KR20230146244A

KR20230146244A - 알부민과 결합하는 리피바디와 인터류킨-15 (Interleukin-15, IL-15)의 융합단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230146244A
Application number: KR1020220044973A
Authority: KR
Inventors: 김학성; 김다솜
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2022-04-12
Filing date: 2022-04-12
Publication date: 2023-10-19

Abstract

본 발명은 인체 내 혈장 알부민에 결합하는 비 항체 단백질 골격과 인터류킨-15(rHSA-hIL15)가 융합된 폴리펩타이드 및 이를 함유하는 지속성 면역 치료제에 관한 것으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 인간 혈장 알부민에 결합하여 인간 혈액 내 반감기를 획기적으로 증대시킬 수 있으므로 기존의 고용량 투여로 인한 부작용을 최소화시킬 수 있다. 또한 상기 폴리펩타이드는 자연상태 인터류킨-15에 비해 보다 효과적으로 면역시스템을 활성화 시킬 수 있으므로, 자가면역세포를 활용한 항암 제제로 널리 활용될 수 있다.

Description

알부민과 결합하는 리피바디와 인터류킨-15 (Interleukin-15, IL-15)의 융합단백질 및 이의 용도{Fusion Protein of Albumin-binding Repebody and Interleukin-15 and Use Thereof}

본 발명은 인터류킨-15 (IL-15) 기반의 신규한 지속성 면역 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로 인체 내 혈장 알부민에 결합하는 비 항체 단백질 골격과 인터류킨-15(rHSA-hIL15)가 융합된 폴리펩타이드 및 이를 함유하는 지속성 면역 치료제에 관한 것이다.

인체의 면역체계를 기반으로 암을 비롯한 질병을 효과적으로 치료하고자 하는 면역치료 방법의 개발에 많은 연구가 진행되어 임상에 사용되거나 임상 실험 중에 있다. 특히, 인체의 세포 독성 T 세포(Cytotoxic T-cell) 혹은 NK 세포(Natural Killer cell)를 이용한 암 치료는 면역세포가 암 세포를 인지하도록 리프로그래밍하여 치료하는 방법으로 높은 효능과 낮은 부작용으로 전 세계적으로 크게 각광받고 있으며 임상에 사용되고 있다. 또한, 면역 시스템의 핵심 조절자인 사이토카인을 기반으로 한 면역 치료제 개발에도 현재 활발한 연구가 진행되고 있다. 인체 면역세포를 활성화시켜 암을 치료하는 사이토카인 기반 면역치료제는 기존의 다른 치료법에 비해 환자의 높은 편리성, 높은 치료 효능 및 낮은 비용 등의 장점이 부각된다. 대표적 면역치료 사이토카인인 인터류킨은 세포 독성 T 세포와 NK 세포 등의 면역세포를 활성화하는 선천성인자로 면역세포의 활성, 증식, 이동성을 조절하는데 핵심 역할을 한다. 이 중에서도 IL-2, IL-7, IL-12, IL-10 및 IL-15은 항암 효과가 입증되어 일부는 임상에 사용되고 있다.

대표적인 사이토카인 면역치료제로 미 FDA로부터 신장암(renal carcinoma)와 흑색종(melanoma)에 대해 승인받은 IL-2 (Proleukin)가 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 IL-2의 경우, 면역세포의 활성을 억제하는 Treg 세포도 함께 활성화시켜 지속적인 항암효과가 유지되기 어렵고 활성 농도를 유지하기 위해 고용량(high dose) 투여가 불가피하여 약 30% 이상의 환자 군에서 grade 1-4 부작용이 보고되는 등 부작용 사례가 매우 심각한 현실이다.

최근 IL-2의 낮은 장기적 항암효과를 개선하기 위해 암세포 사멸에 관여하는 세포 독성 T세포와 NK세포를 활성화시키는 IL-15가 중요한 면역치료제 후보로 대두되고 있다. IL-15는 IL-2와 IL-2/15Rβ/common γ라는 수용체 단백질을 공유해 면역세포 활성과 관련된 많은 기능을 공유하지만 IL-2와는 달리 AICD(activation-induced cell death)를 억제하며, Treg 세포는 활성화하지 않고, memory CD8⁺T세포의 지속적인 작용을 유도하기 때문에 면역치료제로 높은 적합성을 갖는다(Fehniger et al, Todd A, Cytokine & growth factor reviews, 13:169, 2002).

또한, 대부분의 사이토카인은 약 10~15 kDa정도의 작은 크기로 인해 체내에서의 반감기가 짧아, 활성 농도를 유지하기 위해서는 반복 또는 고용량 투약(high dose)이 필수적이기 때문에 이로 인한 부작용이 심각하다. IL-15 역시 국내외 기업에서 투약 용량 및 횟수를 줄이기 위한 방법으로 체내 체류 시간을 증대시키는 연구를 집중적으로 수행 중이며 일부는 전 임상 및 임상에 진입한 상태다. 체내 반감기 증대를 위해 항체 Fc 또는 IL-15 receptor alpha (IL-15Rα) 수용체와 융합시키는 방법과 PEGylation과 같은 화학적인 결합법을 시도하고 있다(Kim, Peter S et al., Oncotarget, 7:16130, 2016/ Ji-Hae Kim et al., Clinical & Translational Immunology, 9:e1168). 하지만 이와 같은 방법 대부분은 해외 및 다국적 제약회사가 점유하고 있는 특허 문제로 인해 신약 개발에 어려운 점이 있다.

뿐만 아니라, 항체 Fc 또는 IL-15Rα와의 결합은 동물세포에서의 발현이 필수적이기 때문에 생산공정이 복잡하고 고가의 생산시설이 필요하다. 지방산 결합, 페길레이션(PEGylation) 등과 같은 화학적 방법의 경우에는 단백질 생산 후 정제를 위한 추가 공정이 필요하기 때문에 생산 비용이 비싸고 수율이 낮으며 약물의 비균질도(heterogeneity)가 높은 등, 문제점들이 있다.

이에, 본 발명자들은 혈액 내 반감기를 증대시켜 반복 또는 고용량 투약으로 인한 부작용을 최소화할 수 있는 지속성 면역치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 인간 혈장 알부민과 결합하는 인공 항체를 인터류킨-15에 융합하여 제작한 폴리펩타이드가 인간 혈장 알부민에 대한 특이성과 결합력이 매우 높음과 동시에 인터류킨-15 수용체에 대한 높은 결합력을 유지하면서도, T 세포와 NK 세포의 신호 전달을 효과적으로 매개하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인체 면역세포 (세포 독성 T 세포 및 NK 세포)를 효율적으로 활성화시켜 암 치료 효능을 극대화할 수 있는 인터류킨-15의 지속성과 효능을 향상시킨 융합 단백질을 제공하는데 있다.

본 발명이 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 상기 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 함유하는 지속성이 향상된 면역치료제를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다;

(ⅰ) 상기 재조합 미생물을 배양하여 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드를 생성시키는 단계; 및

(ⅱ) 상기 배양된 재조합 미생물 또는 배양물로부터 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 면역치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 암의 치료 또는 예방을 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 암의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드의 사용을 제공한다.

본 발명에 따른 지속성 면역치료제로 사용가능한 인터류킨-15 융합 단백질은 인간 혈장 알부민에 특이적으로 결합하는 능력을 가지므로 기존의 혈액 내 순환 시간이 짧았던 IL-15의 생체 이용률 (bioavailability)를 높이며 약물적 한계를 극복하였다. 또한, 상기 융합단백질은 약물의 체내 순환 시간 증대로 줄어든 약물 투여 횟수 및 투여양은 면역 항암제가 야기시킬 수 있는 부작용을 최소화하며 동시에 자연상태 인터류킨-15에 비해 면역세포에 의한 Granzyme B 와 인터페론-γ(Interferon-γ)의 생성을 획기적으로 증대시킴으로써 항암 효과를 극대화시킬 수 있어서 새로운 면역 항암제로서 널리 활용 가능하다.

도 1은 인간 혈장 알부민에 결합하는 리피바디와 최적화된 연결서열을 포함하고, 인터류킨-15의 서열을 가진 융합 단백질 rHSA-IL15의 개략도이다.
도 2는 rHSA-IL15 융합단백질이 인간 혈장 알부민에 농도 구배에 따라 결합하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도3은 rHSA-IL15 융합단백질이 인터류킨-15 수용체 (hIL15Rα)에 농도 구배에 따라 결합하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 rHSA-IL15 융합단백질을 인터류킨-15 의존 세포주 (IL-15 dependent cell line)인 Mo7e에 농도별로 투여하였을 때, 세포의 신호전달을 조절하는 효과를 세포생사판별시험 (cell viability test)을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 rHSA-IL15 융합단백질을 건강한 성인으로부터 분리된 인간 말초 혈관 면역세포에 투여해 T세포 및 NK 세포의 신호전달을 효과적으로 매개하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 인간 혈장 알부민에 특이적으로 결합하는 인공항체인 리피바디를 인터류킨-15에 결합하여 혈액 내 순환 시간이 증가된 지속성 면역 치료제를 개발하고자 하였다.

본 발명에서는 KAIST 김학성 교수 연구팀의 파지 디스플레이 방법(대한민국 공개특허공보 10-2020-0047364 A)을 사용하여 인간 혈장 알부민에 대한 결합력이 우수한 인공항체 "리피바디"를 선별하고, 인간 혈장 알부민에 결합하는 리피바디와 최적화된 연결서열을 포함하고, 인터류킨-15의 서열을 가진 폴리펩타이드가 인간 혈장 알부민과의 상호작용과 인터류킨-15와의 상호작용을 설계한 목적에 맞게 수행하는 것을 증명하였다.

본 발명에 따른 신규 폴리펩타이드의 인간 혈장 알부민과의 결합을 증명하기 위해 도 1의 폴리펩타이드를 제작하였고, 면역 분석법 (Direct ELISA)를 통해 결합력을 분석하였다(도 2). 또한, 신규 폴리펩타이드의 인터류킨-15 수용체와의 결합을 증명하기 위해 도 1의 폴리펩타이드를 이용해 면역 분석법 (Sandwich ELISA)을 통해 결합력을 분석하였다(도 3).

본 발명의 일양태에서는 신규 폴리펩타이드를 인터류킨-15에 의존적인 세포주 Mo7e에 투여해 세포생사판별시험 (cell viability test)을 진행하였으며 건강한 성인으로부터 분리된 인간 말초 혈관 면역세포에 투여해 T세포 및 NK 세포의 신호전달을 효과적으로 매개함을 확인하여 약물로써 잠재성을 입증하였다 (도 4, 도 5 및 도 6).

또한, 리피바디-IL-15 융합 단백질 처리에 의하여, 자연 상태 인터류킨-15과 거의 동등하게 NK 세포의 증식을 효과적으로 유도한다는 것을 확인하였다. 리피바디-IL-15 융합 단백질은 T 세포의 증식에는 큰 영향이 없었지만 자연상태 인터류킨-15 비해 CD69를 발현하는 CD4+ 와 CD8+ T 세포의 population을 더욱 효과적으로 증대시킨다는 것을 확인하였다(도 6).

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 융합 폴리펩타이드(또는 융합 단백질)은 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping mofit)를 가지는 LRR (Leucine rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단과 VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합되어 있는 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 서열과 최적화된 링커 서열 및 인터류킨 15서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 사용된 "리피바디"는 인터날린 단백질의 N-말단 및 LRR(Leucine rich repeat) 패밀리 단백질이 융합된 수용성 융합 폴리펩타이드 및 이를 기본 구조로 하여 부분적으로 변형된 폴리펩타이드를 의미하는데, 한국 KAIST의 김학성 교수팀에 의해 최초로 개발되어 '리피바디(Repebody)'로 명명된 것(대한민국 공개특허공보 10-2011-0099600 A1, 대한민국 등록특허공보 1356075, 국제공개특허공보 WO2013-129852 A1 및 리피바디 관련 논문 Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Feb 28;109(9):3299-304 참조)이다. 보다 구체적으로는, 상기 리피바디는 미생물 유래이고 알파 나선형 캡핑 모티프(capping motif)를 가지는 LRR(Leucine rich repeat) 패밀리 단백질의 N-말단, consensus 설계된 LRR 반복 모듈 및 Variable Lymphocyte Receptor(VLR) 단백질의 C-말단이 융합된 것이다. 특히, 본 발명에서 사용된 인간 혈장 알부민 특이적 리피바디(대한민국 공개특허공보 10-2020-0047364 A)는 인간 혈장 알부민에 특이적으로 결합하는 특성이 있으며, 반감기가 짧은 약물의 효과적인 반감기 증대을 위한 플랫폼을 제시한 바 있다.

본 발명의 용어, "인간 혈장 알부민"은 혈액 내에서 적혈구, 백혈구 등의 혈구 세포를 제외하고 남은 혈장을 구성하는 물질 중 대다수를 차지하는 단백질로, 혈액의 삼투압을 조절하는 역할을 수행하며 혈액 내 이온과 지방산을 운반하는 역할도 수행한다. 알부민은 면역글로블린과 함께 혈액 내에서 약 30일의 매우 긴 반감기를 가지는 것으로 알려져 있는 데, 여기에는 신생아 Fc 수용체(Neonatal Fc Receptor, FcRn)가 관여하고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 인간 혈장 알부민과의 지속적인 상호작용으로 인터류킨-15의 짧은 반감기를 효과적으로 증대시킨다. 이로써 인터류킨-15는 적은 투여양으로도 인체 내의 면역 세포들의 신호전달과정을 효과적으로 매개하는 높은 항암 효능의 면역치료제로서 기능할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명에서 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오타이드가 될 수 있고, 상기 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지는 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pET-21a, pET-32a 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "재조합 미생물"이란, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주세포는 특별히 제한되는 것이 아니나, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 대장균 Rosetta Ⅱ(DE3), Rosettagami Ⅱ(DE3)를 숙주 세포로 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명은 다른 관점에서다음 단계를 포함하는 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인간 인터류킨-15(Interleukin-15)이 융합된 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다:

(ⅰ) 상기 재조합 미생물을 배양하여 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨-15이 융합된 폴리펩타이드를 생성시키는 단계; 및

(ⅱ) 상기 배양된 재조합 미생물 또는 배양물로부터 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨-15이 융합된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간동안 배양하는 것이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 방법은 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨-15이 융합된 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 면역치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 면역치료용 조성물은 암 치료용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역치료제를 사용한 항암치료는 상기 폴리펩타이드가 면역세포에 존재하는 인터류킨-15 수용체에 결합하여 연속된 신호전달을 매개함으로써 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어 '치료'란 조성물의 투여로 환자 본인의 면역 시스템에 존재하는 세포독성 T세포 및 NK 세포를 활용해 암세포의 사멸을 유도하는 것, 혹은 암세포 사멸 과정으로부터 야기된 하나 또는 그 이상의 병변 완화 효과를 의미한다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드를 포함하는 암 치료용 조석물은 약학적으로 허용 가능한 유기물을 추가로 포함할 수 있으며, 이와 함께 제제화 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 유기물"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 유기물 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 유기물로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충제, 정균제, 무통화제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 유기물을 포함하는 지속성 면역치료제 인터류킨-15 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 비 경구용 제형으로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비 경구 투여용 제형으로는 피하주사, 정맥주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태가 있다. 주사용 제형으로 제제화 하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여용으로 제제화 할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 지속성 면역치료제 인터류킨-15 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역 항암 요법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨-15이 융합된 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨-15이 융합된 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨-15이 융합된 폴리펩타이드의 사용에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 면역 치료제의 혈액 내 반감기 증대를 위해 설계된 것이므로, 투여 경로를 비 경구 투여로 한정한다. 구체적으로, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 방법은 본 발명의 지속성 면역치료제 인터류킨-15 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당 업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 지속성 면역치료제 인터류킨-15 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 신규 인터류킨-15 융합 단백질의 제조

인간 혈장 알부민 특이적 리피바디(대한민국 공개특허공보 10-2020-0047364 A)와 IL-15가 결합된 융합 단백질(rHSA-IL15)(도 1)을 제작하였다.

인간 혈장 알부민 특이적 리피바디를 코딩하는 염기서열(서열번호 3) 및 IL-15 염기서열(서열번호 4)로 구성된 핵산 컨스트럭트(서열번호 2)를 제작하였다(Integrated DNA Technologies, Inc.).

상기 제조된 핵산 컨스트럭트를 pET21a(Clontech, USA) 벡터에 삽입하여, IL-15 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제작하였다.

상기 재조합 벡터를 E. coli(Rosettagami Ⅱ, Novagen)로 도입하여 Luria-Bertani (LB) 배지를 사용하여 배양하였으며, 배양 조건은 다음과 같이 설정하였다.

Carbenicillin (50 μg/mL), chloramphenicol (50 μg/mL)을 첨가한 LB 배지에 재조합 벡터가 도입된 E. coli를 37 ℃ 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 OD₆₀₀값이 0.6에 다다를 때까지 배양하였다. 이후, 배양액에 50 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가한 후, 16 시간동안 18 ℃ 진탕 배양기에서 배양하였다.

실시예 2: 인터류킨-15 융합단백질의 정제

상기 실시예 1에서 얻은 알부민 특이적 리피바디와 IL-15의 융합단백질(rHSA-IL15)을 정제하였다.

배양 후, 세포 내 과발현된 신규 IL-15 융합단백질을 Ni²⁺-nitrilotriacetic(Ni-NTA)agaroseresin을 이용해 1차 분리하였다. 이로써 얻은 단백질은 PBS로 equilibrate 되어있는 Superdex S75 column (GE Healthcare)을 사용한 size exclusion chromatography를 거쳐 최종 수득하였다.

PBS 상에 농축된 정제 단백질은 endotoxin removal spin colume을 거쳐 endotoxin-free 상태로 전환된다.

이를 통해, 자연상태의 인터류킨-15은 대장균에서 soluble 형태로 발현이 되지 않았지만 인간 혈장 알부민 특이적 리피바디가 융합된 인터류킨 15은 대장균에서 soluble 형태로 높게 발현되어 매우 간단하고 저렴한 공정으로 생산이 가능한 것을 확인하였다.

실시예 3: 지속성 면역치료제 인터류킨-15의 특성 분석

실시예 3-1: 리피바디-인터류킨-15 융합단백질의 인간 혈장 알부민에 대한 특이적인 결합여부 확인 및 결합력 측정

실시예 2에서 정제된 리피바디-IL15 융합 단백질과 인간 혈장 알부민이 농도 별로 코팅된 96-웰 플레이트(Sigma-Aldrich)를 이용하여 효소결합 면역침강법 (direct Enzyme-linked immunosorbent assay, direct ELISA)을 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 음성 대조군 (Negative control)인 PBS와 비교하였을 때, 리피바디-IL-15 융합 단백질은 인간 혈장 알부민에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으며, 농도 구배에 맞게 sigmoidal curve를 그리는 것을 확인하였다. 결합력을 계산한 결과, 6 nM의 결합력을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 3-2: 리피바디-인터류킨-15 융합단백질의 인터류킨 15 수용체에 대한 특이적인 결합 여부 확인 및 결합력 측정

실시예 2에서 정제된 리피바디-IL-15 융합 단백질을 이용하여, 인터류킨-15 수용체에 대한 효소결합 면역침강법 (sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay, sandwich ELISA)을 수행하였다.

hIL-15 receptor alpha SSD domain (hIL-15Rα SSD)은 E.coli 에서 발현하여 캡쳐 항체로서 사용하였다. Biotinylated anti-human IL-15 항체(R&D systems)를 검출 항체로 사용하였으며, signal generator로서 HRP-Avidin (Biolegend)를 사용하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 음성 대조군 (Negative control)인 PBS와 비교하였을 때, 리피바디-IL-15 융합 단백질이 인터류킨-15의 알파 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으며, 자연 상태의 인터류킨-15와 비슷한 수준의 결합력 (550 pM)을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 4: 지속성 면역치료제 인터류킨-15의 면역세포 활성화 기능 검증

실시예 4-1: 모델세포주 Mo7e를 이용한 인터류킨-15 수용체 매개 신호전달 기능 검증

리피바디-IL-15 융합 단백질의 기능을 검증하기 위하여, 인터류킨-15 수용체 β와 common γ chain의 발현과 이를 통한 신호 전달 체계를 구축하고 있는 모델 세포주 (Mo7e) (충남대학교 의과대학)를 이용한 세포 증식 실험에서 리피바디가 융합된 인터류킨-15가 자연상태 인터류킨-15 보다 더 효과적으로 세포의 증식을 유도한다는 것을 확인하였다 (도 4). 또한, 융합단백질의 투여 농도에 따라 시그모이달 커브(sigmoidal curve)를 나타내며 세포가 증식되는 것을 확인하였다.

실시예 4-2: 인간 유래 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)를 이용한 면역 시스템 활성화 정도 평가

리피바디-IL-15 융합 단백질의 면역 세포 활성화 정도 평가를 위해 인간 유래 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)를 이용하여 ELISpot과 FACS를 이용한 in vitro 실험을 진행하였다.

건강한 성인으로부터 분리한 PBMC에 상기 리피바디-IL15 융합 단백질를 농도 별(50nM, 25nM, 12.5nM, 6.3nM, 3.1nM 및 1.6nM)로 각각 투여한 후, 인터페론-γ(Interferon-γ)과 그랜자임 B(Granzyme B)의 생성 정도를 ELISPot 방법으로 분석하여 정량화 하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 PBS와 양성 대조군인 자연상태 인터류킨-15와 비교하였을 때, 리피바디-IL-15 융합 단백질의 투여 농도에 비례하여 인터페론-γ 와 그랜자임 B의 생성이 증가하였으며, 자연 상태 인터류킨-15에 비해 인터페론-γ 와 그랜자임 B의 생성을 더욱 효과적으로 증대시킨다는 것을 확인하였다.

또한, PBMC에 포함된 세포 독성 T세포와 NK세포의 활성화 정도 평가를 위해 상기 리피바디-IL-15 융합 단백질를 8.3 nM의 농도로 처리하고, 16시간 후 초기 T세포 활성 마커(CD69) 발현 정도를 확인하였으며, 48시간 후 T 세포 및 NK 세포의 population 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 리피바디-IL-15 융합 단백질 처리에 의하여, 자연 상태 인터류킨-15과 거의 동등하게 NK 세포의 증식을 효과적으로 유도한다는 것을 확인하였다. 리피바디-IL-15 융합 단백질은 T 세포의 증식에는 큰 영향이 없었지만 자연상태 인터류킨-15 비해 CD69를 발현하는 CD4+ 와 CD8+ T 세포의 population을 더욱 효과적으로 증대시킨다는 것을 확인하였다. CD69는 T 세포가 활성화 되었을 때 발현하는 마커로써 통상적으로 활성화된 T 세포를 구분하는데 이용된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Fusion Protein of Albumin-binding Repebody and Interleukin-15 and Use Thereof <130> P21-B158 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 409 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rHSA-IL15 <400> 1 Met Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp 1 5 10 15 Asp Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val 20 25 30 Thr Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Glu 35 40 45 Ala Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro 50 55 60 Asn Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser 65 70 75 80 Ala Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Thr Leu Glu Pro Asn 85 90 95 Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu 100 105 110 Lys Glu Leu Gln Leu Trp Ala Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly 115 120 125 Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Ser Leu Ala Leu Gly His Asn 130 135 140 Gln Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly 165 170 175 Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Trp Leu Asp Lys Asn 180 185 190 Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu 195 200 205 Gln Tyr Ile Ser Leu Tyr Asn Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly 210 215 220 Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Gly 225 230 235 240 Gly Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser 245 250 255 Ile Ile Cys Pro Thr Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 260 265 270 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys 275 280 285 Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr 290 295 300 Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys 305 310 315 320 Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser 325 330 335 Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu 340 345 350 Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu 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Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨-15이 융합된 폴리펩타이드.
제1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제2항의 폴리뉴클레오티드 또는 제4항의 재조합벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
다음 단계를 포함하는 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드의 제조방법;
(ⅰ) 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨 15이 융합된 폴리펩타이드를 생성시키는 단계; 및
(ⅱ) 상기 배양된 재조합 미생물 또는 배양물로부터 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨-15이 융합된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
제1항의 인간 혈장 알부민에 선택적으로 결합하는 리피바디와 인터류킨- 15이 융합된 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 면역 치료용 조성물.
제7항에 있어서, 암 치료용인 것을 특징으로 하는 면역 치료용 조성물.