TW201934571A - Ｆｇｆ２１變體、融合蛋白及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種FGF21變體，進一步涉及FGF21變體融合蛋白、蛋白質多聚體及其應用。本發明所述的FGF21變體、融合蛋白及蛋白質多聚體能夠顯著提高與標靶的結合力，並能夠用於治療代謝性疾病。

Description

FGF21變體、融合蛋白及其應用
本發明涉及成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)變體、包含其的融合蛋白及/或蛋白質多聚體，可用於治療代謝性疾病。
目前，治療糖尿病的藥物主要包括三大類：口服小分子藥物、胰島素和GLP-1受體激動劑類藥物。小分子藥物長期服用副作用明顯，且對糖尿病後期的血糖控制不理想。胰島素需要每天多次(至少一次)注射，且由於個體劑量差異易引發低血糖。單一的GLP-1受體激動劑不屬於一線用藥，對糖尿病代謝異常導致的心血管等併發症療效有限。
胰高血糖素樣肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)是一種由小腸L細胞分泌的腸促胰素，其可以刺激胰島β細胞分泌胰島素，從而維持病患體內胰島素的平衡。天然GLP-1僅能在體外保持2分鐘活性，並不適合作為藥物。在過去的幾年中，禮來、諾和諾德、GSK等公司競相改造該蛋白，以期獲得長效GLP-1類降糖藥物。二型糖尿病有外周胰島素抵抗、胰島β細胞的血糖依賴性胰島素分泌受損兩個主要特徵。代謝紊亂往往由多種複雜因素導致，因此針對多重代謝通路的治療將更具潛力。
FGF21屬於FGF家族(fibroblast growth factors，FGFs)成員之一，自1976年發現了第一個FGF(FGF1或aFGF)以來，人體內共發現該家族22個成員。FGFs的生物學功能十分多樣化，到目前為止，研究發現，FGFs參與調節包括細胞分化、增殖和代謝等一系列生理活動。FGF21基因最早由Nishimura等選殖出來。直到2005年，FGF21作為一個新的代謝調節因子的報導才首次揭示了它的生物學活性，後續研究發現，FGF21作為一種主要由肝臟分泌的因子參與了重要的代謝調控。
近年來，人們發現FGF21具有很好的血糖調節功能。FGF21可以促進脂肪細胞對葡萄糖的吸收，增強胰島素敏感性，同時與胰島素相比，FGF21不會引起低血糖等副作用，更能有效保護β胰島細胞，促進胰島β細胞的再生與修復，而且由於沒有促分裂活性，也不會導致潛在的腫瘤風險，這使得FGF21作為潛在的治療2型糖尿病非胰島素類藥物有著巨大潛力。另一方面，與透過胰島素間接作用的GLP類降糖藥物不同，FGF21本身也能刺激GLUT1受體，促進葡萄糖向細胞內的轉運，因此其本身也有希望成為治療1型糖尿病的藥物。
除了針對糖尿病，FGF21也有很好的降脂作用，可以提高脂質的氧化，調節脂質的分解及酮體生成，從而改善機體脂質紊亂，是一個很有潛力的降脂藥。體重升高及血脂導致的心血管疾病也是糖尿病人的一個重要併發症，FGF21在控制血糖的同時，能夠很好的調節體脂紊亂，有效防止糖尿病併發症的發生，亦有單獨作為一款降脂藥、針對非酒精性脂肪肝等疾病成藥的潛力。
然而，FGF21在成藥性方面也面臨著巨大的挑戰。這一方面是由於FGF21的半衰期很短，在小鼠模型中其半衰期僅為一小時左右(Xu et al.，2009)。其原因是FGF21在體內會被蛋白酶迅速降解，同時其在體外形成聚集物的傾向也會導致免疫原性，不利於半衰期的延長。另一方面，FGF21在體內的生物學活性也有限，降糖能力和降脂能力都不足以強大到使其單獨成為一款可用的藥物，這些因素使得目前為止還未有基於FGF21的抗代謝疾病藥物面世。
為了增強其在降糖、降脂等方面的生物學活性，需要對FGF21進行改造，增強其與標靶蛋白的相互作用，以增強其體內效果。目前為止，尚未發現可直接增強FGF21與標靶蛋白相互作用、並直接增強其體內生物學活性的改造方式。
一方面，本發明提供一種FGF21變體，其胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列相比包括一個或多個胺基酸取代，所述一個或多個胺基酸取代包括第167位處的胺基酸取代。
在某些實施方式中，所述第167位處的胺基酸取代為S167H。
在某些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代還包括選自下述的一個或多個位置處的胺基酸取代：第98位、第171位、第175位、第113位、第114位和第135位。
在某些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代L98R。
在某些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代P171A或P171G。
在某些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代R175L、R175P或R175H。
在某些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代G113R。
在某些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代L114Q。
在某些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代R135C。
在某些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包含下述任一組所示胺基酸位置處的胺基酸取代：a)L98、S167和P171；b)L98、S167、P171和R175；以及c)L98、G113、L114、R135、S167、P171和R175。
在某些實施方式中，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：34-37。
另一方面，本發明提供一種融合蛋白，其包含本發明所述的FGF21變體。
在某些實施方式中，所述融合蛋白還包含IgG恆定區結構域或其片段。在某些實施方式中，所述IgG恆定區結構域或其片段包括IgG4 Fc結構域。在某些實施方式中，所述IgG4 Fc結構域包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：5-6。
在某些實施方式中，所述FGF21變體的N端與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端直接或間接相連。在某些實施方式中，所述FGF21變體的N端透過第一轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端相連。在某些實施方式中，所述第一轉接子包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：7-8。
在某些實施方式中，所述融合蛋白包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：9-14和SEQ ID NO：26-27。
在某些實施方式中，所述融合蛋白包含GLP-1受體激動劑部分。在某些實施方式中，所述GLP-1受體激動劑部分包含GLP-1類似物。在某些實施方式中，所述GLP-1受體激動劑部分包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：28。
在某些實施方式中，所述融合蛋白包含所述IgG恆定區結構域或其片段以及所述GLP-1受體激動劑部分，並且所述GLP-1受體激動劑部分的C端與所述IgG恆定區結構域或其片段的N端直接或間接相連。在某些實施方式中，所述GLP-1受體激動劑部分的C端透過第二轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的N端相連。在某些實施方式中，所述第二轉接子包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：7-8。
在某些實施方式中，包含所述IgG恆定區結構域或其片段、所述GLP-1受體激動劑部分以及所述FGF21變體，並且所述FGF21變體的N端與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端直接或間接相連。在某些實施方式中，所述GLP-1受體激動劑部分的C端透過所述第二轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的N端相連，且所述FGF21變體的N端透過所述第一轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端相連。在某些實施方式中，所述融合蛋白包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：16-18。
另一方面，本發明提供一種蛋白質多聚體，其由兩個以上本發明所述的融合蛋白構成。在某些實施方式中，所述的蛋白質多聚體為同源二聚體。
另一方面，本發明提供一種分離的核酸分子，其編碼本發明所述的FGF21變體或本發明所述的融合蛋白。
另一方面，本發明提供一種載體，其包含本發明所述的分離的核酸分子。
另一方面，本發明提供一種細胞，其包含本發明所述的載體。
另一方面，本發明提供製備本發明所述的FGF21變體、本發明所述的融合蛋白或本發明所述的蛋白質多聚體的方法，所述方法包括：在允許所述FGF21變體、所述融合蛋白或所述蛋白質多聚體表達及/或形成的條件下培養本發明所述的細胞。
在某些實施方式中，所述方法進一步包括：回收經表達及/或形成的所述FGF21變體、所述融合蛋白或所述蛋白質多聚體。
另一方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含本發明所述的FGF21變體、本發明所述的融合蛋白或本發明所述的蛋白質多聚體，以及任選地一種或多種藥學上可接受的載體。
另一方面，本發明提供本發明所述的FGF21變體、本發明所述的融合蛋白或本發明所述的蛋白質多聚體在製備藥物中的用途，其中所述藥物用於治療代謝性疾病。在某些實施方式中，本發明所述的用途，其中所述代謝性疾病選自糖尿病、肥胖和肝脂肪變性。
本領域熟習技藝之人士能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本發明的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本發明的示例性實施方式。如本領域熟習技藝之人士將認識到的，本發明的內容使得本領域熟習技藝之人士能夠對所揭露的具體實施方式進行改動而不脫離本發明所涉及發明的精神和範圍。相應地，本發明的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本發明所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。透過參考下文中詳細描述的示例性實施方式和附圖能夠更好地理解本發明所涉及發明的特點和優勢。對附圖簡要說明書如下：圖1顯示本發明的蛋白質多聚體的一個實例的結構示意圖。
圖2顯示本發明的蛋白質多聚體的一個實例的結構示意圖。
圖3顯示本發明的融合蛋白S5、S4、S2、S1及S7與βklotho的結合能力。
圖4顯示本發明的融合蛋白S6、S4、S2及S7與βklotho的結合能力。
圖5顯示本發明的融合蛋白S8、S7及S1的降糖作用。
圖6顯示本發明的融合蛋白S8、S7及S1對肝臟的保護效果。
圖7顯示本發明的融合蛋白S1及S2的降糖作用。
圖8顯示本發明的融合蛋白D1及D2的降糖作用。
圖9顯示本發明的融合蛋白D1及D2在降低甘油三酯(TG)方面的作用。
圖10顯示本發明的融合蛋白D1及D2在降低總膽固醇方面的作用。
圖11顯示本發明的融合蛋白D2與杜拉魯肽降血糖效果的比較。
圖12顯示本發明的融合蛋白S2及D2的純化結果。
圖13顯示本發明的融合蛋白S3、D3、S2的純化結果。
圖14顯示本發明的融合蛋白D3和D2在降糖方面的作用。
圖15顯示本發明的融合蛋白S2、S1、S7、S3在降糖方面的作用。
本發明的其他特點和優越性可透過以下詳細的描述體現。但是，應該理解的是，本發明的實施方案僅以示例性的方式給出，對於本領域熟習技藝之人士，在本發明的實質和範圍內做出多種改變和改良是顯而易見的。
定義
人FGF21野生型序列含有209個胺基酸，具有NCBI參考序號NP_061986.1；成熟的FGF21序列較FGF21野生型缺少前導序列，其含有181個胺基酸。在本發明中，術語“天然FGF21序列”通常是指成熟的人FGF21序列，具有SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列。
在本發明中，術語“FGF21變體”通常是指與所述天然FGF21的胺基酸序列相比，包含一個或多個胺基酸殘基的添加、缺失及/或取代，且基本上仍具有所述天然FGF21的至少一種性質的多肽。所述FGF21變體可透過利用天然或非天然存在的胺基酸在天然FGF21多肽的特定位置進行修飾，所述修飾包含在特定位置插入、替換或刪除保守或非保守的一個或多個胺基酸來產生，也包含在特定位置引入非胺基酸結構。在本發明所述的FGF21變體中，按下述SEQ ID NO：1的編號順序對所述FGF21變體中的胺基酸殘基進行編號：HPIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSMVG PSQGRSPSYA S(SEQ ID NO：1)。
本發明所述的FGF-21變體還可包含胺基酸的缺失，其可以是N-端截短、C-端截短或內部缺失，或者這些的任意組合。包含N-端截短、C-端截短及/或內部缺失的這些變體在本發明中被稱作“缺失變體”或“片段”。術語“缺 失變體”或“片段”在本發明中可互換地使用。所述片段可以是天然存在的(例如剪接變體)或其可以透過人工構建，例如透過基因技術手段。
在本發明中，術語“IgG恆定定區結構域”通常是指包括抗體重鏈恆定區、鉸鏈區和抗體輕鏈恆定區的多肽結構域或多肽片段。所述的抗體可以是IgG抗體，例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型的抗體。
在本發明中，術語IgG恆定區結構域的“片段”通常是指IgG恆定區結構域的一部分，但仍保留至少其部分活性。例如，所述片段可包括CL、CH1、鉸鏈區、CH2和CH3中的一個或多個結構域或片段。
在本發明中，術語“Fc結構域”通常是指由抗體的鉸鏈區、CH2和CH3恆定區部分組成的結構域。在本發明中，IgG4 Fc結構域可包含如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在本發明中，術語“GLP-1”通常指具有生物學活性的GLP-1(7-37)，其胺基酸序列為：HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G。本發明所述的“天然GLP-1序列”是指天然GLP-1(7-37)序列。
在本發明中，術語“GLP-1類似物”通常是指保持GLP-1天然生物學活性的其類似物。例如，本發明中所述的GLP-1類似物可包含在天然GLP-1序列中引入1-10個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸置換(例如保守胺基酸置換)、缺失或插入而得到的多肽。所述GLP-1類似物可而延長GLP-1的體內半衰期，並且同時保留GLP-1的天然生物學活性。在某些實施方式中，所述GLP-1類似物可包含如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列：HG8EGTFTSDVSSYLEE22QAAKEFIAWLVKGG36G(SEQ ID NO：15)；HG8EGTFTSDVSSYLEE22QAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO：28)。
在本發明中，術語“GLP-1的生物學活性”通常是指GLP-1誘導的多種生物學效應，例如刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃運動或腸運動及誘導重量減輕等。GLP-1的顯著特徵包括其刺激胰島素分泌而不伴有低血糖相關危險的能力。
在本發明中，術語“保守胺基酸取代”可包括天然胺基酸殘基(即存在於野生型FGF21多肽序列給定位置上的殘基)被非天然殘基(即不存在於野生型FGF21多肽序列給定位置上的殘基)取代，使得對該位置上的胺基酸殘基的極性或電荷幾乎沒有或沒有影響。保守胺基酸取代還包括通常透過化學上的肽 合成而不是透過在生物系統中的合成而摻入的非天然存在的胺基酸殘基。這些包括肽類比物(peptidomimetics)和胺基酸部分的其它反轉形式或反向形式。
可根據共有的側鏈性質將天然存在的胺基酸殘基分為以下幾類：(1)疏水性殘基：正亮胺酸、M、A、V、L、I；(2)中性親水性殘基：C、S、T；(3)酸性殘基：D、E；(4)鹼性殘基：N、Q、H、K、R；(5)影響鏈方向的殘基：G、P；和(6)芳族殘基：W、Y、F。
保守取代可包括這些類別之一的某個成員被同一類別的另一個成員替換。
表1中顯示某些保守胺基酸取代的示例：
例如，表2中列出了一些保守胺基酸取代的示例，大於0的數值代表兩個胺基酸之間的取代為保守胺基酸取代：
當形成本發明的融合蛋白時，可以、但並非必須使用轉接子或連接子。當轉接子存在時，轉接子的化學結構可能不是決定性的，因為它主要起間隔的作用。轉接子可由透過肽鍵連接在一起的胺基酸構成。在本發明的某些實施方案中，轉接子由透過肽鍵連接的1-20個胺基酸構成。例如，所述1-20個胺基酸可選自20種天然存在的胺基酸。在某些實施方式中，所述1-20個胺基酸可選自甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺和賴胺酸。在一些實施方案中，所述轉接子由空間上不受阻礙的多個胺基酸構成。例如，所述空間上不受阻礙的胺基酸可以為甘胺酸和丙胺酸。所述轉接子可以為富含G的多肽，例如，其可以選自(G)3-S(即“GGGS”)、(G)4-S(即“GGGGS”)和(G)5-S(即“GGGGGS”)。在一些實施方案中，所述轉接子包含GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGSA。其它合適的轉接子包括：GGGGGSGGGSGGGGS、GGGKGGGG、GGGNGSGG、GGGCGGGG和GPNGG等。本發明的轉接子可為任何長度或組成的轉接子。
上文所述轉接子是示例性的，本發明的轉接子可以為長得多的轉接子以及包含其它殘基的轉接子。本發明中所述的轉接子還可為非肽轉接子。例如，可以使用烷基轉接子，例如-NH-(CH2)S-C(O)-，其中s=2-20。這些烷基轉接子可被任何無空間位阻的基團進一步取代，所述無空間位阻的基團包括但不限於低級烷基(例如C1-C6)、低級醯基、鹵素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。示例性的非肽轉接子還可以為聚乙二醇轉接子，其中轉接子的分子量可以為100-5000kD，例如100-500kD。
在本發明中，所述“一個或多個”胺基酸替換中的“多個”通常是指大於1個胺基酸的替換。例如，1~30個、1~20個、1~10個、1~5個、如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、或30個胺基酸的替換。
在本發明中，所述“第一”、“第二”只是為了在描述上進行區分，並沒有其它含義。
在本發明中，術語“包含”通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。
在本發明中，術語“蛋白質”和“多肽”可互換使用，並且在其最廣泛的意義下，是指兩個或更多個胺基酸、胺基酸類似物或肽類比物亞單位組成的化合物。所述兩個或更多個亞單位可透過肽鍵連接。在某些實施方式中，所述兩個或更多個亞單位可透過其他鍵連接，如酯鍵、醚鍵、胺基等。蛋白質或多肽必須含有至少兩個胺基酸並且對於可構成蛋白質或肽序列的胺基酸的最大數目沒有設限。在本發明中，術語“胺基酸”通常是指天然及/或非天然或合成的胺基酸，包括胺基酸的D和L光學異構體(例如甘胺酸及其D和L光學異構體)、胺基酸類似物和肽類比物等。
在本發明中，術語“二聚體”通常是指蛋白質-蛋白質相互作用的一種形式。例如，其可包括兩個相關亞單位組成的蛋白質-蛋白質複合物。在本發明中，術語“同源二聚體”通常是指由兩個相同的亞單位(例如，單體)構成的二聚體。
在本發明中，術語“同源性”、“同一性”或“相似性”可互換地使用，通常是指兩個肽或蛋白質之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性可透過比較各序列中可為比較目的來比對的位置而確定。在所比較的分子中，當其序列中的位置被相同的鹼基或胺基酸佔據時，那麼這些分子在那個位置上是同源的。序列之間的同源性程度隨著序列共有的匹配或同源位置的數目而變化。“無關”或“非同源的”序列表示被比較的序列間共有小於40%的同一性，或者小於25%的同一性。
在本發明中，當表示多肽的胺基酸序列同一性時，術語“至少80%序列同一性”通常是指與各參考序列至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
在本發明中，當與數值關聯使用時，術語“約”通常包括如下範圍內的數值：該範圍具有比所示數值小5%的下限並具有比所示數值大5%的上限。
在本發明中，術語“融合蛋白”通常指由兩個或更多個蛋白或多肽融合得到的蛋白。編碼所述兩個或更多個蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此連接而形成融合基因或融合的核酸分子，該融合基因或融合的核酸分子可編碼所述融合蛋白。所述融合基因的翻譯產生單一多肽，其具有融合前的所述兩個或更多個蛋白或多肽中至少一個、甚至每一個的性質。重組融合蛋白可透過用於生物學研究或治療的重組DNA技術人工創造。在本發明中，融合蛋白和重組融合蛋白可互換地使用。本發明中所述的融合蛋白通常包含至少兩個結構域，介於所述兩個結構域之間的轉接子以及任選地包含第三組分。重組融合蛋白的產生是本領域已知的，並且通常涉及自編碼第一蛋白或多肽的cDNA序列去除終止密碼子，然後透過連接或重疊延伸PCR以符合讀框的方式附接第二蛋白的cDNA序列。該DNA序列然後會由細胞表達成為單一蛋白質。該蛋白質可以經工程化以包括兩種原始蛋白質或多肽的完整序列，或僅僅任一的一部分。
除非上下文另外明確規定，否則如在本說明書和申請專利範圍中所用的，單數形式“一”和“所述”修飾的或未表明是單數或複數提及物包括複數 個提及物。例如，術語“藥學上可接受的載體”、“所述藥學上可接受的載體”包括一個或多個藥學上可接受的載體，或包括其混合物。
在本發明中，術語“組合物”通常是兩種或更多種物質的組合，例如，活性劑與其它惰性或活性化合物的組合。
在本發明中，術語“藥物組合物”通常指包括活性成分與惰性或活性載體的組合，從而使該組合物適於體內或體外或離體的診斷或治療用途。
在本發明中，術語“治療有效量”通常指對受試者產生治療益處所需的活性成分的最小劑量。例如，對於表現出患有或易感2型糖尿病、肥胖症或代謝綜合症的患者或為預防其發病的患者而言，“治療有效量”是指能夠誘導、改進或者造成與上述紊亂相關或因與之對抗所致的病理症狀、疾病進展、生理情況改善的劑量。本發明中，術語“受試者”或“患者”可為人，但也可為非人動物，更具體而言可為同伴動物(如狗、貓等)、農場動物(如牛、羊、豬、馬等)或者實驗室動物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)等。
在本發明中，當描述序列中胺基酸殘基的取代時，表述“XnY”通常表示序列中第n位的殘基X被殘基Y取代。例如，胺基酸取代“R175L”表示，序列中第175位的殘基R被殘基L取代。
FGF21變體
FGF21在體內的生物學活性有限，降糖能力和降脂能力都不足以強大到使其單獨成為一款可用的藥物。為了增強其降糖、降脂等生物學活性，需要對FGF21進行改造，增強其與標靶蛋白的相互作用，進而增強其體內效果。
本發明的發明人出人意料地發現，人FGF21的某些變體形式能夠顯著增強FGF21結合其標靶的能力。
一方面，本發明提供一種FGF21變體，其胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列相比包括一個或多個胺基酸取代，所述一個或多個胺基酸取代包括第167位處的胺基酸取代。
在一些實施方式中，所述第167位處的胺基酸取代為S167H。
在一些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代還包括選自下述的一個或多個位置處的胺基酸取代：第98位、第171位、第175位、第113位、第114位和第135位。
在一些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代L98R。
在一些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代P171A或P171G。
在一些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代R175L、R175P或R175H。
在一些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代G113R。
在一些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代L114Q。
在一些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代R135C。
在一些實施方式中，所述一個或多個胺基酸取代包含下述任一組所示胺基酸位置處的胺基酸取代：a)L98、S167和P171；b)L98、S167、P171和R175；以及c)L98、G113、L114、R135、S167、P171和R175。
，在一些實施方式中，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：26-27。
在一個方面，本發明提供一種FGF21變體，其包含如下SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列： (SEQ ID NO：2)。
其中，X1為L，R，D，E或K；X2為G或R；X3為L或Q；X4為R或C；X5為S，C，R或H；X6為P、C、G或A；X7為R，H，P或L；其中所述FGF21變體與天然FGF21相比，包含在選自X1~X7的至少1處的胺基酸取代，且所述天然FGF21的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在某些實施方式中，與所述天然FGF21相比，所述FGF21變體至少包含在第167位(X5)及/或第175位(X7)的胺基酸取代。例如，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)可在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第167位(X5)的胺基酸取代、第175位(X7)的胺基酸取代或者第167位(X5)以及第175位(X7)的胺基酸取代。
所述第167位的胺基酸取代可選自S167H，S167C和S167R。所述第175位的胺基酸取代可選自R175L，R175H和R175P。在一些實施方式中，所述第167位的胺基酸取代選自S167H，S167C和S167R，且所述第175位的胺基酸取代選自R175L，R175H和R175P。在一些實施方式中，所述第167位的胺基酸取代為S167H，且所述第175位的胺基酸取代選自R175L，R175H和R175P。在某些實施方式中，所述第167位的胺基酸取代為S167H，且所述第175位的胺基酸取代為R175L。
在某些實施方式中，本發明所述的FGF21變體(例如，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示)至少包含在第98位(例如，SEQ ID NO：2中的X1)及/或第171位(例如，SEQ ID NO：2中的X6)的胺基酸取代。例如，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)可在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第98位(X1)的胺基酸取代、第171位(X6)的胺基酸取代或者第98位(X1)以及第171位(X6)的胺基酸取代。
所述第98位的胺基酸取代可選自L98D，L98R，L98E和L98K。所述第171位的胺基酸取代可選自P171A，P171C和P171G。在一些實施方式中，所述第98位的胺基酸取代選自L98D，L98R，L98E和L98K，且所述第171位的胺基酸取代選自P171A，P171C和P171G。在一些實施方式中，所述第98位的胺基酸取代為L98R，且所述第171位的胺基酸取代選自P171A和P171G。
在某些實施方式中，本發明所述的FGF21變體(例如，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示)除包含在第167位(X5)及/或第175位(X7)的所述胺基酸取代外，還包含第98位(例如，SEQ ID NO：2中的X1)及/或第171位(例如，SEQ ID NO：2中的X6)的胺基酸取代。例如，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)可在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第167位(X5)的所述胺基酸取代以及第98位(X1)的所述胺基酸取代。又例如，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)可在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第167位(X5)的所述胺基酸取 代以及第171位(X6)的所述胺基酸取代。在某些實施方式中，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第167位(X5)的所述胺基酸取代、第171位(X6)的所述胺基酸取代以及第98位(X1)的所述胺基酸取代。在某些實施方式中，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第175位(X7)的所述胺基酸取代以及第98位(X1)的所述胺基酸取代。在某些實施方式中，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第175位(X7)的所述胺基酸取代以及第171位(X6)的所述胺基酸取代。在某些實施方式中，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第175位(X7)的所述胺基酸取代、第98位(X1)的所述胺基酸取代以及第171位(X6)的所述胺基酸取代。在某些實施方式中，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第175位(X7)的所述胺基酸取代、第167位(X5)的所述胺基酸取代以及第171位(X6)的所述胺基酸取代。在某些實施方式中，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第175位(X7)的所述胺基酸取代、第167位(X5)的所述胺基酸取代以及第98位(X1)的所述胺基酸取代。在某些實施方式中，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上至少包含第175位(X7)的所述胺基酸取代、第167位(X5)的所述胺基酸取代、第171位(X6)的所述胺基酸取代以及第98位(X1)的所述胺基酸取代。
在一些實施方式中，本發明的所述FGF21變體(例如，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示)還包含第113位(例如，SEQ ID NO：2中的X2)、第114位(例如，SEQ ID NO：2中的X3)及/或第135位(例如，SEQ ID NO：2中的X4)的胺基酸取代。
所述第113位(X2)的胺基酸取代可為G113R。所述第114位(X3)的胺基酸取代可為L114Q。所述第135位(X4)的胺基酸取代可為R135C。
在某些實施方式中，本發明的所述FGF21變體(例如，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示)除包含第167位(X5)及/或第175位(X7)的所述胺基酸取代，及/或第98位(例如，SEQ ID NO：2中的X1)及/或第171位(例如，SEQ ID NO：2中的X6)的所述胺基酸取代外，還包含第113位(例如，SEQ ID NO：2中的X2)、第114位(例如，SEQ ID NO：2中的X3)及/或第135位(例如，SEQ ID NO：2中的X4)的 所述胺基酸取代。在某些實施方式中，所述FGF21變體(SEQ ID NO：2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO：1)的基礎上包含第167位(X5)、第175位(X7)、第98位(X1)、第171位(X6)、第113位(X2)、第114位(X3)和第135位(X4)的所述胺基酸取代。
在某些實施方式中，本發明所述的FGF21變體包含如SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：34-37中任一項所示的胺基酸序列。
融合蛋白及蛋白質多聚體
在另一方面，本發明提供融合蛋白，其包含本發明所述的FGF21變體。所述融合蛋白還可包含IgG恆定區結構域或其片段，且所述IgG恆定區結構域或其片段與所述FGF21變體融合，從而構成所述融合蛋白。
所述IgG恆定區結構域的片段可以為IgG恆定區結構域的一部分，但仍保留至少其部分活性。在一些實施方式中，IgG恆定區結構域或其片段包含或者為IgG4 Fc結構域。
在一些實施方式中，所述IgG4 Fc結構域包含如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。在某些實施方式中，所述FGF21變體透過轉接子融合至所述IgG恆定區結構域或其片段。例如，所述FGF21變體的N端可與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端直接或間接相連。在一些實施方式中，所述FGF21變體的N端透過第一轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端相連。所述第一轉接子可包含胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：7)或GGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO：8)。
在某些實施方式中，所述融合蛋白可包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
在某些實施方式中，本發明所述的融合蛋白還包含GLP-1受體激動劑部分。所述GLP-1受體激動劑部分可包括GLP-1類似物。在一些實施方式中，所述GLP-1類似物包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，所述融合蛋白包含本發明所述的FGF21變體，所述IgG恆定區結構域或其片段以及所述GLP-1受體激動劑部分。在某些實施方式中，所述GLP-1受體激動劑部分的C端與所述IgG恆定區結構域或其片段 的N端直接或間接相連。在一些實施方式中，所述GLP-1受體激動劑部分的C端透過第二轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的N端相連。在一些實施方式中，所述GLP-1受體激動劑部分的C端透過第二轉接子與IgG恆定區結構域或其片段的N端相連，且所述FGF21變體的N端透過第一轉接子與IgG恆定區結構域或其片段的C端相連。所述第一轉接子和所述第二轉接子可分別獨立地包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，所述融合蛋白包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：16-18。
另一方面，本發明提供蛋白質多聚體，其包含兩個或兩個以上本發明所述的融合蛋白。在一些實施方式中，所述蛋白質多聚體為同源二聚體。例如，所述蛋白質多聚體可以由兩個相同的本發明所述的融合蛋白構成。在某些實施方式中，所述蛋白質多聚體中的兩個或更多個單體(即兩個或更多個本發明所述的融合蛋白)主要透過非共價相互作用及/或二硫鍵彼此結合而構成所述蛋白質多聚體。
本發明所述的FGF21變體、融合蛋白、蛋白質多聚體或組合物(如藥物組合物)可用於治療代謝性疾病。所述代謝性疾病可選自糖尿病、肥胖和肝脂肪變性。在一些實施例中，所述代謝性疾病是糖尿病，例如II型糖尿病。在另一些實施方式中，所述代謝性疾病是肥胖症。其他實施方案包括代謝病況或代謝紊亂，例如血脂異常、高血壓、肝脂肪變性，例如非酒精性脂肪肝(NASH)、心血管疾病，例如動脈粥樣硬化、以及老化。
核酸分子、載體及細胞
在另一個方面，本發明提供分離的核酸分子，其編碼本發明所述的FGF21變體，或者本發明所述的融合蛋白。
所述核酸分子可以是RNA的形式，或者DNA的形式，所述DNA包括cDNA和合成的DNA。DNA可以是雙股或單股的。編碼本發明的FGF21變體或融合蛋白的編碼序列可以由於遺傳密碼的冗余或簡並性的結果而不同。所述核酸分子可包含：僅蛋白的編碼序列；蛋白的編碼序列和其他部分的編碼序列，如引導序列或分泌序列或前蛋白序列；蛋白的編碼序列和非編碼序列，如內含子或蛋白的編碼序列的5’及/或3’非編碼序列等。因此，術語“編碼蛋白的核 酸分子”涵蓋這樣的多核苷酸，其可不僅僅包含蛋白或多肽的編碼序列，還包括其他部分的編碼序列及/或非編碼序列。
在一些實施方式中，所述分離的核酸分子包含下述任一項所示的核酸序列：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25。
在另一個方面，本發明提供載體，其包含本發明所述的核酸分子。所述載體(例如，表達載體)通常可作為附加體或作為宿主染色體DNA的整體的一部分在宿主生物體中複製。一般地，表達載體可含有選擇性標記物，例如，四環素、新黴素和二氫葉酸還原酶等，以允許檢測被期望的核酸分子轉化的那些細胞。例如，pcDNA3.4載體。
在另一個方面，本發明還提供細胞(例如宿主細胞)，其包含本發明所述的載體。所述細胞可包括，例如，哺乳動物細胞(如CHO、NS0、HEK293或COS細胞)；細菌細胞(如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence))；或真菌或酵母細胞。在某些實施方式中，所述細胞為HEK293細胞或CHO細胞。
在另一個方面，本發明還提供製備本發明所述的FGF21變體、本發明所述的融合蛋白或本發明所述的蛋白質多聚體的方法。所述方法包括：在允許所述FGF21變體、所述融合蛋白或所述蛋白質多聚體表達及/或形成的條件下培養本發明所述的細胞(例如，宿主細胞)。在某些實施方式中，所述製備方法還包括：回收經表達及/或形成的所述FGF21變體、所述融合蛋白或所述蛋白質多聚體。可以透過熟知的方法將含有目的核酸分子的載體轉移至細胞(例如宿主細胞)中，這樣的方法取決於所述細胞的類型而不同。例如，氯化鈣轉化通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他宿主細胞。一般而言，可以在《Mammalian Cell Biotechnology：A Practical Approach》，M.Butler編(IRL Press，1991)和Sambrook等人的著作中找到將細胞培養生產力最大化的原理、方法和實踐技術。
在另一個方面，本發明提供一種組合物(如藥物組合物)，其包含本發明所述的FGF21變體、本發明所述的融合蛋白或本發明所述的蛋白質多聚體，以及任選地一種或多種藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑。所述組合物 中可包含治療有效量的本發明所述的FGF21變體、本發明所述的融合蛋白或本發明所述的蛋白質多聚體。
所述藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑較佳為在所採用的劑量和濃度下對受試者無毒性。
所述組合物可含有用於改變、保持或保存例如組合物的pH、同滲溶摩、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶出或釋放速率、吸收或滲透的配製劑。可由熟習技藝之人士根據例如預期給藥途徑、遞送方式和所需劑量來確定合適的組合物製劑(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences)。
可以選擇將所述FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體組合物用於胃腸外遞送。或者，可以選擇組合物用於吸入或用於透過消化道遞送，例如口服。這類藥學上可接受的組合物的製備是本領域熟習技藝之人士瞭解的。
當預期胃腸外給藥時，用於本發明的組合物可以是無熱原、胃腸外可接受的包含所需FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體與藥學上可接受的溶媒的水溶液形式。對於胃腸外注射的特別合適的溶媒是無菌蒸餾水，其中將FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體配製成適當防腐的無菌等滲溶液。又一種製備物可包括所需分子與某種物質(例如可注射微球、可生物蝕解的顆粒、聚合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體)的製劑，所述物質提供用於控釋或緩釋產品，所述產品然後可透過積存注射遞送。還可使用透明質酸，這可具有促進循環中持續時間延長的作用。用於引入所需分子的其它合適方法包括可植入遞藥裝置。
在一個實施方案中，可以配製所述組合物用於吸入。例如，可將本發明所述的FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體製成吸入用乾粉劑。還可用氣溶膠遞送用的拋射劑配製FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體吸入溶液劑。在又一個實施方案中，可使溶液劑霧化。國際公告號WO 94/20069中更多地描述了經肺給藥，其描述了化學修飾蛋白質的經肺遞送。
還考慮可口服給予某些製劑。在本發明的一個實施方案中，以這種方式給予的FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體可以用或不用常用於配製固體劑型(例如片劑和膠囊劑)中的載體來配製。例如，可以設計膠囊劑以使製劑的活性部分在胃腸道的生物利用度最大化且系統前降解最小化時的點上釋 放。可包括促進FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體吸收的其它物質。還可以使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、助懸劑、片劑崩解劑和黏合劑。
另一種組合物可包含有效量的所述FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體與適用於片劑製備的無毒賦形劑的混合物。透過將片劑溶於無菌水或另一種合適的溶媒中，以單位劑型製備溶液劑。
也可提供其它類型的FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體組合物，例如，可包括在持續遞送或受控遞送製劑中包含FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體的製劑。配製多種其它持續遞送或受控遞送工具的技術，例如脂質體載體、可生物蝕解微粒或多孔珠粒和積存注射劑也為本領域熟習技藝之人士所知(參見例如國際公告號WO 93/15722，該專利披露了用於藥物組合物遞送的多孔聚合微粒的控釋，以及Wischke&Schwendeman，2008，Int.J.Pharm.364：298-327，和Freiberg&Zhu，2004，Int.J.Pharm.282：1-18，其論述了微球/微粒製劑和用途)。如本發明所述的，水凝膠是持續遞送或受控遞送製劑的實例。
用於體內給藥的所述FGF21變體、融合蛋白或蛋白質多聚體組合物通常應該是無菌的。這可透過除菌濾膜過濾實現。如果將組合物凍乾，則採用該方法的除菌可在凍乾和複溶之前或之後進行。用於胃腸外給藥的組合物可以凍乾形式保存，或者保存在溶液中。另外，一般將胃腸外組合物裝入具有無菌入口的容器中，例如具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內注射用溶液袋或小瓶。
一旦製成組合物，便可將之作為溶液劑、混懸劑、凝膠劑、乳劑、固體劑或作為脫水粉劑或凍乾粉劑保存在無菌小瓶中。這類製劑可以隨時可用的形式或需要在給藥前複溶的形式(例如凍乾形式)保存。
在某些實施方式中，本發明涉及用於產生單劑量給藥單位的藥盒。藥盒可各自含有具有乾燥蛋白質的第一容器和具有含水製劑的第二容器兩者。本發明的範圍還包括包含單室預灌裝注射器和多室預灌裝注射器(例如液體劑注射器和凍乾劑注射器(lyosyringe)的藥盒)。
所述藥物組合物的給藥途徑與已知方法一致，例如口服；透過靜脈內、腹膜內、腦內(腦實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內或 病灶內途徑注射；透過緩釋系統(其也可被注射)；或透過植入裝置。需要時，可透過推注或連續通過輸注，或者透過植入裝置給予組合物。
備選地或另外地，可透過植入在其上已吸收或包封了所需活性成分的膜、海棉或其它合適的材料局部給予組合物。在使用植入裝置時，可將該裝置植入任何合適的組織或器官，並且可透過擴散、定時釋藥推注(timed-release bolus)或連續給藥遞送所需活性成分。
所述組合物可用於治療代謝性疾病。在一些實施例中，所述代謝性疾病是糖尿病，例如2型糖尿病。在另一些實施方式中，所述代謝性疾病是肥胖症。其他實施方案包括代謝病況或代謝紊亂，例如血脂異常、高血壓、肝脂肪變性，例如非酒精性脂肪肝(NASH)、心血管疾病，例如動脈粥樣硬化、以及老化。
另一方面，本發明還提供以下實施方式。
1.FGF21變體，其胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列相比包括一個或多個胺基酸取代，所述一個或多個胺基酸取代包括第167位處的胺基酸取代，其中所述第167位處的胺基酸取代為S167H。
2.根據實施方式1所述的FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代還包括選自下述的一個或多個位置處的胺基酸取代：第98位、第171位、第175位、第113位、第114位和第135位。
3.根據實施方式2所述的FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代L98R。
4.根據實施方式2-3中任一項所述的FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代P171A或P171G。
5.根據實施方式2-4中任一項所述的FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代R175L、R175P或R175H。
6.根據實施方式2-5中任一項所述的FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代G113R。
7.根據實施方式2-6中任一項所述的FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代L114Q。
8.根據實施方式2-7中任一項所述的FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代包括胺基酸取代R135C。
9.根據實施方式1-8中任一項所述的FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代包含下述任一組所示胺基酸位置處的胺基酸取代：a)L98、S167和P171；b)L98、S167、P171和R175；以及c)L98、G113、L114、R135、S167、P171和R175。
10.根據實施方式1-9中任一項所述的FGF21變體，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：34-37。
11.融合蛋白，其包含實施方式1-10中任一項所述的FGF21變體。
12.根據實施方式11所述的融合蛋白，其還包含IgG恆定區結構域或其片段。
13.根據實施方式12所述的融合蛋白，其中所述IgG恆定區結構域或其片段包括IgG4 Fc結構域。
14.根據實施方式13所述的融合蛋白，其中所述IgG4 Fc結構域包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：5-6。
15.根據實施方式12-14任一項所述的融合蛋白，其中所述FGF21變體的N端與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端直接或間接相連。
16.根據實施方式15所述的融合蛋白，其中所述FGF21變體的N端透過第一轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端相連。
17.根據實施方式16所述的融合蛋白，其中所述第一轉接子包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：7-8。
18.根據實施方式11-17中任一項所述的融合蛋白，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：9-14和SEQ ID NO：26-27。
19.根據實施方式11-18中任一項所述的融合蛋白，其還包含GLP-1受體激動劑部分。
20.根據實施方式19所述的融合蛋白，其中所述GLP-1受體激動劑部分包含GLP-1類似物。
21.根據實施方式19-20中任一項所述的融合蛋白，其中所述GLP-1受體激動劑部分包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：28。
22.根據實施方式19-21中任一項所述的融合蛋白，其包含所述IgG恆定區結構域或其片段以及所述GLP-1受體激動劑部分，並且所述GLP-1受體激動劑部分的C端與所述IgG恆定區結構域或其片段的N端直接或間接相連。
23.根據實施方式22所述的融合蛋白，其中所述GLP-1受體激動劑部分的C端透過第二轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的N端相連。
24.根據實施方式23所述的融合蛋白，其中所述第二轉接子包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：7-8。
25.根據實施方式19-24中任一項所述的融合蛋白，其包含所述IgG恆定區結構域或其片段、所述GLP-1受體激動劑部分以及所述FGF21變體，並且所述FGF21變體的N端與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端直接或間接相連。
26.根據實施方式25所述的融合蛋白，其中所述GLP-1受體激動劑部分的C端透過所述第二轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的N端相連，且所述FGF21變體的N端透過所述第一轉接子與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端相連。
27.根據實施方式25-26中任一項所述的融合蛋白，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：16-18。
28.蛋白質多聚體，其由兩個以上實施方式11-27中任一項所述的融合蛋白構成。
29.根據實施方式28所述的蛋白質多聚體，其為同源二聚體。
30.分離的核酸分子，其編碼實施方式1-10中任一項所述的FGF21變體或實施方式11-27中任一項所述的融合蛋白。
31.載體，其包含實施方式30所述的分離的核酸分子。
32.細胞，其包含實施方式31所述的載體。
33.製備實施方式1-10中任一項所述的FGF21變體、實施方式11-27中任一項所述的融合蛋白或實施方式28-29中任一項所述的蛋白質多聚體的方法，所述方法包括：在允許所述FGF21變體、所述融合蛋白或所述蛋白質多聚體表達及/或形成的條件下培養實施方式32所述的細胞。
34.根據實施方式33所述的方法，其進一步包括：回收經表達及/或形成的所述FGF21變體、所述融合蛋白或所述蛋白質多聚體。
35.藥物組合物，其包含實施方式1-10中任一項所述的FGF21變體、實施方式11-27中任一項所述的融合蛋白或實施方式28-29中任一項所述的蛋白質多聚體，以及任選地一種或多種藥學上可接受的載體。
36.實施方式1-10中任一項所述的FGF21變體、實施方式11-27中任一項所述的融合蛋白或實施方式28-29中任一項所述的蛋白質多聚體在製備藥物中的用途，其中所述藥物用於治療代謝性疾病。
37.根據實施方式36所述的用途，其中所述代謝性疾病選自糖尿病、肥胖和肝脂肪變性。
實施例1：融合蛋白S1-S8表達載體的構建
委託蘇州金唯智生物科技有限公司合成目的基因(該目的基因5’端依次包含人IgG4的Fc、連接子和FGF21變體，該目的基因編碼的融合蛋白S1-S7的胺基酸序列參見表3)，在37℃條件下，利用內切酶Hind Ⅲ和EcoR I(TAKARA，Japan)消化處理目的基因序列和載體質體pcDNA3.4，採用Gel Extraction Kit試劑盒按廠商說明純化回收消化產物。利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按廠商說明將純化回收的目的基因和載體連接，16℃恆溫處理1小時，得到重組表達質體。
將上述重組表達質體轉化到感受態細胞DH5a中，取菌體塗佈安比西林培養盤。挑取培養盤上的單一殖株於1ml LB培養基(蛋白腖10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L和瓊脂2%，抗生素含量100μg/mL)中培養後萃取質體，經廣州艾基生物技術有限公司定序驗證正確，採用Invitrogen質體大提試劑盒萃取一系列經驗證正確的表達載體，用限制性內切酶Pvu I酶切(TAKARA，Japan)，進行線性化後利用乙醇沉澱方法純化回收，-20℃保藏備用。
實施例2：融合蛋白S1-S8的表達
將HEK293F宿主細胞(Invitrogen，Freestyle 293F)用293 Expression Medium培養基復蘇培養，當細胞密度約1×106個細胞/mL時對宿主細胞進行轉染。轉染約3×107個細胞，實施例1製備的線性化表達載體約37.5μg，採用FreeStyleTM MAX Reagent轉染試劑盒進行。轉染後細胞於30mL的293 Expression Medium培養基中培養。培養第二天，開始使用遺傳黴素G418(Merck)對轉化子進行篩選，根據細胞生長情況，每3天更換一次培養基，約14天後，可見有抗性的選殖出現，可進行擴大培養。細胞傳代密度約0.5×106個細胞/mL，對獲得的混合選殖株用293 Expression Medium培養基進行傳代培養。當細胞存活率約90%時，收集細胞培養液。
實施例3：融合蛋白S1-S8的純化
將實施例2製備的細胞培養液在200g下離心10min，取上清在8000rpm下離心30min後，收集上清，利用Protein A層析柱(EzFast Protein A Diamond，柏格隆)對離心後的細胞培養液上清進行親和純化，平衡液為20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脫液為0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液pH3.2，收集目標吸收峰下蛋白洗脫液，用PBS緩衝液透析後取部分樣品進行質譜檢測，質譜(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型號G6530，Agilent Technologies)檢測分子量，與理論分子量一致，且為同源二聚體形式。同時對收集的樣品經還原與非還原後透過10% SDS-PAGE電泳檢測。以融合蛋白S2為例，其純化結果顯示在圖12中。其中第1泳道為蛋白分子量標記物，第5泳道為融合蛋白S2發酵上清液，第6泳道為純化後的融合蛋白S2，而第7泳道為還原後的融合蛋白S2。
實施例4：ELISA法檢測融合蛋白與標靶的結合能力
首先，將10μg βKlotho蛋白(AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)溶解於10ml蛋白包被液(碳酸鹽緩衝液pH9.6)中，混合均勻後在ELISA板的各孔中分別加入100μL，4℃下放置過夜。然後除去包被液，用PBST溶液洗滌4次，各孔中加入200μL封閉液(5g脫脂奶粉加入到100ml PBS溶液)，在37℃下孵育，2h後，除去封閉液，各孔加入不同濃度的融合蛋白樣品100μL，用自封袋封好後在37℃下放置，2h後，用PBST溶液洗滌4次，加入100μL的Anti-Human IgG 4 Fc-HRP(1/1000)(Abcam)，在37℃下孵育1h。最後，用PBST溶液洗滌4次，加入高敏感的TMB底物100μL，2min後加入50μL的終止夜(2M H2SO4)結束反應，用酶標儀測定各孔的OD值讀數。
結果如圖3和圖4所示。圖3顯示，融合蛋白S7隨著濃度的降低與標靶的結合能力顯著下降，而與S7相比，增加第167位及/或第175位的胺基酸取代後，融合蛋白S1\S2\S4\S5與標靶的結合能力顯著增強。S1\S2\S4\S5在100μg/mL~0.8μg/mL濃度範圍內與標靶結合能力均可維持在較高水準，表明第167位和175位與標靶結合能力密切相關。圖4顯示，增加第113位元、114位以及135位的胺基酸取代，融合蛋白與標靶的結合能力依然維持在較高水準。
實施例5：fortebio方法檢測融合蛋白與標靶的結合能力
將各融合蛋白樣品用緩衝液(PBS緩衝液100ml，加入0.1gBSA攪拌至充分溶解，再加入20μL的吐溫20，混合均勻)稀釋至40nM，加入到樣品板的各孔中，透過親和力檢測系統(OCTET RED 96 SYSTEM)，用帶有streptavidin(鏈黴親和素)的探針結合生物素化的βKlotho(25nM，AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)蛋白後，自動檢測其與各融合蛋白的結合情況，結果見表4。KD值越低代表融合蛋白與靶點的結合能力越強。表4顯示，與融合蛋白S7相比，增加第167位胺基酸取代的融合蛋白S1與標靶的結合能力有很大提高，在進一步增加第175位的胺基酸取代後，如融合蛋白S2，與標靶的結合能力是S7的2倍。
實施例6：融合蛋白D1-D3表達載體的構建
首先，利用PCR擴增獲得上游片段(包含GLP-1部分)和下游片段(Fc-FGF21)，PCR擴增程式為：98℃，預變性5min；98℃，變性10s；56℃黏合10s；72℃延伸5s或10s；重複30個循環；72℃繼續延伸8min。然後用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，並用OMEGA膠回收試劑盒回收上游片段和下游片段。將獲得的上游片段與下游片段透過SOE PCR獲得全長序列。SOE PCR擴增程式為：98℃，預變性5min；98℃，變性10s；56℃黏合10s；72℃延伸15s；重複30個循環；72℃繼續延伸8min。然後用Gel Extraction Kit試劑盒(OMEGA，America)回收全長目的基因。
在37℃條件下，利用內切酶Hind Ⅲ和EcoR I(TAKARA，Japan)消化處理全長目的基因序列和載體質體pcDNA3.4，採用Gel Extraction Kit試劑盒(OMEGA，America)按廠商說明純化回收消化產物。利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按廠商說明將純化回收的目的基因和載體連接，16℃恆溫處理1小時，得到重組表達質體。
將上述重組表達質體轉化到感受態細胞DH5a中，取菌體塗佈安比西林培養盤。挑取培養盤上的單一殖株於1ml LB培養基(蛋白腖10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L和瓊脂2%，抗生素含量100μg/mL)中培養後萃取質體，經定序驗證正確後，採用Invitrogen質體大提試劑盒萃取一系列經驗證正確的表達載體，用限制性內切酶Pvu I(TAKARA，Japan)酶切，進行線性化後利用乙醇沉澱方法純化回收，-20℃保藏備用。
實驗過程中用到的引子如下： 上游片段(包含GLP-1部分)擴增引子：
引子AUZ-F：cccaagcttgccgccaccatgaccagactgaccgtgc(SEQ ID NO：29)
引子lfc1-R：gccgtacttgctctcagatccaccgcctccgcttc(SEQ ID NO：30)
下游片段(Fc-FGF21)擴增引子：
引子lfc1-F：gcggaggcggtggatctgagagcaagtacggccc(SEQ ID NO：31)
引子fgf21-R：ccggaattctcatcagctggcgtagctagggct(SEQ ID NO：32)
SOE PCR引子：
引子AUZ-F cccaagcttgccgccaccatgaccagactgaccgtgc(SEQ ID NO：29)
引子fgf21-R：ccggaattctcatcagctggcgtagctagggct(SEQ ID NO：32)
實施例7：融合蛋白D1-D3的表達
將HEK293F宿主細胞(Invitrogen，Freestyle 293F)用293 Expi Medium培養基復蘇培養，當細胞密度約1×106個細胞/mL時對宿主細胞進行轉染。轉染細胞約3×107細胞，線性化表達實施例6構建的載體約30μg，採用Expi Fectamine293 Reagent轉染試劑盒進行。轉染後細胞於30mL的293 Expi Medium培養基中培養。培養第二天，開始使用遺傳黴素G418(merck)對轉化子進行篩選，根據細胞生長情況，每3天更換一次培養基，約14天後，可見有抗性的選殖出現，可進行擴大培養。細胞傳代密度約0.5×106細胞/mL，對獲得的混合選殖株用293 Expression Medium培養基進行傳代培養。當細胞存活率約90%時，收集細胞培養液。
實施例8：融合蛋白D1-D3的純化
將實施例7製備的細胞培養液在200g下離心10min，取上清在8000rpm下離心30min後，收集上清，利用Protein A層析柱(EzFast Protein A Diamond，柏格隆)對離心後的細胞培養液上清進行親和純化，平衡液為20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脫液為0.1M甘胺酸洗脫pH3.2，收集目標吸收峰下蛋白洗脫液，用PBS緩衝液透析後取部分樣品進行質譜檢測，質譜(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型號G6530，Agilent Technologies)檢測分子量，與理論分子量一致，且為同源二聚體形式。同時對收集的樣品經還原與非還原後透過10% SDS-PAGE電泳檢測。以融合蛋白D2為例，其純化結果顯示在圖12 中。其中第1泳道為蛋白分子量標記物，第2泳道為融合蛋白D2發酵上清液，第3泳道為純化後的融合蛋白D2，而第4泳道為還原後的融合蛋白D2。
實施例9：db/db小鼠模型中融合蛋白S1/S7/S8的降糖及保護肝功能藥效研究
融合蛋白在db/db小鼠模型(南京大學模式動物研究所)中的藥效研究。實驗過程為對純化的融合蛋白用10mM的PBS稀釋，對符合實驗要求的db/db小鼠隨機選擇分組，共4組，包括溶媒組，S7組(SEQ ID NO：26)、S1組(SEQ ID NO：9)，S8組(SEQ ID NO：27)，按每隻db/db小鼠注射40nM/kg相應的融合蛋白進行計算給藥，給藥體積為10ml/kg，每個融合蛋白注射9隻小鼠，每週給藥一次，給藥兩週。給藥後臨床觀察血糖變化情況(結果見圖5)。與S8組相比，給藥後第一天和給藥第二天，S1組顯示出快速降低血糖的作用，同時S1組顯示出更平穩的降糖效果。與S7組相比，S1組具有更好的降糖效果。
給藥兩週後，犧牲小鼠，檢測其血液穀草轉胺酶(AST)及穀丙轉胺酶(ALT)水準(結果見圖6)，以評價藥物對肝功能保護作用。資料顯示，S7組及S1組顯著降低了穀草轉胺酶(AST)及穀丙轉胺酶(ALT)水準，顯示出對肝臟的保護作用。
可見，S1組相對於S7組在降糖及護肝方面均顯示出更優的效果。
實施例10：db/db小鼠模型中融合蛋白S1/S2的單次降糖藥效研究
db/db模型小鼠(南京大學模式動物研究所)隨機分成3組，包括溶媒組，S1組(SEQ ID NO：9)，S2組(SEQ ID NO：10)，按每隻db/db小鼠注射40nM/kg的相應融合蛋白進行計算給藥，給藥體積為10ml/kg，每個融合蛋白注射9隻小鼠，給藥一次，給藥後臨床觀察血糖變化情況(結果見圖7)。由圖7的結果可知，與溶媒組相比，S1組與S2組均能顯著降低血糖，S2組顯示出相對更優的降糖效果。
實施例11：db/db小鼠模型中融合蛋白D1/D2的降糖及降脂藥效研究
db/db模型小鼠(南京大學模式動物研究所)隨機分成4組，包括溶媒組，D1組(SEQ ID NO：16)，D2組(SEQ ID NO：17)，按每隻db/db小鼠注射30nM/kg的相應融合蛋白進行計算給藥，給藥體積為10ml/kg，每個融合蛋白注 射9隻小鼠，每週給藥一次，給藥2週。給藥後臨床觀察血糖變化情況(結果見圖8)。由圖8可知，融合蛋白D1和D2均表現出了較強的降糖能力。
初次給藥14天後，檢測血清甘油三酯(TG)結果見圖9、總膽固醇(TCHO)結果見圖10。結果表明，融合蛋白D1和D2具有顯著的降甘油三酯及降總膽固醇的效果。
實施例12：融合蛋白D2、杜拉魯肽在ob/ob小鼠模型中的降糖藥效果研究
融合蛋白在ob/ob小鼠模型中(南京大學模式動物研究所)的藥效研究，實驗過程為對純化的一系列相應融合蛋白用10mM的PBS稀釋，小鼠隨機分成4組，包括溶媒組，D2組(SEQ ID NO：17)10nmol/kg、D2組(SEQ ID NO：17)20nmol/kg、杜拉魯肽(Lily)20nmol/kg組，給藥體積為10ml/kg，每個融合蛋白注射9隻小鼠，每週給藥兩次，連續給藥3週。每次給藥前取樣檢測血糖變化情況見圖11。結果顯示，與杜拉魯肽相比，融合蛋白D2具有更好的降糖效果，且降糖曲線更加平穩。
實施例13 表達載體Plasmid-X1的構建
委託蘇州金唯智生物科技有限公司合成目的基因(該目的基因依次如表6所示)，在37℃條件下，利用內切酶Hind Ⅲ和EcoR I(TAKARA，Japan)消化處理目的基因序列和載體質體pCDNA3.4，採用Gel Extraction Kit試劑盒按廠商說明純化回收消化產物。利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按廠商說明將純化回收的目的基因和載體連接，16℃恆溫處理1小時，得到重組表達質體。
將上述重組表達質體轉化到感受態細胞DH5a中，取菌體塗佈安比西林培養盤。挑取培養盤上的單一殖株於1ml LB培養基(蛋白腖10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L和瓊脂2%，抗生素含量100μg/L)中培養後萃取質體，經廣州艾基生物技術有限公司定序驗證正確，採用Invitrogen質體大提試劑盒萃取一系列經驗證正確的表達載體，用限制性內切酶Pvu I酶切(TAKARA，Japan)，進行線性化後利用乙醇沉澱方法純化回收，-20℃保藏備用。
實施例14 融合蛋白表達載體轉染細胞並表達
將HEK293F宿主細胞(Invitrogen，Freestyle 293F)用293 Expi Medium培養基復蘇培養，當細胞密度約1×106細胞/mL時對宿主細胞進行轉染。轉染細胞約3×107細胞，線性化表達實施例13製備的載體各約30μg，採用Expi Fectamine293 Reagent轉染試劑盒進行。轉染後細胞於30mL的293 Expi Medium培養基中培養。培養第二天，開始使用遺傳黴素G418(merck)對轉化子進行篩選，根據細胞生長情況，每3天更換一次培養基，約14天後，可見有抗性的選殖出現，可進行擴大培養。細胞傳代密度約0.5×106個細胞/mL，對獲得的混合選殖株用293 Expression Medium培養基進行傳代培養。當細胞存活率約90%時，收集細胞培養液。
實施例15 收集細胞發酵培養液純化融合蛋白
將實施例14獲得的細胞培養液在200g下離心10min，取上清在8000rpm下離心30min後，收集上清，利用Protein A層析柱(EzFast Protein A Diamond，柏格隆)對離心後的細胞培養液上清進行親和純化，平衡液為20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脫液為0.1M甘胺酸洗脫pH3.2，收集目標吸收峰下蛋白洗脫液，用PBS緩衝液透析後取部分樣品進行質譜檢測，質譜(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型號G6530，Agilent Technologies)檢測分子量，與理論分子量一致，且為同源二聚體形式。同時對收集的樣品經還原與非還原後透過10% SDS-PAGE電泳檢測。結果如圖13所示。圖13中泳道1-10依次為SPC、S3、D3、S2、Marker、DTT處理的SPC、DTT處理的S3、DTT處理的D3、DTT處理的S2和Marker。
實施例16：db/db小鼠模型中融合蛋白的降糖及改善血脂藥效研究
融合蛋白D3和D2在db/db小鼠模型(江蘇集萃藥康生物科技有限公司)中的藥效研究。實驗過程為對純化的融合蛋白用10mM的PBS稀釋，對符合實驗要求的db/db小鼠隨機選擇分組，共3組，包括溶媒組，融合蛋白D3和D2按每隻db/db小鼠注射10nM/kg相應的融合蛋白進行計算給藥，給藥體積為10ml/kg，每個融合蛋白注射9隻小鼠，每週給藥一次，給藥兩週。給藥後臨床觀察血糖、體重和攝食量的變化情況(結果見圖14)。與溶媒對照組相比，具有降血糖活性。
實施例17：ob/ob小鼠模型中融合蛋白的降糖及改善血脂藥效研究
融合蛋白在ob/ob小鼠模型(江蘇集萃藥康生物科技有限公司)中的藥效研究。實驗過程為對純化的融合蛋白用10mM的PBS稀釋，對符合實驗要求的ob/ob小鼠隨機選擇分組，共6組，包括對照組(僅PBS緩衝液)，S2，S1，S7，S3和SPC，按每隻ob/ob小鼠注射20nM/kg相應的融合蛋白進行計算給藥，給藥體積為10ml/kg，每個融合蛋白注射8隻小鼠，單次給藥。給藥後臨床觀察血糖、體重和攝食量的變化情況(結果見圖15)。與對照組相比，S1、S2、S3在給藥後24h顯示出較弱的降糖效應；S1、S2、S3、SPC均在給藥後48h顯示較強的降糖效果(P<0.001、P<0.05)，其中S2的降糖效應維持到120h(P<0.01，P<0.001)，其他僅維持到給藥後96h，降糖幅度上S1略優。S7除在給藥72h顯示較強的降糖效應外，其他時間均未顯示明顯降糖效應。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本發明所列舉的實施方式的多種變化對本領域熟習技藝之人士來說是顯而易見的，且保留在所附申請專利範圍和其均等方案的範圍內。
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<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> FGF21變體
<220>
<221> UNSURE
<222> (98)..(98)
<223> 98位的Xaa為Leu，Arg，Asp，Glu或Lys
<220>
<221> UNSURE
<222> (113)..(114)
<223> 113位的Xaa為Gly或Arg；114位的Xaa為Leu或Gln
<220>
<221> UNSURE
<222> (135)..(135)
<223> 135位的Xaa為Arg或Cys
<220>
<221> UNSURE
<222> (167)..(167)
<223> 167位的Xaa為Ser，Cys，Arg或His
<220>
<221> UNSURE
<222> (171)..(171)
<223> 171位的Xaa為Pro，Cys，Gly或Ala
<220>
<221> UNSURE
<222> (175)..(175)
<223> 175位的Xaa為Arg，His，Pro或Leu
<400> 2
<210> 3
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> FGF21 98R171A167H175L
<400> 3
<210> 4
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> FGF2198R171G167H175L
<400> 4
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> fc lily
<400> 5
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<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> IgG4 Fc hec
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> linker
<400> 7
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> linker a
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<223> S 98R，171G，167H,175L
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<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S 98R，171A，167H，175P
<400> 12
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<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S 98R，171A，167H，175H
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S 98R，171A，167H,175P，113R，114Q，135C
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> GLP-1類似物
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> D 98R，171A，167H、175L
<400> 17
<210> 18
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> D 98R，171G，167H、175L
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> DNA S 98R，171A，167H
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S DNA 98R，171A，167H，175P
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<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> SDNA 98R，171A，167H，175H
<400> 22
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<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> SDNA 98R，171A，167H，175P，113R，114Q，135C
<400> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(arfificial sequence)
<220>
<223> DDNA 98R，171A，167H
<400> 24
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<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> DDNA 98R，171A，167H，175L
<400> 25
<210> 26
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S 98R，171A
<400> 26
<210> 27
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S 98R，171G
<400> 27
<210> 28
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> GLP-1類似物
<400> 28
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物AUZ-F
<400> 29
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物lfc1-R
<400> 30
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物lfc1-F
<400> 31
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物fgf21-R
<400> 32
<210> 33
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 對照融合蛋白SPC
<400> 33
<210> 34
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S1中的FGF21變體的序列
<400> 34
<210> 35
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S4中的FGF21變體的序列
<400> 35
<210> 36
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S5中的FGF21變體的序列
<400> 36
<210> 37
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S6中的FGF21變體的序列
<400> 37

Claims (24)

  1. 一種FGF21變體，其胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列相比包括一個或多個胺基酸取代，所述一個或多個胺基酸取代包括第167位處的胺基酸取代，其中所述第167位處的胺基酸取代為S167H。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之FGF21變體，其中一個或多個胺基酸取代還包括在選自下述的一個或多個位置處的胺基酸取代：第98位、第171位、第175位、第113位、第114位和第135位。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代還包括選自下述的一個或多個胺基酸取代：L98R；P171A或P171G；R175L、R175P或R175H；G113R；L114Q和R135C。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之FGF21變體，其中所述一個或多個胺基酸取代包含下述任一組所示胺基酸位置處的胺基酸取代：a)L98、S167和P171；b)L98、S167、P171和R175；以及c)L98、G113、L114、R135、S167、P171和R175。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之FGF21變體，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：34-37。
  6. 一種融合蛋白，其包含如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的FGF21變體。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之融合蛋白，其還包含IgG恆定區結構域或其片段。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之融合蛋白，其中所述IgG恆定區結構域包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：5-6。
  9. 如申請專利範圍第7項或第8項所述之融合蛋白，其中所述FGF21變體的N端與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端直接或間接相連。
  10. 如申請專利範圍第6項至第9項中任一項所述之融合蛋白，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：9-14和SEQ ID NO：26-27。
  11. 如申請專利範圍第6項至第10項中任一項所述之融合蛋白，其還包含GLP-1受體激動劑部分。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之融合蛋白，其中所述GLP-1受體激動劑部分包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：28。
  13. 如申請專利範圍第11項或第12項所述之融合蛋白，其包含所述IgG恆定區結構域或其片段以及所述GLP-1受體激動劑部分，並且所述GLP-1受體激動劑部分的C端與所述IgG恆定區結構域或其片段的N端直接或間接相連。
  14. 如申請專利範圍第11項至第13項中任一項所述之融合蛋白，其包含所述IgG恆定區結構域或其片段、所述GLP-1受體激動劑部分以及所述FGF21變體，並且所述FGF21變體的N端與所述IgG恆定區結構域或其片段的C端直接或間接相連。
  15. 如申請專利範圍第11項至第14項中任一項所述之融合蛋白，其包含下述任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：16-18。
  16. 一種蛋白質多聚體，其由兩個以上如申請專利範圍第6項至第15項中任一項所述的融合蛋白構成。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之蛋白質多聚體，其為同源二聚體。
  18. 一種分離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的FGF21變體或如申請專利範圍第11項至第15項中任一項所述的融合蛋白。
  19. 一種載體，其包含如申請專利範圍第18項所述的分離的核酸分子。
  20. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第19項所述的載體。
  21. 一種製備如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的FGF21變體、如申請專利範圍第6項至第15項中任一項所述的融合蛋白、或如申請專利範圍第16項或第17項所述的蛋白質多聚體的方法，所述方法包括：在允許所述FGF21變體、所述融合蛋白或所述蛋白質多聚體表達和/或形成的條件下培養如申請專利範圍第20項所述的細胞。
  22. 一種藥物組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的FGF21變體、如申請專利範圍第6項至第15項中任一項所述的融合蛋白、或如申請專利範圍第16項或第17項所述的蛋白質多聚體，以及任選地一種或多種藥學上可接受的載體。
  23. 一種如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的FGF21變體、如申請專利範圍第6項至第15項中任一項所述的融合蛋白、或如申請專利範圍第16項或第17項所述的蛋白質多聚體用於製備藥物之用途，其中所述藥物用於治療代謝性疾病。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之用途，其中所述代謝性疾病選自糖尿病、肥胖和肝脂肪變性。
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