CN101157908B - 一种肿瘤血管新生体外共培养模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微囊化肿瘤细胞与内皮细胞共培养模型。本发明取肿瘤细胞混匀于2％海藻酸钠溶液中，通过微囊发生器将细胞混悬液喷入100mmol/L氯化钙溶液内胶化，生理盐水洗涤，与0.1％多聚赖氨酸溶液反应，生理盐水洗涤，再与0.15％海藻酸钠溶液反应后，生理盐水洗涤，用55mmol/L的柠檬酸钠溶液液化微囊核心，在CO2培养箱中培养，微囊化肿瘤细胞直接用于共培养，或冻存，取内皮细胞贴壁培养或三维生长，加入微囊化肿瘤细胞于同一培养液中，共培养，分离肿瘤细胞与内皮细胞，行基因和蛋白检测及培养液细胞因子检测。解决了Matrigel胶方法的局限性、Transwell的缺陷。具有模拟肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用的微环境，一次制作，长期使用，降低了科研人力、财力需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤血管新生，特别涉及一种微囊化肿瘤细胞与内皮细胞共培养模型制备方法。
背景技术
在肿瘤生长早期，实体肿瘤生长到1到2mm后，其继续生长就会依赖新生血管的形成。在此之前，肿瘤细胞本身已经释放了大量的促血管新生因子诱导肿瘤血管新生。这些新生血管是肿瘤和外界进行物质交换的基础，血管新生与恶性肿瘤的发展、侵袭和转移密切相关。因此，研究血管新生的机理研究，特别是早期的肿瘤血管新生，显得非常必要和迫切。
建立肿瘤血管新生模型是研究其形成机制的重要手段。其中，体外共培养模型是模拟体内肿瘤血管新生的有效方法。
共培养是一种模拟体内微环境的最简单的模型，主要分为两种：直接接触共培养和非直接接触共培养。
直接接触培养主要是利用两种细胞或组织接触，通过旁分泌、自分泌分泌细胞因子或直接接触等相互作用方式，但两种细胞分离较困难，不便于观察和后续检测。
在本发明之前，非直接接触共培养是共培养体系中一者对另者的影响是通过旁分泌的细胞因子相互作用，但两者不接触。由于两种细胞容易分离，便于观察和不影响后续的检测。目前非直接接触共培养主要采用Martrigel胶、Transwell等。
Matrigel胶是一种从肿瘤中提取出来的促内皮细胞生长的细胞外基质复合物。在室温下，它形成类似于体内的细胞外基底膜的胶状结构，把内皮细胞培养在Matrigel胶内，内皮细胞表现出新生血管的特征。Matrigel胶方法的局限性是并不能很好模仿体内肿瘤和血管内皮的微环境，细胞分离及提取困难，而且细胞因子的弥散受到一定的影响。
Transwell是利用细胞分别培养在两个不同的两个室中，中间隔有孔底膜，细胞不能通过。上下两室的培养液时是相通的，从而两种细胞就通过各自分泌的可溶性细胞因子相互作用。在Transwell室内外的细胞易分离，但Transwell价格昂贵，尚未能很好模拟体内肿瘤生长，孔底膜不能有目的的隔离分子。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，设计、研制一种微囊化肿瘤细胞与内皮细胞共培养模型制备方法。
本发明的技术方案是：
一种肿瘤血管新生体外共培养模型制备方法，其步骤如下：
(1)取肿瘤细胞充分混匀于2％海藻酸钠溶液中；
(2)通过微囊发生器，将细胞混悬液喷入100mmol/L氯化钙溶液内使其胶化；
(3)待微胶珠硬化，生理盐水洗涤；
(4)与0.1％多聚赖氨酸溶液反应后，生理盐水洗涤；
(5)再与0.15％海藻酸钠溶液反应后，生理盐水洗涤；
(6)用55mmol/L的柠檬酸钠溶液液化微囊核心后，置于CO2培养箱中培养；
(7)微囊化肿瘤细胞直接用于共培养，或冻存；
(8)取内皮细胞贴壁培养或三维生长，加入微囊化肿瘤细胞于同一培养液中，共培养。
(9)分离肿瘤细胞与内皮细胞，分别行基因和蛋白检测以及培养液细胞因子的检测。
本发明的优点和效果在于微囊化肿瘤细胞生长很好模型了体内肿瘤生长，特别是肿瘤早期的生长方式；通过共培养的方法，很好的模拟了肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用的微环境；肿瘤细胞与内皮细胞极易分离；微囊化肿瘤细胞可以冻存于液氮中，一次制作，长期使用，大大降低了科研人力、财力需求；另外还可根据不同研究需要，改变微囊的直径、截流量和微囊内细胞密度。
具体分析如下：
细胞微囊化培养是固定化技术中的一种，它是用一层半透膜将细胞包裹在珠状的微囊里，从而使生物大分子和细胞不能从微囊里溢出，而小分子的物质、培养基的营养物质可自由出入半透膜，达到培养的目的。实际上，微囊里也是一种微小的培养环境，因而能使细胞生长良好。肿瘤细胞微囊化后呈三维立体生长，更接近于体内肿瘤早期生长特点，且微囊内肿瘤细胞生长旺盛，可通过分泌血管新生相关因子作用于内皮细胞，从而促进内皮细胞增生，两者共培养为肿瘤血管新生研究提供了一种新的研究手段。而且，微囊的分子截流量与所使用的多聚赖氨酸的分子量成正相关，因此通过调整多聚赖氨酸分子量大小，可控制微囊的通透性，为细胞间的分子作用特别是中小分子提供更为简便的研究手段。
肿瘤细胞在APA微囊内呈立体正常，较好的模仿了体内肿瘤生长特点。内皮细胞呈贴壁生长或三维生长，而肿瘤细胞为微囊化培养，二者可在同一体系中培养，能充分交换细胞因子，但又极易分开，便于检测培养液细胞因子、两种细胞的基因和蛋白微囊化肿瘤细胞冻存于液氮中，能很好保存细胞活性和微囊形态结构，通过一次肿瘤细胞微囊化制作，可以长期应用于共培养研究。APA微囊参数的可控制性，通过改变微囊的直径、截流量和微囊内细胞密度，使本共培养模型可以适合不同研究需要，特别是中小分子(MD<110KD)在肿瘤血管新生作用。
本发明的其他优点和效果将在下面继续描述。
附图说明
图1——微囊化HepG2(x40)，APA微囊内HepG2细胞呈立体分布图。
微囊表面光滑，大小均匀(类似早期肿瘤生长)。
图2——本发明微囊化肿瘤细胞与内皮细胞共培养示意图(内皮细胞呈贴壁 生长或三维生长，而肿瘤细胞为微囊化培养，二者共同培养于同一体系中)。
图3——人脐静脉内皮细胞形成管腔样结构示意图(团影为HepG2微囊(x100)，人脐静脉内皮细胞成血管能力明显增强)。
具体实施方式
1、肿瘤细胞微囊化
复苏人肝癌细胞株HepG2细胞，将其接种于25ml培养瓶中；待细胞融合90％时，消化，细胞计数。以105个HepG2细胞与1ml2.0％藻酸钠溶液比例充分混匀，通过微囊发生器喷入100mmol/L氯化钙溶液内使其胶化；10分钟后吸去氯化钙溶液，用生理盐水溶液洗涤3遍，然后与0.1％多聚赖氨酸溶液反应，生理盐水溶液洗涤3遍；0.15％海藻酸钠溶液反应，生理盐水溶液洗涤3遍；最后用55mmol/L的柠檬酸钠溶液液化微囊核心，处理6分钟；生理盐水溶液洗涤3遍，培养基洗涤一次，置于37℃5％CO2培养箱培养，如图1所示。
3天后，可见微囊内HepG2细胞出现分裂，细胞进入生长旺盛时期，可将包有肿瘤细胞微囊和内皮细胞置于同一培养基中共培养。
微囊化HepG2计数与冻存：
微囊内细胞计数，选取100个微囊，破囊后计算出平均每个微囊内细胞为150个细胞；如需冻存，可将微囊化HepG2细胞溶入含10％DMSO的冻存液，调整培养基中的微囊数量约100个/ml，通过程序降温仪控制降温速度，保持每分钟降低1℃，-80℃过夜，第二天放入液氮中。
2、分离人脐静脉内皮细胞内皮细胞
取足月胎儿脐带25cm，脐静脉腔上下两端分别置管，PBS清洗后，注入0.25％胰酶至脐带处于高张力，于37℃孵育7分钟，含20％胎牛血清的1640灌洗脐静脉腔，收集液体约50ml，离心，弃上清，加入EBM-2，于37℃5％CO2培养箱培养。换液每周2-3次。1：3～4比例传代。
3、微囊化HepG2与人脐静脉内皮细胞共培养
将内皮细胞接种于6孔板中；待细胞贴壁后，可按1：10比例加入微囊化HepG2细胞；与EBM-2(10％胎牛血清)共培养2天后，如图2所示。相对于单独培养组，共培养的内皮细胞集合度明显升高；去除微囊化HepG2，用PBS洗涤内皮细胞，可对脐静脉内皮细胞进一步进行形态或功能分析，及分子水平检测。
我们采用两种实验证实我们的共培养模型适宜肿瘤血管新生研究。
1.共培养后脐静脉内皮细胞增殖实验(MTT)：共培养2天，脐静脉内皮细胞增殖率升高；
2.成血管能力实验：脐静脉内皮细胞培养于纤维蛋白凝胶内，微囊化Hep G2培养于凝胶上)，结果显示脐静脉内皮细胞成血管能力增强，如图3所示。
上述发明内容用简单的语言表达即为：肿瘤细胞为APA微囊化培养，内皮细胞呈贴壁生长或三维生长，二者共同培养于同一体系中。
上述实施内容，为研究肿瘤血管新生机理提供了可靠的研究分析平台。本模型通过研究哪些因素参与了肿瘤血管新生，从而提出干预措施，最终达到抑制肿瘤血管新生的目的。
本发明请求保护的内容并不局限于本具体实施方式的描述。
Claims (2)
1.一种肿瘤血管新生体外共培养模型的制备方法，其步骤如下：
(1)取肿瘤细胞充分混匀于2％海藻酸钠溶液中；
(2)通过微囊发生器，将细胞混悬液喷入100mmol/L氯化钙溶液内使其胶化；
(3)待微胶珠硬化，生理盐水洗涤；
(4)与0.1％多聚赖氨酸溶液反应后，生理盐水洗涤；
(5)再与0.15％海藻酸钠溶液反应后，生理盐水洗涤；
(6)用55mmol/L的柠檬酸钠溶液液化微囊核心后，置于CO2培养箱中培养；
(7)微囊化肿瘤细胞直接用于共培养，或冻存；
(8)取内皮细胞贴壁培养或三维生长，加入微囊化肿瘤细胞于同一培养液中，共培养；
(9)分离肿瘤细胞与内皮细胞，分别行基因和蛋白检测以及培养液细胞因子的检测。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤血管新生体外共培养模型制备方法，其特征在于步骤(8)中，内皮细胞与微囊内肿瘤细胞比例为1∶10。
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