CN1431017A - 持续释放两种新生血管形成抑制因子的微囊物质及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种经藻酸盐包裹编码vasostatin和血管内皮细胞生长因子受体-1/-2基因的遗传工程细胞形成微囊化物质及其制备方法和应用。所制备的微囊物质皮下植入体内后能持续释放这两种因子而发挥抑制新生血管形成的作用。可用于治疗多种与血管生成相关的疾病和多种肿瘤(尤其是实体瘤)。克服了外源性蛋白治疗时存在的需要长期反复给药、所需使用剂量大、治疗成本高、增加病人费用以及纯化过程复杂使生产具有一定困难的缺点。
Description
本发明涉及基因工程技术和生物工程技术。特别是获得经藻酸盐包裹编码vasostatin和血管内皮细胞生长因子受体-1/-2因子的基因表达载体转染的细胞形成微囊化物质及其制备方法和应用。
血管生成(angiogenesis)是指从已存在的血管系统生成新的血管的过程。血管生成是正常组织生长与发育所必需的过程,而在成年人中,除了女性的生殖系统及机体的修复过程(如伤口愈合)有血管生成外,其它组织则少见,且其过程一般较短暂并受机体严格调控。与之相反,在某些病理性疾病中,如肿瘤、Kaposi肉瘤、类风湿性关节炎、增生性视网膜病、牛皮癣、硬皮病等,常发生无控制的血管发生。受机体严格调控的及不受严格调控的血管生成是以相似的方式进行的。毛细血管是由基底膜包裹内皮细胞和外膜细胞形成的。当血管生成开始时,由内皮细胞和血细胞释放的金属蛋白水解酶逐步侵蚀基底膜,然后位于血管腔内的内皮细胞伸出基底膜。在血管生长因子的刺激下,内皮细胞通过受侵蚀的基底膜迁移。迁移的内皮细胞从母血管分岔形成“新芽”,内皮细胞在这里开始有丝分裂和增殖。内皮细胞新芽彼此合并形成毛细环,从而产生新的血管。随着研究的不断深入,人们发现虽然血管生成抑制剂(如血管抑素、内皮抑素)的重组蛋白能抑制肿瘤生长(见O’Reilly MS,Holmgren L,Shing Y,Chen C,Rosenthal RA,Moses M,Lane WS,Cao Y,Sage EH,Folkman J.An-giostatin:A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metas-tases by a Lewis Lung Carcinoma.Cell,1994,79:315-328以及O’Reilly MS,Boehm T,Shing Y,Fukai N,Vasios G,Lane WS,Flynn E,Birkhead JR,Olsen BR,Folkman J.Endostatin:An endogenous inhibitor of angiogenesis andtumor growth.Cell,1997,88:277-285),但它们的临床应用却受到许多限制,如:用血管抑素治疗小鼠肿瘤时,在两周的皮下注射治疗中,小鼠每20克体重,治疗第一天需要给24微克重组蛋白,此后每天需要给12微克的药,才能达到抑制肿瘤的作用;用内皮抑素治疗时,每公斤体重小鼠每天需要高达10-20毫克的重组蛋白才能在15天的治疗中起作用。因此,重组蛋白治疗需要长期反复给药、所需剂量大又无疑会增加成本、纯化过程复杂使生产具有一定困难、大剂量应用给病人带来高额费用等。因此,有必要寻找一种新的方法来长期释放血管生成抑制因子、竞争性结合促血管形成因子的可溶性受体、或促血管形成因子的下调因子,达到有效治疗肿瘤的目的。
本发明正是为了克服上述现有技术中的不足之处而提供一种通过基因转移技术和生物工程技术,经制备获得经藻酸盐微囊化的两种抗新生血管形成因子的微囊物质,将其移植入机体后,能长期释放这两种抑制剂,持续产生相应蛋白,直接抑制新生血管形成。克服了外源性蛋白治疗时存在的使用剂量大、作用时间不持久、生产成本高的缺点。
本发明根据Vasostatin是内源性血管生成抑制剂,可溶性血管内皮细胞生长因子受体-1(sFLT-1)是目前仅知的内源性表达的VEGF抑制剂,对治疗肿瘤具有一定的价值。发明的主要技术内容:用藻酸盐包裹编码人vasostatin和人sFLT-1基因的载体转染的293细胞或A549肺癌细胞形成藻酸盐圆珠,载体为真核表达载体pcDNA3.1(+)和pSecTag2B,并分别能表达人sFLT-1和人vasostatin蛋白,形成的圆珠直径约300-500μm,每ml藻酸盐中含2×105-2×107细胞。人vasostatin来源于人钙网蛋白N端1-180位氨基酸,蛋白大小约为21千道尔顿(kDa);人sFLT-1来源于内皮细胞因子受体-1的胞外段1-6个免疫球蛋白样结构域,蛋白大小约为110千道尔顿(kDa)。
本发明的制备方法如下:利用骨骼肌cDNA文库和脐静脉内皮细胞cDNA文库经聚合酶链式反应分别合成人vasostatin cDNA片段和人sFLT-1 cDNA片段后,构建入过渡质粒pU C18和PCR2.1-TOPO TA中,经测序验证序列,再分别构建入哺乳动物细胞真核表达载体pSecTag2B和pcDNA3.1(+),转染293细胞或A549细胞后,检测蛋白表达和活性,用藻酸盐包裹。其流程见图1。
本发明所制备的持续释放两种新生血管形成抑制因子的微囊物质的应用,是将其作为长期释放血管内皮细胞抑增生制剂,直接用于抑制新生血管中的内皮细胞的增殖,抑制与血管生成相关疾病的发生与发展,当4粒这种微囊物质被移植入机体皮下后,6周内能释放人vasostatin和人sFLT-1因子,产生相应蛋白,直接抑制新生血管形成,其作用时间持久、使用剂量低,成本低,从而克服外源性蛋白治疗时存在的使用剂量大、作用时间不持久、生产成本高的缺点。用于预防和治疗多种与血管生成相关的疾病,如Kaposi肉瘤、类风湿性关节炎、增生性视网膜病以及能抑制多种肿瘤(尤其是实体瘤)的生长、发展和转移等。
本发明与现有技术相比具有如下优点:经制备获得经藻酸盐微囊化的两种抗新生血管形成制剂的微囊物质,将其移植入机体后,能长期释放人vasostatin和人sFLT-1基因,持续产生相应蛋白,直接抑制新生血管形成,可应用于多种与血管生成相关的疾病的治疗;可用于抑制多种肿瘤(尤其是实体瘤)的生长、发展和转移。克服了外源性蛋白治疗时存在的需要长期反复给药、所需使用剂量大,增加高额治疗成本,以及纯化过程复杂使生产具有一定困难、增加病人经济负担的缺点。
以下是本发明说明书附图的图面说明:
图1是本发明显示持续释放血管内皮细胞增生抑制剂人vasostatin和人可溶性VEGF受体-1的微囊化流程。
图2是本发明PCR产物经1%琼脂糖电泳分析后的照片,显示获得人va-sostatin基因的PCR产物经1%琼脂糖电泳分析的结果。
图中序号说明:M:DNA的分子量标准。1:模板来自人骨骼肌的cDNA文库。vaso:合成的人vasostatin基因的位置。
图3是本发明人vasostatin的基因序列和相应蛋白的氨基酸序列。
图4是本发明人sFLT-1的基因序列和相应蛋白的氨基酸序列。
图5是本发明显示用Western Blot检测的重组质粒p2B-vaso在真核哺乳动物细胞293细胞或A549肺癌细胞中的表达情况。
图中序号说明:e-p:转染空载体pSecTag2B的上清。vaso:转染重组质粒p2B-vaso载体的上清。saline:转染生理盐水的上清
图6是本发明显示用Western Blot检测的重组质粒pc3.1-sflt在真核哺乳动物细胞293细胞或A549肺癌细胞中的表达情况。
图中序号说明:E-p:转染空载体pcDNA3.1(+)的上清。sFLT-1:转染重组质粒pc3.1-sflt载体的上清。saline:转染生理盐水的上清。
图7是本发明A,B,C,显示藻酸盐珠植入小鼠治疗肿瘤中,治疗组与对照组的肿瘤体积与时间的关系。横坐标表示治疗时间(天数),纵坐标表示肿瘤的体积(mm3)。D,E,F显示治疗组与对照组小鼠的生存曲线比较。横坐标表示治疗时间(天数),纵坐标表示生存率(%)。(A,D)Meth A纤维肉瘤细胞(B,E)LL/2Lewis肺癌细胞(C,F)MMT乳腺癌细胞其中,●表示治疗组,■表示空载体组,△表示生理盐水组。
本发明以下将结合实施例和说明附图作进一步详述:
实施例1:来源于人vasostatin基因的获得:在图3中显示了编码人vaso-statin的核苷酸序列及相应蛋白的氨基酸序列。选择人骨骼肌的cDNA文库作为聚合酶链式反应(PCR)的模板,设计并合成相应的引物,上游引物为:5’-ATCGAATTCATGGAGCCCGCCGTCTA-3’,下游引物为5’-CAAAGCTTCTATTCCAAGGAGCCGGAC-3’。利用PCR合成人的vasostatin cDNA片段,得到片段的大小与预计的相同,约540bp,见图2。回收PCR产物片段后,插入载体pUC18(购自Invitrogen公司),得到重组质粒pUC18-vaso,通过Perkin-Elmer公司的DNA测序仪对其测序,结果表明PCR产物的序列与人vasostatin基因序列一致,见图3,证明得到了来源于人的vasostatin基因。
实施例2.来源于人sFLT-1基因的获得:在图4中显示了编码人sFLT-1的核苷酸序列及相应蛋白的氨基酸序列。选择人脐静脉内皮细胞cDNA文库作为聚合酶链式反应(PCR)的模板,设计并合成相应的引物,上游引物为:5’-GCTCACCATGGTCAGCTA-3’,下游引物为5’-CTGCTATCATCTCC-GAACTC-3’,利用PCR合成人的sFLT-1 cDNA片段,合成条件为;94℃变性1分钟后,以94℃ 45秒、58℃ 2分钟、72℃ 4分钟作30循环,得到片段的大小与预计的相同约为2.2Kb。回收PCR产物片段后,插入载体PCR2.1-TOPO TA(购自Invitrogen公司),得到重组质粒p2.1-sflt,通过Perkin-Elmer公司的DNA测序仪对其测序,结果表明PCR产物的序列与人sFLT-1基因序列一致(图4),证明得到了来源于人的sFLT-1基因。
实施例3人vasostatin和人sFLT-1的真核表达载体的构建及表达使用pSecTag 2B(购自Invitrogen公司)作为表达载体,它具有真核基因表达调控序列:CMV启动子、鼠的Igκ信号肽序列、牛生长因子加尾信号,使目的基因能在真核细胞中分泌表达。将编码人vasostatin的基因片段克隆到pSecTag2B的双酶(EcoR I/Hind III)位点中,得到重组质粒p2B-vaso,反应条件为:酶切反应体积均为20μl,DNA与限制性内切酶的比例为1μg∶5单位,反应时间为1-2小时不等,连接反应的目的基因Vaso-cDNA与质粒载体DNA的比例为4∶1,连接反应均在16℃水浴中进行,连接时间为过夜。使用pcDNA3.1(购自Invitrogen公司)作为表达载体,将编码人sFLT-1的基因片段克隆到pcD-NA3.1(+)的EcoRI位点中,反应条件条件同上,得到重组质粒pc3.1-sflt。
实施例4.脂质体法转染293细胞或A549肺癌细胞:通过脂质体法将重组质粒p2B-vaso、pc3.1-sflt导入真核哺乳动物细胞——293或A549细胞中,得到转染后的细胞培养液。具体步骤如下(以p2B-vaso为例,pc3.1-sflt的方法相似):
1)将2×105-2×107的293胞接种于六孔板培养皿中。
2)在37℃,5%CO2培养箱中培养20小时,使细胞长满培养皿表面积的60%。
3)在无菌玻璃试管中配制下列溶液:
溶液A(μl):试剂 重组质粒 空载体 对照p2B-vaso 4μg - -pSecTag2B - 4μg -培养基(μl) 96 96 100合计(μl) 100 100 100
溶液B(μl):
将4μl Lipofectin-Reagent加入96μl无血清培养基中,混匀、室温放置30-40分钟。
4)将A液、B液轻轻混匀,室温放置15分钟。
5)用无血清培养液2ml洗涤细胞一次。
6)在A、B混合液中加入0.8ml无血清无抗生素的培养液,混匀后小心滴加至细胞上。
7)37℃,5%CO2培养箱培养24小时。
8)弃去转染液,加2ml完全培养液继续培养,并收集细胞上清液。
实施例5.藻酸钠包裹上述被转染的细胞,获得藻酸钠珠。具体操作如下:
1)在37℃、无菌操作下,将被转染的293细胞按2×105-2×107细胞/ml藻酸钠的比例悬浮在1.5%藻酸钠中,并将混合液加入0.25M CaCl2液体中,形成300-500μl大小的园珠。
2)生理盐水洗上述园珠3次。
3)用生理盐水4℃悬浮园珠备用。
实施例6.免疫印迹法即Western Blot检测目的蛋白的表达:将细胞培养液作十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳,以购自Santa Cruz Biotechnique公司的羊抗钙网蛋白N端抗体和购自Sigma Chemical Co.的抗FLT-1单克隆抗体分别作1∶200稀释后作为一抗并4℃过夜,以生物素标记的兔抗羊IgG和羊抗鼠IgG为二抗,进行检测,结果见图5、图6。
实施例7.人vasostatin和人sFLT-1抑制内皮细胞增生:将细胞培养液作内皮细胞增生抑制实验,具体步骤如下:
1)取1×103 HUVEC细胞加入96孔培养板,每个样品做3个复孔,以培养液作对照,37℃,5%CO2培养箱培养24小时。
2)弃细胞上清,每孔加入40μl脂质体共转染的293细胞或A549细胞上清液,20分钟后加入60μl全培养基,在37℃,5%CO2培养箱培养72小时。
3)用台盼蓝染色细胞后计数细胞。
结果表明:只有人vasostatin基因和人sFLT-1转染的动物细胞上清液有vasostatin和sFLT-1蛋白的表达,而且所表达的vasostatin具有抑制内皮细胞增生的生物学活性,细胞抑制率大于70%,而对照组和生理盐水组的细胞抑制率均小于5%。
实施例8.应用——人vasostatin和人sFLT-1抑制小鼠实体肿瘤生长:将6-8周龄的雌雄各半的Balb/c小鼠分为三组:治疗组、生理盐水组、对照组,且每组10只。在小鼠的背部皮下分别接种1×106个纤维肉瘤Meth A细胞,6天后当肿瘤大小为100-200mm3时,每只小鼠皮下植入藻酸钠珠4粒:治疗组植入的藻酸钠珠含重组质粒,对照组植入的藻酸钠珠含空质粒,生理盐水组植入的藻酸钠珠含生理盐水。每4天观察一次,共4周。观察小鼠生存情况,并用游标卡尺测量小鼠肿瘤的大小。用同样的方法对小鼠分别进行Lewis肺癌LL/2细胞和乳腺癌MMT细胞的荷瘤及藻酸盐治疗、观察。将小鼠的肿瘤体积对时间作曲线,结果见图7(A,B,C)。小鼠的生存曲线见图7(D,E,F)。可以看出,荷瘤小鼠经人vasostatin和人sFLT-1的藻酸盐微囊化进行细胞移植治疗后,小鼠的肿瘤生长得到控制,荷瘤小鼠的生存期延长。小鼠肿瘤大小和生存期与对照组相比有显著性差异(p<0.01)。
Claims (5)
1.一种持续释放两种新生血管形成抑制因子的微囊物质,其特征在于:用藻酸盐包裹编码人vasostatin和人sFLT-1基因的载体转染的293细胞或A549肺癌细胞形成藻酸盐圆珠,载体为真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)和pSecTag2B,并分别能表达人sFLT-1和人vasostatin蛋白,形成的圆珠直径300-500μm,每ml藻酸盐中含2×105-2×107细胞。
2.根据权利要求1所述的一种持续释放两种新生血管形成抑制因子的微囊物质,其特征在于:所说的人vasostatin来源于人钙网蛋白N端1-180位氨基酸,蛋白大小为21千道尔顿(kDa);人sFLT-1来源于人血管内皮细胞因子受体-1的胞外段第1-6个免疫球蛋白样结构域,蛋白大小为110千道尔顿(kDa)。
3.根据权利要求1所述的一种持续释放两种新生血管形成抑制因子的微囊物质,其特征在于:所说的藻酸盐可以是藻酸钠。
4.制备权利要求1、2和3持续释放两种新生血管形成抑制因子的微囊物质的方法,其特征在于:
4.1人vasostatin基因片段的获得:选择人骨骼肌的cDNA文库作为聚合酶链式反应的模板,设计并合成相应的引物,上游引物为:5’-ATC-GAATTCATGGAGCCCGCCGTCTA-3’,下游引物为5’-CAAAGCTTC-TATTCCAAGGAGCCGGAC-3’,利用PCR合成人的vasostatin cDNA片段,回收PCR产物片段后,插入载体pUC18,得到重组质粒pUC18-vaso;
4.2人sFLT-1基因片段的获得:选择人脐静脉内皮细胞cDNA文库作为聚合酶链式反应的模板,设计并合成相应的引物,上游引物为:5’-GCTCAC-CATGGTCAGCTA-3’,下游引物为5’-CTGCTATCATCTCCGAACTC-3’,利用PCR合成人的sFLT-1cDNA片段,并插入载体PCR2.1-TOPO TA,得到重组质粒p2.1-sflt;
4.3人vasostatin和人sFLT-1的真核表达载体的构建及表达:使用pSecTag2B、pcDNA3.1(+)作为表达载体,使目的基因能在真核细胞中分泌表达;将编码人vasostatin的基因片段克隆到pSecTag2B的双酶EcoRI/HindIII位点中,得到重组质粒p2B-vaso;将编码人sFLT-1的基因片段克隆到pcD-NA3.1(+)载体中,得到重组质粒pc3.1-sflt;通过脂质体法将重组质粒p2B-vaso、pc3.1-sflt导入真核哺乳动物细胞293或A549肺癌细胞中,继续培养,每周换液并收集上清,直到6周;将细胞上清液作十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳,以羊抗钙网蛋白N端抗体和抗FLT-1单克隆抗体作为一抗,用免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况;
4.4人vasostatin和人sFLT-1抑制内皮细胞增生:将被转染的293细胞上清液滴加在人脐静脉内皮细胞上后,内皮细胞增生受到抑制;
4.5藻酸盐包裹上述被转染的293细胞或A549肺癌细胞,获得藻酸盐珠即微囊物质。
5.根据权利要求1、2、3和4所制备的持续释放两种新生血管形成抑制因子的微囊物质的应用,其特征在于:用于长期释放血管增生抑制剂,直接用于抑制新生血管中的内皮细胞的增殖,抑制与血管生成相关疾病的发生与发展,特别是抑制肿瘤的发生、发展与转移。
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