CN107523535B - 内皮细胞yap和stat3相互结合在促进内皮细胞血管新生中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了内皮细胞YAP和STAT3相互结合在促进内皮细胞血管新生中的应用。本发明提供了YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合在制备促进动物或人血管新生产品中的应用；或YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合在制备延长STAT3在细胞核滞留的产品中的应用；或YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合在制备提高STAT3在细胞核内的转录目的基因活性产品中的应用；本发明发现了调控血管新生的关键靶点，即内皮细胞中YAP与STAT3的结合，通过干预两个蛋白的结合可以抑制血管新生，对于缺血性疾病、血管发育异常的疾病如肿瘤等的治疗都有指导意义。

Description

内皮细胞YAP和STAT3相互结合在促进内皮细胞血管新生中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种内皮细胞YAP和STAT3相互结合在促进内皮细胞血管新生中的应用。

背景技术

血管是哺乳动物体内遍布全身的重要结构，它与心脏共同构成了体内闭合的循环管道——心血管系统。血管承载血液，运送血液中氧气和营养物质至全身各个组织器官，并将二氧化碳和代谢终产物带回心脏，因此血管作为血液运送的管道，是生命赖以维持的重要器官。新血管的生成参与到从胚胎发育到组织损伤修复、癌症发生发展等一系列正常生理及病理生理过程之中。新血管生成可以分为血管新生(angiogenesis)和血管生成(vasculogenesis)。血管新生是指从已存在的微血管内皮细胞出芽形成新生血管的过程，而血管生成是指由血管祖细胞直接形成血管结构的过程。另外，从已有侧枝动脉经过扩张和肌性重塑发展为动脉血管的过程，称为动脉生成(arteriogenesis)。

内皮细胞是在血管内壁紧密排列的单层细胞，内皮细胞一旦受到促血管新生的因素刺激，便可以转变激活成为具有增殖和迁移能力的表型的内皮细胞参与血管新生过程。血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGF-A；以下简称VEGF)，作为血管内皮生长因子家族成员之一，是在胚胎发育以及成年个体血管新生中有着至关重要作用的调控因子。内皮细胞一旦受到VEGF的刺激，便可以转变为顶细胞，从静息的血管中迁移出来，并募集大量的茎细胞形成血管芽，继而进一步发展成为血管。VEGF信号通路在内皮细胞中调控各级信号分子，形成复杂的分子调控网络，有序地调控内皮细胞功能。

Hippo/YAP通路是通过影响细胞存亡、增殖等功能在发育过程中调控器官大小的重要信号通路。YAP蛋白作为转录共激活因子，是Hippo通路中最为重要的效应元件。YAP蛋白本身不具有DNA结合结构域，因此其需要与其他转录因子结合，发挥其转录调控作用。目前，已知可以和YAP结合的转录因子包括TEAD家族、受体酪氨酸蛋白激酶ErbB4、Runt相关转录因子2和p73等。Hippo通路可以通过改变YAP磷酸化水平进而影响YAP蛋白在细胞中的分布，从而起到调控下游目的基因的转录激活以及改变细胞功能的作用。最近研究指出血管内皮钙粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)介导的内皮细胞连接可以改变YAP蛋白磷酸化水平并抑制其转录活性，导致内皮细胞中血管生成素-2(angiopoietin-2，ANG2)表达水平降低，由此抑制血管新生过程。

除此之外，血管新生还受到许多其他作用因素的影响，其中炎症因子在许多病理状态下可以通过增加血管通透性导致内皮细胞激活表达VEGF等促血管新生的因子，进而导致病理性的血管新生。趋化因子(C-C基序)配体2和白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)可以诱导VEGF表达，说明炎症因子可以与VEGF协同调控血管新生过程。信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是IL-6通路下游的转录因子，其作为信号转导和转录激活因子家族成员，在IL-6的作用下磷酸化而激活，进入细胞核中发挥其转录因子的作用。最近研究表明，STAT3在血管新生过程中同样有着重要作用。内皮细胞特异性缺失STAT3的小鼠在中风或者心肌梗死后出现血管新生抑制表型，同时伴随着内皮细胞增殖和迁移能力下降。另外，VEGF和IL-6抑制剂的协同给药比单独给药的抑制效果更为明显，说明血管内皮生长因子和IL-6共同调控血管新生这一重要的生理过程。

成人体内血管新生不仅在诸如缺血后组织修复、伤口愈合等病理生理过程中起着重要作用，而且在癌症发生发展、慢性炎症性疾病、糖尿病视网膜病变和动脉粥样硬化等疾病中扮演关键角色。因此，研究血管新生过程的调控机制及治疗对血管新生相关的疾病是非常重要的。

发明内容

本发明的一个目的是提供YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合的用途。

本发明提供的YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合在制备促进动物或人血管新生产品中的应用；

或YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合在制备延长STAT3在细胞核滞留的产品中的应用；

或YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合在制备提高STAT3在细胞核内的转录目的基因活性产品中的应用；

或YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合在制备削弱细胞核内CRM1和STAT3结合产品中的应用。

本发明另一个目的是提供促进YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合的物质的用途。

本发明提供的促进YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合的物质在制备促进动物或人血管新生产品中的应用；

或促进YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合的物质在制备延长STAT3在细胞核滞留的产品中的应用；

或促进YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合的物质在制备提高STAT3在细胞核内的转录目的基因活性产品中的应用；

或促进YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合的物质在制备削弱细胞核内CRM1和STAT3结合产品中的应用。

上述促进YAP蛋白和STAT3蛋白在细胞核内相互结合的物质为刺激YAP蛋白入核的物质和刺激STAT3蛋白入核的物质，具体刺激YAP蛋白入核的物质为VEGF、刺激STAT3蛋白入核的物质为IL-6等。

上述应用中，所述YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合为YAP蛋白和STAT3蛋白在细胞核内相互结合。

上述应用中，所述提高STAT3在细胞核内的转录目的基因活性为提高STAT3在细胞核内的转录血管新生相关基因活性；

上述应用中，所述血管新生相关基因为ADM、ANGPLT4、CDKN1B、EPAS1和/或ANG2。

上述应用中，所述细胞为动物或人的内皮细胞。

上述应用中，所述促进动物或人血管新生是通过提高STAT3在细胞核内的转录血管新生相关基因活性实现的；

所述提高STAT3在细胞核内的转录血管新生相关基因活性是通过延长STAT3在细胞核滞留实现的；

所述延长STAT3在细胞核滞留是通过削弱CRM1和STAT3细胞核内结合实现的；

所述削弱CRM1和STAT3细胞核内结合是通过YAP蛋白和STAT3蛋白细胞核内相互结合实现的。

上述应用中，所述YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合为YAP蛋白SH3结合结构域和STAT3蛋白的第656-680位的氨基酸相互结合；

所述YAP蛋白SH3结合结构域为所述YAP蛋白氨基酸序列第278-290位氨基酸。

阻断或抑制YAP蛋白与STAT3蛋白结合的物质在制备抑制VEGF或IL-6诱导内皮细胞迁移和/或成管功能产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第3个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，包括促进YAP蛋白和STAT3蛋白细胞核中相互结合的物质或YAP蛋白和STAT3蛋白；

所述产品具有如下1)-4)中任一种功能：

1)促进动物或人血管新生；

2)延长STAT3在细胞核滞留；

3)提高STAT3在细胞核内的转录目的基因活性；

4)削弱细胞核内CRM1和STAT3结合。

本研究旨在阐明在复杂环境因素下，血管新生过程的调控机制，以期为治疗有血管新生参与的疾病提供新的治疗思路和潜在靶点。

为研究Hippo/YAP通路在血管新生中的作用，使用人类脐静脉内皮细胞(Humanumbilical vein endothelial cell，HUVEC)作为体外细胞实验研究模型。为探寻在内皮细胞中与YAP蛋白结合的转录因子，通过蛋白质组学的方法，从筛选与其结合的转录因子，并用蛋白质免疫共沉淀、免疫蛋白质印迹以及细胞免疫荧光等实验方法验证与之结合的蛋白。除此之外，通过构建内皮细胞特异性过表达YAP蛋白小鼠，将新生小鼠视网膜血管新生模型作为生理性血管新生的模型，以及成年小鼠皮下异体移植肿瘤中血管新生模型作为病理性血管新生的模型，来验证内皮细胞中YAP蛋白在体内血管新生过程中作用。

本发明的实验证明，1)YAP内皮特异性过表达小鼠呈现促进血管新生的表型，包括视网膜新生血管以及肿瘤新生血管；2)内皮细胞中YAP蛋白可以与STAT3蛋白结合并通过使其滞留在细胞核中而促进其下游ANG2等基因转录表达；3)YAP与STAT3结合是促进血管新生的重要机制。本发明发现了调控血管新生的关键靶点，即内皮细胞中YAP与STAT3的结合，通过干预两个蛋白或者是干预两个蛋白的结合可以抑制血管新生，对于缺血性疾病、血管发育异常的疾病如肿瘤等的治疗都有指导意义。

附图说明

图1为内皮细胞特异性过表达YAP小鼠鉴定。

分离EC-YAP^Tg小鼠和其同窝出生的野生型YAP^flox小鼠肺内皮细胞，并提取细胞的总蛋白和总RNA。A Western Blotting方法检测YAP和GAPDH蛋白表达水平。B Image J软件对(A)中蛋白表达进行定量及统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；未配对双尾t检验，n＝3)。

图2为内皮细胞特异性过表达YAP小鼠视网膜新生血管形成。

YAP^flox和EC-YAP^Tg两组小鼠视网膜铺片进行荧光植物凝集素B4(isolectin B4)染色。A完整的视网膜铺片，白色标记的为血管网络，白色虚线圆圈代表的是EC-YAP^Tg组小鼠血管向外生长的轮廓(比例尺，400μm)。B-D为高倍镜下视网膜血管结构，B显示为血管分支结构(比例尺，20μm)，C显示为顶细胞结构(比例尺，20μm)，D为血管网前端顶细胞伸出的丝状伪足(比例尺，5μm)。E为视网膜血管网外周长度和血管覆盖面积的定量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；未配对t检验，每组视网膜n＝6)。F-H分别为视网膜血管结构中每个视野分支点数量和顶细胞数量，以及每100μm结构中丝状伪足数量的定量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；未配对t检验，每组视网膜n＝6)。

图3为内皮细胞特异性过表达YAP促进肿瘤组织血管新生并促进肿瘤组织形成。

EC-YAP^Tg小鼠和其同窝出生的野生型YAP^flox小鼠背部右侧皮下接种7×10⁶个小鼠Lewis肺癌细胞，接种21天后取出接种后的肿瘤组织。A每隔7天使用游标卡尺测量体表肿瘤的长径和与长径垂直的短径长度并计算肿瘤体积(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；未配对双尾t检验，n＝6)。B大体观察肿瘤细胞接种21天后形成的肿瘤组织C测量21天后形成的肿瘤组织重量(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；未配对双尾t检验，n＝6)。D肿瘤组织包埋后切片，免疫荧光方法检测肿瘤组织中血管新生情况。图为共聚焦显微镜下拍摄的肿瘤组织切片，CD31标记内皮细胞，DAPI标记细胞核。(比例尺，100μm)。E为每10个低倍镜下视野中CD31阳性区域面积的定量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；未配对双尾t检验，n＝6)。

图4为STAT3与YAP蛋白在内皮细胞中相互作用。

A HUVEC中与YAP相互作用目标蛋白蛋白组学分析流程示意图。B HUVECs中分别转染GFP对照和Flag-YAP过表达腺病毒24小时，抗Flag免疫磁珠共沉淀及纯化得到的细胞裂解液，通过SDS-PAGE电泳并经过银染显色分析得到YAP蛋白相互作用复合体。C蛋白质谱分析显示与YAP相互作用蛋白的得分及丰度。D HUVEC转染FLAG-YAP过表达腺病毒24小时，抗Flag-免疫磁珠共沉淀后Western Blotting显示STAT3与YAP蛋白的结合。E在全细胞裂解液、细胞浆裂解液和细胞核裂解液中，用YAP和STAT3抗体分别进行免疫共沉淀后，WesternBlotting显示STAT3与YAP蛋白的结合情况。

图5为YAP蛋白促进STAT3在细胞核中的聚集并增加其转录活性。

A-D HUVEC中分别转染对照GFP和FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，以10ng/mL浓度给予IL-6刺激如图中所示时间。A和B Western Blotting方法分别检测全细胞、细胞胞浆和细胞核蛋白裂解液中STAT3和YAP总蛋白水平和STAT3第705位酪氨酸磷酸化水平，全细胞和细胞胞浆裂解液中以蛋白GAPDH表达水平作为内参，细胞核裂解液中以蛋白H3表达水平作为内参。同时用Image J软件对STAT3和YAP总蛋白以及磷酸化表达水平蛋白表达进行定量及统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝3)。C和D共聚焦显微镜拍摄的免疫荧光染色的图片，右下角图片显示荧光标记的为STAT3，右上角图片荧光标记的为DAPI，左侧图片荧光标记的为共定位情况。(比例尺，50μm)。同时定量统计STAT3在细胞核与细胞胞浆中的比例(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝3)。E在BAEC中将STAT3启动子荧光素酶报告基因质粒分别与LacZ、Flag-YAP-WT和Flag-YAP-5SA质粒共转染24小时后，同时转染β-gal作为内参，给予细胞PBS或者IL-6(10ng/mL)处理24小时。每组的荧光素酶活性以β-gal活性为内参进行校正，校正后的结果表示为以共转染LacZ质粒给予PBS处理组为1的相对值(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝5)。

图6为YAP蛋白过表达促进IL-6/STAT3通路下游目的基因的表达。

A HUVECs中分别转染对照GFP和FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，以10ng/mL浓度给予IL-6处理4小时。实时定量PCR方法分别检测YAP、CTGF、ADM、ANGPLT4、CDKN1B和EPAS1等基因mRNA表达水平(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝3)B HUVEC以10ng/mL浓度预处理LMB 4小时，未预处理的HUVECs和经过预处理的HUVECs分别给予PBS或者IL-6处理4小时。实时定量PCR方法分别检测各组ANG2基因mRNA表达水平(数据显示为Means±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝3)。C HUVEC分别转染对照GFP或FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，给予细胞PBS或者IL-6(10ng/mL)处理4小时。实时定量PCR方法分别检测各组ANG2基因mRNA表达水平(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝3)。D HUVEC转染FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，以50μM浓度给予细胞S3I-201预处理1小时。预处理后的细胞与未经过预处理的细胞分别给予PBS或者IL-6(10ng/mL)处理4小时。实时定量PCR方法分别检测各组ANG2基因mRNA表达水平(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的单因素方差分析，n＝3)。EHUVEC中分别转染对照GFP和FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，以10ng/mL浓度给予细胞白介素-6处理4小时。分别用STAT3、YAP和兔对照IgG将与其结合的染色质沉淀下来，随后经过实时定量PCR方法检测经免疫沉淀反应后的DNA含量(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝3)。

图7为YAP与STAT3相互作用屏蔽了STAT3出核信号并阻断STAT3与CRM1的结合。

A YAP蛋白与STAT3结合模式图。展示了YAP蛋白SH3结合结构域，预测的STAT3与YAP蛋白结合的位点(aa656-687)，STAT3中第524-536位氨基酸序列(为STAT3的出核信号)以及全长的STAT3蛋白结构。B YAP和STAT3结构域结构及突变位点示意图。C HEK293A细胞中将Myc-STAT3质粒或者Myc-STAT3^656-680D与Flag-YAP-5SA质粒或者Flag-YAP^△SH3bm质粒共转染24小时，收集全细胞裂解液用于免疫共沉淀实验，Western Blotting分别检测Flag和Myc的蛋白表达。D HEK293A细胞中将Myc-STAT3质粒或者Myc-STAT3^656-680D与LacZ质粒或者Flag-YAP-5SA质粒共转染24小时后，细胞给予PBS或者以10ng/mL浓度的IL-6处理30分钟或者60分钟。图为共聚焦显微镜下所拍摄的免疫荧光染色图片，左侧大图显示荧光抗体标记Myc，右上角图片显示DAPI标记细胞核(比例尺，10μm)。E HEK293A细胞中将Myc-STAT3质粒与LacZ质粒，Flag-YAP-5SA质粒或者Flag-YAP^△SH3bm质粒共转染24小时。抗Myc抗体用于STAT3的免疫共沉淀实验，Western Blotting分别检测CRM1，Flag和Myc的蛋白表达。F在BAECs中将GFP-STAT3质粒或者GFP-STAT3^M524-537质粒与LacZ或者Flag-YAP-5SA共同转染24小时后，细胞分别给予PBS或者IL-6(10ng/mL)处理30分钟或60分钟，或者LMB(10ng/mL)处理4小时。图为共聚焦显微镜下所拍摄的免疫荧光染色图片，左侧大图荧光显示的为GFP，右上角小图显示DAPI标记细胞核(比例尺，10μm)。

图8为STAT3与YAP蛋白的相互作用对内皮细胞成血管功能及血管新生的影响。

A-D HUVECs转染YAP或者对照siRNA 24小时后，用胰酶消化并将其分别种在基质胶中或用于Transwell小室，分别用给予细胞如图所示处理4小时。A光镜下拍摄的不同处理组形成的基质胶管状结构(比例尺，100μm)。B荧光显微镜所拍摄的不同处理组中穿过Tsanswell小室的DAPI标记的内皮细胞细胞核(比例尺，100μm)。C计数低倍镜下5个随机视野中管状结构长度(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝5)。D不同处理组中每5个随机视野中迁移的内皮细胞数量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝5)。E-H HUVECs转染STAT3或者对照siRNA 24小时后，用胰酶消化并将其分别种在基质胶中或用于Transwell小室，分别用给予细胞如图所示处理4小时。E光镜下拍摄的不同处理组形成的基质胶管状结构(比例尺，100μm)。F荧光显微镜所拍摄的不同处理组中穿过Tsanswell小室的DAPI标记的内皮细胞细胞核(比例尺，100μm)。G计数低倍镜下5个随机视野中管状结构长度(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝5)。H不同处理组中每5个随机视野中迁移的内皮细胞数量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，n＝5)。I-K将500μL含有PBS或者IL-6(10ng/mL)基质胶注入YAP^flox小鼠或者EC-YAP^Tg小鼠皮下，移植14天后将基质胶块组织取出。I大体观察基质胶胶块颜色。J将基质胶胶块包埋后切片，用免疫荧光染色观察毛细血管生成情况，CD31标记内皮细胞，DAPI标记细胞核(比例尺，100μm)。K统计每只小鼠的基质胶切片中，低倍镜下10个视野CD31阳性的细胞的数量(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，每组小鼠n＝6)。

图9为YAP蛋白促进小鼠视网膜血管新生作用依赖转录因子STAT3。

A小鼠视网膜血管生成实验策略的示意图。箭头所示为新生小鼠出生后第3和4天以1mg/kg浓度经腹腔注射S3I-201或者VP。B-D YAP^flox和EC-YAP^Tg小鼠经不同处理后视网膜铺片进行荧光植物凝集素B4(isolecin B4)染色。B完整的视网膜铺片，白色为荧光标记的血管网络，白色虚线圆圈代表的是未给药的EC-YAP^Tg组小鼠血管向外生长的轮廓(比例尺，800μm)。C-D为高倍镜下视网膜血管结构，C显示为血管分支结构(比例尺，20μm)，D显示为顶细胞结构(比例尺，20μm)。E-H分别为视网膜血管覆盖面积占总视网膜面积比例、血管网外周长度、视网膜血管结构中每5个视野分支点数量和顶细胞数量的定量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，每组小鼠n＝6)。I高倍镜下顶细胞伸出的丝状伪足(比例尺，5μm)。J每100μm结构中丝状伪足数量的定量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，每组小鼠n＝6)。

图10为ANG2中和抗体阻断了过表达YAP促进的小鼠视网膜血管新生。

A小鼠视网膜血管生成实验策略的示意图。箭头所示为每只新生EC-YAP^Tg小鼠出生后第1和3天经腹腔注射对照IgG或者ANG2中和抗体10μg。B-D EC-YAP^Tg小鼠经不同处理后视网膜铺片进行荧光植物凝集素B4(isolecin B4)染色。B为完整的视网膜铺片，白色为荧光标记的血管网络，白色虚线圆圈代表的是给予对照IgG注射的EC-YAP^Tg组小鼠血管向外生长的轮廓(比例尺，400μm)。C-D为高倍镜下视网膜血管结构，C显示为血管分支结构(比例尺，20μm)，D显示为顶细胞结构(比例尺，20μm)。E-H分别为血管网外周长度、视网膜血管覆盖面积占总视网膜面积比例、视网膜血管结构中每5个视野分支点数量和顶细胞数量的定量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，每组小鼠n＝6)。I高倍镜下顶细胞伸出的丝状伪足(比例尺，5μm)J每100μm结构中丝状伪足数量的定量统计分析(数据显示为Mean±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双向方差分析，每组小鼠n＝6)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、过表达YAP蛋白促进内皮细胞功能改变和血管新生

1、内皮特异性YAP蛋白过表达小鼠的YAP表达鉴定

为研究体内YAP蛋白在后天血管新生中的作用，构建了内皮细胞特异性过表达YAP的小鼠模型。

由YAP^flox杂合小鼠(Nature.2016；540:579-582，同时可购于南京大学-南京生物医药研究院)与Tie-2CRE杂合小鼠(材料记载在如下文献中：Nature.2016；540:579-582)交配后繁育获得同窝出生的野生型(YAP^flox)小鼠和YAP基因内皮细胞特异性过表达(EC-YAP^Tg)小鼠。

分离YAP^flox小鼠和EC-YAP^Tg小鼠肺内皮细胞，分别提取蛋白(用RIPA裂解液

北京索莱宝科技有限公司，货号R0010提取)和RNA(用RNA提取试剂盒北京BioTeke公司，货号RP3402提取)。

用Western Blotting来检测YAP^flox小鼠和EC-YAP^Tg小鼠中的YAP蛋白在肺内皮细胞中的表达(一抗：兔抗YAP多克隆抗体，美国Cell Signaling Technology公司，货号14074；二抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，美国ProteinTech公司，货号SA00001-2)。

结果如图1A和B，EC-YAP^Tg小鼠内皮细胞中YAP蛋白表达比野生型高3.5倍左右。

2、内皮细胞特异性过表达YAP促进小鼠视网膜中血管新生

为明确YAP在生理性血管新生中的作用，建立了内皮细胞特异性过表达YAP小鼠的视网膜新生血管模型。

将出生后第5天的野生型(YAP^flox)小鼠和YAP基因内皮细胞特异性过表达(EC-YAP^Tg)小鼠麻醉后取视网膜铺片。用植物凝集素B4染色上述视网膜铺片，对视网膜结构进行分析，结果显示与野生型YAP^flox小鼠相比，EC-YAP^Tg小鼠中视网膜血管结构中，血管网辐射长度以及血管网面积明显增加。同时高倍镜视野中，血管网分支点和顶细胞的数量，以及顶细胞伸出的丝状伪足数量明显增多(如图2)。

以上结果表明，内皮细胞过表达YAP明显促进了出生早期视网膜中的血管新生。

3、内皮细胞过表达YAP促进小鼠移植肿瘤中的血管新生

为进一步明确YAP蛋白对病理性血管新生的影响，利用肿瘤组织异体移植模型来探究内皮细胞过表达YAP蛋白在其中的作用。

将内皮细胞过表达YAP小鼠(EC-YAP^Tg小鼠)和其同窝出生的野生型小鼠(YAP^flox小鼠)进行同种异体Lewis肺癌移植(材料和方法记载在如下文献中：Cancer Cell.2003 Jul；4(1):31-9.Figure 1)，以观察肿瘤组织中的新生血管情况。

接种后每隔七天检测肿瘤生长情况，随着移植天数的增加，YAP^flox小鼠体表肿块体积逐渐增大，而EC-YAP^Tg小鼠体表肿块体积增加更为明显(如图3A)。21天后，取出肿瘤组织观察并称重，内皮特异性过表达YAP明显促进肿瘤生长(如图3B，C)。

对肿瘤组织包埋切片后，进行免疫荧光染色分析(方法见Nature.2016；540:579-582。染色抗体为CD31,美国Abcam公司货号ab28364)EC-YAP^Tg小鼠和YAP^flox小鼠肿瘤组织中的新生血管，荧光标记的内皮细胞标志物CD31显示了在EC-YAP^Tg小鼠移植肿瘤中新生血管较YAP^flox小鼠明显增多(如图3D)。以上结果表明，内皮细胞中YAP蛋白对肿瘤组织血管新生起着至关重要的作用。

实施例2、内皮细胞中YAP蛋白和转录因子STAT3相互作用

上述实施例1中已经证明YAP蛋白促进血管新生，为探寻在内皮细胞中可能与YAP蛋白结合的转录因子，在高表达YAP蛋白的HUVEC中进行免疫共沉淀及蛋白组学分析。

图4A显示了蛋白组学分析流程。

在HUVECs(美国Lonza公司，货号CC-2519)中分别转染FLAG-YAP过表达腺病毒(将人源的YAP蛋白编码基因全长序列序列3)导入到GV314载体(上海吉凯基因化学技术有限公司，GV314质粒)中，克隆位点为BamHI/AgeI，并进一步包装成腺病毒)和GFP对照病毒(材料和方法记载在如下文献中：Biochem Biophys Res Commun.2016 Aug 19；477(2):247-54)24小时后，得到高表达Flag-YAP蛋白的HUVECs和表达GFP对照的HUVECs。

将细胞裂解(RIPA裂解液北京索莱宝科技有限公司，货号R0010)得到的全细胞裂解液与抗Flag的免疫磁珠(美国Sigma-Aldrich公司，货号：M8823)4℃孵育1-3小时，之后加入peptides竞争结合FLAG(美国Sigma-Aldrich公司，货号F4799)洗脱目的蛋白15分钟，得到的含蛋白复合体溶液。

将含蛋白复合体溶液进行SDS-PAGE电泳，将电泳后的凝胶进行银染显色后得到两组的差异蛋白，即为与YAP蛋白结合的目标蛋白(如图4B)。将得到的差异蛋白进行质谱分析，得到许多已知与YAP结合的蛋白包括AMOT，LATS1和TEAD家族成员等，图4C显示了质谱分析得到的与YAP结合的蛋白得分及丰度。发现，在HUVECs中与YAP结合的蛋白中，STAT3的得分及丰度列于所有蛋白之首。

因此，进一步将得到的含蛋白复合体的溶液进行Western Blotting(兔抗YAP抗体，美国Cell Signaling Technology公司，货号14074；鼠抗STAT3抗体，美国CellSignaling Technology公司，货号9139；二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)，美国ProteinTech公司，货号SA00001-1以及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，美国ProteinTech公司，货号SA00001-2)，发现YAP与STAT3存在结合(如图4D)。

为探究YAP与STAT3在内皮细胞中结合的亚细胞定位，在分离得到内皮细胞细胞浆与细胞核组分(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号78833，按照试剂盒说明步骤提取)中，用YAP和STAT3抗体(兔抗YAP抗体，美国Cell Signaling Technology公司，货号14074；鼠抗STAT3抗体，美国Cell Signaling Technology公司，货号9139)分别进行免疫共沉淀实验。结果显示，在细胞浆和细胞核中都可以检测到YAP与STAT3相互结合(图4E)。

以上结果表明，STAT3与YAP蛋白在细胞核中可以相互结合，可能是内皮细胞中发挥重要转录调控作用。

实施例3、内皮细胞中YAP蛋白在延长转录因子STAT3在细胞核中滞留中的应用

STAT3可以被IL-6激活，并作为与一个DNA结合的转录因子，调控急性炎症反应中的相关基因表达，激活的STAT3转位入核，但细胞核中的STAT3不能持续停留发挥转录活性，而是持续穿梭于细胞胞浆和细胞核之间。

上述实施例2实验表明STAT3与YAP蛋白在细胞核中可以相互结合，为了研究STAT3与YAP蛋白在细胞核中相互结合会产生什么影响，先用诱导STAT3进入内皮细胞核的物质如IL-6进行刺激，具体如下：

1、YAP蛋白延长IL-6介导的STAT3在内皮细胞细胞核中的转位

为研究YAP蛋白是否影响IL-6对STAT3的激活，在高表达YAP蛋白的HUVEC中，观察IL-6介导的STAT3在细胞胞质和细胞核中穿梭的情况。

具体方法如下：

在HUVEC中分别转染GFP对照病毒和FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，给予10ng/mL的IL-6处理0、15、30和60分钟后，分别提取全细胞、细胞胞浆和细胞核的蛋白裂解液(RIPA裂解液北京索莱宝科技有限公司，货号R0010)，进行Western Blotting以检测STAT3的表达情况(一抗为鼠抗STAT3抗体，美国Cell Signaling Technology公司，货号9139，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)，美国ProteinTech公司，货号SA00001-1)。

在转染GFP对照病毒组，IL-6处理15分钟时，可见STAT3第705位酪氨酸磷酸化(一抗为兔抗phospho-STAT3(Tyr705)抗体，美国Cell Signaling Technology公司，货号9145，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，美国ProteinTech公司，货号SA00001-2)表达明显增高，在30分钟时开始下降，并在60分钟时基本恢复至静息水平，而总的STAT3蛋白表达水平未见明显变化；但与之对应的是，STAT3蛋白在细胞核中15分钟时间点明显增多，并持续到30分钟，在60分钟后恢复至静息水平。

在转染高表达YAP蛋白组，在全细胞裂解液中IL-6激活的STAT3第705位酪氨酸磷酸化水平同样在15分钟后增加并持续到30分钟，在60分钟开始下降；然而在细胞核中，IL-6处理后STAT3在细胞核中的积聚持续到60分钟(如图5A和B)。

同样，在HUVEC中分别转染GFP对照病毒和FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，给予10ng/mL的IL-6处理0、15、30和60分钟后，通过免疫荧光染色(方法记载在如下文献中：Nature.2016；540:579-582)观察STAT3在细胞中的定位。

1)处理后的细胞，弃去培养液，PBS洗，5分钟×3次；

2)4％多聚甲醛，室温放置10分钟，PBS洗，5分钟×3次；

3)0.5％Triton X-100室温孵育15分钟，PBS洗，5分钟×3次；

4)山羊血清工作液37℃孵育30分钟；

5)将一抗按适当比例用PBS稀释混合，弃血清后，滴加，4℃湿盒过夜；

6)取出湿盒，PBS洗5分钟×3次；

7)荧光二抗按适当比例用PBS稀释混合，滴加，37℃孵育30分钟

8)PBS洗，5分钟×3次，用含DAPI的防荧光萃灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜镜下观察分析。

结果如图5C所示，右下角图片红色荧光标记STAT3，右上角蓝色荧光标记细胞核，左侧大图显示两种荧光共定位情况。在GFP对照病毒组，可见STAT3在IL-6诱导后15至30分钟积聚在细胞核中，在60分钟时已经游离在细胞浆中；而在FLAG-YAP过表达腺病毒组，STAT3在IL-6处理60分钟时，仍然持续积聚在细胞核中(如图5C和D)，表明YAP蛋白延长IL-6介导的STAT3在内皮细胞细胞核中的转位。

2、YAP蛋白对IL-6介导的STAT3转录活性的影响

为检测YAP蛋白对IL-6介导的STAT3转录活性的影响，用野生YAP蛋白(Flag-YAP-WT)和持续激活的YAP蛋白(Flag-YAP-5SA，因其5个可被LAST磷酸化的丝氨酸位点全部突变而持续激活)通过其与STAT3报告基因的结合来观察STAT3的转录活性。

在HEK293A细胞中，将STAT3荧光素酶报告基因质粒分别与LacZ(美国addgene公司，货号42560)，Flag-YAP-WT(美国addgene公司，货号18881)和Flag-YAP-5SA(美国addgene公司，货号33103)质粒共转24小时后，给予细胞IL-6或PBS处理24小时后，检测荧光素酶的活性。同时共转β-gal质粒(美国addgene公司，货号8387)并检测β-gal活性作为内参。

结果显示(图5E)，IL-6刺激后，STAT3转录活性较未处理组升高近5倍；Flag-YAP-WT组，在IL-6刺激后STAT3转录活性较LacZ对照升高2倍；Flag-YAP-5SA组，在IL-6处理后STAT3转录活性较LacZ对照组和Flag-YAP-WT组均有明显升高。

以上结果表明，YAP蛋白与STAT3在细胞核中相互结合延长STAT3在细胞核中的滞留，从而增加STAT3的转录活性，提高细胞核中与血管新生相关基因如ANG2的表达，从而实现促进血管新生。

3、过表达YAP蛋白促进STAT3的转录活性

为进一步检测YAP对IL-6/STAT3通路的影响，在HUVEC中分别转染对照GFP病毒或者FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，给予细胞10ng/mL浓度的IL-6或者PBS处理4小时后，提取细胞mRNA并逆转录为cDNA，通过实时定量PCR方法检测STAT3下游相关目的基因(表1所示)。

表1 为STAT3下游相关目的基因的扩增引物

如图6A中所示，过表达YAP蛋白后，与Ad-GFP组相比YAP及其下游CTGF基因mRNA表达水平显著增高。Ad-GFP组经过IL-6处理后，STAT3下游基因肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)、血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4，ANGPLT4)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，CDKN1B)和内皮PAS结构域蛋白1(endothelial PAS domain-containing protein 1，EPAS1)等基因表达增加；同时，过表达YAP蛋白组经IL-6处理后，ADM、ANGPLT4、CDKN1B和EPAS1基因表达水平，较IL-6处理后的Ad-GFP组均有明显升高。以上结果表明，过表达YAP增强了IL-6/STAT3通路对其下游靶基因的调控。

ANG2是由激活的内皮细胞释放的自分泌因子，对血管生成和维持血管稳态具有重要的作用。因此，进一步探究了YAP与STAT3构成的转录复合体对ANG2的转录是否具有调控作用。

在HUVEC中，转染FLAG-YAP过表达腺病毒或对照GFP病毒24小时后，给予细胞IL-6处理6小时后，用实时定量PCR检测ANG2mRNA表达水平(引物序列见表1)。

在对照GFP病毒组，IL-6处理后，ANG2mRNA表达升高；而FLAG-YAP过表达腺病毒组与对照GFP病毒组相比，ANG2mRNA表达未见明显升高，FLAG-YAP过表达腺病毒组经IL-6处理后，ANG2mRNA表达较经IL-6处理的对照GFP病毒组升高近3倍，与FLAG-YAP过表达腺病毒未经IL-6处理组相比ANG2mRNA表达有近12倍增高(如图6C)。以上结果表明，YAP蛋白促进了IL-6对ANG2的转录调控。

继而在HUVEC中感染FLAG-YAP过表达腺病毒24小时后，给予细胞IL-6处理或在给予IL-6处理的同时给予STAT3特异性抑制剂S3I-201(美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号sc-204304)。结果显示，S3I-201阻断了IL-6诱导的ANG2 mRNA表达水平的增加，由此说明，STAT3参与IL-6诱导的ANG2的转录调控。

另外，细霉素B(leptomycin B，LMB，美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号sc-358688)是细胞核输出受体的抑制剂，可以抑制STAT3的出核，延长其在细胞核中停留的时间。将HUVECs以10ng/mL浓度预处理LMB 4小时，未预处理的HUVEC和经过预处理的HUVEC分别给予PBS或者IL-6处理4小时。LMB明显增加了IL-6诱导的ANG2基因的表达(如图6B)。

进一步，为验证YAP与STAT3形成的转录复合体对ANG2基因转录的影响，通过实时定量PCR对染色质免疫沉淀后的DNA进行定量分析(方法可见：Circ Res.2014 May 9；114(10):1576-84，用到的ANG2的序列是上游5’-TCTTTAATTGGTTCCCTTAG-3’，下游5’-TAGGCTTCACCAGACAACC-3’)。HUVEC中分别转染对照GFP并和FLAG-YAP过表达腺病毒)24小时后，以10ng/mL浓度给予IL-6或者PBS处理4小时。经IL-6处理后的对照组与PBS处理后的对照组相比ANG2启动子上STAT3的蛋白含量明显增多，YAP蛋白含量未见明显变化；而在过表达YAP蛋白组经IL-6处理后，STAT3和YAP蛋白在ANG2启动子上的富集增多程度明显高于经IL-6处理后的对照组。

以上结果表明，内皮细胞核中YAP蛋白与STAT的结合对延长STAT3在细胞核中停留和增强其转录活性具有重要作用(如图6E)。

实施例4、YAP蛋白与STAT3结合遮挡了STAT3的出核信号

STAT3在细胞核和细胞胞浆的穿梭反映了STAT3入核和出核转运的动态平衡。为探究YAP延长STAT3在细胞核中聚集的机制，通过Z-DOCK程序构建了YAP和STAT3相互作用模型，并绘出了YAP和STAT3相互作用的潜在区域。图7A所示为预测的STAT3/YAP复合体的3D结构，如图7B所示，YAP SH3结合结构域可能与STAT3结构中第656至680位氨基酸肽段相互作用，这一结合可能会导致相邻的STAT3结构中位于第524至535位的核输出信号(NES)的遮盖。

为验证这一结合位点，构建了携带Myc标签的野生型STAT3(Myc-STAT3，将STAT3全长基因(序列4)片段插入到pcDNA3/Myc的EcoRI/NotI位点得到的质粒)和携带Myc标签的删除第656-680位氨基酸序列的STAT3缺失突变质粒(Myc-STAT3^656-680D)(将STAT3全长缺失氨基酸656-680位对应基因片段的序列插入到pcDNA3/Myc(J Biol Chem.2006；281(28):19489-500.))的EcoRI/NotI位点。将这两种质粒与Flag-YAP-5SA或携带Flag标签的YAP蛋白SH3结合结构域缺失突变质粒(Flag-YAP^ΔSH3bm)(美国addgene公司，货号59141)在HEK293A细胞中共转染，并通过相互免疫共沉淀(方法见Nat Commun.2017Mar 31；8:14866.)来检测不同蛋白的相互作用情况。如图7C所示，STAT3蛋白与YAP5SA突变蛋白具有强烈的相互作用，而STAT3缺失突变质粒不能与YAP5SA蛋白相互结合，YAP蛋白SH3结合结构域缺失突变蛋白同样也不能与全长STAT3蛋白结合。

以上结果表明，STAT3第656-680位的氨基酸序列和YAP SH3结合结构域分别是构成STAT3和YAP转录复合体的必要蛋白结构。

为研究预测的STAT3与YAP蛋白结合的区域是否影响STAT3在细胞核中的聚集，在HEK293A细胞中将Flag-YAP-5SA与Myc-STAT3或Myc-STAT3^656-680D共转染24小时后，用IL-6处理30分钟或60分钟。如图7D所示，红色荧光标记带Myc标签的STAT3，共聚焦显微镜所示的图片显示，在未转染Flag-YAP-5SA的细胞中，IL-6处理后细胞中STAT3在聚集细胞核中，而在60分钟时STAT3已经移出细胞核分布在细胞胞浆中；而在共转染Flag-YAP-5SA的细胞中，IL-6处理60分钟后Myc-STAT3仍停留在细胞核中，这一结果与之前在HUVEC中得到的结果一致。而在Myc-STAT3^656-680D与Flag-YAP-5SA共转染的细胞中，并未见YAP蛋白延长STAT3在IL-6诱导下在细胞核中聚集。

STAT3转运出细胞核是由CRM1介导的，因此假设YAP蛋白与STAT3的结合可能遮挡了STAT3的出核信号并影响CRM1介导的STAT3的出核转运。为验证这一假说，将携带GFP标签的野生型STAT3质粒(GFP-STAT3)或者第524至537位的氨基酸片段缺失突变的STAT3质粒(GFP-STAT3^M524-537，将STAT3全长缺失氨基酸524-537位对应基因片段的序列插入到pcDNA3/GFP(美国Addgene公司，货号74165)的EcoRI/NotI位点)与Flag-YAP-5SA或者空白对照质粒在牛主动脉内皮细胞(处实(上海)生物科技有限公司，货号B304-05)中共转染24小时后，给予IL-6处理30或者60分钟。如图7F所示，共聚焦荧光图片显示，在IL-6处理60分钟后，第524至537位的氨基酸片段缺失突变的STAT3仍聚集在细胞核中，这一作用与Flag-YAP-5SA延长STAT3在细胞核中的聚集效果相同。进一步，在HEK 293 A细胞中将Myc-STAT3与Flag-YAP-5SA或者Flag-YAP^ΔSH3bm共转染24小时后，进行免疫共沉淀实验。如图7E所示，Flag-YAP-5SA减少了CRM1与STAT3的结合，表明YAP和STAT3细胞核内结合削弱了CRM1与STAT3的结合，从而实现延长STAT3在细胞核中的滞留。

实施例5、YAP和STAT3相互结合在内皮细胞血管新生中的作用

为检测YAP和STAT3相互结合是否在内皮细胞促血管新生过程中发挥作用，在HUVEC中分别转染YAP或者STAT3小分子干扰RNA(购于美国Santa Cruz Biotechnology公司，YAP siRNA货号sc-38637；STAT3siRNA货号sc-29493。转染按照siRNA提供的步骤进行)24小时后，进行体外基质胶成血管实验和Transwell小室迁移实验(Transwell小室购买于美国Cell Biolabs,INC,，货号CBA-110，具体方法：

将HUVEC铺在培养皿中，用YAP或者对照siRNA转染24小时，待细胞生长至70-80％时，血清饥饿过夜；

弃培养基，用PBS洗细胞表面2次，加入胰酶消化，镜下观察发现细胞变圆后用培养基(DMEM+0.2％BSA)终止消化，重悬细胞；

将大约10⁵个细胞接种于预先用0.1％Ⅰ型胶原孵育过的Transwell小室内，然后将含有VEGF(100ng/mL)或IL-6(10ng/mL)的培养基(分组如图8所示)加入到24孔板内即小室外部；

孵育4小时后用多聚甲醛固定细胞，切下小室底部，下表面向上放于载玻片上，滴加含DAPI的封片剂封片，在荧光显微镜下观察，计数细胞。

如图8所示，VEGF或IL-6处理分别增加了内皮细胞的迁移和血管生成功能，而VEGF和IL-6联合用药比分别用药处理更大程度地增加了内皮细胞的迁移和血管生成能力。用小干扰RNA敲低YAP或者STAT3减弱了VEGF和IL-6诱导内皮细胞迁移和成管功能。

进一步在体内验证YAP和STAT3复合体在血管新生中的作用，利用内皮细胞特异性过表达小鼠基质胶血管生成模型，分别在YAP^flox小鼠或者EC-YAP^Tg小鼠皮下移植含有IL-6或者PBS的基质胶(购于美国BD Biosciences公司，货号356234)14天，以观察基质胶中血管生成情况。如图8I所示，14天后取出包埋的基质胶，IL-6诱导的血管生成在EC-YAP^Tg小鼠中明显多于对照YAP^flox小鼠。分析基质胶中CD31染色阳性区域的面积，IL-6诱导的新生血管密度在EC-YAP^Tg小鼠中明显多于对照YAP^flox小鼠。以上结果表明，内皮细胞中YAP和STAT3相互结合对血管新生具有重要调控作用。

实施例6、YAP蛋白促进小鼠视网膜血管新生作用依赖转录因子STAT3

为在体内验证内皮细胞过表达YAP蛋白增强的视网膜血管新生是否通过STAT3，还是通过经典的YAP蛋白转录伴侣TEAD。如图9所示，在新生的YAP^flox小鼠和EC-YAP^Tg小鼠中给予STAT3特异性抑制剂S3I-201(美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号sc-204304)和TEAD抑制剂维替泊芬(verteporfin，VP，美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号sc-475698)刺激(新生鼠出生后第3天和第4天腹腔注射给药，剂量为1mg/kg)，来观察新生小鼠视网膜中血管生成情况。

EC-YAP^Tg小鼠与YAP^flox小鼠相比呈高血管新生状态，使用STAT3抑制剂后视网膜血管网的外周长及面积并未增加，同时观察血管网络分支节点、顶细胞数量以及顶细胞伸出的丝状伪足数量并未增加。而使用维替泊芬并未阻断内皮细胞过表达YAP蛋白诱导的血管网络生成状态。以上结果表明，YAP蛋白促进血管新生的作用是通过STAT3而不是TEAD，说明在内皮细胞中YAP和STAT3相互结合在血管新生中起着决定性作用。

实施例7、STAT3促进的ANG2生成在YAP蛋白介导的血管新生中的作用

为探究转录因子STAT3下游基因ANG2在YAP蛋白介导的血管新生中的作用，在新生的内皮特异性过表达YAP小鼠出生后第1和3天中给予ANG2中和抗体或者对照IgG抗体(购于美国AdipoGen Life Sciences公司，ANG2中和抗体货号AG-27B-0016PF，对照IgG抗体货号AG-35B-0008。腹腔注射给药，剂量为每只小鼠每次10μg)，来观察小鼠视网膜中血管新生情况。

如图10所示，通过ANG2中和抗体处理后的EC-YAP^Tg小鼠视网膜中血管新生较对照IgG组受到明显抑制，血管网外周周长及血管网面积减少，同时血管网络分支节点、顶细胞的数量以及顶细胞伸出丝状伪足的数量明显降低。以上结果表明，YAP蛋白的促血管新生作用依赖其与STAT3的细胞核内结合而诱导的下游ANG2靶基因的表达。

序列表

<110> 天津医科大学

<120> 内皮细胞YAP和STAT3相互结合在促进内皮细胞血管新生中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 508

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<22>

<400> 1

Met Asp Pro Gly Gln Gln Pro Pro Pro Gln Pro Ala Pro Gln Gly Gln

1 5 10 15

Gly Gln Pro Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gly Gln Gly Pro Pro Ser Gly

20 25 30

Pro Gly Gln Pro Ala Pro Ala Ala Thr Gln Ala Ala Pro Gln Ala Pro

35 40 45

Pro Ala Gly His Gln Ile Val His Val Arg Gly Asp Ser Glu Thr Asp

50 55 60

Leu Glu Ala Leu Phe Asn Ala Val Met Asn Pro Lys Thr Ala Asn Val

65 70 75 80

Pro Gln Thr Val Pro Met Arg Leu Arg Lys Leu Pro Asp Ser Phe Phe

85 90 95

Lys Pro Pro Glu Pro Lys Ser His Ser Arg Gln Ala Ser Thr Asp Ala

100 105 110

Gly Thr Ala Gly Ala Leu Thr Pro Gln His Val Arg Ala His Ser Ser

115 120 125

Pro Ala Ser Leu Gln Leu Gly Ala Val Ser Pro Gly Thr Leu Thr Pro

130 135 140

Thr Gly Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Thr Pro Thr Ala Gln His Leu

145 150 155 160

Arg Gln Ser Ser Phe Glu Ile Pro Asp Asp Val Pro Leu Pro Ala Gly

165 170 175

Trp Glu Met Ala Lys Thr Ser Ser Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn His

180 185 190

Ile Asp Gln Thr Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Ala Met Leu Ser

195 200 205

Gln Met Asn Val Thr Ala Pro Thr Ser Pro Pro Val Gln Gln Asn Met

210 215 220

Met Asn Ser Ala Ser Gly Pro Leu Pro Asp Gly Trp Glu Gln Ala Met

225 230 235 240

Thr Gln Asp Gly Glu Ile Tyr Tyr Ile Asn His Lys Asn Lys Thr Thr

245 250 255

Ser Trp Leu Asp Pro Arg Leu Asp Pro Arg Phe Ala Met Asn Gln Arg

260 265 270

Ile Ser Gln Ser Ala Pro Val Lys Gln Pro Pro Pro Leu Ala Pro Gln

275 280 285

Ser Pro Gln Gly Gly Val Met Gly Gly Ser Asn Ser Asn Gln Gln Gln

290 295 300

Gln Met Arg Leu Gln Gln Leu Gln Met Glu Lys Glu Arg Leu Arg Leu

305 310 315 320

Lys Gln Gln Glu Leu Leu Arg Gln Val Arg Pro Gln Ala Met Arg Asn

325 330 335

Ile Asn Pro Ser Thr Ala Asn Ser Pro Lys Cys Gln Glu Leu Ala Leu

340 345 350

Arg Ser Gln Leu Pro Thr Leu Glu Gln Asp Gly Gly Thr Gln Asn Pro

355 360 365

Val Ser Ser Pro Gly Met Ser Gln Glu Leu Arg Thr Met Thr Thr Asn

370 375 380

Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Ser Gly Thr Tyr His Ser Arg Asp Glu

385 390 395 400

Ser Thr Asp Ser Gly Leu Ser Met Ser Ser Tyr Ser Val Pro Arg Thr

405 410 415

Pro Asp Asp Phe Leu Asn Ser Val Asp Glu Met Asp Thr Gly Asp Thr

420 425 430

Ile Asn Gln Ser Thr Leu Pro Ser Gln Gln Asn Arg Phe Pro Asp Tyr

435 440 445

Leu Glu Ala Ile Pro Gly Thr Asn Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Gly

450 455 460

Asp Gly Met Asn Ile Glu Gly Glu Glu Leu Met Pro Ser Leu Gln Glu

465 470 475 480

Ala Leu Ser Ser Asp Ile Leu Asn Asp Met Glu Ser Val Leu Ala Ala

485 490 495

Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ser Phe Leu Thr Trp Leu

500 505

<210> 2

<211> 770

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<22>

<400> 2

Met Ala Gln Trp Asn Gln Leu Gln Gln Leu Asp Thr Arg Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gln Leu His Gln Leu Tyr Ser Asp Ser Phe Pro Met Glu Leu Arg Gln

20 25 30

Phe Leu Ala Pro Trp Ile Glu Ser Gln Asp Trp Ala Tyr Ala Ala Ser

35 40 45

Lys Glu Ser His Ala Thr Leu Val Phe His Asn Leu Leu Gly Glu Ile

50 55 60

Asp Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln

65 70 75 80

His Asn Leu Arg Arg Ile Lys Gln Phe Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Glu

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Ala Asn His Pro Thr Ala Ala Val Val Thr Glu Lys Gln Gln Met Leu

130 135 140

Glu Gln His Leu Gln Asp Val Arg Lys Arg Val Gln Asp Leu Glu Gln

145 150 155 160

Lys Met Lys Val Val Glu Asn Leu Gln Asp Asp Phe Asp Phe Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Leu Lys Ser Gln Gly Asp Met Gln Asp Leu Asn Gly Asn Asn

180 185 190

Gln Ser Val Thr Arg Gln Lys Met Gln Gln Leu Glu Gln Met Leu Thr

195 200 205

Ala Leu Asp Gln Met Arg Arg Ser Ile Val Ser Glu Leu Ala Gly Leu

210 215 220

Leu Ser Ala Met Glu Tyr Val Gln Lys Thr Leu Thr Asp Glu Glu Leu

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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370 375 380

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Asn Gly Ser Leu Ser Ala Glu Phe Lys His Leu Thr Leu Arg Glu Gln

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Ser Asn Ile Cys Gln Met Pro Asn Ala Trp Ala Ser Ile Leu Trp Tyr

465 470 475 480

Asn Met Leu Thr Asn Asn Pro Lys Asn Val Asn Phe Phe Thr Lys Pro

485 490 495

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Ser Ser Thr Thr Lys Arg Gly Leu Ser Ile Glu Gln Leu Thr Thr Leu

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530 535 540

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545 550 555 560

Phe Trp Val Trp Leu Asp Asn Ile Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Ile

565 570 575

Leu Ala Leu Trp Asn Glu Gly Tyr Ile Met Gly Phe Ile Ser Lys Glu

580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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625 630 635 640

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Leu Tyr Pro Asp Ile Pro Lys Glu Glu Ala Phe Gly Lys Tyr Cys Arg

675 680 685

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Tyr Leu Lys Thr Lys Phe Ile Cys Val Thr Pro Thr Thr Cys Ser Asn

705 710 715 720

Thr Ile Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Thr Leu Asp Ser Leu Met Gln

725 730 735

Phe Gly Asn Asn Gly Glu Gly Ala Glu Pro Ser Ala Gly Gly Gln Phe

740 745 750

Glu Ser Leu Thr Phe Asp Met Glu Leu Thr Ser Glu Cys Ala Thr Ser

755 760 765

Pro Met

770

<210> 3

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<22>

<400> 3

atggatcccg ggcagcagcc gccgcctcaa ccggcccccc agggccaagg gcagccgcct 60

tcgcagcccc cgcaggggca gggcccgccg tccggacccg ggcaaccggc acccgcggcg 120

acccaggcgg cgccgcaggc accccccgcc gggcatcaga tcgtgcacgt ccgcggggac 180

tcggagaccg acctggaggc gctcttcaac gccgtcatga accccaagac ggccaacgtg 240

ccccagaccg tgcccatgag gctccggaag ctgcccgact ccttcttcaa gccgccggag 300

cccaaatccc actcccgaca ggccagtact gatgcaggca ctgcaggagc cctgactcca 360

cagcatgttc gagctcattc ctctccagct tctctgcagt tgggagctgt ttctcctggg 420

acactgaccc ccactggagt agtctctggc ccagcagcta cacccacagc tcagcatctt 480

cgacagtctt cttttgagat acctgatgat gtacctctgc cagcaggttg ggagatggca 540

aagacatctt ctggtcagag atacttctta aatcacatcg atcagacaac aacatggcag 600

gaccccagga aggccatgct gtcccagatg aacgtcacag cccccaccag tccaccagtg 660

cagcagaata tgatgaactc ggcttcaggt cctcttcctg atggatggga acaagccatg 720

actcaggatg gagaaattta ctatataaac cataagaaca agaccacctc ttggctagac 780

ccaaggcttg accctcgttt tgccatgaac cagagaatca gtcagagtgc tccagtgaaa 840

cagccaccac ccctggctcc ccagagccca cagggaggcg tcatgggtgg cagcaactcc 900

aaccagcagc aacagatgcg actgcagcaa ctgcagatgg agaaggagag gctgcggctg 960

aaacagcaag aactgcttcg gcaggtgagg ccacaggcaa tgcggaatat caatcccagc 1020

acagcaaatt ctccaaaatg tcaggagtta gccctgcgta gccagttacc aacactggag 1080

caggatggtg ggactcaaaa tccagtgtct tctcccggga tgtctcagga attgagaaca 1140

atgacgacca atagctcaga tcctttcctt aacagtggca cctatcactc tcgagatgag 1200

agtacagaca gtggactaag catgagcagc tacagtgtcc ctcgaacccc agatgacttc 1260

ctgaacagtg tggatgagat ggatacaggt gatactatca accaaagcac cctgccctca 1320

cagcagaacc gtttcccaga ctaccttgaa gccattcctg ggacaaatgt ggaccttgga 1380

acactggaag gagatggaat gaacatagaa ggagaggagc tgatgccaag tctgcaggaa 1440

gctttgagtt ctgacatcct taatgacatg gagtctgttt tggctgccac caagctagat 1500

aaagaaagct ttcttacatg gttatag 1527

<210> 4

<211> 2313

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<22>

<400> 4

atggcccaat ggaatcagct acagcagctt gacacacggt acctggagca gctccatcag 60

ctctacagtg acagcttccc aatggagctg cggcagtttc tggccccttg gattgagagt 120

caagattggg catatgcggc cagcaaagaa tcacatgcca ctttggtgtt tcataatctc 180

ctgggagaga ttgaccagca gtatagccgc ttcctgcaag agtcgaatgt tctctatcag 240

cacaatctac gaagaatcaa gcagtttctt cagagcaggt atcttgagaa gccaatggag 300

attgcccgga ttgtggcccg gtgcctgtgg gaagaatcac gccttctaca gactgcagcc 360

actgcggccc agcaaggggg ccaggccaac caccccacag cagccgtggt gacggagaag 420

cagcagatgc tggagcagca ccttcaggat gtccggaaga gagtgcagga tctagaacag 480

aaaatgaaag tggtagagaa tctccaggat gactttgatt tcaactataa aaccctcaag 540

agtcaaggag acatgcaaga tctgaatgga aacaaccagt cagtgaccag gcagaagatg 600

cagcagctgg aacagatgct cactgcgctg gaccagatgc ggagaagcat cgtgagtgag 660

ctggcggggc ttttgtcagc gatggagtac gtgcagaaaa ctctcacgga cgaggagctg 720

gctgactgga agaggcggca acagattgcc tgcattggag gcccgcccaa catctgccta 780

gatcggctag aaaactggat aacgtcatta gcagaatctc aacttcagac ccgtcaacaa 840

attaagaaac tggaggagtt gcagcaaaaa gtttcctaca aaggggaccc cattgtacag 900

caccggccga tgctggagga gagaatcgtg gagctgttta gaaacttaat gaaaagtgcc 960

tttgtggtgg agcggcagcc ctgcatgccc atgcatcctg accggcccct cgtcatcaag 1020

accggcgtcc agttcactac taaagtcagg ttgctggtca aattccctga gttgaattat 1080

cagcttaaaa ttaaagtgtg cattgacaaa gactctgggg acgttgcagc tctcagagga 1140

tcccggaaat ttaacattct gggcacaaac acaaaagtga tgaacatgga agaatccaac 1200

aacggcagcc tctctgcaga attcaaacac ttgaccctga gggagcagag atgtgggaat 1260

gggggccgag ccaattgtga tgcttccctg attgtgactg aggagctgca cctgatcacc 1320

tttgagaccg aggtgtatca ccaaggcctc aagattgacc tagagaccca ctccttgcca 1380

gttgtggtga tctccaacat ctgtcagatg ccaaatgcct gggcgtccat cctgtggtac 1440

aacatgctga ccaacaatcc caagaatgta aactttttta ccaagccccc aattggaacc 1500

tgggatcaag tggccgaggt cctgagctgg cagttctcct ccaccaccaa gcgaggactg 1560

agcatcgagc agctgactac actggcagag aaactcttgg gacctggtgt gaattattca 1620

gggtgtcaga tcacatgggc taaattttgc aaagaaaaca tggctggcaa gggcttctcc 1680

ttctgggtct ggctggacaa tatcattgac cttgtgaaaa agtacatcct ggccctttgg 1740

aacgaagggt acatcatggg ctttatcagt aaggagcggg agcgggccat cttgagcact 1800

aagcctccag gcaccttcct gctaagattc agtgaaagca gcaaagaagg aggcgtcact 1860

ttcacttggg tggagaagga catcagcggt aagacccaga tccagtccgt ggaaccatac 1920

acaaagcagc agctgaacaa catgtcattt gctgaaatca tcatgggcta taagatcatg 1980

gatgctacca atatcctggt gtctccactg gtctatctct atcctgacat tcccaaggag 2040

gaggcattcg gaaagtattg tcggccagag agccaggagc atcctgaagc tgacccaggt 2100

agcgctgccc catacctgaa gaccaagttt atctgtgtga caccaacgac ctgcagcaat 2160

accattgacc tgccgatgtc cccccgcact ttagattcat tgatgcagtt tggaaataat 2220

ggtgaaggtg ctgaaccctc agcaggaggg cagtttgagt ccctcacctt tgacatggag 2280

ttgacctcgg agtgcgctac ctcccccatg tga 2313

Claims (6)

1.YAP蛋白和STAT3蛋白在细胞核内相互结合在制备促进动物或人血管新生产品中的应用；

或YAP蛋白和STAT3蛋白在细胞核内相互结合在制备延长STAT3在细胞核滞留的产品中的应用；

或YAP蛋白和STAT3蛋白在细胞核内相互结合在制备提高STAT3在细胞核内的转录目的基因活性产品中的应用；所述目的基因为血管新生相关基因活性；所述血管新生相关基因为ADM、ANGPLT4、CDKN1B、EPAS1和/或ANG2；

或YAP蛋白和STAT3蛋白在细胞核内相互结合在制备削弱细胞核内CRM1和STAT3结合产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述血管新生相关基因为ADM、ANGPLT4、CDKN1B、EPAS1和/或ANG2。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细胞为动物或人的内皮细胞。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高STAT3在细胞核内的转录血管新生相关基因活性是通过延长STAT3在细胞核滞留实现的；

所述延长STAT3在细胞核滞留是通过削弱CRM1和STAT3在细胞核内结合实现的；

所述削弱CRM1和STAT3细胞核内结合是通过YAP蛋白和STAT3蛋白在细胞核内相互结合实现的。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述YAP蛋白和STAT3蛋白相互结合为YAP蛋白SH3结合结构域和STAT3蛋白的第656-680位的氨基酸相互结合；

所述YAP蛋白SH3结合结构域为所述YAP蛋白氨基酸序列第278-290位氨基酸。

6.阻断或抑制YAP蛋白与STAT3蛋白结合的物质在制备抑制VEGF或IL-6诱导内皮细胞迁移和/或血管生成功能产品中的应用；

所述物质为YAP或者STAT3小分子干扰RNA。

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