CN108026161A - 胶原蛋白v衍生片段的抗血管生成特性 - Google Patents

胶原蛋白v衍生片段的抗血管生成特性 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列的肽作为药物的用途，尤其是用作FGF‑2诱导的血管生成的抑制剂的用途，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。

Description

胶原蛋白V衍生片段的抗血管生成特性
技术领域
本发明涉及血管生成过程领域，尤其是FGF-2诱导的血管生成。本发明更具体地涉及在癌症治疗领域抑制血管生成过程。
背景技术
血管生成(新血管生长的过程)在发育、繁殖和修复中至关重要。然而，病理性血管生成不仅发生在肿瘤形成中，而且发生在可被归类为“血管生成依赖性疾病”的一系列非肿瘤性疾病中。
血管生成在肿瘤生长和转移中起关键作用。事实上，血管生成因子在肿瘤中过表达。已经开展了大量努力来开发用于癌症治疗的抗血管生成策略。
专利申请US 2014/0100164描述了呈现抗血管生成活性的肽。从三个人类蛋白家族中鉴定出与抗血管生成活性相关的一般肽基序：包含I型血小板反应蛋白结构域的蛋白质、CXC趋化因子和胶原蛋白。从IV型胶原蛋白发出的肽被鉴定为呈现抗血管生成活性。
专利申请US 2013/0316950还描述了衍生自胶原蛋白IV的肽及其用于限制癌症中血管生成的用途。
血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成现象中起核心作用。因此，已经研究了选择性靶向VEGF及其受体的制剂，并且已经在临床试验中显示出有希望的活性。特别地，已经开发了名称为知的抗血管生成药物。
然而，在临床前和临床两个环境中，这些治疗的益处最多是短暂的，之后是恢复肿瘤生长和进展。事实上，似乎有些患者最终会对这些药物产生耐药性。对这种耐药性提出的一个机制是在肿瘤组织中其他促血管生成因子，特别是成纤维细胞生长因子2(FGF-2)的上调。
FGF-2，也称为βFGF、FGF2、FGF-β或碱性成纤维细胞生长因子，属于肝素结合成纤维细胞生长因子家族。FGF-2通过两种不同类型的受体，高亲和力酪氨酸激酶受体(FGFR)和低亲和力硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)与细胞表面和细胞外基质中存在的内皮细胞相互作用。在正常组织的伤口愈合期间和肿瘤发育期间，FGF-2作用于内皮细胞。当VEGF途径被抗血管生成药物阻断时，观察到FGF-2上调，其允许肿瘤血管形成和再生长。
为了防止这种“肿瘤逃逸”抗VEGF治疗，研究聚焦于开发新的抗血管生成的方法和药物，特别是针对FGF-2介导的血管生成。
已经显示FGF-2拮抗剂长-五聚蛋白3(PTX3)以高亲和力和特异性结合FGF-2。直接靶向FGF-2的衍生自PTX3的合成肽显示出抗血管生成活性(Alessi等，2009)。
已经努力以鉴定显示出显著和特异性的抗FGF-2介导的血管生成活性的其它合成肽。
发明简述
出乎意料地，发明人现在已经鉴定出可以用作药物的源自人胶原蛋白Vproα1链的肽。
所述肽可以用作特别是用于治疗癌症的药物，尤其是作为FGF-2诱导的生物作用的抑制剂，更尤其是作为FGF-2诱导的血管生成过程的抑制剂。实际上，当向动物或患者施用时，该肽呈现特异性的抗血管生成特性。
所述肽的特征是包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。
所述肽衍生自胶原蛋白V的α1链的片段[Ile824-Pro950]，为了更清楚，完整链α1(V)(pro-α1(V)链)中的氨基酸编号是保守的。
在一个具体的实施方案中，所述肽是之前被描述为结合肝素的肽的肽“HEPV”，其是胶原蛋白V pro-α1链的12kDa片段，由残基Ile824-Pro950组成(Delacoux等，1998；Delacoux等，2000；Ricard-Blum等，2006)。
包含所述肽的药物组合物和成套试剂盒也是本申请的目的。
以下也是本发明的目的：与可检测标记偶联的包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列[Ile824-Pro950]具有至少85％一致性的氨基酸序列，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。
本申请还涉及用于成像动物或人个体的血管生成部位的方法，包括检测之前已向所述动物或所述人个体施用的如上定义的肽的标记的步骤。
附图说明
图1.衍生自链proα1(V)的肽HEPV的结构。
A.前胶原蛋白V异源三聚体[α1(V)]2α2(V)的结构。CRR，富含半胱氨酸的重复结构域；VR，可变区；TSPN，血小板反应蛋白N末端样结构域。
B.proα1(V)和proα2(V)链的结构。黑条代表位于小三螺旋结构域和主要三螺旋结构域之间的非胶原结构域(NC2)。
C.片段HEPV的氨基酸序列。碱性残基精氨酸和赖氨酸以粗体表示。负责肝素结合的序列以下划线示出。
图2.HEPV刺激胶原蛋白IV和XVIIIα1链的表达。
通过实时PCR分析用HEPV处理4、12和24小时的人皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)中COL14A1和COL18A1mRNA的表达。将值归一化至管家基因L30。定量以相对于对照(在不存在HEPV的相同条件下培养的细胞)表示。值是平均值±SEM(n＝3)。
图3.从肽HEPV制备非功能性突变体，HEPV-ΔHBS。
A.HEPV-ΔHBS的SDS PAGE分析。泳道1，含有重组HEPV-ΔHBS的大肠杆菌(E.coli)裂解物。泳道2，阳离子交换层析之后的含有HEPV-ΔHBS的部分。泳道3，第二步用阳离子交换层析纯化之后的纯化的含有HEPV-ΔHBS的部分。
B.HEPV和HEPV-ΔHBS对肝素的亲和性。被突变为丙氨酸的HEPV碱性残基用下划线表示。仅示出含有肝素结合位点的片段的区域G901-P923。将纯化的HEPV和HEPV-ΔHBS通过肝素-琼脂糖亲和层析，并用NaCl梯度洗脱(虚线)。HEPV用0.35M NaCl洗脱，而HEPV-ΔHBS用0.2M NaCl洗脱。
图4.HEPV抑制内皮细胞中FGF-2诱导的ERK1/2和Akt磷酸化。在HEPV或HEPV-ΔHBS存在下，用FGF-2(A)或VEGF(B)处理的内皮细胞裂解物中使用针对ERK1/2、p-ERK1/2、Akt和p-Akt的抗体的蛋白印迹和定量。用特异性抗体检测磷酸化的p-ERK1/2和p-Akt蛋白。
图5.HEPV作用于小鼠的血管形成。
(A)荧光肽HEPV或HEPV-ΔHBS识别血管生成部位的能力。将用FGF-2或PBS浸渍的海绵植入裸鼠。静脉注射Alexa700标记的荧光肽后，使用2D荧光反射成像(见箭头)定量其在海绵的血管生成区域的积累。然后在200ms期间计算海绵中发出的荧光的相对强度，并表示为参考光单位(RLU)。
(B)在植入用FGF-2或PBS浸渍的海绵的裸鼠中的新血管形成。用肽HEPV或HEPV-ΔHBS反复处理后，提取海绵并定量血红蛋白的存在。血红蛋白的存在反应了照片所记载的血管含量。
图6.HEPV影响裸鼠中植入肿瘤的肿瘤生长。
(A)从第5天开始，每2天通过肿瘤周围注射含有50μg对照(HEPV-ΔHBS)或HEPV肽的50μl PBS反复处理皮下植入的鼠Tsa/Pc乳腺癌细胞。可以观察到，在HEPV处理的动物中肿瘤生长明显减慢(p＜0.05)。使用检测血管的抗CD31抗体(B)或染色增殖细胞的抗Ki67抗体(C)免疫染色肿瘤切片。
在使用肽HEPV处理期间，裸鼠中植入的乳腺肿瘤中的新血管形成被抑制，特别是在头20天内。同样，这种处理减少增殖肿瘤细胞的数量。
发明详述
本说明书中使用的所有技术术语是本领域技术人员公知的，并且在Sambrook等人的名为《Molecular Cloning：a Laboratory Manual》的参考手册中被广泛定义。
本发明涉及用作药物的包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列的肽，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。
残基根据它们在如SEQ ID NO：5所示的包含1838个残基的胶原蛋白V的proα1(V)链的完整序列中的位置来编号。
序列SEQ ID NO：1表示衍生自人胶原蛋白proα1(V)链的肽的序列，其包含从第824位的异亮氨酸开始到第950位的脯氨酸结束的127个残基，如SEQ ID NO：5的下划线所示。
短语“与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列”是指与参考序列具有85％氨基酸一致性的候选序列。这要求在比对后，候选序列中85％的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸相同。
“氨基酸一致性”是指在两个序列中均观察到的相同氨基酸。一致性不考虑可能出现在氨基酸上的翻译后修饰，例如认为羟基化脯氨酸与非羟基化脯氨酸相同。
根据本发明的一致性借助于计算机分析，例如ClustalW计算机比对程序及其建议的默认参数来确定。可从网页http：//www.clustal.org/clustal2/获得ClustalW软件。通过使用该程序及其默认设置，比对查询多肽和参考多肽的部分。计数完全保守的残基数量，并除以参考多肽的长度。
术语“至少85％”表示两个序列(查询多肽和序列为SEQ ID NO：1的参考多肽)的一致性百分比为至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
具体地，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列显示与SEQ ID NO：1至少90％的一致性。
具体地，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列显示与SEQ ID NO：1至少95％的一致性。
具体地，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列显示与SEQ ID NO：1至少98％的一致性。
根据本发明，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列存在以下保守残基：Lys905、Arg909和Arg912。这些残基对于肽的特异性和活性是必需的且不能被改变，因为有改变肽的特异性和/或活性的风险。
在本发明的一个实施方案中，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列存在以下保守残基：Lys905、Arg909、Arg91、Arg918和Arg921。涉及肝素结合位点的这些氨基酸的存在可能对于肽作为药物的活性也是重要的。
不希望束缚于理论，发明人已经观察到，根据本发明的肽特异性结合肝素和硫酸乙酰肝素，这两个分子均涉及细胞-基质相互作用(Delacoux等，2000；Ricard-Blum等，2006)。如果结合位点消失或不再具有功能，FGF-2信号途径被抑制，如实施例部分所示。
短语“用作药物”是指所述肽在治疗，尤其是人的治疗中的用途。
“药物”与“药品”、“药剂”、“药”或“医药产品”是同义词，是指意欲内用或外用的用于治愈、治疗或预防疾病的活性化合物。
出乎意料地，发明人已经鉴定可以用作药物的作为活性化合物的之前所述的肽。有利地，所述肽对动物或人是无毒的，因为在注射入血液系统后，它不会在肝中积累。
肽的用途
根据第一个实施方案，根据本发明的肽用作靶细胞上FGF-2诱导的生物作用的抑制剂。该实施方案可在体内或体外进行。
术语“抑制剂”是指肽的作用模式，其降低或甚至抑制FGF-2对其靶细胞的生物活性。具体地，一般观察到的FGF-2的生物作用被降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，在一个优选的实施方案中，FGF-2对靶细胞的生物作用被100％抑制，即它们被完全抑制。
短语“靶细胞上FGF-2诱导的生物作用”是指由足够量的FGF-2的存在特异性诱导的所有生物作用。主要作用是形成新血管，但FGF-2也在调节骨矿化中起作用。
FGF-2的靶细胞是表达能够结合因子FGF-2且将信号传递至细胞的受体的细胞。目前已经鉴定了两类受体，高亲和力酪氨酸激酶受体(FGFR)和低亲和力硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)。靶细胞主要是内皮细胞，但也有心肌细胞和成骨细胞相关细胞。
FGF-2涉及多种生理功能，因此作为FGF-2诱导的生物作用的抑制剂的肽可用于治疗数种疾病，特别是治疗：多形性成胶质细胞瘤、心力衰竭、阿尔茨海默病、肾小球硬化和具有髓样化生的骨髓纤维化。
多形性成胶质细胞瘤(GBM)是中枢神经系统肿瘤的最恶性形式，目前的疗法在治疗该癌症方面几乎无效。它也是最高血管化的癌症之一。GBM细胞分泌FGF-2增强内皮细胞的血脑屏障功能，这也有助于GBM中的耐药性。据推测，成胶质细胞瘤干细胞或干细胞样细胞(GSC)(具有自我更新和产生肿瘤能力的罕见类型的多能癌细胞)的存在可能是癌症对治疗的耐性和致死性的重要因素。已经表明，FGF-2在调节GBM和GSC中起重要作用(Haley和Kim，Cancer letters，2014)。
心力衰竭是发病率和死亡率的主要原因。FGF-2通过激活FGF受体1c(FGFR)来激活MAPK信号，从而促进心脏肥大和纤维化。调节FGF-2信号可能代表心力衰竭的潜在治疗策略(Itho和Ohta，Front Physiol，2013)。
神经发生在老年人齿状回中仍然存在，但其在神经营养环境发生变化的阿尔茨海默病(AD)等病理病症中的作用和调节机制尚不清楚。在来自成年大鼠的海马祖细胞中，FGF-2以剂量依赖性方式降低微管相关蛋白2，并增加tau的水平，表明FGF-2诱导的树突到轴突极性位移。AD发病机制可能涉及异常升高的FGF-2相关的齿状回神经发生的失调，特别是神经元极性。已经显示出改善AD患者的认知和情绪的神经营养药脑浆素被发现通过减少细胞凋亡和抵消FGF-2诱导的极性移位来增加培养物中神经元样分化的成年大鼠海马祖细胞(Tatebayashi等，Acta Neuropathol，2003)。抵消FGF-2活性可能代表这一疾病的有希望的治疗靶点。
在肾脏中，FGF-2增加肾小球蛋白的通透性并加速肾小球硬化(Chen等，CurrentVascular Pharmacology，2004)。在同种异体移植物的肾小球和新内膜中观察到FGF-2的大量积累。对硫酸乙酰肝素多糖侧链的分析显示，在对照和同基因移植的肾中，非FGF-2结合的硫酸乙酰肝素表型在同种异体移植物中转化为FGF2-结合表型。FGF2诱导的增殖依赖于硫酸化，且可以通过外源性加入硫酸乙酰肝素来抑制。通过肝素结合片段HEPV抵消FGF-2信号可以阻止慢性移植功能障碍中肾小球硬化的发展和新内膜形成(Katta等，Am J Pathol，2013)。
具有髓样化生的骨髓纤维化(MMM)是以造血和骨髓纤维化的克隆扩增为特征的骨髓增生性疾病。之前的结果显示，在MMM患者中，两种有效的纤维生成因子的产生增加也参与原始造血细胞的调节，即转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)。这种疾病的骨髓增生特征可能由CD34+造血祖细胞异常增殖引起。在正常CD34+细胞中检测到的FGF-2及其I型和II型受体的非常低的表达与在患者的CD34+细胞中观察到明显更高的表达相反。与MMM患者的CD34+祖细胞中TGF-β结合受体的减少相关的FGF-2及其受体的表达增加可能促进造血祖细胞的扩增，不仅通过刺激其生长和/或存活，而且还通过克服负调控信号(Le Bousse-Kerdiles，Blood，1996；Le Bousse-Kerdilè sandMartyré，AnnHamatol，1999)。抵消FGF-2活性可能代表这一疾病的有希望的治疗靶点。
其他疾病可以用根据本发明的肽治疗，例如糖尿病性视网膜病变和类风湿性关节炎。该抗血管生成肽也可用于治疗眼部增生性疾病，如年龄相关性黄斑变性。
根据第二个实施方案，根据本发明的肽用作FGF-2诱导的血管生成的抑制剂。
“血管生成”是指包括血管形成、血管重建、血管稳定、血管成熟以及功能性血管网络建立的动态过程。在主要是内皮细胞的特定靶细胞上存在足量的FGF-2诱导这种血管生成过程。
已经表明，血管生成在数种疾病中失调，例如在川崎病(KD)的慢性期的冠状动脉(CA)动脉瘤。在疾病发作后不久，在急性KDCA动脉瘤和心肌中发生明显的新血管形成，涉及多种血管生成因子，并且血管生成的失调可能导致KD血管病变(Freeman等，2005，PediatrCardiol)。抵消FGF2活性可能代表这种疾病的有希望的治疗靶点。
根据第三个实施方案，根据本发明的肽用作癌症治疗，尤其是实体肿瘤治疗中的药物。
癌症一般是指可以扩散到邻接组织或机体其他部位的由不受控制的异常生长的细胞引起的一组疾病之一。特别是，癌细胞显示不受控制的增殖、专门功能的丧失、不死、转移可能性、快速生长和增殖速率，以及特定的形态特征和细胞标志物。癌细胞可以形成实体肿瘤，其中癌细胞在机体的特定部位集合在一起。
在一个具体的方面，用作癌症治疗的药物的肽意欲治疗最常见的癌症之一，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、皮肤癌、脑癌和子宫颈癌。
肽的特征
本发明涉及用作药物的包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列的肽，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。
在本发明的一个具体方面，肽包含SEQ ID NO：2所示的序列[X-K905-X-X-X-R909-X-X-R912-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X]，其中X代表任何氨基酸。20个氨基酸的这个序列包含对于作为药物的肽的活性而言重要的保守残基Lys905、Arg909和Arg912。
参考序列SEQ ID NO：1由127个残基组成。在这些残基中，已经鉴定了结合肝素的特定位点，其中保守残基Lys905、Arg909和Arg912的作用是关键的(参见实施例部分)；此外，已经鉴定了残基Arg918和Arg921，即使不是绝对必须，也在与肝素的结合活性中起作用(Ricard-Blum等，2006)。
根据本发明的肽包含这些必要氨基酸和尤其是通过缺失、添加或替换残基可以被改变的其他氨基酸，限制是与SEQ ID NO：1所示的参考序列具有85％一致性。特别地，可以改变肽以增加其半衰期、增加其生物利用度和/或使其不易于蛋白水解。这些改变可以包括肽的环化、D-氨基酸的掺入或非天然氨基酸的掺入。这些改变基本上都不应干扰肽的所需生物活性。
在本发明的一个具体方面，肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列：
G-K-P-G-P-R-G-Q-R-G-P-T-G-P-R-G-E-R-G-P。
根据该实施方案，肽包含在残基G904和残基P923之间的与SEQ ID NO：3的20个氨基酸序列具有100％一致性的序列和位于N末端和C末端部分的其他残基。
在本发明的一个优选实施方案中，肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1所示的序列组成。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过化学合成，或通过使用活系统例如细菌、酵母或真核细胞诸如动物和植物细胞来制备肽。用于合成肽的优选微生物是大肠杆菌和酵母。
因此，通过任何合适的转化技术，将携带编码肽的核酸分子的载体引入细菌或真核细胞。然后，在合适的培养基中，在合适的温度例如37℃下，在恒定搅拌下生长微生物，并产生如载体编码的肽。然后在用作药物之前，将所述肽例如在离子交换柱上纯化。特别地，通过质谱分析纯化的肽，以检查纯化样品中不存在细菌污染物。
根据本发明，术语“肽”总是指“纯化的”或“分离的”肽，表明所述肽已经与细菌生长培养基中天然存在的其他成分，例如蛋白质和有机分子分离。
在本发明的一个具体实施方案中，肽与可检测标记偶联。
可检测标记是指尤其是在成像过程中“可检测”的化合物，因为它是有色的、荧光的或发光的。在一个具体的实施方案中，可检测标记选自放射性标记、亲和标记、磁性颗粒、荧光或发光标记。
特别地，可检测部分可以是造影剂或可检测蛋白质。本领域技术人员知道若干可检测的蛋白质，例如绿色荧光蛋白质和若干荧光染料，例如Alexa Fluor家族。
可检测标记可以是荧光蛋白。特别地，如果肽在活系统中产生，携带编码该肽的核酸的载体也包括编码这种荧光蛋白的核酸。
在本发明的一个具体方面，在载体上两个核酸均置于相同启动子的控制下，一起转录和翻译，以该方式形成包含所述肽和可检测蛋白两者的融合蛋白。
在本发明的另一个方面，所述肽与发色团化学融合。
有利地，可以通过本领域技术人员熟知的技术，通过体内成像在动物或患者体内追踪所述肽。
肽的施用
在本发明的一个优选方面，当用作药物时，向动物或个体施用有效量的肽，并在血管生成或肿瘤部位获得所述肽的积累。
肽的“有效量”是指引起所需生物反应所需的量。本领域技术人员理解，有效量可以根据因素，例如所需的生物端点、肽的结构和/或靶组织而变化。
可以通过任何施用途径来施用肽。合适的途径可以包括口服、口腔、通过吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道、经粘膜、鼻或肠内施用、肠胃外递送包括肌内、皮下和静脉内注射或其他递送方式。
一个优选的施用方式是向动物或个体的血液系统的肠胃外施用。
在癌症治疗的情况下，血管生成部位主要是实体肿瘤周围的部位，其中动态血管生成过程被刺激，尤其是被FGF-2的存在刺激。
本发明尤其涉及上述的肽用于治疗癌症的用途，通过向动物或个体施用有效量的所述肽，从而在血管生成或肿瘤部位获得所述肽的积累。
以下实施例4和图5A表明，当注射入小鼠的血液系统，含有氨基酸Lys905、Arg909和Arg912的肽HEPV在血管生成的部位积累，尽管其中三个必要氨基酸被丙氨酸替换的对照肽并不积累。
药物组合物和和成套试剂盒
本发明还涉及包含有效量的至少一种上述肽和药学上可接受的介质的药物组合物。
药学上可接受的介质是用无毒成分制备的生理上可接受的介质，其用于向需要的动物或患者施用活性化合物。
药物组合物可以包含不同的肽，尤其是至少两种选自之前所公开的肽的肽。
该药物组合物可以进一步包含抑制血管生成的化合物，尤其是抑制VEGF诱导的血管生成的化合物。
包含有效量的至少一种上述肽和药学上可接受的介质的该药物组合物可以进一步包含抗炎化合物。
包含有效量的至少一种上述肽和药学上可接受的介质的该药物组合物可以进一步包含抗癌活性成分。
包含有效量的至少一种上述肽和药学上可接受的介质的该药物组合物可以进一步包含抑制VEGF诱导的血管生成的化合物和抗炎剂。
包含有效量的至少一种上述肽和药学上可接受的介质的该药物组合物可以进一步包含抑制血管生成的化合物和抗癌活性成分。
包含有效量的至少一种上述肽和药学上可接受的介质的该药物组合物可以进一步包含抑制血管生成的化合物、抗炎剂和抗癌活性成分。
有利地，向动物或个体的血液系统施用药物组合物之后，在血管生成或肿瘤部位获得所述肽的积累。如图5A所示，该特征对于所述肽作为药物的用途非常有利。
本发明还涉及成套试剂盒，包含有效量的至少一种上述肽，和另一种抑制血管生成的化合物，尤其是抑制VEGF诱导的血管生成的化合物，和/或抗炎化合物，和/或抗癌活性成分。
所述成套试剂盒允许在不同时间向患者施用肽和抑制血管生成的化合物，和/或抗炎化合物，和/或抗癌活性成分。这两个或三个组分的施用可以同时或顺次实现。
特别地，成套试剂盒包含有效量的至少一种上述肽和抑制血管成成的化合物。
在另一个实施方案中，成套试剂盒包含有效量的至少一种上述肽和抗癌活性成分，例如化疗化合物。
在另一个实施方案中，成套试剂盒包含有效量的至少一种上述肽和抗炎化合物。
在另一个实施方案中，成套试剂盒包含有效量的至少一种上述肽、抑制血管生成的化合物和抗癌活性成分，例如化疗化合物。
在另一个实施方案中，成套试剂盒包含有效量的至少一种上述肽、抑制血管生成的化合物和抗炎化合物。
在另一个实施方案中，成套试剂盒包含有效量的至少一种上述肽、抑制血管生成的化合物、抗炎化合物和抗癌活性成分。特别地，可以在第一步中用抑制血管生成的化合物，和/或抗炎化合物，和/或抗癌活性成分治疗患者；如果看起来患者的肿瘤周围仍然呈现活性血管生成过程，则在第二步的治疗中施用根据本发明的肽，用或不用抗癌活性成分。
有利地，可以用其他方法进一步治疗患者。这种方法可以包括但不限于：化疗、放疗或手术。本发明的药物组合物的施用可以在其他癌症治疗之前、期间或之后进行。
本发明还涉及用于在体外或体外抑制FGF-2对靶细胞的生物作用的方法，包括使细胞与有效量的肽接触，所述肽包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列[Ile824-Pro950]具有至少85％一致性的氨基酸序列，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。
在本发明的另一个方面，在所述肽中，五个残基Lys905、Arg909、Arg912、Arg918和Arg921是保守的。
进行上述方法，特别的，其中所述肽包含SEQ ID NO：2所示的保守序列[X-K905-X-X-X-R909-X-X-R912-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X]，其中X是任何氨基酸。
在本发明的一个具体方面，所述肽包含SEQ ID NO：3所示的保守氨基酸序列[G-K905-P-G-P-R909-G-Q-R912-G-P-T-G-P-R918-G-E-R921-G-P]。
在本发明的一个优选实施方案中，该方法所用的肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1所示的序列组成。
标记的肽及其用途
本发明还涉及与可检测标记偶联的包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列[Ile824-Pro950]具有至少85％一致性的氨基酸序列的肽，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。
在本发明的另一个方面，在所述标记的肽中，五个残基Lys905、Arg909、Arg912、Arg918和Arg921是保守的。
在本发明的一个具体方面，所述标记的肽包含SEQ ID NO：2所示的保守序列[X-K905-X-X-X-R909-X-X-R912-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X]，其中X是任何氨基酸。
在本发明的一个具体方面，所述标记的肽包含SEQ ID NO：3所示的保守氨基酸序列[G-K905-P-G-P-R909-G-Q-R912-G-P-T-G-P-R918-G-E-R921-G-P]。
在本发明的一个优选实施方案中，所述标记的肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：1所示的序列组成。
可检测标记尤其是放射性标记、亲和标记、磁性颗粒、荧光或发光标记。可检测标记可以是荧光标记。
在本发明的另一个方面，所述肽与发色团化学融合。
有利地，可以通过本领域技术人员熟知的技术，通过体内成像在动物或患者体内追踪所述肽。
本发明还涉及上述标记的肽作为尤其在体内使用的成像剂的用途。
本发明还涉及用于成像动物或人个体的血管生成部位的方法，包括检测之前已向所述动物或所述人个体施用的如上定义的肽的标记的步骤。
本发明还涉及用于成像动物的血管生成部位的方法，包括以下步骤：
(a)将可检测标记与例如上述至少一种肽偶联；
(b)向所述动物施用所述标记的肽，和
(c)处死动物后检测所述标记。
在本发明的一个优选方面，当用作体内的成像剂时，向动物或人个体施用有效量的肽，并在血管生成或肿瘤部位获得所述肽的积累。
可以通过任何施用途径来施用肽。合适的途径可以包括口服、口腔、通过吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道、经粘膜、鼻或肠内施用、肠胃外递送包括肌内、皮下和静脉内注射或其他递送方式。
通过本领域技术人员熟知的任何技术来检测标记。
具体实施方式
材料和方法
HEPV和ΔHBS-HEPV的制备、表送和纯化
如之前所述制备重组HEPV片段和ΔHBS-HEPV构建体，并将其插入pT7/7表达载体的EcoRI和PstII位点。使用QuikChange II定点突变试剂盒(Stratagene，UK)，用其中905位的精氨酸被丙氨酸替换的之前获得的PR905A质粒作为模板来产生三倍突变体R905/R909/R912。用以下寡核苷酸引入点突变：
5’-GCGCCCAGGACCGGCGGGGGCAGGCAGGCCCAACG-3’(SEQ ID NO.6)，和
5’-CGTTGGGCCTGCCTGCCCCGCCGGTCCTGGCGC-3’(SEQ ID NO.7)。
通过核苷酸测序验证ΔHBS-HEPV的信息。将名称为pHEPV的重组野生型质粒和获得的突变体pΔHBS-HEPV转化入大肠杆菌菌株(BL21 SI-GJ1158)，所述菌株携带在盐可诱导proU启动子控制下的T7RNA聚合酶基因。用0.2M NaCl诱导20h后，通过离心并重悬于50mMTris-HCl，pH 7.4中收获细胞，然后超声。离心并过滤后，首先将细菌上清液进行使用HiTrapSP柱(Amersham)的阳离子交换层析，以除去大多数污染细菌蛋白，并使用Mono Q柱(Amersham)纯化至均匀。在15％凝胶上通过SDS-PAGE分析含有重组蛋白的部分，并用50mMTris-HCl，pH 7.5透析。将重组HEPV片段和ΔHBS-HEPV存储于-20℃直至使用。
肝素亲和层析
在50mM Tris-HCl(pH7.4)中平衡肝素-琼脂糖亲和柱(HiTrap Heparin，Amersham)。将蛋白质样品上样到柱上，并以0.5ml/min的流速施加0-500mM NaCl，1M Tris-HCl(pH 7.4)的程序化线性梯度，这通过连续电导率测量证实。收集级分(1ml)，通过监测214nm处的吸光度来测定蛋白质样品的洗脱曲线。为了精确比较突变体的洗脱位置，其用NaCl梯度的洗脱与标准HEPV洗脱相比得到。
定量实对RT-PCR
通过苯酚-氯仿-异丙醇萃取(Trizol Reagent，Invitrogen)从8×106个细胞中分离总RNA。使用M-MLV逆转录酶(Promega)对1μg RNA进行逆转录酶反应。使用SYBR GreenSupermix(Biorad)和特异性引物，使用I-Cycler光学系统(Biorad)进行定量PCR。使用以下引物：
COL4A1正向5’-CTGGTCCAAGAGGATTTCCA-3’(SEQ ID NO.8)；
COL4A1反向5’-TCATTGCCTTGCACGTAGAG-3’(SEQ ID NO.9)；
COL18A1正向5’-GCGCCAAAGGAGAAGTGG-3’(SEQ ID NO.10)；
COL18A1反向5’-TTTCAGCCTCCAACTGAAGAA-3’(SEQ ID NO.11)；
L30正向5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’(SEQ ID NO.12)；和
L30反向5’-TAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3’(SEQ ID NO.13)。
选择L30作为管家基因，并用于归一化。通过本领域技术人员熟知的方法测定相对转录物丰度。用2-ΔΔCT方法确定相对基因表达。用学生t检验测定统计学显著性(n＝4)。
磷酸化试验
将HUVEC在6孔板的ECGM2中以2.105个细胞/孔接种。在无血清培养基中，用HEPV或ΔHBS-HEPV(8μg/mL)处理细胞24h，然后在37℃下用FGF-2或VEGF(50ng/mL)刺激5或20分钟。然后用冷PBS洗涤细胞两次，刮掉，并在4℃裂解缓冲液1％NP-40(150mM NaCl、50mMHepes pH 7.4、5mM EDTA、10％甘油、1％NP-40、完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、1mMNa3VO4)中裂解。离心(13000g，15min，4℃)后，收集可溶性蛋白。通过BCA蛋白试验(Pierce)测定蛋白的量，并在SDS-PAGE上上样等量的蛋白质(10μg)，并在PVDF膜上在100V下转移1小时。用含有5％BSA的TBS-T缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4和0.05％Tween 20)封闭印迹，并与含有5％牛血清白蛋白的TBST中的一级抗体一起于4℃孵育过夜。通过与购买的辣根过氧化物酶偶联的二级抗体和从Biorad购买的ECL检测试剂连续孵育来检测免疫反应性。用于磷酸蛋白检测的抗体如下：抗AKT、抗磷酸化Akt(Ser473)、抗ERK1/2和抗磷酸化ERK1/2(Thr202/Tyr204、Thr185/Tyr187)(均来自Cell Signaling Technology)。
动物实验
所有动物实验均在符合EEC指南和实验室动物护理原则(NIH出版号14，第86-23期，1985年修订)的情况下进行；该实验方案经动物保护和使用委员会批准。在本研究中使用雌性无胸腺NMRI裸鼠(Janvier，Le Genest-Isle，France)并将其保持在特定无病原体条件下。在全身麻醉下进行局部手术，其通过腹膜内注射Domitor(Pfizer，Orsay，France)和Imalgene(Merial，Lyon，France)诱导。
移植海绵
将Disc Cellspon纤维素海绵(厚度2mm，直径10mm；Cellomeda，Turku，Finland)移植入小鼠的皮肤下。在移植前，用50μl PBS(阴性对照)或FGF-2(200ng/50μl；阳性血管生成对照)(重组FGF-2，Eurobio-AbCys，Les Ulis，France)水合海绵。移植后，在不存在和存在待测试的HEPV肽的情况下，在不用(阴性对照)或用200ng FGF-2(阳性对照)的情况下，在第一天和第二天用50μl PBS将海绵重新注入皮肤。
2D荧光体内成像
在第7天检查血管生成。对于2D荧光成像，将200μl HEPV-Cy5或HEPVΔHBS-AlexFluo700静脉注射(50μg)入小鼠尾静脉，并在注射后3小时成像。用配备有干涉滤光片的660nm发光二极管照射小鼠，在-80℃下通过装配有高通RG 9过滤器(Schott，Clichy，France)的背部稀疏电荷耦合器件(CCD)相机获得的荧光图像以及黑白图像(ORCAII-BT-512G；Hamamatsu，Massy，France)。然后将ROI定位在海绵上，以便在200ms内测量光子/像素的数量。
血红蛋白测量
在移植PBS或FGF-2处理的海绵后，在第0、2、3和5天用50μl含有50μg HEP肽处理，在第8天测量血红蛋白含量。通过致死性注射处死小鼠，然后迅速切除海绵并拍照。将每个海绵在1ml含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中匀浆，在200g下离心，并定量上清液。通过用Drabkin′s试剂(Sigma-Aldrich，Saint-Quentin Fallavier，France)测量血红蛋白的浓度来评估海绵植入物的血管化程度。结果以mg/ml表示。
抗肿瘤活性
TS/Apc-pGL3是源自用pGL3-荧光素酶报告基因稳定转染的原始腺癌TS/Apc小鼠细胞系的细胞系(Promega，Charbonnières，France)。在37℃下，在含有1％谷氨酰胺、10％胎牛血清、50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素、β-巯基乙醇(25μM)和700μg/ml的RPMI1640中，在加湿5％CO2培养箱中培养细胞(G418硫酸盐；Gibco，Paisley，UK)。
使用购自Janvier(法国Le Sainteste Saint France)的二十只6-8周龄雌性无胸腺瑞士裸鼠，并将其保持在特定无病原体条件下。接受皮下(s.c.)注射入右侧悬浮在200μlPBS中的106个TS/Apc-pGL3细胞的小鼠通常导致一周后形成6-8mm直径的肿瘤。从sc植入后第5天开始，小鼠每2天接受2次肿瘤周围注射50μl含有50μg HEP(n＝10)或HEPVΔHBS(n＝10)肽的50μl PBS溶液。使用卡尺评估肿瘤生长。
在第20天，每组处死3只小鼠用于免疫组化研究。在移植后第35天，提取所有剩余的肿瘤。
将来自肿瘤的冷冻切片(8μm)在丙酮中固定10分钟。然后将切片在含有0.1％吐温20的Tris缓冲盐水中洗涤3×5分钟，并用0.1％甲醇中的H2O2封闭内源性过氧化物酶20分钟。然后将切片与大鼠单克隆抗CD31抗体(MEC13.3；1：500；Pharmingen)或兔抗Ki67(1：100；AbCAM)顺次温育1小时，并用CD31的山羊抗大鼠抗体(1：500；Cell-signaling)或Ki67的山羊抗兔抗体(1：200；Dako)孵育1小时。使用二氨基四氯化锡作为色原体(Dako；SanAntonio，TX，USA)显示过氧化物酶活性。切片用苏木精复染，全部装入。
通过免疫组织化学染色内皮标志物CD31，然后在低倍放大范围(100×)下，每个肿瘤的5个视野(每个条件5个肿瘤)观察。然后，使用ImageJ软件(http：//rsbweb.nih.gov/ij)在这些区域的每一个中测量血管数量。所有计数都以盲目的方式进行。
对Ki67进行免疫组织化学染色后，在高倍放大范围(200×)下观察载玻片。每个肿瘤拍摄6-9个区域。这些照片通过ImageJ软件中的ImmunoRatio插件进行分析(http：//rsbweb.nih.gov/ij)。以盲法评估Ki67指数，并计算为Ki67阳性细胞除以一个视野中的所有肿瘤细胞。
实施例1：HEPV对胶原蛋白表达的作用
已经进行转录组学分析以鉴定HEPV调控的基因。用或不用HEPV处理内皮HDMEC细胞4、12和24小时。在219个上调基因中，分别编码胶原蛋白IV和XVIII的α1链的基因COL4A1和COL18A1被鉴定为非常相关，因为它们编码的蛋白质位于血管内皮基底膜中并且切割后具有强的抗血管生成活性。
这些基因的上调已经通过定量PCR验证(图2)。
因此，似乎HEPV诱导涉及血管生成过程控制的蛋白质的表达。
实施例2：制备非功能性的HEPV突变体：ΔHBS-HEPV
肽HEPV的序列如SEQ ID NO：1所示。
肽ΔHBS-HEPV具有的序列如SEQ ID NO：4所示，其中以下残基被丙氨酸替换：Lys905、Arg909和Arg912。
两种肽均在大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌系统中产生。在离子交换层析柱上纯化肽ΔHBS-HEPV。图3A显示在柱纯化之前(泳道1)、第一步后(泳道2)和第二步后(泳道3)的大肠杆菌生长培养基的上清液。
比较两种肽对肝素的亲和力，在肝素-琼脂糖柱上用洗脱肽所需的NaCl量来测定。
尽管HEPC肽用浓度为0.35M的NaCl洗脱，突变肽ΔHBS-HEPV用接近于NaCl生理浓度(0.15M)的0.2M的浓度洗脱(图3B)。
因此，与肽HEPV相比，似乎突变体明显不能与肝素结合，因而适于在下个实验中作为阴性对照。
实施例3.HEPV作用于FGF-2和VEGF的信号通路
图4所示的实验的目的在于测定，将内皮细胞与肽HEPV一起孵育之后，所述肽的存在是否影响对FGF-2的反应。测量的对FGF-2的反应是用特异性抗体测定的参与FGF-2和VEGF信号通路的蛋白质ERK 1/2和Akt的磷酸化水平。
内皮细胞HUVEC已经用HEPV或对照肽ΔHBS-HEPV处理24小时，并用FGF-2(图4A)或VEGF(50ng/ml)(图4B)刺激。
用FGF-2刺激后，未处理细胞显示显著增加的ERK1磷酸化(“磷酸化的ERK1/2”是泳道p-ERK1/2)。这种磷酸化在用HEPV处理的细胞中被抑制。与此相反，对照肽ΔHBS-HEPV在抑制ERK1/2磷酸化方面无效(图4A)。
HEPV的这种作用是FGF-2特异性的，因为用VEGF刺激的所有细胞均显示ERK1/2磷酸化，甚至在用HEPV处理之后(图4B)。
用FGF-2和VEGF刺激之后，对于Akt蛋白的磷酸化水平观察到相似结果。
实施例4.HEPV作用于小鼠体内的血管形成
在裸鼠中，将纤维素海绵植入皮肤下以人工刺激血管生成，该海绵含有血管生成因子(FGF-2)。阴性对照海绵包含PBS。
将HEPV和ΔHBS-HEPV肽与荧光(Alexa Fluor 700)融合，并注射入小鼠的血液系统。为追踪融合蛋白在体内的定位，每3小时拍照。
在海绵部位的荧光定量(图5A)表明：
-对于用刺激血管生成的FGF-2浸渍的海绵，融合蛋白HEPV-fluo在海绵中强烈积累；
-与此相反，对照融合蛋白ΔHBS-HEPV-fluo不在海绵中积累。
此外，在用FGF-2浸渍的海绵中，新形成血管的数量是在对照海绵中观察到的数量的两倍(图5A，右图)。
未显示的其他结果表明，肽HEPV不会非特异性地在各种器官中积累，除了消除专门器官的肾和膀胱外。此外，肽不会在肝脏中积累，因此是无毒的。
图5B显示HEPV在抗血管生成活性方面的结果。在第一天然后每隔两天，将20μgHEPV或ΔHBS-HEPV与PBS或FGF-2同时注射。处理7天后，取出海绵并分析。通过海绵中发现的血红蛋白水平测量血管生成水平。与用ΔHBS-HEPV处理的小鼠相比，当用HEPV处理小鼠时，血红蛋白水平显著降低(2.5倍)(图5B，右图)。
这些结果表明(i)HEPV肽能够抑制FGF-2诱导的血管生成；和(ii)对肝素的功能性结合位点是获得该效果所必需的。
实施例5.HEPV影响肿瘤生长
通过在裸小鼠中植入鼠乳腺癌细胞(TSA)诱导肿瘤。一旦肿瘤发展，在37天期间每两天进行肿瘤内注射HEPV(50μg)。用卡尺测量肿瘤的体积。
结果如图6A所示。直到第18天，所有肿瘤根据相同的模式发展。从治疗的第20天起，用HEPV处理的肿瘤生长减慢，直到实验结束。
在第20天和第33天处死来自各组的小鼠以检查新血管的形成。通过观察肿瘤样品计数血管。
结果如图6B所示。在第20天，当与ΔHBS-HEPV处理小鼠相比，在用HEPV处理的小鼠中观察到显著降低的血管密度。奇怪的是，在第33天，差异不显著。可能的解释是在该处理步骤中，坏死区的存在不允许血管生成过程的正确进行。
在这些肿瘤样品上也实现了具有抗体抗Ki67的肿瘤细胞的增殖。
结果如图6C所示。在第20天，观察到显著降低的肿瘤细胞增殖。然而，在第33天，增殖似乎反弹回来了。
表1-序列
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Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu
1 5 10 15
Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro
20 25 30
Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe
50 55 60
Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro
65 70 75 80
Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly
85 90 95
Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro
115 120 125
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Xaa表示任何氨基酸
<400> 2
Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly
1 5 10 15
Glu Arg Gly Pro
20
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HEPV的突变体
<400> 4
Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu
1 5 10 15
Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro
20 25 30
Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe
50 55 60
Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro
65 70 75 80
Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Gln Ala Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly
85 90 95
Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Pro
115 120 125
<210> 5
<211> 1838
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Asp Val His Thr Arg Trp Lys Ala Arg Ser Ala Leu Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Pro Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Ala Pro Pro
20 25 30
Pro Ser Arg Ala Ala Gln Pro Ala Asp Leu Leu Lys Val Leu Asp Phe
35 40 45
His Asn Leu Pro Asp Gly Ile Thr Lys Thr Thr Gly Phe Cys Ala Thr
50 55 60
Arg Arg Ser Ser Lys Gly Pro Asp Val Ala Tyr Arg Val Thr Lys Asp
65 70 75 80
Ala Gln Leu Ser Ala Pro Thr Lys Gln Leu Tyr Pro Ala Ser Ala Phe
85 90 95
Pro Glu Asp Phe Ser Ile Leu Thr Thr Val Lys Ala Lys Lys Gly Ser
100 105 110
Gln Ala Phe Leu Val Ser Ile Tyr Asn Glu Gln Gly Ile Gln Gln Ile
115 120 125
Gly Leu Glu Leu Gly Arg Ser Pro Val Phe Leu Tyr Glu Asp His Thr
130 135 140
Gly Lys Pro Gly Pro Glu Asp Tyr Pro Leu Phe Arg Gly Ile Asn Leu
145 150 155 160
Ser Asp Gly Lys Trp His Arg Ile Ala Leu Ser Val His Lys Lys Asn
165 170 175
Val Thr Leu Ile Leu Asp Cys Lys Lys Lys Thr Thr Lys Phe Leu Asp
180 185 190
Arg Ser Asp His Pro Met Ile Asp Ile Asn Gly Ile Ile Val Phe Gly
195 200 205
Thr Arg Ile Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Gly Asp Ile Gln Gln Leu
210 215 220
Leu Phe Val Ser Asp His Arg Ala Ala Tyr Asp Tyr Cys Glu His Tyr
225 230 235 240
Ser Pro Asp Cys Asp Thr Ala Val Pro Asp Thr Pro Gln Ser Gln Asp
245 250 255
Pro Asn Pro Asp Glu Tyr Tyr Thr Glu Gly Asp Gly Glu Gly Glu Thr
260 265 270
Tyr Tyr Tyr Glu Tyr Pro Tyr Tyr Glu Asp Pro Glu Asp Leu Gly Lys
275 280 285
Glu Pro Thr Pro Ser Lys Lys Pro Val Glu Ala Ala Lys Glu Thr Thr
290 295 300
Glu Val Pro Glu Glu Leu Thr Pro Thr Pro Thr Glu Ala Ala Pro Met
305 310 315 320
Pro Glu Thr Ser Glu Gly Ala Gly Lys Glu Glu Asp Val Gly Ile Gly
325 330 335
Asp Tyr Asp Tyr Val Pro Ser Glu Asp Tyr Tyr Thr Pro Ser Pro Tyr
340 345 350
Asp Asp Leu Thr Tyr Gly Glu Gly Glu Glu Asn Pro Asp Gln Pro Thr
355 360 365
Asp Pro Gly Ala Gly Ala Glu Ile Pro Thr Ser Thr Ala Asp Thr Ser
370 375 380
Asn Ser Ser Asn Pro Ala Pro Pro Pro Gly Glu Gly Ala Asp Asp Leu
385 390 395 400
Glu Gly Glu Phe Thr Glu Glu Thr Ile Arg Asn Leu Asp Glu Asn Tyr
405 410 415
Tyr Asp Pro Tyr Tyr Asp Pro Thr Ser Ser Pro Ser Glu Ile Gly Pro
420 425 430
Gly Met Pro Ala Asn Gln Asp Thr Ile Tyr Glu Gly Ile Gly Gly Pro
435 440 445
Arg Gly Glu Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Ala Ile Ile Glu Pro Gly
450 455 460
Met Leu Ile Glu Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Pro Ala Gly Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Pro Gly Thr Met Gly Pro Thr Gly Gln Val Gly Asp Pro Gly
485 490 495
Glu Arg Gly Pro Pro Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Asp Gly Leu
500 505 510
Pro Gly Pro Pro Gly Thr Met Leu Met Leu Pro Phe Arg Phe Gly Gly
515 520 525
Gly Gly Asp Ala Gly Ser Lys Gly Pro Met Val Ser Ala Gln Glu Ser
530 535 540
Gln Ala Gln Ala Ile Leu Gln Gln Ala Arg Leu Ala Leu Arg Gly Pro
545 550 555 560
Ala Gly Pro Met Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Pro Val Gly Pro Pro
565 570 575
Gly Ser Gly Gly Leu Lys Gly Glu Pro Gly Asp Val Gly Pro Gln Gly
580 585 590
Pro Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Pro Gly Arg
595 600 605
Arg Gly Arg Ala Gly Ser Asp Gly Ala Arg Gly Met Pro Gly Gln Thr
610 615 620
Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Asp Gly Leu Ala Gly Leu Pro Gly
625 630 635 640
Glu Lys Gly His Arg Gly Asp Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro
645 650 655
Pro Gly Asp Asp Gly Glu Arg Gly Asp Asp Gly Glu Val Gly Pro Arg
660 665 670
Gly Leu Pro Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly
675 680 685
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Thr Gly Met Asp Gly Gln
690 695 700
Pro Gly Pro Lys Gly Asn Val Gly Pro Gln Gly Glu Pro Gly Pro Pro
705 710 715 720
Gly Gln Gln Gly Asn Pro Gly Ala Gln Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly
725 730 735
Ala Ile Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Pro Leu Gly Lys Pro Gly Leu
740 745 750
Pro Gly Met Pro Gly Ala Asp Gly Pro Pro Gly His Pro Gly Lys Glu
755 760 765
Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Gly Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly
770 775 780
Pro Ile Gly Tyr Pro Gly Pro Arg Gly Val Lys Gly Ala Asp Gly Ile
785 790 795 800
Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp Gly Phe Pro
805 810 815
Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ile Gly
820 825 830
Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu Gly Pro Lys Gly Arg
835 840 845
Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Glu Lys
850 855 860
Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly
865 870 875 880
Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu
885 890 895
Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg
900 905 910
Gly Pro Thr Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly
915 920 925
Lys Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro
930 935 940
Pro Gly Glu Arg Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Phe Pro
945 950 955 960
Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly
965 970 975
His Pro Gly Gln Arg Gly Glu Thr Gly Phe Gln Gly Lys Thr Gly Pro
980 985 990
Pro Gly Pro Pro Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Glu Thr
995 1000 1005
Gly Pro Met Gly Glu Arg Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1010 1015 1020
Glu Gln Gly Leu Pro Gly Leu Ala Gly Lys Glu Gly Thr Lys Gly Asp
1025 1030 1035 1040
Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro Gly Leu Arg
1045 1050 1055
Gly Phe Pro Gly Asp Arg Gly Leu Pro Gly Pro Val Gly Ala Leu Gly
1060 1065 1070
Leu Lys Gly Asn Glu Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser
1075 1080 1085
Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ile Gly Ile Pro
1090 1095 1100
Gly Arg Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly
1105 1110 1115 1120
Ala Pro Gly Glu Lys Gly Pro Gln Gly Pro Ala Gly Arg Asp Gly Leu
1125 1130 1135
Gln Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro
1140 1145 1150
Gly Glu Asp Gly Asp Lys Gly Glu Ile Gly Glu Pro Gly Gln Lys Gly
1155 1160 1165
Ser Lys Gly Asp Lys Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro
1170 1175 1180
Gln Gly Pro Ile Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Asp Gly Glu Pro
1185 1190 1195 1200
Gly Pro Arg Gly Gln Gln Gly Leu Phe Gly Gln Lys Gly Asp Glu Gly
1205 1210 1215
Pro Arg Gly Phe Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Leu Gln Gly Leu
1220 1225 1230
Pro Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Gln Met
1235 1240 1245
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly
1250 1255 1260
Ala Asp Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Asn Pro Gly Ala
1265 1270 1275 1280
Val Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala Gly Glu Pro Gly Leu Pro
1285 1290 1295
Gly Glu Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly
1300 1305 1310
Glu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Pro
1315 1320 1325
Pro Gly Asp Asp Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Pro Val Gly Phe Pro
1330 1335 1340
Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly
1345 1350 1355 1360
Pro Pro Gly Asp Lys Gly Asp Asp Gly Glu Pro Gly Gln Thr Gly Ser
1365 1370 1375
Pro Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Arg
1380 1385 1390
Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Glu Gly Arg Gln Gly Glu Lys Gly
1395 1400 1405
Ala Lys Gly Glu Ala Gly Leu Glu Gly Pro Pro Gly Lys Thr Gly Pro
1410 1415 1420
Ile Gly Pro Gln Gly Ala Pro Gly Lys Pro Gly Pro Asp Gly Leu Arg
1425 1430 1435 1440
Gly Ile Pro Gly Pro Val Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly
1445 1450 1455
Pro Asp Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Leu
1460 1465 1470
Lys Gly Asp Ser Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly His Pro Gly Leu Ile
1475 1480 1485
Gly Leu Ile Gly Pro Pro Gly Glu Gln Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly
1490 1495 1500
Leu Pro Gly Pro Gln Gly Ser Ser Gly Pro Lys Gly Glu Gln Gly Ile
1505 1510 1515 1520
Thr Gly Pro Ser Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro
1525 1530 1535
Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Ala Lys Gly Ser Ser Gly Pro Thr Gly
1540 1545 1550
Pro Lys Gly Glu Ala Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
1555 1560 1565
Pro Gly Glu Val Ile Gln Pro Leu Pro Ile Gln Ala Ser Arg Thr Arg
1570 1575 1580
Arg Asn Ile Asp Ala Ser Gln Leu Leu Asp Asp Gly Asn Gly Glu Asn
1585 1590 1595 1600
Tyr Val Asp Tyr Ala Asp Gly Met Glu Glu Ile Phe Gly Ser Leu Asn
1605 1610 1615
Ser Leu Lys Leu Glu Ile Glu Gln Met Lys Arg Pro Leu Gly Thr Gln
1620 1625 1630
Gln Asn Pro Ala Arg Thr Cys Lys Asp Leu Gln Leu Cys His Pro Asp
1635 1640 1645
Phe Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys Ser Arg
1650 1655 1660
Asp Ser Phe Lys Val Tyr Cys Asn Phe Thr Ala Gly Gly Ser Thr Cys
1665 1670 1675 1680
Val Phe Pro Asp Lys Lys Ser Glu Gly Ala Arg Ile Thr Ser Trp Pro
1685 1690 1695
Lys Glu Asn Pro Gly Ser Trp Phe Ser Glu Phe Lys Arg Gly Lys Leu
1700 1705 1710
Leu Ser Tyr Val Asp Ala Glu Gly Asn Pro Val Gly Val Val Gln Met
1715 1720 1725
Thr Phe Leu Arg Leu Leu Ser Ala Ser Ala His Gln Asn Val Thr Tyr
1730 1735 1740
His Cys Tyr Gln Ser Val Ala Trp Gln Asp Ala Ala Thr Gly Ser Tyr
1745 1750 1755 1760
Asp Lys Ala Leu Arg Phe Leu Gly Ser Asn Asp Glu Glu Met Ser Tyr
1765 1770 1775
Asp Asn Asn Pro Tyr Ile Arg Ala Leu Val Asp Gly Cys Ala Thr Lys
1780 1785 1790
Lys Gly Tyr Gln Lys Thr Val Leu Glu Ile Asp Thr Pro Lys Val Glu
1795 1800 1805
Gln Val Pro Ile Val Asp Ile Met Phe Asn Asp Phe Gly Glu Ala Ser
1810 1815 1820
Gln Lys Phe Gly Phe Glu Val Gly Pro Ala Cys Phe Met Gly
1825 1830 1835
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 6
gcgcccagga ccggcggggg caggcaggcc caacg 35
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 7
cgttgggcct gcctgccccg ccggtcctgg cgc 33
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
ctggtccaag aggatttcca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
tcattgcctt gcacgtagag 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gcgccaaagg agaagtgg 18
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
tttcagcctc caactgaaga a 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
atggggaagg tgaaggtcg 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
taaaagcagc cctggtgacc 20

Claims (17)

1.包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列的肽作为药物的用途，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。
2.权利要求1所述的肽作为靶细胞上FGF-2诱导的生物作用的抑制剂的用途。
3.权利要求1或2所述的肽作为FGF-2诱导的血管生成的抑制剂的用途。
4.权利要求1-3任一项所述的肽用作癌症治疗，尤其是实体肿瘤治疗中的药物的用途。
5.权利要求1-4任一项所述的肽，包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
6.权利要求1-5任一项所述的肽，包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
7.权利要求1-6任一项所述的肽，其中它的氨基酸序列由SEQ IDNO：1所示的序列组成。
8.权利要求1-7任一项所述的肽，其中它在活系统，例如细菌、酵母或真核细胞中产生。
9.权利要求1-8任一项所述的肽，其中它与可检测标记偶联。
10.权利要求3-9任一项所述的肽作为药物的用途，通过向动物或个体施用有效量的所述肽，从而在血管生成或肿瘤部位获得所述肽的积累。
11.药物组合物，包含有效量的至少一种权利要求1-10任一项所述的肽和药学上可接受的介质。
12.权利要求11所述的药物组合物，进一步包含另一种抑制血管生成的化合物、和/或抗炎化合物，和/或抗癌活性成分。
13.成套试剂盒，包含有效量的权利要求1-10任一项所述的肽和另一种抑制血管生成的化合物、和/或抗炎化合物，和/或抗癌活性成分。
14.与可检测标记偶联的包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％一致性的氨基酸序列的肽，其中存在其含有的残基Lys905、Arg909和Arg912。
15.权利要求9或14所述肽，其中所述肽与放射性标记、亲和标记、磁性颗粒、荧光或发光标记偶联。
16.权利要求14或15所述的肽作为体内成像剂的用途。
17.用于成像动物或人个体的血管生成部位的方法，包括检测之前已向所述动物或所述人个体施用的权利要求14或15任一项所述的肽的标记的步骤。
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