CN117265009B - 一种gpc3-car-nkt细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
一种gpc3-car-nkt细胞的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117265009B CN117265009B CN202310281884.1A CN202310281884A CN117265009B CN 117265009 B CN117265009 B CN 117265009B CN 202310281884 A CN202310281884 A CN 202310281884A CN 117265009 B CN117265009 B CN 117265009B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gpc3
- car
- seq
- nkt cells
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims abstract description 66
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 102100032530 Glypican-3 Human genes 0.000 claims description 41
- 101001014668 Homo sapiens Glypican-3 Proteins 0.000 claims description 41
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 5
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims description 4
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 4
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 7
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 3
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 20
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 7
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 6
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 6
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 102100028113 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710108699 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091008877 NK cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010648 Natural Killer Cell Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/303—Liver or Pancreas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体公开了一种GPC3‑CAR‑NKT细胞的制备方法及其应用；本发明建立了一种能高效扩增制备GPC3‑CAR‑NKT细胞的工艺，为基于NKT细胞的免疫疗法研究提供了坚实的基础，可实现临床级别的CAR‑NKT细胞制备；同时，本发明还证明了CAR工程化可以增强NKT细胞的抗肿瘤活性，证明了CAR‑NKT细胞用于肝脏实体瘤治疗的可行性，因此本发明公开的GPC3‑CAR‑NKT细胞及其制备方法可应用于针对肿瘤的免疫药物——特别是以实体肿瘤细胞为靶向细胞的药物的研发和制备。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体公开了一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法及其应用。
背景技术
目前以嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）免疫疗法在血液瘤的治疗领域了取得了举世瞩目的成果。但CAR-T细胞疗法依然面临很多困境，例如严重的毒副作用（细胞因子风暴、神经毒性等）、高度个性化导致难以实现产业化、实体肿瘤治疗效果差等。因此，近年来工程化其他免疫细胞的疗法也成为一个十分热门的方向研究方向，例如NK、NKT、巨噬细胞、γδT细胞等。这些免疫细胞具有不同于T细胞的一些特性，有望克服工程化T细胞在肿瘤治疗方面的一些缺陷。
嵌合抗原受体（CAR）是一种人工构建的抗原受体，其结构中包含3部分：胞外结构域、跨膜区、胞内结构域。胞外结构域一般是有抗体来源的轻链可变区和重链可变区构成的scFv和铰链区组成，scFv的功能在于孵育CAR工程化细胞靶向性；跨膜区常用CD8α或者CD28等分子的跨膜区，其作用主要是锚定CAR分子于细胞膜上；胞内区域由共刺激结构域（例如4-1BB或者CD28等）及CD3ζ信号转导区构成。
自然杀伤T细胞（NKT）是一群细胞表面既表达T细胞受体（TCR），又表达NK细胞受体的特殊T细胞亚群，其是脂质反应性T细胞的一个子集，在肿瘤监测和机体抗肿瘤中发挥重要作用。 NKT细胞是在胸腺中发育出来的，其主要衍生于常规T细胞双阳发育阶段。 NKT细胞在机体的肿瘤监测和抗肿瘤方面具有重要作用。NKT细胞可以直接作用于肿瘤细胞对其进行裂解，也可以通过分泌细胞因子、激活相关免疫细胞等发挥抗肿瘤的活性。目前，基于CAR-NKT细胞的肿瘤免疫治疗在研究中展现出了富有前景的治疗效果。在一项治疗复发性神经母细胞瘤的临床研究中，CAR-NKT细胞取得了良好的治疗效果，而且在安全性方面比CAR-T细胞有更好的表现。
但由于NKT细胞在外周中的占比较低，其提取、富集、扩增制备仍面临着挑战。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开了一种高效的人NKT细胞分离富集、NKT细胞制备和工程化NKT细胞制备工艺，并研究了利用上述制备的NKT细胞来制备GPC3-CAR-NKT细胞，研究其针对实体肿瘤的杀伤效果，为CAR-NKT细胞疗法的研究奠定了基础。
本发明的技术方案如下：
一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，包括以下步骤：
1）NKT细胞的制备；
2）GPC3 CAR慢病毒载体构建；
3）GPC3 CAR慢病毒制备；
4）GPC3-CAR-NKT细胞制备及表型检测。
进一步的，上述一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，所述1）NKT细胞的制备包括以下步骤：
a.通过Ficoll-PaqueTMPREMIUM对健康供体的外周血单核细胞PBMC进行提取，进而从PBMC使用NKT细胞分选试剂盒富集获得NKT细胞;
b.随后将获得的NKT细胞以1×106个/孔接种至24孔板中，补加NKT完全培养基至2ml;在37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。培养过程中定期对细胞进行计数，统计扩增倍数;
c.在扩增后检测NKT细胞扩增纯度。
进一步的，上述一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，所述2）GPC3 CAR慢病毒载体构建包括以下步骤：
合成编码GM-CSFRα信号肽DNA序列，GPC3抗体轻链可变区VL DNA序列、Linker DNA序列、GPC3抗体重链可变区VHDNA序列、IgG4 FcDNA序列、CD28跨膜区DNA序列、CD28共刺激结构域DNA序列以及CD3ζ胞内信号传导结构域DNA序列，并将其亚克隆至LV-EF1α-MCS-kana载体，通过测序验证序列正确的克隆载体用于慢病毒包装制备。在上述结构中VL、Linker和VH组成的scFv可以赋予NKT细胞靶向性，胞内共刺激结构域以及CD3ζ信号转导结构域可以提供NKT细胞活化所需要的活化信号，这样所构建的CAR-NKT细胞可以具有显著增强的特异性抗肿瘤活性。
进一步的，上述一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，所述GM-CSFRα信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述GPC3抗体轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述Linker氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述GPC3抗体重链可变区VH氨基酸序列如SEQID NO：7所示；所述IgG4 Fc氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；所示CD28跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；所述CD28共刺激结构域氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；所述CD3ζ胞内信号传导结构域氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
进一步的，上述一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，所述编码GM-CSFRα信号肽的DNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述编码GPC3抗体轻链可变区VL的DNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述编码Linker的DNA序列如SEQ ID NO：6所示；所述编码GPC3抗体重链可变区VH的DNA序列如SEQ ID NO：8所示；所述编码IgG4 Fc的序列如SEQ ID NO：10所示；所述编码CD28跨膜区的DNA序列如SEQ IDNO：12所示；所述编码CD28共刺激结构域的DNA序列如SEQ ID NO：14所示；所述编码CD3ζ胞内信号传导结构域的DNA序列如SEQ ID NO：16所示。
进一步的，上述一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，所述3）GPC3 CAR慢病毒制备包括以下步骤：
①Day1，接种约4.5×106个293T细胞至培养瓶中，培养基25 ml；
②Day3，转染；首先准备2支15ml离心管，分别命名为MixA管和MixB管，在MixA管中加入9.33μg pVSV-G、17.5μg pGag/Pol、13.42μg pRev、29.63μg GPC3 CAR慢病毒表达质粒以及1750μl DMEM基础培养基，在MixB管中加入140μl PEI和1750μl DMEM基础培养基，然后将MixA管和MixB管混到一块室温孵育10-15min，最后将孵育好的DNA-PEI复合物逐滴加入到培养瓶中，轻轻混匀；
③Day5，收集转染后48 h的病毒上清至50 ml离心管中，并补加25 ml新鲜培养基；④Day6，收集转染后72 h的病毒上清至50 ml离心管中，将两次收集的病毒上清4 ℃、3000g离心10 min去除细胞碎片和杂质，使用0.22 μm小滤器过滤除菌，最后加入适量PEG6000过夜浓缩；
⑤Day7，将浓缩过夜的病毒4℃、2000 g离心15 min，弃上清，加入适量1×HBSS重悬，并使用蔗糖纯化法纯化慢病毒浓缩液，最后使用适量1×HBSS重悬纯化后的慢病毒颗粒，将病毒悬液分装到0.5 ml冻存管中，置于-80 ℃保存。
进一步的，上述一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，所述4）GPC3-CAR-NKT细胞制备及表型检测包括以下步骤：
离心收集扩增5天的NKT细胞，加入新鲜的NKT细胞完全培养基重悬细胞，计数后将NKT细胞以5×105个/孔接种至24孔板中；以MOI=10，计算GPC3 CAR慢病毒的用量，将其加入到接种好NKT细胞中，放入37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。培养7天后，分别收集细胞，分别使用APC-GPC3蛋白和FITC mouse anti-humanCD3抗体和APC mouse anti-humanCD56抗体标记细胞，通过流式细胞仪检测NKT细胞纯度和CAR分子阳性率。
进一步的，一种GPC3-CAR-NKT细胞，由上述制备方法制备而成。
进一步的，上述GPC3-CAR-NKT细胞在研制以实体肿瘤细胞作为靶细胞的药物中的应用。
进一步的，上述GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法在研制以实体肿瘤细胞作为靶细胞的药物中的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果:
本发明建立了一种能高效扩增制备GPC3-CAR-NKT细胞的工艺，为基于NKT细胞的免疫疗法研究提供了坚实的基础，可实现临床级别的CAR-NKT细胞制备；同时，本发明还证明了CAR工程化可以增强NKT细胞的抗肿瘤活性，证明了CAR-NKT细胞用于肝脏实体瘤治疗的可行性，因此本发明公开的GPC3-CAR-NKT细胞及其制备方法可应用于针对肿瘤的免疫药物——特别是以实体肿瘤细胞为靶向细胞的药物的研发和制备。
附图说明
图1.本发明构建的LV-GPC3 CAR-MCS-kana载体图谱；
图2.NKT细胞的扩增倍数统计；
图3.NKT细胞的纯度检测；
图4.GPC3 CAR-NKT的阳性率检测；
图5.HuH7细胞表面GPC3抗原的表达量检测；
图6.GPC3-CAR-NKT细胞对人肝癌HuH7细胞的裂解效果；
图7.GPC3-CAR-NKT细胞的IFN-γ分泌检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到：如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。
以下为本发明中提到的核酸或氨基酸序列
SEQ ID NO 1：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO 2：
ATGCTGCTCCTGGTGACAAGCCTGCTCCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTCCTGCTGATCCCC
SEQ ID NO 3：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLRINSLQPEDFGSYSCQHFWSTPPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO 4：
GACATTCAGATGACACAGAGCCCCGCTAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGAGACCGTGACCATCACCTGCAGAGCTAGCGGCAACATCCACAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCAAGGCAAGAGCCCTCAGCTGCTGGTGTACAACGCCAAGACCCTGGCCGACGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACACAGTACAGCCTGAGAATCAACAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGGCAGCTACAGCTGTCAGCACTTCTGGAGCACCCCCCCCTACACCTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO 5：
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO 6：
GGGGGGGGCGGCAGCGGCGGGGGCGGGTCCGGGGGGGGCGGCAGC
SEQ ID NO 7：
QVQLQQSGAELAKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSSYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTYEDSAVYYCARSATVGAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO 8：
CAAGTGCAGCTCCAACAGTCCGGCGCCGAGCTGGCCAAGCCCGGCGCTAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCTAGCGGCTACACCTTCACAAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCAAGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCTAGCAGCAGCTACACCAAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTACGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAAGCGCCACCGTGGGCGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGCACAAGCGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO 9：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
SEQ ID NO 10：
GAGAGCAAATACGGCCCCCCTTGCCCCCCCTGTCCCGCTCCCGAATTCCTGGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTCGTGGACGTGAGCCAAGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGGCAGCCTAGAGAGCCCCAAGTGTACACCCTCCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGGCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGACTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAGATG
SEQ ID NO 11：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO 12：
TTCTGGGTGCTGGTGGTCGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTCCTCGTGACCGTGGCTTTTATCATCTTCTGGGTG
SEQ ID NO 13：
RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO 14：
AGAAGCAAGAGAAGCAGAGGCGGCCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGAAGACCCGGCCCCACAAGAAAGCACTATCAGCCCTACGCCCCCCCTAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGC
SEQ ID NO 15：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO 16：
AGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTATCAGCAAGGGCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCTAGAAGAAAGAACCCCCAAGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAAAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGACGGAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAAGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAAGCCCTGCCCCCTAGATGA。
实施例1
NKT细胞的制备。
本实施例中适用的NKT细胞是通过Ficoll-PaqueTMPREMIUM（GE healthcare）对健康供体的外周血单核细胞（PBMC）进行提取，进而从PBMC适用NKT细胞分选试剂盒（美天旎，货号：130-093-064）富集获得的。
随后将获得的NKT细胞以1×106个/孔接种至24孔板中，补加NKT完全培养基至2ml。所用NKT完全培养基配方为：免疫细胞培养基（天津灏阳，货号：ANDL-TBD-G）+5 %人血清白蛋白、+500 IU/ml IL-2（近岸生物，货号：GMP-CD66）+IL-21 200 IU/ml（近岸生物，货号：GMP-CC45）+300 IU/ml IL-15（近岸生物，货号： GMP-C016），在37℃ 含5% CO2的培养箱中培养。培养过程中定期对细胞进行计数，统计扩增倍数，结果显示在21天的培养周期里面，NKT细胞获得了高达12000倍左右的扩增，这一扩增效率可以完全满足临床应用的需求（如图2所示）。同时，在扩增第14天检测NKT细胞扩增纯度，结果显示NKT细胞的纯度也高达90%以上（如图3所示）。
因此，本发明建立了一种高扩增效率和高纯度的NKT细胞制备工艺，而且在工艺中所用试剂均为不含动物来源成分的试剂，可以避免动物来源物质造成的治疗风险，同时还可以减少产品质检放行的成本。这一制备方法可以满足后续NKT疗法用于临床应该用的需求。
实施例2
制备GPC3-CAR-NKT细胞。
GPC3 CAR慢病毒载体构建
1.合成下列编码基因序列，并将其亚克隆至LV-EF1α-MCS-kana载体：GM-CSF Rα信号肽氨基酸序列（SEQ ID NO：1）、DNA序列（SEQ ID NO：2）；GPC3抗体轻链可变区VH氨基酸序列（SEQ ID NO：3）、DNA序列（SEQ ID NO：4）,Linker氨基酸序列（SEQ ID NO：5）、DNA序列（SEQ ID NO：6）； GPC3抗重轻链可变区VL氨基酸序列（SEQ ID NO：7）、DNA序列（SEQ ID NO：8）； IgG4 Fc氨基酸序列（SEQ ID NO：9）、DNA序列（SEQ ID NO：10）；CD28跨膜区氨基酸序列（SEQ ID NO：11）、DNA序列（SEQ ID NO：12）；CD28共刺激结构域氨基酸序列（SEQ ID NO：13）、DNA序列（SEQ ID NO：14）；CD3ζ胞内信号传导结构域氨基酸序列（SEQ ID NO：15）、DNA序列（SEQ ID NO：16），将构建成功后的载体命名为LV-GPC3 CAR-MCS-kana，其结构图谱如图1所示。通过测序验证序列正确中用于慢病毒包装制。
2.GPC3 CAR慢病毒制备
以1个T175培养瓶为例：①Day 1，接种约4.5×106个293T细胞至培养瓶中，培养基25ml；②Day 3，转染；首先准备2支15 ml离心管，分别命名为Mix A管和Mix B管，在Mix A管中加入9.33 μg pVSV-G、17.5 μg pGag/Pol、13.42 μg pRev、29.63μg GPC3 CAR慢病毒表达质粒以及1750μl DMEM基础培养基，在Mix B管中加入140μl PEI（1μg/μl，Polysciences，货号：24765-100）和1750μl DMEM基础培养基，然后将Mix A管和Mix B管混到一块室温孵育10-15 min，最后将孵育好的DNA-PEI复合物逐滴加入到培养瓶中，轻轻混匀；③Day 5，收集转染后48 h的病毒上清至50 ml离心管中，并补加25 ml新鲜培养基；④Day 6，收集转染后72 h的病毒上清至50 ml离心管中，将两次收集的病毒上清4 ℃、3000 g离心10 min去除细胞碎片和杂质，使用0.22 μm小滤器过滤除菌，最后加入适量PEG6000（上海生工，货号：A610432-0500）（每ml病毒滤液加入0.245 ml PEG6000浓缩液）过夜浓缩；⑤Day 7，将浓缩过夜的病毒4 ℃、2000 g离心15 min，弃上清，加入适量1×HBSS（OriCell，货号：HBS-10001）重悬，并使用蔗糖纯化法（20%蔗糖，VETEC，货号：V900116-500G）纯化慢病毒浓缩液，最后使用适量1×HBSS重悬纯化后的慢病毒颗粒，将病毒悬液分装到0.5 ml冻存管中，置于-80 ℃保存。
3.GPC3-CAR-NKT细胞制备及表型检测
离心收集扩增5天的NKT细胞，加入新鲜的NKT细胞完全培养基重悬细胞，计数后将NKT细胞以5×105个/孔接种至24孔板中。以MOI=10，计算GPC3 CAR慢病毒的用量，将其加入到接种好NKT细胞中，放入37℃ 含5% CO2的培养箱中培养。培养7天后，分别收集细胞，分别使用APC-GPC3蛋白（ACRO，货号：GP3-HA2H9）和FITC mouse anti-human CD3抗体（biolegend，货号：344804）和APC mouse anti-human CD56抗体（biolegend，货号：362504）标记细胞，通过流式细胞仪检测NKT细胞纯度和CAR分子阳性率，结果显示，我们制备获得了阳性率高达93%的GPC3 CAR-NKT细胞（如图3和4所示）。
实施例3
1. 对靶细胞的杀伤效果
使用表达由EGFP的Huh7细胞作为靶细胞。Huh7细胞表面的GPC3抗原表达量，结果显示Huh7细胞表面几乎接近100%的表达GPC抗原（图5所示）。EGFP的表达可随靶细胞的凋亡而丢失，因此杀伤后EGFP阳性细胞的占比可以表征NKT细胞的杀伤能力。
为了验证GPC3 CAR-NKT细胞对肿瘤细胞的裂解能力，设计如下实验：首先将EGFP-Huh7细胞以2×105个/孔接种至48孔板中，然后以1:2、1:1、5:1的效靶比分别将未转染NKT细胞和GPC3 CAR-NKT细胞加入到48孔板中进行共培养，培养时间为24 h。培养结束后，上流式细胞仪检测肿瘤细胞残留情况，结果显示：相比于NKT细胞，在各个效靶比条件下的GPC3CAR-NKT细胞均能更有效的清除Huh7细胞（图6所示），说明GPC3 CAR分子修饰能够显著增强NKT细胞的抗肿瘤活性。
2. 细胞因子分泌水平检测
在共孵育的第16 h，收集杀伤实验中的共培养上清100μl。参照IFN-γElisa试剂盒（联科，货号：EK180-96）检测说明书，对各组共培养上清中细胞IFN-γ含量进行检测，结果显示，同Huh7细胞共孵育后，不同效靶比的条件下，GPC3 CAR-NKT细胞均比NKT细胞有显著增多的细胞因子IFN-γ分泌结果（图7所示），这一结果与上述杀伤清除肿瘤细胞的实验结果一致。
以上结果可以看出，相比于NKT细胞GPC3 CAR-NKT细胞对Huh7细胞有明显增强的特异性杀伤功能，而且其细胞因子IFN-γ分泌水平也是远高于NKT细胞，因此CAR-NKT细胞在肿瘤的治疗方面极具应用前景。
由以上实施例可知：本发明建立了一种能高效扩增制备GPC3-CAR-NKT细胞的工艺，为基于NKT细胞的免疫疗法研究提供了坚实的基础，可实现临床级别的CAR-NKT细胞制备；同时，本发明还证明了CAR工程化可以增强NKT细胞的抗肿瘤活性，证明了CAR-NKT细胞用于肝脏实体瘤治疗的可行性，因此本发明公开的GPC3-CAR-NKT细胞及其制备方法可应用于针对肿瘤的免疫药物——特别是以实体肿瘤细胞为靶向细胞的药物的研发和制备。
发明的有限几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）NKT细胞的制备；
2）GPC3 CAR慢病毒载体构建；
3）GPC3 CAR慢病毒制备；
4）GPC3-CAR-NKT细胞制备及表型检测；
所述2）GPC3 CAR慢病毒载体构建包括以下步骤：
合成编码GM-CSFRα信号肽基因序列，GPC3抗体轻链可变区VL基因序列、Linker基因序列、GPC3抗体重链可变区VH基因序列、IgG4 Fc基因序列、CD28跨膜区基因序列、CD28共刺激结构域基因序列以及CD3ζ胞内信号传导结构域基因序列，并将其亚克隆至LV-EF1α-MCS-kana载体，通过测序验证序列正确的克隆载体用于慢病毒包装制备；
所述GM-CSFRα信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述GPC3抗体轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述Linker氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述GPC3抗体重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述IgG4Fc氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；所示CD28跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；所述CD28共刺激结构域氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；所述CD3ζ胞内信号传导结构域氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
2.根据权利要求1所述的一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述1）NKT细胞的制备包括以下步骤：
a.通过Ficoll-PaqueTM PREMIUM对健康供体的外周血单核细胞PBMC进行提取，进而从PBMC使用NKT细胞分选试剂盒富集获得NKT细胞;
b.随后将获得的NKT细胞以1×106个/孔接种至24孔板中，补加NKT完全培养基至2 ml;在37 ℃含5% CO2的培养箱中培养；
培养过程中定期对细胞进行计数，统计扩增倍数；
c.在扩增后检测NKT细胞扩增纯度。
3.根据权利要求1所述的一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述编码GM-CSFRα信号肽的DNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述编码GPC3抗体轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述编码Linker的DNA序列如SEQ ID NO：6所示；所述编码GPC3抗体重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO：8所示；所述编码IgG4 Fc的序列如SEQ ID NO：10所示；所述编码CD28跨膜区的DNA序列如SEQ ID NO：12所示；所述编码CD28共刺激结构域的DNA序列如SEQ ID NO：14所示；所述编码CD3ζ胞内信号传导结构域的DNA序列如SEQ ID NO：16所示。
4.根据权利要求1所述的一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述3）GPC3CAR慢病毒制备包括以下步骤：
①Day1，接种4.5×106个293T细胞至培养瓶中，培养基25 ml；
②Day3，转染；首先准备2支15 ml离心管，分别命名为Mix A管和Mix B管，在Mix A管中加入9.33μg pVSV-G、17.5μg pGag/Pol、13.42μg pRev、29.63μg GPC3 CAR慢病毒表达质粒以及1750μl DMEM基础培养基，在Mix B管中加入140μl PEI和1750μl DMEM基础培养基，然后将Mix A管和Mix B管混到一块室温孵育10-15min，最后将孵育好的DNA-PEI复合物逐滴加入到培养瓶中，轻轻混匀；
③Day5，收集转染后48 h的病毒上清至50 ml离心管中，并补加25 ml新鲜培养基；④Day6，收集转染后72 h的病毒上清至50m l离心管中，将两次收集的病毒上清4 ℃、
3000g离心10min去除细胞碎片和杂质，使用0.22 μm小滤器过滤除菌，最后加入适量PEG6000过夜浓缩；
⑤Day7，将浓缩过夜的病毒4 ℃、2000 g离心15 min，弃上清，加入适量1×HBSS重悬，并使用蔗糖纯化法纯化慢病毒浓缩液，最后使用适量1×HBSS重悬纯化后的慢病毒颗粒，将病毒悬液分装到0.5 ml冻存管中，置于-80 ℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种GPC3-CAR-NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述4）GPC3-CAR-NKT细胞制备及表型检测包括以下步骤：
离心收集扩增5天的NKT细胞，加入新鲜的NKT细胞完全培养基重悬细胞，计数后将NKT细胞以5×105个/孔接种至24孔板中；以MOI=10，计算GPC3 CAR慢病毒的用量，将其加入到接种好NKT细胞中，放入37℃含5%CO2的培养箱中培养；
培养7天后，分别收集细胞，分别使用APC-GPC3蛋白和FITC mouse anti-humanCD3抗体和APC mouse anti-humanCD56抗体标记细胞，通过流式细胞仪检测NKT细胞纯度和CAR分子阳性率。
6.一种GPC3-CAR-NKT细胞，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的方法制备。
7.如权利要求6所述的GPC3-CAR-NKT细胞在制备治疗肝脏实体肿瘤的药物中的应用。
8.如权利要求1-5任一项所述的方法在制备治疗肝脏实体肿瘤的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310281884.1A CN117265009B (zh) | 2023-03-22 | 2023-03-22 | 一种gpc3-car-nkt细胞的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310281884.1A CN117265009B (zh) | 2023-03-22 | 2023-03-22 | 一种gpc3-car-nkt细胞的制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117265009A CN117265009A (zh) | 2023-12-22 |
| CN117265009B true CN117265009B (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=89199656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310281884.1A Active CN117265009B (zh) | 2023-03-22 | 2023-03-22 | 一种gpc3-car-nkt细胞的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117265009B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107384949A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-11-24 | 闾民 | 表达靶向GPC3嵌合抗原受体的恒定自然杀伤T细胞（iNKT）及其制备和应用 |
| CN109970859A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-07-05 | 亘喜生物科技（上海）有限公司 | Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞 |
-
2023
- 2023-03-22 CN CN202310281884.1A patent/CN117265009B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107384949A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-11-24 | 闾民 | 表达靶向GPC3嵌合抗原受体的恒定自然杀伤T细胞（iNKT）及其制备和应用 |
| CN109970859A (zh) * | 2017-12-27 | 2019-07-05 | 亘喜生物科技（上海）有限公司 | Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GPC3的结构和功能及其在肝细胞癌诊治中的应用;汪胜豪等;中国细胞生物学学报;20180129(02);第275-281页 * |
| 诱导表达IL-18的GPC3-CAR-T细胞对小鼠肝细胞癌的治疗作用;苏靖雯等;肿瘤;20200625(06);第397-408页 * |
| 靶向GPC3的第四代嵌合抗原受体T细胞(分泌IL-7和CCL19)的构建以及功能;黄婉莉等;生物工程学报;20200512;36(05);第979-991页 * |
| 靶向肝癌的GPC3-CAR-T细胞的构建与功能鉴定;吴斯玮等;中国肿瘤生物治疗杂志;20170616;24(07);第748-755页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117265009A (zh) | 2023-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Oberschmidt et al. | Development of automated separation, expansion, and quality control protocols for clinical-scale manufacturing of primary human NK cells and alpharetroviral chimeric antigen receptor engineering | |
| JP7193886B2 (ja) | キメラ抗原受容体で修飾されたγδ Ｔ細胞を生産する方法 | |
| US20200108096A1 (en) | Method for culturing natural killer cell, using transformed t cell | |
| JP5097856B2 (ja) | サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法 | |
| Shimasaki et al. | Natural killer cell reprogramming with chimeric immune receptors | |
| US20200224162A1 (en) | New dual chimeric antigen receptor-t cell which can be regulated, construction method therefor and use thereof | |
| CN112204133B (zh) | Car nk细胞 | |
| JP2021508447A (ja) | Ｎｋ細胞形質導入のための方法 | |
| CN116209764A (zh) | 感染、活化及扩增免疫细胞的方法及组合物 | |
| CN111139222B (zh) | 一种重组间充质干细胞及其制备方法和用途 | |
| CN117265009B (zh) | 一种gpc3-car-nkt细胞的制备方法及其应用 | |
| JP7179986B2 (ja) | 形質転換されたｔ細胞を用いた臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の培養方法 | |
| JP5911810B2 (ja) | 制御性ｔ細胞の製造方法 | |
| WO2022251584A1 (en) | Methods and compositions for transduction of nk cells | |
| CN117264063B (zh) | 一种抗gpc3抗体及其应用 | |
| CN113278652A (zh) | 增加Survivin表达的CAR-T细胞并联合IL-15在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| US20240132841A1 (en) | Large scale car-t immune cell manufacturing method utilizing lentiviral vector transfection | |
| US20220249556A1 (en) | Methods for transducing immune cells | |
| WO2023125860A1 (zh) | 通用型car-t细胞的制备技术及其应用 | |
| US20240117309A1 (en) | Methods for expanding t cell populations | |
| WO2024054769A1 (en) | Methods for the generation of a monocyte/macrophage cell product from expanded cord blood cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells | |
| CN116514997A (zh) | 一种表达增强的嵌合抗原受体的构建及其应用 | |
| CN116874609A (zh) | 一种新型模块化通用型car-t细胞及其制备方法 | |
| 장지윤 | Generation of chimeric antigen receptor-inducible Treg by targeting CD40L | |
| CN103937747B (zh) | 重组多刺激分子细胞及其制备方法和在nkt细胞扩增中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |