糖凝胶电泳并由凝胶中提取片段而制备)混合，并通过T4DNA连接酶连接所述片段。通过该过程，构建包含具有其上添加的1个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的质粒pTK-2729。该pTK-2729用限制酶BglII切割，并通过重复上述过程，构建包含具有其上添加的2个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的pTK-2749和包含具有其上添加的3个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的pTK-2750。

接着，pTK-2729、pTK-2749和pTK-2750用限制酶BglII和NotI切割以制备编码加上SLPI(D2)的所述连接物的一部分的基因片段(所得片段被分别指定为片段1、片段2和片段3)。正如在实施例1中构建pTK-2396的情况(表3)，将基因片段A与D通过T4DNA连接酶进行片段连接以构建表达具有修饰连接物，在抗体分子与SLPI(D2)之间分别具有连接物GSGGGGS、GSGGGGSGGGGS和GSGGGGSGGGGSGGGGS的F1024S-SLPI(D2)的重链的质粒(分别指定为pTK-2751、pTK-2752和pTK-2753)。

这些质粒与轻链表达质粒(pTK-2344)在COS-1细胞中共转染以表达培养物上清液中具有修饰连接物的F1024S-SLPI(D2)，上清液通过Prosep-A柱纯化。

全部纯化产物均被确认具有对CD14抗原的结合活性。

表12和13显示引物对和连接物的SEQ ID NOS。

[表13]

表12

引物名称	碱基序列	SEQ ID
			连接物SG-4-s	5’pGATCTGGAGGTGGAG3’	201
连接物SG-4-a	5’pGATCCTCCACCTCCA3’	202

[表14]

表13

连接物序列	SEQ ID
		GGGGS	203
GSGGGGS	204
		GSGGGGSGGGGS	205
GSGGGGSGGGGSGGGGS	206

9-2)F1024S-SLPI的弹性蛋白酶抑制活性

通过重复实施例3-2)(3)的步骤来评价1024D-SLPI(D1D2)、F1024D-SLPI(D2)、F1024S-SLPI(D1D2)和F1024S-SLPI(D2)，以及具有其上添加的1、2或3个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的融合蛋白质的弹性蛋白酶抑制活性，不同之处在于加入S-2484溶液后在37℃培养5分钟。

对照组如下制备：将10μL弹性蛋白酶溶液与80μL稀释液混合，在37℃培养3分钟，加入10μLS-2484溶液，在37℃精确培养5分钟，之后加入50μL20％乙酸溶液。F1024S-SLPI(D1D2)和F1024S-SLPI(D2)的50％抑制浓度分别为22.5μg／mL和26.9μg／mL，具有其上添加的1、2和3个GGGGS连接物复本的SLPI(D2)的融合蛋白质的50％抑制浓度分别为11.6μg／mL、11.9μg／mL和11.6μg／mL。

(实施例10)人源化抗体(hF1024S-D2(3))的制备

在数据库中寻找大鼠抗体F1024-1-3的重链及轻链可变区的氨基酸序列，这些序列被分别确定与人抗体IGHV7-81(BC032733)和HUMIGRFFM(L48242)具有很高的同源性。因此，通过将抗体F1024的轻重链的3个互补决定区(CDR)植入(1)IGHV7-81和HUMIGRFFM(以下称为RF)或(2)已经通过晶体结构分析进行彻底分析的NEW、Eu和REI(参见图47)的各框架(FR)中可进行人源化。基于各氨基酸序列(图48)设计核苷酸序列，通过将核苷酸序列分为数个部分并对其进行分析而制备全部6个基因片段。各片段用重链pTK-2370和轻链pTK-2344的可变区替换以构建表达质粒(重链：pTK-2887用于IGHV7-81-HA，pTK-2679用于NEW-HA，pTK-2685用于Eu-HA；轻链：pTK-2955用于RF-KA，pTK-2680用于REI-KA，pTK-2681用于Eu-KA)。COS-1细胞与该质粒和嵌合抗体表达质粒(pTK-2370用于重链，pTK-2344用于轻链)的各种组合体共转染，对于上清液中分泌的抗体比较其与GPVI抗原的结合活性。

关于重链，在所有情况中均发现由于人源化而导致的表达量的明显下降。考虑到该状况，将各种突变体引入FR中，并对结果进行检测。同时，证实了对于轻链的表达和结合活性。

对于三种人源化重链表达质粒，通过构建大量突变体，其中FR中的人特异性序列的一部分恢复为来自大鼠的序列，并分析这样的构建体可以最终获得维持表达和结合活性的序列(pTK-2909用于IGHV7-81-HC，pTK-3007用于IGHV7-81-HX，pTK-2803用以NEW-HB，pTK-2811用于Eu-HB)(图49显示了所述氨基酸序列)。

最后，检测人源化重链和人源化轻链的组合，显示了最高表达与结合活性的组合是IGHV7-81-HX与RF-KA或其他轻链的组合。

其他抗体融合蛋白质的抗体部分通过类似的步骤人源化。

(实施例11)能够以高产率稳定制造抗体融合蛋白质F1024S-D2(3)的菌株的制造

1-1能够以高产率稳定表达F1024S-D2(3)的质粒(pTK-2671)的制造

通过使用用于模板的、表达F1024S-D2(3)的重链的短暂表达质粒(实施例1中描述的pTK-2370)并使用表14中所示的引物对(F1024H-kozak，IgG4-1)进行PCR。扩增产物用限制酶EcoRI和NheI切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取包含抗体F1024的重链可变区的基因片段(片段U)。使用的引物对的SEQ ID NOS显示在表14中。

[表15]

表14

引物名称	碱基序列	SEQ ID
			F1024H-kozak	5’GGGGAATTCGCCGCCACCATGGATTGGTTGTGGAA3’	207
IgG4-1	5’GCTGTGCTCTCGGAGGTGCT3’	208

pTK-2370用限制酶NheI和Sse8387I切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取包含F1024S-D2(3)的重链恒定区、编码D2(3)的基因序列和SV40polyA信号的基因片段(片段V)。表达F1024的轻链的质粒(实施例1中描述的pTK-2344)用限制酶BsiWI和NcoI切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取包含抗体F1024的轻链可变区的基因片段(片段W)。

包含EF启动子、人轻链恒定区和小鼠DHFR表达单位(包含SV40启动子(不包括增强子区域)作为启动子，和来自SV40的polyA信号)的质粒(pTK-2577)用限制酶BsiWI和EcoRI切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取所关心的载体片段(片段X)。同时，该质粒也用Sse8387I和NcoI切割，并在琼脂糖凝胶电泳后提取包含EF启动子区域的基因片段(片段Y)。

基因片段U至Y使用T4DNA连接酶(TAKARA BIO INC.)连接为一个片段以构建稳定表达质粒(pTK-2671)，该质粒能够同时表达F1024S-D2(3)的重链和轻链，并且包含小鼠DHFR表达单位用作已将所述质粒引入其中的细胞中的标记。

通过使用类似的步骤，也可以构建用于其他抗体融合蛋白质的能够以高产率进行稳定表达的质粒。

(实施例12)功效(体外)的评价

12-1)对于舒缓激肽合成的抑制作用的确认

(1)对于由APTT试剂诱导的人及兔血浆中舒缓激肽的合成的抑制作用的确认

使用的正常人血浆是Dade Ci-Trol Level1(DADE BEHRINGINC.)。兔血浆如下制备：使用含有1／10体积3.8％柠檬酸钠(用于测定红细胞沉降率的柠檬酸钠，Iwaki Seiyaku Co.，Ltd.)的注射器由雄兔(New Zealand white，Kitayama Labes Co.，Ltd.)的耳动脉采集血液，并在4℃和3000rpm(05PR-22，Hitachi)下将血液离心分离10分钟。向80pL人或兔血浆中加入邻二氮杂菲溶液后，加入已经被稀释液连续稀释的F1024S-D2(3)溶液至最终浓度为0μg／mL、1μg／mL、3μg／mL、10μg／mL和30μg／mL，或者加入人免疫球蛋白(hIg)至最终浓度为30μg／mL。搅拌后血浆在37℃培养10分钟。将80μL用Milli-QWater稀释的APTT试剂加入，血浆进一步在37℃培养10分钟。收集100μL血浆，并加入20μL舒缓激肽测定用试剂盒(Markit-Mbradykinin，Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)所附的脱蛋白质剂，该血浆在4℃和10000rpm(MRX-150，TOMY)下离心分离10分钟。通过使用舒缓激肽测定用试剂盒测定所得上清液的舒缓激肽浓度。结果发现F1024S-D2(3)浓度依赖性地抑制了由APTT试剂诱导的人及兔血浆中的舒缓激肽的合成(图51和51)。

12-2)对于凝固抑制作用的确认

(1)对于由凝血调节蛋白诱导的人血浆中的凝血酶的合成的抑制作用(因子XI依赖地)的确认

向包含人血小板为3x10⁵／μL的人血浆和包含兔血小板为3x10⁵／μL的兔血浆中，加入F1024S-D2(3)溶液至最终浓度为0μg／mL、3μg／mL、10μg／mL、30μg／mL、100μg／mL和300μg／mL，或者加入人免疫球蛋白(hIg)至最终浓度为300μg／mL。血浆然后在37℃预培养10分钟。加入用25mmol／L CaCl₂溶液稀释8000倍的凝血调节蛋白(Simplastin Exel，BIOMERIEUX，INC.)的溶液后在37℃开始培养。在加入凝血调节蛋白溶液之前和加入凝血调节蛋白溶液之后收集5μL培养液，并加至100μL Buffer B(50mmol／L T ris-HCl缓冲液(pH7.9)，包含0.5mg／mL BSA、0.1mol／L NaCl和20mmol／L EDTA)与25μtL2mmol／L S-2238的混合物中，所述混合物在37℃培养10分钟。加入100μL50体积％乙酸后，将反应液以200μL／孔添加至96孔板，并通过平板读取器(Thermomax microplate reader，Molecular DevicesCorporation)测定405nm处的吸光率。结果发现F1024S-D2(3)浓度依赖性地抑制了由凝血调节蛋白诱导的人及兔血浆中的凝血酶的合成(图52～53)。

12-3)凝固抑制作用的确认

(1)人ATPP延长作用的确认

通过与实施例3-3)(1)的步骤类似的步骤，使用人类正常人血浆，分别评价最终浓度为2.00μg／mL、2.00μg／mL、1.95μg／mL和2.29μg／mL的实施例8中制备的F1024S-TM23456M、F1024S-TM23456L、Fl024S-TM234567M和F1024S-TM234567L的APTT延长作用。结果，APTT通过所述4个融合蛋白质被分别延长了26％、32％、42％和57％。

(实施例13)体外测试的功效评价

13-1)F1024S-D2(3)的抗炎作用的确认

将10mg／kg F1024S-D2(3)由耳静脉施用于家兔(New Zealandwhite，1.8～2.6kg，Kitayama Labes Co.，Ltd.)，并随着柠檬酸的加入采集血液。将LPS(WE.coli055：B5，DIFCO)加入所采集的血液中至最终浓度为1ng／mL，血液在37℃培养4小时。在4℃和10000rpm(MRX-150，TOMY)下离心分离血液10分钟，所得血浆通过ELISA使用抗兔TNF-α抗体测定其TNF-α浓度。结果发现直到施用F1024S-D2(3)后24小时为止LPS刺激的血液中的TNF-α的合成被抑制(图54)。

13-2)F1024S-D2(3)的抗凝血作用的确认

通过在采集血液后立即进行离心分离而获得的实施例13-1)中的血浆用于活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的测定。APTT的测定通过重复实施例3-3)的步骤进行。结果发现直到施用F1024S-D2(3)后8小时为止APTT被延长(图55)。

(实施例14)体内功效的评价

14-1)家兔CLP(盲肠结扎穿孔)样本

制造家兔CLP(盲肠结扎穿孔)腹膜炎样本，确认施用F1024S-D2(3)后存活率和凝固参数的改善。

盲肠结扎穿孔致家兔腹膜炎样本如下制取：利用Keith，A等的方法(Journal of Surgical Research，29：189，1980)，在麻醉下刺穿家兔(NewZealand white，1.8～2.6kg，Kitayama Labes Co.，Ltd.)的盲肠，并将盲肠内容物喷洒在腹腔中。2小时后，将10mg／kg F1024S-D2(3)施用至耳静脉，之后，F1024S-D2(3)施用3天，每天2次。对照组被施用人免疫球蛋白(hIg)以代替F1024S-D2(3)。检测存活率并记录72小时以绘制Kaplan-Meier存活曲线。盲肠结扎穿孔后8小时，采集添加有柠檬酸的血液，测定D二聚物作为血浆的凝固参数。结果发现相比于对照组，施用了F1024S-D2(3)的组的存活率(图56)和D二聚物(图57)均得到改善。

图56和57的对照组的概要描述显示在表15中。

[表16]

表15

Claims (24)

1.一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(II)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是蛋白质抑制剂。

3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是多价酶抑制剂。

4.如权利要求1～3中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血因子(凝血蛋白酶)或炎性蛋白酶。

5.如权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是FXa和／或FXIa。

6.如权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血酶。

7.如权利要求1～6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI。

8.如权利要求1～6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白。

9.如权利要求1～6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI结构域2。

10.如权利要求1～8中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白的功能结构域，尤其是EGF样结构域。

11.如权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是弹性蛋白酶。

12.如权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。

13.如权利要求1～11中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是具有1～4个氨基酸取代的UTI结构域2的突变体。

14.如权利要求1～13中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是具有中和活性的抗体。

15.如权利要求1～14中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是识别人类CD14的氨基酸号269～315的至少一部分的抗体。

16.如权利要求1～15中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是嵌合抗体。

17.如权利要求1～16中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是人源化抗体。

18.如权利要求1～17中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是下述抗体：该抗体包含表2中所描述的重链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3，或表2中所描述的轻链的CDR1、CDR2和CDR3作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3。

19.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1～18中任一项所述的蛋白质的至少一部分。

20.一种载体，所述载体包含如权利要求19所述的多核苷酸。

21.一种细胞，所述细胞包含如权利要求19所述的多核苷酸或如权利要求20所述的载体。

22.一种方法，所述方法用于制造如权利要求1～18中任一项所述的蛋白质，该方法使用如权利要求19所述的多核苷酸、如权利要求20所述的载体和如权利要求21所述的细胞中的至少一种。

23.一种疾病的预防和／或治疗剂，所述疾病的预防和／或治疗剂包含如权利要求1～18中任一项所述的蛋白质、如权利要求19所述的多核苷酸、如权利要求20所述的载体和如权利要求21所述的细胞中的至少一种。

24.如权利要求23所述的预防和／或治疗剂，其中，所述疾病是败血症、严重败血症或败血病性休克、SIRS相关疾病、内毒素休克或ARDS。

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