CN116209764A - 感染、活化及扩增免疫细胞的方法及组合物 - Google Patents

感染、活化及扩增免疫细胞的方法及组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于有效地感染、活化及扩增免疫细胞(例如自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞)的方法及组合物。

Description

感染、活化及扩增免疫细胞的方法及组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年9月8日提交的美国临时申请号63/075,651和2020年9月8日提交的美国临时申请号63/075,747的优先权，其中每一个的内容通过引用整体并入本申请中。
背景技术
NK细胞在肿瘤免疫疗法中具有巨大潜力，这是因为它们能够直接且迅速地杀死肿瘤细胞。使用基因工程化重新引导NK细胞(CAR-NK)的功能是克服表达于NK细胞上的多种抑制性受体并强化靶向疗法的用途的有效策略。当前，临床前研究及临床研究展示，表达嵌合抗原受体(CAR)的NK细胞可以发挥显著抗肿瘤作用且其安全性高于CAR-T细胞疗法。例如参见Wang等人，Int.Immunopharmacol.2019；74:105695。
然而，CAR-NK细胞疗法仍面临一些难题，例如原代NK细胞在体外的扩增及活化、难以储存及运输NK细胞产品和低转导效率。因此，仍需要有效地制备用于NK细胞疗法的组合物及方法。本发明满足了此类需要且也提供了相关优点。
发明内容
在一方面，本文提供包含修饰的RD114猫类内源性逆转录病毒包膜糖蛋白(RD114TR)及修饰的狒狒包膜糖蛋白(BaEVTR)的假型γ逆转录病毒颗粒。在一些实施方案中，RD114TR糖蛋白包含RD114糖蛋白的胞外结构域和跨膜结构域以及双嗜性鼠类白血病病毒(MLV-A)糖蛋白的细胞质结构域，或基本上由其组成或进一步由其组成。另外或替代地，BaEVTR糖蛋白包含狒狒包膜糖蛋白(BaEV)的胞外结构域及跨膜结构域以及MLV-A糖蛋白的细胞质结构域，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，将RD114TR及BaEVTR作为膜蛋白并入颗粒包膜中。在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒是选自莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(friend murine embryonic stem cell virus，FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)及猫类白血病病毒的种类。
在另一方面中，提供制备(包含(但不限于)感染、活化或扩增)自然杀伤(NK)细胞的群体的方法。该方法包含将细胞群体与一种或多种免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)一起培养，或基本上由其组成或进一步由其组成，该细胞群体包括下列各项中的一项或多项，或基本上由其组成或进一步由其组成：NK细胞、能够衍生NK细胞的祖细胞或能够衍生NK细胞的干细胞。在一些实施方案中，使用相同或不同的一种或多种免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)或其组合重复此培养步骤一次、两次、三次或更多次。在一些实施方案中，该细胞群体在细胞群体中耗尽表达以下中的一种或多种的细胞：CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR。
在一些实施方案中，一种或多种免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)是选自下列各项中的一项或多项：人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原；一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别且结合NK细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖NK细胞；一种或多种因此活化或增殖NK细胞的细胞因子；或一种或多种因此活化或增殖NK细胞的化学部分。
在一方面，提供制备γδT细胞群体的方法，该方法包含将包含下列各项中的一项或多项的细胞群体与一种或多种免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)一起培养，或基本上由其组成或进一步由其组成：γδT细胞、能够衍生γδT细胞的祖细胞或能够衍生γδT细胞的干细胞。在一些实施方案中，该细胞群体在细胞群体中耗尽表达以下中的一种或多种的细胞：T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR。在一些实施方案中，使用相同或不同中的一种或多种免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)或其组合重复此培养步骤一次、两次、三次或更多次。
在一些实施方案中，一种或多种免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)是选自以下中的一种或多种：人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原；一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别且结合γδT细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖γδT细胞；一种或多种因此活化或增殖γδT细胞的细胞因子；或一种或多种因此活化或增殖γδT细胞的化学部分。
在可能涉及本文的任何本发明的方面的一些实施方案中，aAPC进一步表达以下各项中的一种或多种：4-1BBL、膜结合(mb)IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL(可诱导T细胞共刺激配体、B7H2、B7RP1)、MICA(MHC I类多肽相关序列A)、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25结合的mb IL-2突变体、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的mb IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)或调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物。在一个实施方案中，aAPC进一步表达mb IL-21及4-1BBL。
在可能涉及本文的任何本发明的方面的一些实施方案中，细胞因子是选自由以下组成的组：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、缺乏CD25结合的IL-2突变体、IL-7、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803可溶性)、IL-15、IL-18、IL-21、LEC、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)或MICA。在一些实施方案中，将细胞群体与100-500IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15或25ng/mL IL-21中的任何一个或任两个或所有三个一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与50IU/ml IL-2及0.5ng/ml IL-15中的任何一个或两个一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与50IU/ml IL-2一起培养。
如本文所公开的任何方法中的一些实施方案进一步包含例如在一个或多个如本文所公开的培养步骤之前和/或之后将多核苷酸引入培养的细胞群体中以用于表达。在一些实施方案中，多核苷酸编码CAR和/或另一治疗性蛋白或多肽(例如抗体或其片段、酶、配体或受体)。
如本文所公开的任何方法中的一些实施方案进一步包括将假型γ逆转录病毒颗粒引入培养的细胞群体中，由此将如本文所公开的多核苷酸引入培养的细胞中。在一些实施方案中，该颗粒包含RD114TR及BaEVTR作为包膜蛋白。在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒是选自莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)及猫类白血病病毒的种类。
如本文所公开的任何方法中的一些实施方案进一步包含使用RetroNectin以促进包含如本文所公开的多核苷酸的慢病毒或逆转录病毒载体(例如如本文所公开的假型γ逆转录病毒颗粒)及待引入多核苷酸的细胞的共定位。一个实例是将RetroNectin涂覆于在细胞群体中引入如本文所公开的多核苷酸的容器中的内表面上。RetroNectin是增强慢病毒及逆转录病毒调节的基因转导的63kD重组人类纤连蛋白片段。其可购自TaKaRawww.takarabio.com/products/gene-function/t-cell-transduction-and-culture/retronectin-reagent，最后访问时间为2020年9月4日。
另外，提供产生逆转录病毒颗粒(例如γ逆转录病毒颗粒)的方法。该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成或进一步由以下步骤组成：(i)将表达载体基因组的载体引入适于将载体基因组包装至第一逆转录病毒颗粒中的第一包装细胞系中，(ii)将第一逆转录病毒颗粒转导至适用于复制第一逆转录病毒颗粒的第二包装细胞系中；和(iii)分离所复制的逆转录病毒颗粒。在一些实施方案中，该方法进一步包含培养引入载体的第一包装细胞系。在其他实施方案中，该方法进一步包含用载体引入的第一包装细胞系的培养物分离的第一逆转录病毒颗粒。另外或替代地，该方法进一步包含培养转导的第二包装细胞系。因此，提供通过该方法产生的逆转录病毒颗粒以及所产生逆转录病毒颗粒在产生工程化的免疫细胞(例如被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞)中的用途。
在可能涉及本文的任何本发明的方面的一些实施方案中，在引入步骤之前将细胞群体培养至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天或至少约10天。另外或替代地，在引入步骤之前将细胞群体培养不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过15天、不超过3周或不超过1个月。在一个实施方案中，在引入步骤之前将细胞群体培养约5天至约10天。
在可能涉及本文的任何本发明的方面的一些实施方案中，细胞群体包括以下中的任一种或多种，或基本上由其组成或进一步由其组成：NK细胞、γδT细胞、干细胞、造血干细胞(HSC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、衍生自干细胞、HSC或iPSC中的任一种或多种的NK细胞或衍生自干细胞、HSC或iPSC中的任一种或多种的γδT细胞。另外或替代地，细胞群体分离自对象的脐带血、对象的外周血或对象的骨髓。
在一方面，提供抑制癌细胞的生长的方法。该方法包括使通过如本文所公开的方法制得的CAR表达细胞的群体与癌细胞接触，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，由CAR识别的抗原是在癌细胞上表达的TAA。接触步骤可在体内或体外进行。
在另一方面，提供治疗对象的癌症的方法。该方法包含施用通过如本文所公开的方法制得的CAR表达细胞的群体，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，由CAR识别的抗原是癌细胞表达的TAA。
在又一方面，提供表达抗原及以下细胞表面标志物中的一种或多种的工程化aAPC：4-1BBL、膜结合(mb)IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25结合的mb IL-2突变体、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的mb IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)或调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物。
在另一方面中，提供通过如本文所公开的方法制得的NK细胞、γδT细胞或其中任一种或两种的细胞群体。在一些实施方案中，该细胞和/或细胞群体表达CAR和/或另一种治疗性蛋白或多肽(例如抗体或其片段、酶、配体或受体)。
在一方面中，提供一种组合物，其包含如本文所公开的细胞或其群体和载体，任选地药学上可接受的载体，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在另一方面中，提供一种试剂盒，其包含一种或多种适用于如本文所公开的方法中的药剂和任选的说明，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，药剂选自下列各项中的一种或多种：编码CAR或另一种治疗性蛋白的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、用于检测细胞表型的抗体、用于分离或富集或纯化免疫细胞的抗体、用于检测多核苷酸、细胞因子及aAPC的引物。
在又一方面中，提供用于产生假型γ逆转录病毒颗粒的病毒包装系统以及产生假型γ逆转录病毒颗粒的方法。该系统包含以下各项，或基本上由其组成或进一步由其组成：(a)表达载体基因组的质粒；(b)包装质粒；和(c)一种或多种表达RD114TR及BaEVTR的包膜质粒，而该方法包含在适合于包装假型γ逆转录病毒颗粒的条件下将该系统引入包装细胞系中，或基本上由其组成或进一步由其组成。
前述一般说明及下列详细说明是示例性及说明性的，并旨在进一步阐释所要求保护的公开内容。根据下列附图说明及本发明的实施方式，其他目标、优点及新颖性特征对于本领域技术人员是显而易见的。
附图说明
图1提供向人类原代NK细胞的基于γ逆转录载体(PCIR)的治疗基因递送的示意图。
图2A至2B提供当原代NK细胞进入显著增殖状态以提供基因递送时的生长曲线和的时间点的确定。将扩增的原代NK细胞的逆转录病毒转导的时间点优化。原代NK细胞进入显著增殖状态以供基因递送时的生长曲线和时间点一起确定。用于本发明中的原代人类NK细胞来源于外周血(PB)，且使用MACSxpress人类全血NK细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec,130-098-185)分离。通过使用CD56及CD3抗体将细胞染色来测定纯度，且将NK细胞定义为CD56+/CD3-群体(图2A)。将NK细胞与NK MACS培养基(130-114-429)在50IU/ml人类IL-2及辐照的K562-mb21-41BBL饲养细胞(比率为1:1)的存在下一起培养。显而易见地，在分离并培养5天之后，原代NK细胞进入显著增殖状态，因此使用第6-10天时的活化NK细胞进行基因递送(图2B)。
图3A至3D示出了使用RetroNectin完成的RD114TR及BaEVTR假型γ逆转录病毒颗粒(PCIR)的功效，该RetroNectin允许在NK细胞中以高生存率及高产率进行较大程度的基因转移。在本发明中使用RetroNectin结合病毒(RBV)感染策略且细节阐释于图3A中。在感染之后存在具有显著较高存活率(介于73.51％-82.81％之间)的NK细胞(可以通过排除低正向散射(FSC)及高侧向散射(SSC)事件来获得大致活细胞门)(图3B)，三个供体中的EGFRCAR基因(Fab-AF647阳性)转导效率介于65.11％-72.75％之间(图3C)，且在感染后第8天三个供体中的高增殖状态产率是初始感染NK数量的25、34及45倍(图3D)。
图4提供基于使用相同递送策略的直接感染相同增殖状态的活化NK细胞的逆转录病毒滴定的确定。在本发明中，为研发针对人类原代NK细胞的基于γ逆转录载体(PCIR)的治疗基因递送，滴定测定方法基于在第7天对相同增殖状态的活化NK细胞采用完全相同的感染策略。在图3A至3D中所显示的此PCIR-EGFR-CAR-NK递送分析中，所用的空载体是PCIR-EV-EGFP。将在转染后48及72小时收获的所汇集的原始病毒上清液的连续稀释液添加至RetroNectin涂覆的板中且程序与图1及图3A相同。使用ALEXA
Figure BDA0004112630850000051
647AffiniPure山羊抗小鼠IgG(F(ab')2片段特异性(Jackson ImmunoResearch_115-605-006)检测CAR的小鼠来源单链可变片段(ScFv)。使用下式计算转导单位/mL：TU/mL＝(转导细胞数×荧光百分比×稀释因子)/(转导体积(以mL表示))。为了获得更准确的价效，获取多个稀释液的平均值。在此研究中使用MOI 3(参见图3A至3D)。
图5A至5C示出了γ逆转录载体工程化的CAR-NK胜过慢病毒载体工程化的CAR-NK，其中在长期培养中具有高度稳定的转导基因表达。基于分选GFP阳性群体来富集慢病毒工程化的PCIL-EGFR-CAR-NK及EV-GFP对照，且逆转录病毒工程化PCIR-EGFR-CAR-NK是基于山羊抗小鼠Fab-AF647阳性细胞的分选。在分选后第10天使用流式细胞术及荧光显微术成像来评估PCIL-EGFR-CAR-NK转导速率及表达，且PCIL-EGFR-CAR-NK及PCIL-GFP空载体对照中的GFP阳性细胞从约100％显著降至39％(图5A及5C)。然而，流动分析证实，在分选后第10天、第14天及第25天，PCIR-EGFR-CAR-NK具有高度稳定的转导基因表达(图5B及5C)。
图6A及6B示出使用实时细胞分析(RTCA)获得的γ逆转录载体PCIR/BaEVTR工程化的EGFR-CAR-NK细胞的高度转导效率及细胞毒性的功效。NovoCyte 3005流式细胞术分析证实了来自4个供体的γ逆转录载体PCIR/BaEVTR工程化的EGFR-CAR-NK的高转导效率。携载截短CD19的空载体(EV-Tcd19)及EGFR转基因的转导速率分别为平均85％(CD19-PE阳性)及79.6％(山羊抗小鼠Fab-AF647阳性)(图6A)。使用xCELLigence RTCA MP Bundle(ACEABiosciences，目录号：00380601040)实施免疫细胞杀伤分析。这些图示出了两个供体使用5,000个细胞/孔的LN229且添加500个细胞/孔的效应物(1:10E:T)的实验的阻抗数据。与具有最低活细胞指数的空载体模拟转导组及未转导NK组相比，工程化EGFR-CAR-NK具有动态实时杀伤性(图6B)。
图7示出了17-24天的NK细胞扩增。
图8A至8C提供293Vec-GalV及293Vec-BaEV包装细胞以及用于滴定的两种细胞系Jurkat T及HT1080的逆转录病毒进入受体表达。如图8A中所示，在逆转录病毒中，狒狒内源性病毒(BaEV)及猫类内源性逆转录病毒(RD114)使用普通细胞表面受体ASCT2(钠依赖性中性氨基酸转运蛋白)进入细胞。除ASCT2外，狒狒内源性病毒(BaEV)也使用ASCT1作为细胞进入受体。长臂猿白血病病毒(GALV)使用钠依赖性磷酸转运蛋白(Pit1)作为其进入受体。图8B提供两种包装细胞系293Vec-GalV及293Vec-BaEV以及滴定细胞系Jurkat T及HT1080上的ASCT1、ASCT2及Pit1的免疫染色。直方图代表以下各项的平均荧光强度(MFI)：用兔IgG同型对照(Invitrogen，目录号：02-6102)及相应二级抗体与Alexa Fluor 647偶联的山羊抗兔IgG(A-21245；Invitrogen)染色的细胞、用抗ASCT1(LifeSpan BioSciences,LS-C179222)及相应二级抗体染色的细胞、用抗ASCT2(Cell Signaling Technology,8057S)及相应二级抗体染色的细胞及用抗Pit1(ThermoFisher,PA5-98650)染色的细胞。图8C示出了可使用两种细胞系(Jurkat T及HT1080)来滴定三种逆转录病毒包膜蛋白(BaEV、RD114及GALV)，由于此类逆转录病毒包膜蛋白的相应进入受体具有广泛性表达。对于293基包装细胞系293Vec GALV及293Vec BaEV而言，仅GALV假型逆转录病毒可以使用进入受体Pit1将其感染。针对各细胞类型，在图8C中绘制三根条：左侧条代表ASCT1的表达，中间条代表ASCT2的表达，且右侧条代表Pit1的表达。
图9图解说明了用于生成稳定逆转录病毒生产者-293Vec-BaEV的转导策略的工作流程。使用基于莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo-MuLV)的逆转录病毒载体(PCIR)作为靶转基因递送媒介。使用BaEV假型化293Vec-BaEV包装细胞系来产生媒介以感染源自于脐带血的NK细胞。使用以下两种包装细胞系进行此产生：293Vec-GALV(用于产生瞬时长臂猿白血病病毒(GALV)假型上清液)及293Vec-BaEV(用于生成最终载体)。两种细胞系都由BioVecPharma供应。然后使用此上清液转导BaEV假型化包装细胞系293Vec-BaEV以生成批量生产者。对于高滴定量的克隆生成而言，通过限制稀释和使用通过滴定每个克隆产生的上清液而选择的高滴度克隆，该293Vec-BaEV批量生产者可以进一步分选或单细胞克隆。然后，可以从高滴定量稳定逆转录病毒生产者-293Vec-BaEV连续产生上清液。
图10A及10B示出了来自稳定逆转录病毒生产者-293Vec-BaEV的原始上清液的改进的效价，该293Vec-BaEV产生具有大尺寸转基因的载体。“多个靶标组合为一个”是由申请人研发的独特治疗策略。使用BaEV假型化293Vec-BaEV包装细胞系来产生媒介。图10A示出了具有大转基因插入体(>11kb)的代表性逆转录病毒可以由293Vec-BaEV包装细胞瞬时地且稳定地产生。将总共3.5百万个293Vec-BaEV包装细胞接种于100mm组织培养盘中，并在37℃下培养48-72h。在细胞达到90-100％汇合时，收集原始上清液并在1500g下旋转5min。在Jurkat T细胞上滴定上述上清液。将一系列病毒上清液加载于RetroNectin预涂覆的非组织培养液处理的24孔板上并使用包括10％热灭活胎牛血清的完全DMEM培养基达到500μl。将板在32℃、2000g下旋转2小时，且添加10万个Jurkat T细胞，并在1000g下旋转5min。将板在37℃下培养48h，然后实施流动分析以根据下式测定效价(转导单位/ml)：转导单位(TU)/mL＝[(靶细胞数)×(阳性细胞％)]。在此实例中，通过针对人类CD34抗体(QBEnd/10)(别藻蓝蛋白)(Novus Biologicals,LLC,#FAB7227A)的流式抗体检测报告基因RQR8的表达。如图10B中所示，与瞬时产生的病毒(TU＝2.2E5)相比，来自用于具有大尺寸转基因的载体的稳定逆转录病毒生产者-293Vec-BaEV(TU＝7.2E5)的原始上清液具有改进的价效。
具体实施方式
定义
应当理解，本文所用的章节或子章节标题仅出于组织性目的且不应解释为限制和/或孤立所阐述的主题。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本领域技术人员通常所理解的相同含义。尽管任何类似或等效于本文所阐述的方法及材料可以用于本发明的实践或测试中，但目前所阐述的是优选的方法、装置及材料。本文所引用的所有技术及专利公开文件的全部内容以引用方式并入本文中。本文中的任何内容均不得解释为承认公开无权因事先公开而提前公开。
除非另有指示，否则本发明实践将采用本领域技术人员所熟知的组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学及重组DNA的常用技术。例如参见Sambrook及Russell编辑，(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版；Ausubel等人编辑，(2007)Current Protocols in Molecular Biology系列；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)系列；MacPherson等人，(1991)PCR 1:A PracticalApproach(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson等人，(1995)PCR 2:APractical Approach；Harlow及Lane编辑，(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique，第5版；Gait编辑，(1984)Oligonucleotide Synthesis，美国专利第4,683,195号；Hames及Higgins编辑，(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins编辑，(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells andEnzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller及Calos编辑，(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold SpringHarbor Laboratory)；Makrides编辑，(2003)Gene Transfer and Expression inMammalian Cells；Mayer及Walker编辑，(1987)Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology(Academic Press,London)；Herzenberg等人编辑，(1996)Weir’sHandbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo:ALaboratoryManual，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2002))；Sohail(编辑)(2004)Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application(CRC Press)。
所有指定数值(例如pH、温度、时间、浓度及分子量，包含范围)都是在适当地以增量0.1或1.0的变化(+或-)的近似值。应理解但并不总是明确地说明，所有指定数值之前都具有术语“约”。也应理解但并不总是明确陈述的，本文所阐述的试剂仅是示例性的且这类试剂的等效物是本领域内已知的。
在提及可测量的值(例如量或浓度等)时，本文所用的术语“约”旨在涵盖20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的指定量变化。
除非上下文明确地指示其他含义，否则说明书及权利要求中所用的单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”及“该/所述”包含复数指代。例如，术语“细胞”包含多个细胞，包含其混合物。
如由本领域技术人员所理解，出于任何及所有目的，本文所公开的所有范围都旨在涵盖任何及所有可能的其子范围及子范围组合。另外，如由本领域技术人员所理解的，范围包含每一个单独的成员。
如本文中所使用的，术语“包含”意指组合物及方法包含所列举的要素，但不排除其他要素。在使用“基本上由……组成”来定义组合物及方法时，其应意指出于所陈述目的排除对组合有任何本质意义的其他要素。因此，基本上由如本文所定义要素组成的组合物将不排除来自分离及纯化方法以及药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)的痕量污染物。“由……组成”应意指排除其他成分及用于施用本发明组合物的实质性方法步骤或用于产生组合物或达成预期结果的制造过程步骤的超过痕量的要素。由此类过渡术语中的每一个定义的实施方案皆在本发明范围内。
“任选(optional)”或“任选地(optionally)”意指随后阐述的情况可能发生或可能不发生，从而该说明包含该情况发生的情形及该情况不发生的情形。
如本文中所使用，“和/或”是指且涵盖所列举的相关项目中的一种或多种的任何及所有可能的组合，且在解释为替代(“或”)时是指并无组合。
“实质上”或“基本上”意指几乎全部或完全，例如95％或更大的一些给定量。在一些实施方案中，“实质上”或“基本上”意指95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。
在一些实施方案中，组分名称中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”或类似者用于区分及鉴别一种以上在其名称中共有某一属性的组分。例如，“第一细胞系”及“第二细胞系”用于区分两种细胞系。
本文关于核酸(例如DNA或RNA)所用的术语“分离的”是指分别存在于天然大分子来源中的与其他DNA或RNA分离的分子。术语“分离的核酸”旨在包含呈非天然片段形式且并不以自然状态发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指与其他细胞蛋白分离的多肽、蛋白质、病毒和/或宿主细胞且旨在涵盖经纯化多肽及重组多肽、蛋白质、病毒和/或宿主细胞。在其他实施方案中，术语“分离的”意指与在自然界中通常与细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、病毒、抗体或其片段相关联的组分、细胞及其他组分分离。例如，分离的细胞是与具有不同表型或基因型的组织或细胞分离的细胞。如本领域技术人员所了解的，非天然的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、病毒或抗体或其片段不需要“分离”来区分其与其天然的对应物。
在一些实施方案中，术语“工程化”或“重组”是指具有至少一种通常不被发现于天然蛋白质、多肽、多核苷酸、菌株、野生型菌株或所提及物种的亲代宿主菌株的修饰。在一些实施方案中，术语“工程化”或“重组”是指通过人为干预来合成。如本文中所使用，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码多肽的DNA插入适合表达的载体中，从而使用该表达载体转变宿主细胞以产生异源蛋白。
术语“多核苷酸”、“核酸”及“寡核苷酸”可互换使用且指任何长度的聚合核苷酸形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)。多核苷酸可以具有任何三维结构，且可实施任何已知或未知功能。下列各项是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针及引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及核苷酸类似物。若存在，则可在组装多核苷酸之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。非核苷酸组分可以中断核苷酸序列。多核苷酸可以在聚合后通过例如与标记组分结合来进一步修饰。该术语也指双链分子及单链分子。除非另有指定或需要，否则本发明的任何多核苷酸实施方案涵盖双链形式及已知或预计构成双链形式的两种互补单链形式中的每一项。
多核苷酸由以下4种核苷酸碱基的特定序列构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；且在多核苷酸是RNA时胸腺嘧啶由尿嘧啶(U)代替。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。此字母表示可输入具有中央处理单元的计算机的数据库中且用于生物信息学应用(例如功能基因组学及同源性搜索)。
表达“多核苷酸扩增”包含例如PCR、连接扩增(或连接酶链反应，LCR)及扩增方法等方法。这些方法是本领域内已知的且广泛实践。例如参见美国专利第4,683,195号及第4,683,202号以及Innis等人，1990(关于PCR)；及Wu等人(1989)Genomics 4:560-569(关于LCR)。一般而言，PCR程序描述一种基因扩增方法，其包含：(i)使引物序列特异性杂交至DNA样品(或库)内的特定基因，(ii)随后使用DNA聚合酶进行涉及多轮退火、延长及变性的扩增，及(iii)筛选PCR产物以获得具有适当大小的条带。所用引物是具有足够长度及适当序列的寡核苷酸以引发聚合，即，每一个引物都特定地设计以与待扩增基因组基因座的每一条链互补。
用于实施PCR的试剂及硬件可商购获得。可用于扩增来自特定基因区域的序列优选地与靶区域或其侧接区域中的序列互补，且与其特异性杂交。通过扩增生成的核酸序列可以直接测序。或者，可以在序列分析之前克隆扩增的序列。以酶促方式扩增的基因组片段的直接克隆及序列分析的方法是本领域内已知的。
“基因”是指含有至少一个能够在转录及翻译之后编码特定多肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)的多核苷酸。
术语“表达”是指产生基因产物，例如mRNA、肽、多肽或蛋白质。如本文中所使用的，“表达”是指将多核苷酸转录成mRNA的过程和/或随后将转录的mRNA翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包含在真核细胞中剪接mRNA。
“基因产物”或替代地“基因表达产物”是指在转录及翻译基因时生成的氨基酸(例如肽或多肽)。在一些实施方案中，基因产物可以指在转录基因时生成的mRNA。
如针对多核苷酸所应用的，术语“编码”是指如果多核苷酸在呈其天然状态时或在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时可以发生转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA，则其可视为“编码”该多肽。反义链是该核酸的互补序列，并且可以从中推断出编码序列。
“在转录控制下”(其在本文中也用作“引导表达”)是本领域内众所周知的术语，并且指示多核苷酸序列(通常DNA序列)的转录依赖于其操作性连接至有助于开始转录或促进转录的组件。“操作性连接”意指多核苷酸以允许其在细胞中发挥作用的方式进行配置。
本文所用的术语“调控序列”、“表达控制组件”或“启动子”意指操作性连接至待转录和/或复制的靶多核苷酸且有利于表达和/或复制靶多核苷酸的多核苷酸。启动子是表达控制组件或调控序列中的一个的实例。启动子可位于基因或其他多核苷酸的5’端或上游来为调控的基因转录提供控制点。聚合酶II及III是启动子的实例。
本文所用的术语“启动子”是指任何调控编码序列(例如基因)的表达的序列。启动子可以是，例如组成型、诱导型、抑制型或组织特异型。“启动子”是一种控制序列且是控制转录的开始及速率的多核苷酸序列区域。其可以含有可结合调控蛋白及分子(例如RNA聚合酶及其他转录因子)的基因组件。启动子的非限制性实例包含EF1α启动子及CMV启动子。EF1α序列是本领域内已知的(例如参见addgene.org/11154/sequences/、ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04617，各自最后一次访问于2019年3月13日；以及Zheng及Baum(2014)Int’l.J.Med.Sci.11(5):404-408)。CMV启动子序列是本领域内已知的(例如参见snapgene.com/resources/plasmid-files/？set＝basic_cloning_vectors&plasmid＝CMV_promoter，最后一次访问于2019年3月13日；以及Zheng及Baum(2014)(见上文))。实例为：EF1α启动子序列：SEQ ID NO:148及任选地其等效物。
增强子是增加靶序列的表达的调控组件。“启动子/增强子”是含有能够提供启动子功能及增强子功能的序列的多核苷酸。例如，逆转录病毒的长末端重复含有启动子功能及增强子功能。增强子/启动子可以是“内源性”或“外源性”或“异源性”。“内源性”增强子/启动子是与基因组中的给定基因的天然连接者。“外源性”或“异源性”增强子/启动子是通过基因操控(即分子生物技术)与基因并列以便该基因的转录由所连接的增强子/启动子引导。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，该复合物由核苷酸残基的碱基之间的氢键来稳定。氢键结合可通过Watson Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式来发生。复合物可以包含两条链(形成双螺旋结构)、三条或更多条链(形成多链复合物)、单一自杂交链或其任一组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，例如PCR反应的开始，或核酶对多核苷酸的酶切割。
可以在具有不同“严格度”的条件下实施杂交反应。一般而言，低严格度杂交反应在约40℃下于10x SSC或具有等效的离子强度/温度的溶液中来实施。中等严格度杂交通常在约50℃下于6x SSC中来实施，且高严格度杂交反应通常在约60℃下于1x SSC中来实施。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下实施。生理条件中的一项非限制性实例是通常细胞中的温度、离子强度、pH及Mg2+浓度。
当杂交以反向平行配置发生于两个单链多核苷酸之间，则该反应称为“退火”且将这些多核苷酸描述为“互补”。双链多核苷酸可以与另一多核苷酸“互补”或“同源”，条件是可以在第一多核苷酸的一条链与第二多核苷酸之间发生杂交。“互补性”或“同源性”(一个多核苷酸与另一多核苷酸的互补程度)可以根据相对链中预计的根据公认碱基配对规则彼此形成氢键结合的碱基比例来进行量化。
“同源性”或“同一性”或“类似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列类似性。可以通过比较各序列中的位置来确定同源性，这些序列可以出于对比目的进行比对。在比较序列中的位置由相同碱基或氨基酸占据时，分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度随序列所共有的匹配或同源位置的数量而变化。“非相关”或“非同源”的序列与本发明的一个序列共有小于40％的同一性或小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一序列具有一定百分比(例如70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意指，在所比较的两个序列比对时，该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用本领域内已知的软件程序(例如描述于Ausubel等人编辑，(2007)Current Protocols in Molecular Biology中的)来进行该项比对及测定同源性或序列同一性百分比。优选地，使用预设参数进行比对。一种比对程序是使用默认参数的BLAST。特别地，程序是BLASTN及BLASTP，其使用下列预设参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两条；截止值＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；说明＝50个序列；分类依据＝高评分；数据库＝非冗余，基因库+EMBL+DDBJ+PDB+基因库CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。该项程序的细节可以参考下列网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。在另一实施方案中，程序是以下各项中的任一项：可获得于www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/处的Clustal Omega、可获得于www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/处的Needle(EMBOSS)、可获得于www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/处的Stretcher(EMBOSS)、可获得于www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/处的Water(EMBOSS)、可获得于www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/处的Matcher(EMBOSS)、可获得于www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/处的LALIGN。在其他实施方案中，使用预设设置。
在一些实施方案中，如本文所公开的多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，如本文所公开的多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，如本文所公开的多核苷酸是DNA及RNA的杂合体。
在一些实施方案中，参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物编码由参考编码的相同序列。在一些实施方案中，参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸的等效物任选地在高严格度条件下杂交至参考、互补参考、反向参考和/或反向互补参考。
另外或替代地，等效核酸、多核苷酸或寡核苷酸与参考核酸、多核苷酸或寡核苷酸具有至少70％或至少75％或至少80％序列同一性或至少85％序列同一性或至少90％序列同一性或至少92％序列同一性或至少95％序列同一性或至少97％序列同一性或至少98％序列同一性，或者，等效核酸在高严格度条件下杂交至参考多核苷酸或其互补序列。在一方面，等效物一定编码任选地可通过本文所描述的一种或多种分析鉴别的功能性蛋白。另外或替代地，多核苷酸等效物与参考或母体多核苷酸编码具有相同或类似功能的蛋白质或多肽。
如针对工程化细胞(例如嵌合抗原受体细胞)的产生所应用的，术语“转导(transduce或transduction)”是指将外来核苷酸序列引入细胞中的过程。在一些实施方案中，通过载体(例如病毒载体或非病毒载体)进行此转导。
如本文中所使用的，限制酶是在分子内的特定识别位点(称为限制位点)处或其附近将DNA切割成片段的酶。其用于在基因克隆及蛋白质产生实验期间辅助将多核苷酸(例如基因)插入质粒载体中。为了最优的应用，修饰通常用于基因克隆的质粒(例如编码病毒载体基因组)以包含富含限制酶识别序列的短聚连接体序列(称为多克隆位点或MCS)。其在将基因片段插入质粒载体中时提供了灵活性；基因内天然含有的限制位点影响了用于消化DNA的内核酸酶的选择，因为有必要在有意切割DNA末端的同时避免对所需DNA的限制。为了将基因片段克隆至载体中，通常使用相同限制酶切割质粒DNA及基因插入物，且然后通过称为DNA连接酶的酶黏合在一起。
术语“蛋白质”、“肽”及“多肽”可互换使用且在其最广泛意义上是指它们的两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物化合物。这些亚单位可通过肽键连接。在另一实施方案中，亚单位可通过其他键(例如酯、醚等)连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸且并不限制可构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数量。如本文中所使用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸(包含甘氨酸以及D及L光学异构体)、氨基酸类似物及肽模拟物。
如本文中所使用，术语“抗体”共同地指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包含(例如但不限于)IgA、IgD、IgE、IgG及IgM、其组合及任何脊椎动物在免疫反应期间产生的类似分子，该脊椎动物是例如哺乳动物(例如人类、山羊、兔及小鼠)以及非哺乳动物物种(例如鲨鱼免疫球蛋白)。除非另有具体阐述，否则术语“抗体”包含完整免疫球蛋白及“抗体片段”或“抗原结合片段”，其特异性结合至感兴趣的分子(或一组高度类似的感兴趣的分子)且基本上不结合至其他分子(例如，抗体及抗体片段对感兴趣的分子的结合常数对生物样品中的其他分子的结合常数大于至少103M-1、大于至少104M-1或大于至少105M-1)。术语“抗体”也包含工程化基因形式，例如嵌合抗体(例如鼠类或人源化非灵长类动物抗体)、异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。也参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(PierceChemical Co.,Rockford,Ill.)；Owen等人，Kuby Immunology，第7版，W.H.Freeman&Co.,2013；Murphy,Janeway’s Immunobiology，第8版，Garland Science,2014；Male等人，Immunology(Roitt)，第8版，Saunders,2012；Parham,The Immune System，第4版，GarlandScience,2014。
如本文中所使用，术语“单克隆抗体”是指通过单一B淋巴细胞克隆或由已转染的单一抗体的轻链及重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法所产生，例如通过融合骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以制备杂合抗体形成细胞。单克隆抗体包含人源化单克隆抗体。
就抗体结构而言，免疫球蛋白具有由二硫键相互连接的重(H)链及轻(L)链。存在以下两类轻链：拉姆达(λ)及卡帕(κ)。存在以下5个决定抗体分子的功能活性的主要重链种类(或同型)：IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。每一个重链及轻链含有恒定区及可变区(这些区域也称为“结构域”)。重链可变区及轻链可变区的组合特异性结合抗原。轻链可变区及重链可变区含有间杂有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)的“框架”区。已定义框架区及CDR的范围(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，其以引用方式并入本文中)。Kabat数据库现正在线维护。不同轻链或重链的框架区序列在物种内相对保守。抗体的框架区(即组成轻链及重链的组合框架区)主要采用β折叠构形且CDR形成环，这些环连接β折叠结构在一些情形下形成该β折叠结构的一部分。因此，框架区域起作用以形成支架，该支架通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的方向。
CDR主要负责结合至抗原表位。每条链上的CDR通常被称为CDR1、CDR2及CDR3(自N-末端开始依序编号)，且也通常根据特定CDR所位于的链来鉴别(重链区标记为CDRH，例如CDRH1、CDRH2及CDRH3；且轻链区标记为CDRL，例如CDRL1、CDRL2及CDRL3)。因此，CDRH3是来自发现其的抗体重链的可变结构域的CDR3，而CDRL1是来自发现其的抗体轻链的可变结构域的CDR1。例如，TNT抗体具有针对TNT相关抗原所特有的VH区及VL区序列，且因此具有特定CDR序列。具有不同特异性(即针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同CDR。尽管CDR在抗体之间有所变化，但CDR内仅有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
如本文中所使用，可结晶片段(Fc)区是指抗体的尾部区，其在一些实施方案中可用于稳定抗体并任选地与免疫细胞或血小板上的Fc受体相互作用(例如结合)或结合补体蛋白。在一些实施方案中，可使用Fc突变体，例如在Fc或其等效物中于对应于人类IgG4Fc区的位置处(例如对于SEQ ID NO:81而言，相应位置是EQ ID NO:81的氨基酸(aa)16、aa 17及aa 79)包含人类IgG4 Fc区突变F234A、L235A及N297Q中的一个或两个或所有三个。
多肽或其各自等效物可以在羧基末端后接有额外的50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4或3或2或1个氨基酸。
其等效物包含与CAR具有至少80％氨基酸同一性的多肽或由在高严格度条件下杂交至编码CAR的多核苷酸的互补序列的多核苷酸编码的多肽，其中高严格度条件包括约55℃至约68℃的培养温度；约1×SSC至约0.1×SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；及约1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。
替代实施方案包含具有来自其他抗体CDR的适当CDR的LC可变区中的一个或多个CDR(例如CDR1、CDR2、CDR3)。且包含其各自等效物。因此，作为一个实例，来自LC可变区的CDR1及CDR2可与另一抗体LC可变区的CDR3进行组合，且在一些方面，可以在羧基末端处包含额外的50个氨基酸、或约40个氨基酸、或约30个氨基酸、或约20个氨基酸、或约10个氨基酸、或约5个氨基酸、或约4或3或2或1个氨基酸。在另一方面中，EGFR CAR是WO 2016/164370中所公开的CAR。
在一方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”意指抗体选择性结合其表位蛋白或其片段的能力，如通过ELISA或其他适合的方法所测量的能力。生物等效抗体包含但不限于那些与参考抗体结合至相同表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物及抗体模拟物。
不需要明确的叙述即可推断且除非另有指代，否则在本公开涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，该物质的等效物或生物等效物旨在属于本公开的范围内。如本文中所使用，在提及参考蛋白质、抗体、多肽或核酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”同义，且意指具有最小同源性而仍维持所需结构或功能性的那些。除非在本文中特别地列举，否则本文所提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白质都被视为包含其等效物。例如，等效物旨在与参考蛋白质、多肽或核酸具有至少约70％同源性或同一性、或至少80％同源性或同一性、和或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或98％百分比的同源性或同一性，且展现实质上等效的生物活性。或者，在提及多核苷酸时，其等效物是在严格条件下杂交至参考多核苷酸或其互补序列的多核苷酸。
术语“抗体变体”旨在包含在除小鼠外的物种中产生的抗体。其也包含含有针对抗体或片段的线性多肽序列的翻译后修饰的抗体。其进一步涵盖完全人类抗体。
术语“抗体衍生物”旨在涵盖结合如上文所定义的表位且是本发明的天然单克隆抗体的修饰物或衍生物的分子。衍生物包含但不限于例如双特异性抗体、多特异性抗体、异种特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体、多特异性抗体、二价抗体、嵌合抗体、重组抗体及人源化抗体。
如本文中所使用，术语“特异性结合”意指抗体与抗原之间以至少10-6M的结合亲和力进行接触。在某些方面，抗体以至少约10-7M及优选地10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M的亲和力进行结合。
如本文中所使用，术语“抗原”是指可由特定体液或细胞免疫性的产物(例如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可为任何类型的分子，包含例如半抗原、简单中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子(例如复合碳水化合物(例如、多糖)、磷脂及蛋白质)。常见的抗原类别包含但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物及其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自体免疫疾病、过敏及移植物排斥的抗原、毒素及其他各种抗原。
在一些实施方案中，结合部分(例如抗体、其抗原结合片段或CAR)的抗原可在本文中以以下形式来提供：“抗原”后有结合部分(例如BCMA CAR)，或在抗原前具有“抗”且在抗原后具有结合部分(例如抗BCMA抗体)，或在“关于”或“针对”后接有的结合部分且然后是抗原(例如关于CS1的抗体)。
如本文中所使用，术语肿瘤相关抗原(TAA)、癌症抗原、肿瘤抗原、癌症相关抗原及肿瘤相关抗原可在本文中互换使用且是指癌症或肿瘤细胞的抗原性物质。在一些实施方案中，TAA呈现在一些肿瘤或癌症细胞上且也任选地以较低含量呈现在一些正常细胞上。在一些实施方案中，TAA仅呈现在肿瘤或癌症细胞上，但并不呈现在正常细胞上。在一些实施方案中，TAA是选自G蛋白偶合受体C类家族5成员D(GPRC5D)、B细胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7(CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)、表皮生长因子受体变体III(EGFRVIII)、FLT3、CD70、间皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人类表皮生长因子受体2(HER2)、ERBB2(Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1(CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、白介素13受体α2(IL13Ra2)、鸟苷酰基环化酶C(GUCY2C)、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、胸苷激酶1(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神经节苷脂G2(GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮细胞黏附分子前体(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、黏蛋白1(Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、纤维母细胞活化蛋白α(FAP)、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2前体(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位切断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、天冬酰胺内肽酶、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、FCRL5或IGLL1。
如本文中所使用，病毒抗原是指表达于病毒中和/或由病毒基因组编码的抗原。非限制性实例包含流行性感冒病毒的血球凝集素(HA)及神经氨酸酶(NA)以及COVID-19的刺突蛋白、S1、S2、核衣壳包膜蛋白。
如本文中所使用，术语“抗原结合结构域”是指可特异性结合至抗原靶标的任何蛋白质或多肽结构域。
如本文中所使用的，提及细胞的术语“自体”是指分离的并输注回同一对象(接受者或宿主)的细胞。“同种异体”是指非自体细胞。
本文所用的术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指包括以下部分的融合蛋白：能够结合至抗原的细胞外结构域、跨膜结构域，其衍生自不同于衍生细胞外结构域的多肽的多肽、及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时称为“嵌合受体”、“T体”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”意指任何可结合至某一抗原的寡肽或多肽。“细胞内结构域”或“细胞内信号传导结构域”意指任何已知的用作传输信号以激活或抑制细胞中的生物过程的结构域的寡肽或多肽。在某些实施方案中，除主要信号传导结构域外，细胞内结构域也可以包含一个或多个共刺激信号传导结构域，或者基本上由其组成，或进一步包含这类结构域。“跨膜结构域”意指任何已知跨越细胞膜且可用于连接细胞外结构域及信号传导结构域的寡肽或多肽。嵌合抗原受体可以任选地包含“铰链结构域”，该铰链结构域用作细胞外结构域与跨膜结构域之间的连接体。这些结构域的非限制性实例提供于本文中，例如：铰链结构域：IgG1重链铰链编码序列：SEQ ID NO:112。其他非限制性实例包含本领域内已知的IgG4铰链区、IgD及CD8结构域。其他示例序列提供于序列表中，例如：跨膜结构域：CD28跨膜区编码序列：SEQ ID NO:113；细胞内结构域：4-1BB共刺激信号传导区编码序列：SEQ ID NO:114；细胞内结构域：CD28共刺激信号传导区编码序列：SEQ ID NO:115；及细胞内结构域：CD3ζ信号传导区编码序列：SEQ ID NO:116。
每一种示例性结构域组分的其他实施方案包含具有类似生物功能的其他蛋白质，该蛋白质与由上文所公开的核酸序列编码的蛋白质共有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性、优选地90％的序列同一性、更优选地至少95％的序列同一性。另外，此类结构域的非限制性实例提供于本文中。
如本文中所使用，术语“CD8α铰链结构域”是指与此名称有关的特定蛋白质片段及任何具有类似生物功能的其他分子，该其他分子与如本文所示的CD8α铰链结构域序列共有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性、优选地90％的序列同一性、更优选地至少95％的序列同一性。人类、小鼠及其他物种的CD8α铰链结构域的示例性序列提供于Pinto,R.D.等人(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177中。与CD8α铰链结构域有关的序列提供于Pinto,R.D.等人(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177中。此类序列的非限制性实例包含：人类CD8α铰链结构域：SEQ ID NO:117；小鼠CD8α铰链结构域：SEQ ID NO:118；及猫CD8α铰链结构域：SEQ ID NO:119。
如本文中所使用的，术语“CD8α跨膜结构域”是指与此名称有关的特定蛋白质片段及任何具有类似生物功能的其他分子，此类其他分子与如本文所示的CD8α跨膜结构域序列共有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性、优选地90％的序列同一性、更优选地至少95％的序列同一性。与人类T细胞表面糖蛋白CD8α链(基因库登录号：NP_001759.3)的氨基酸位置183至203或小鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链(基因库登录号：NP_001074579.1))的氨基酸位置197至217及大鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链(基因库登录号：NP_113726.1)的氨基酸位置190至210有关的片段序列提供了CD8α跨膜结构域的其他示例性序列。与所列举的登录号中的每一个都有关的序列提供如下：人类CD8α跨膜结构域：SEQ ID NO:120；小鼠CD8α跨膜结构域：SEQ ID NO:121；及大鼠CD8α跨膜结构域：SEQ ID NO:122。
如本文中所使用，术语“CD28跨膜结构域”是指与此名称有关的特定蛋白质片段及任何具有类似生物功能的其他分子，此类分子与如本文所示的CD28跨膜结构域序列共有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性、至少90％的序列同一性或至少95％的序列同一性。与基因库登录号：XM_006712862.2及XM_009444056.1有关的片段序列提供了CD28跨膜结构域的其他非限制性示例序列。与所列举的登录号中的每一个有关的序列提供于本文中。
如本文中所使用，术语“4-1BB共刺激信号传导区”是指与此名称有关的特定蛋白质片段及任何具有类似生物功能的其他分子，此类分子与如本文所示的4-1BB共刺激信号传导区序列共有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性、优选地90％的序列同一性、更优选地至少95％的序列同一性。4-1BB共刺激信号传导区的非限制性示例序列提供于美国公开文件20130266551A1中，例如所提供的下述示例性序列：4-1BB共刺激信号传导区：SEQID NO:123。
如本文中所使用，术语“CD28共刺激信号传导区”是指与此名称有关的特定蛋白质片段及任何具有类似生物功能的其他分子，此类分子与本文所示的CD28共刺激信号传导区序列共有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性、优选地90％的序列同一性、更优选地至少95％的序列同一性。CD28共刺激信号传导结构域的示例性序列提供于以下文献中：美国专利第5,686,281号；Geiger,T.L.等人，Blood 98:2364-2371(2001)；Hombach,A.等人，JImmunol 167:6123-6131(2001)；Maher,J.等人，Nat Biotechnol 20:70-75(2002)；Haynes,N.M.等人，J Immunol 169:5780-5786(2002)；Haynes,N.M.等人，Blood 100:3155-3163(2002)。非限制性实例包含下述CD28序列的残基114-220：SEQ ID NO:124及其等效物。
如本文中所使用，术语“ICOS共刺激信号传导区”是指与此名称有关的特定蛋白质片段及任何具有类似生物功能的其他分子，此类分子与如本文所展示的ICOS共刺激信号传导区序列共有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性、优选地90％的序列同一性、更优选地至少95％的序列同一性。ICOS共刺激信号传导区的非限制性示例序列提供于美国公开文件2015/0017141A1中，示例性多核苷酸序列提供如下：ICOS共刺激信号传导区编码序列：SEQ ID NO:125。
如本文中所使用，术语“OX40共刺激信号传导区”是指与此名称有关的特定蛋白质片段及任何具有类似生物功能的其他分子，此类分子与如本文所示的OX40共刺激信号传导区序列共有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性、或90％的序列同一性、或至少95％的序列同一性。OX40共刺激信号传导区的非限制性示例序列公开于美国公开文件2012/20148552A1中，且包含下文所提供的示例性序列：OX40共刺激信号传导区编码序列：ID NO:126及其等效物。
可以使用其他共刺激信号传导区，例如CD27、CD40、CD40L和/或TLR中的那些。例如参见公开于美国公开文本20160340406A1中的那些。
如本文中所使用，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与此名称有关的特定蛋白质片段及任何具有类似生物功能的其他分子，此类分子与如本文所示的CD3ζ信号传导结构域序列共有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性、优选地90％的序列同一性、更优选地至少95％的序列同一性。CD3ζ信号传导结构域的非限制性示例序列提供于美国公开文件20130266551A1中，例如SEQ ID NO:3。
本文所用的信号肽(有时称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)是指存在于大部分前往分泌通路的新合成蛋白质的N-末端处的短肽(通常长16-30个氨基酸)。在一个实施方案中，信号肽是分泌信号。
分泌信号意指允许蛋白质自细胞溶质输出至分泌通路中的分泌信号肽。蛋白质可以展现不同程度的成功分泌且通常某些信号肽在与特定蛋白质配对时可以引起较低或较高的程度。在真核生物中，信号肽是由真核细胞的细胞溶质中的信号识别颗粒(SRP)识别的疏水性氨基酸串。在自mRNA-核糖体复合物产生信号肽之后，SRP结合肽且停止蛋白质翻译。SRP然后将mRNA/核糖体复合物输送至粗面内质网中，在此将蛋白质翻译至内质网的内腔中。然后信号肽从蛋白质上切割出来，在内质网中产生可溶性或膜标记(如果也存在跨膜区)的蛋白质。此类物质是本领域内已知的且可从供货商(例如Oxford Genetics)购得。
如本文中所使用，可切割肽也被称为可切割接头，其意指可以例如由酶切割的肽。一种包含该可切割肽的翻译的多肽可以产生两种最终产物，因此允许表达来自一个开放阅读框的一个以上的多肽。可切割肽的一个实例是自切割肽，例如2A自切割肽。2A自切割肽是一类18-22aa长的肽，其可以诱导切割细胞中的重组蛋白。在一些实施方案中，2A自切割肽选自P2A、T2A、E2A、F2A及BmCPV2A。例如参见Wang Y等人，2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori.Sci Rep.2015；5:16273(公开于2015年11月5日)。
如本文中所使用，术语“T2A”及“2A肽”可互换使用且是指任何2A肽或其片段、任何2A样肽或其片段或人工肽，该人工肽包括含有共有多肽基序D-V/I-E-X-N-P-G-P(SEQ IDNO:177)的相对短肽序列(取决于病毒的来源，长约20个氨基酸)中的必需氨基酸，其中X是指任何通常视为自切割的氨基酸。
“可检测标记”、“标记”、“可检测标志物”或“标志物”可互换使用且包含但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料及蛋白质(包括酶)。可检测标记也可以附接至本文所描述的多核苷酸、多肽、抗体或组合物。
如本文中所使用，术语“标记”或可检测标记意指直接或间接地结合至待检测组合物以生成“标记的”组合物的直接或间接地可检测的化合物或组合物，例如N-末端组氨酸标签(N-His)、磁活性同位素(例如115Sn、117Sn及119Sn)、非放射性同位素(例如13C及15N)、多核苷酸或蛋白质(例如抗体)。该术语也包括结合至将在表达插入序列时提供信号的多核苷酸的序列，例如绿色荧光蛋白(GFP)等。标记可以是自检测(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记情形下，标记可以催化受底物化合物或组合物发生可检测的化学变化。标记可以适用于小规模检测或更适用于高通量筛选。因此，适合的标记包含但不限于磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料及蛋白质(包括酶)。标记可以被简单检测或其可以被量化。简单检测的反应通常包含仅证实存在的反应，而量化的反应通常包括具有可量化(例如可以数值形式报告)值(例如强度、极化和/或其他性质)的反应。在发光或荧光分析中，可以直接使用与实际上参与结合的分析组分相关的发光体或荧光团或间接使用与另一组分(例如报告基因或指示剂)相关的发光体或荧光团来生成可检测反应。产生信号的发光标记的实例包括但不限于生物发光及化学发光。可检测发光反应通常包含发光信号的变化或出现。用于以发光方式标记分析组分的适合的方法及发光体是本领域内已知的且描述于例如Haugland,Richard P.(1996)Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals(第6版)中。发光探针的实例包含但不限于水母素及荧光素酶。
如本文中所使用，术语“免疫偶联物”包含与第二药剂(例如细胞毒性剂、可检测剂、放射性试剂、靶向剂、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、半合成抗体或多特异性抗体)相关的或连接的抗体或抗体衍生物。
适宜荧光标记的实例包括但不限于荧光素、罗丹明(rhodamine)、四甲基罗丹明、伊红(eosin)、赤藓红(erythrosin)、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀绿(Malacite green)、均二苯乙烯、荧光黄(Lucifer Yellow)、Cascade BlueTM及得克萨斯红(Texas Red)。其他适合的光学染料描述于Haugland,Richard P.(1996)Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals(第6版)中。
在另一方面，荧光标记被功能化以有利于共价附接至存在于细胞或组织的表面中或其上的细胞组分(例如细胞表面标志物)。适合的功能性基团包括但不限于异硫氰酸酯基团、氨基、卤基乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯及磺酰基卤化物，其都可用于使荧光标记附接至第二分子。荧光标记的功能性基团的选择取决于附接至连接体、试剂、标志物或第二标记剂的位点。
如本文中所使用，纯化标记或标志物是指可用于纯化标记的结合分子或组分的标记，例如表位标签(包括但不限于Myc标签、人类流行性感冒血球凝集素(HA)标签、FLAG标签)、亲和标签(包括但不限于谷胱甘肽-S转移酶(GST)、聚组氨酸(His)标签、钙调蛋白结合蛋白(CBP)或麦芽糖结合蛋白(MBP))或荧光标签。
如本文中所使用，调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物是指表达于细胞(例如免疫细胞)上且能够活化IL2通路(例如CD122信号传导通路和/或CD132信号传导通路)的蛋白质或多肽或另一部分。CD122也称为白介素-2受体亚单位β，而CD132也称为白介素-2受体亚单位γ。白介素2受体(其参与T细胞调节的免疫反应)针对结合白介素2的能力以3种形式存在。低亲和力形式是α亚单位的单体(也称为CD25)且并不参与信号转导。中间亲和力形式由γ/β亚单位异源二聚体组成，而高亲和力形式由α/β/γ亚单位异源三聚体组成。受体的中间亲和力形式及高亲和力形式都参与来自白介素2的促有丝分裂信号的受体调节的内吞作用及转导。这些蛋白质也形成三种IL-15受体亚单位中的一种，而CD132与其他配体特异性受体配对以引导淋巴细胞对细胞因子(包含IL4、IL7、IL9及IL21)具有反应。活化受体可以增加CD8+效应T细胞的增殖。例如参见Noguch等人，Science.262(5141):1877-80。因此，调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物的非限制性实例包含IL2受体、IL4受体、IL7受体、IL9受体、IL15受体、IL21受体、膜结合性IL2、膜结合性IL4、膜结合性IL7、膜结合性IL9、膜结合性IL15或膜结合性IL21。可使用其他重组蛋白，例如融合至任何跨膜结构域及CD122、CD132、IL2受体、IL4受体、IL7受体、IL9受体、IL15受体或IL21受体的胞质结构域的任何细胞外结构域。
如本文中所使用，白介素(IL)是指最早由白血细胞(白血球)表达的细胞因子。免疫系统的功能主要取决于白介素。大部分白介素由辅助性CD4 T淋巴细胞以及通过单核细胞、巨噬细胞及内皮细胞合成。其促进了T及B淋巴细胞以及造血细胞的发育及分化。如本文中所使用，白介素可以是从细胞分泌出的可溶性细胞因子和/或表达于细胞表面上的膜结合(mb)细胞因子。本领域技术人员可以转化细胞因子的可溶性形式及膜结合形式，例如工程化细胞因子的跨膜结构域和/或信号肽。
白介素-2(IL-2)是一种白介素，其是免疫系统中的一类细胞因子信号传导分子。其是调控负责免疫性的白血细胞(白细胞，通常是淋巴细胞)的活性的15.5-16kDa蛋白质。在一些实施方案中，IL-2是人类IL-2。在一些实施方案中，IL-2源于其他物种，例如具有XP_517425.1的NCBI参考序列的黑猩猩IL-2。此蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可以参见以下基因卡片ID：GC04M122451、HGNC(6001)、NCBI Entrez Gene(3558)、Ensembl(ENSG00000109471)、
Figure BDA0004112630850000211
(147680)、UniProtKB/Swiss-Prot(P60568)及Open Targetsatform(ENSG00000109471)，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。
因此，在一些实施方案中，IL-2包含MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSET TFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:178)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，IL-2包含SEQ ID NO:178的氨基酸(aa)21至aa 153，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，本文所用的IL-2是野生型IL-2或其等效物。在一些实施方案中，本文所用的IL-2是通过宿主细胞(例如HEK 293细胞或CHO细胞或大肠杆菌(E.coli)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))在体外产生的重组IL-2。例如参见由Sigma-Aldrich(SRP3085、SRP6170、I7908、I2644、H7041或I17002)及STEMCELLTM Technologies(78036)出售的人类IL-2。在其他实施方案中，IL-2等效物刺激NK细胞的增殖或活化其细胞毒性功能或二者都有，其显著类似于野生型IL-2。本领域技术人员可利用用于评估NK细胞的增殖及细胞毒性功能的分析，例如离体培养及细胞计数(例如参见Choi等人，J ImmunotherCancer.2019Jul 5；7(1):168)、51铬释放分析(例如参见Dong等人，CancerDiscov.2019Oct；9(10):1422-1437.doi:10.1158/2159-8290.CD-18-1259.Epub 2019Jul24)、基于比色测量的细胞毒性分析(例如参见Chava等人，J Vis Exp.2020Feb 22；(156):10.3791/60714)或基于流式细胞术的细胞毒性分析(例如参见Kim等人，FrontImmunol.2020Aug14；11:1851)。在一些实施方案中，IL-2等效物包含野生型IL-2的片段(例如SEQ ID NO:179的aa 22至aa 153)，或基本上由其组成或进一步由其组成。另外或替代地，IL-2等效物包含野生型IL-2或其片段的变体，或基本上由其组成或进一步由其组成，该变体是例如在N-末端处添加额外甲硫氨酸或具有一个或多个下列突变：对应于SEQ ID NO:178的aa38的氨基酸残基任选地突变成甲硫氨酸、对应于SEQ ID NO:178的aa 39的氨基酸残基任选地突变成丝氨酸、对应于SEQ ID NO:178的aa 58的氨基酸残基任选地突变成丙氨酸或赖氨酸、对应于SEQ ID NO:178的aa 62的氨基酸残基任选地突变成赖氨酸或异亮氨酸或丙氨酸或谷氨酰胺、对应于SEQ ID NO:178的aa 65的氨基酸残基任选地突变成天冬酰胺或谷氨酸或丙氨酸或精氨酸、对应于SEQ ID NO:178的aa 82的氨基酸残基任选地突变成亮氨酸或丙氨酸、对应于SEQ ID NO:178的aa 88的氨基酸残基任选地突变成缬氨酸、对应于SEQ ID NO:178的aa 145的氨基酸残基任选地突变成丝氨酸或丙氨酸或其任何组合。非限制性实例包含由PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ IDNO:179)组成的阿地白介素(Aldesleukin)、由MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQC LEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNR WITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:180)组成的替西白介素(Teceleukin)、Neoleukin2/15(例如参见Silva等人，Nature.2019Jan；565(7738):186-191)以及公开于US9206243B2或US8012465B2中的那些。另外或替代地，IL-2等效物包含IL-2衍生物(例如通过糖基化、乙酰化或磷酸化修饰)，或基本上由其组成或进一步由其组成。
白介素-15(IL-15)是结构类似于白介素-2(IL-2)的细胞因子。如同IL-2，IL-15结合至由IL-2/IL-15受体β链(CD122)及常用的γ链(γ-C,CD132)构成的复合物且通过该复合物传导信号。通过病毒感染后通过单核吞噬细胞(及一些其他细胞)分泌IL-15。此细胞因子诱导自然杀伤细胞的增殖。在一些实施方案中，IL-15是人类IL-15。此蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可参见以下基因卡片ID：GC04P141636、HGNC:5977、NCBI EntrezGene:3600、Ensembl:ENSG00000164136、
Figure BDA0004112630850000221
600554或UniProtKB/Swiss-Prot:P40933，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，IL-15是人类IL-15同种型1。因此，在一些实施方案中，IL-15包含MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIED LIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSS NGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:181)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，IL-15包含SEQ ID NO:181的氨基酸(aa)30至aa 162，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，IL-15是人类IL-15同种型2。因此，在一些实施方案中，IL-15包含MVLGTIDLCSCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTA MKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFL QSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:182)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，IL-15源于其他物种，例如具有UniProtKB参考ID：P48092的恒河猴IL-15。
在一些实施方案中，本文所用的IL-15是野生型IL-15或其等效物。在一些实施方案中，本文所用的IL-15是由宿主细胞(例如HEK 293细胞或大肠杆菌)在体外产生的重组IL-15。例如参见通过Sigma-Aldrich(SRP6293或SRP3077)及STEMCELLTM Technologies(78031)出售的人类IL-15。在其他实施方案中，IL-15等效物刺激NK细胞的增殖或活化其细胞毒性功能或二者都有，其显著类似于野生型IL-15。本领域技术人员可以利用用于评估NK细胞的增殖及细胞毒性功能的分析，且阐述于本文中。IL-15等效物的非限制性实例包括公开于US20190263877A1、US10450359B2及US10537615B2中的那些。另外或替代地，IL-15等效物包含IL-15衍生物(例如通过糖基化、乙酰化或磷酸化修饰)，或基本上由其组成或进一步由其组成。
白介素-21(IL-21)(在本文中也称为IL-21多肽)是对免疫系统细胞(包含可破坏病毒性感染或癌性细胞的自然杀伤(NK)细胞及细胞毒性T细胞)具有强效调控效应的细胞因子。该细胞因子诱导其靶细胞中的细胞分裂/增殖。在一些实施方案中，IL-21是人类IL-21。该蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可以参见以下基因卡片ID：GC04M122612、HGNC:6005、NCBI Entrez Gene:59067、Ensembl:ENSG00000138684、
Figure BDA0004112630850000231
605384及UniProtKB/Swiss-Prot:Q9HBE4，其中的每一个的全部内容以引用方式并入本文中。
在其他实施方案中，IL-21等效物刺激免疫细胞(例如NK细胞)的增殖或维持其生存率或二者都有，其显著类似于野生型IL-21。本领域技术人员可以利用用于评估细胞增殖及生存率的分析，例如离体培养及细胞计数或活/死细胞染色(例如四唑还原分析、刃天青还原分析、蛋白酶生存率标志物分析、ATP分析或活细胞实时分析)。例如参见Choi等人，JImmunother Cancer.2019Jul 5；7(1):168；及Riss等人，Cell Viability Assays.2013年5月1日；Markossian等人编辑，Assay Guidance Manual.Bethesda(MD):Eli Lilly&Company及the National Center for Advancing Translational Sciences,2004；在2021年5月14日可访问的www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/。
CD122是白介素-2的受体且也称为白介素2受体亚单位β。此β亚单位参与受体介导的内吞作用且转导IL2的促有丝分裂信号。其很可能与IL15RA有关，后者参与IL15的嗜中性粒细胞吞噬作用的刺激。该蛋白质或潜在基因或用于检测该蛋白质的适合的抗体的非限制性示例性序列可以参见以下基因卡片ID：GC22M037125、HGNC:6009、NCBI Entrez Gene:3560、Ensembl:ENSG00000100385、
Figure BDA0004112630850000241
146710或UniProtKB/Swiss-Prot:P14784，其中的每一个的全部内容以引用方式并入本文中。
如本文中所使用，感兴趣的序列中“对应于”参考序列中的鉴别位置的氨基酸(aa)或核苷酸(nt)残基位置是指，在感兴趣的序列与参考序列之间进行序列比对时该残基位置与所鉴别位置对齐。可利用各种程序实施此类序列比对，例如Clustal Omega及BLAST。
在一些实施方案中，术语“载体”意指保留感染及转导非分裂和/或缓慢分裂性细胞且整合至靶细胞基因组中的能力的重组载体。
“质粒”是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在许多情形下，其为圆形及双链。质粒提供了用于微生物群体内的水平基因转移的机制且通常在既定环境状态下提供选择性优点。质粒可以携带在竞争环境中对天然抗生素产生耐药性的基因，或者产生的蛋白质在类似情况下可能作为毒素。用于此类用途的许多质粒可以商业购得。将待复制基因插入含有使细胞抵抗特定抗生素的基因及多克隆位点(MCS或多聚接头)的质粒的拷贝中，该多克隆位点是含有一些允许容易地在此位置处插入DNA片段的常用限制位点的较短区域。质粒的另一主要用途是制备大量蛋白质。在此情形下，研究人员培育含有具有感兴趣的基因的质粒的细菌。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素抗性一样，其也可以通过诱导以自插入基因产生大量蛋白质。这是一种廉价而简单的大规模生产基因或蛋白质的方法。
“病毒载体”定义为以重组方式产生发病毒或病毒颗粒，其包含在体内、离体或在体外待递送至宿主细胞中的多核苷酸。如本领域技术人员已知的，存在6类病毒。DNA病毒构成I类及II类。RNA病毒及逆转录病毒构成剩余种类。III类病毒具有双链RNA基因组。IV类病毒具有正单链RNA基因组，本身用作mRNA V类病毒的该基因组具有用作mRNA合成模板的负单链RNA基因组。VI类病毒具有正单链RNA基因组，但在复制以及mRNA合成中都具有DNA中间体。逆转录病毒携载RNA形式的其基因信息；然而，在病毒感染细胞后，RNA被逆转录成整合至感染的细胞的基因组DNA中的DNA形式。整合DNA形式称为前病毒。病毒载体的实例包含逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体等。α病毒载体(例如基于塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)的载体及基于辛得比斯病毒(Sindbisvirus)的载体)也已研发以用于基因疗法及免疫疗法中。参见Schlesinger及Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439及Ying等人(1999)Nat.Med.5(7):823-827。
在一些实施方案中，载体衍生自或基于野生型病毒。在其他实施方案中，载体是衍生自或基于野生型腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒(例如γ逆转录病毒和/或慢病毒)。逆转录病毒的实例包含但不限于莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)或弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、马类感染性贫血病毒(EIAV)、猿类免疫缺陷病毒(SIV)及猫类免疫缺陷病毒(FIV)。病毒载体可以包含衍生自两种或更多种不同病毒的组分，且也可以包含合成组分。可以操纵载体组分以获得期望的特性，例如靶细胞特异性。
本发明的重组载体可衍生自灵长类动物及非灵长类动物。灵长类动物慢病毒的实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类获得性免疫缺陷综合征的病原体(AIDS)及猿类免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒基团包括原型“慢发病毒”维斯那-梅迪病毒(visna/maedivirus)(VMV)以及相关山羊类关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马类感染性贫血病毒(EIAV)及最近描述的猫类免疫缺陷病毒(FIV)及牛类免疫缺陷病毒(BIV)。先前技术的重组慢病毒载体是本领域内已知的，例如参见美国专利第6,924,123号、第7,056,699号、第7,419,829号及第7,442,551号，这些专利以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，慢病毒载体是自我不活化的慢病毒载体。在其他实施方案中，慢病毒载体具有缺乏TATA盒的U3区。另外或替代地，慢病毒载体具有缺乏一个或多个转录因子结合位点的U3区。
逆转录病毒(例如γ逆转录病毒和/或慢病毒)包括(a)包膜，其包含脂质及糖蛋白；(b)载体基因组，其是递送至靶细胞中的RNA(通常是在5’端处包含帽且在侧接有LTR的3’端处包含聚A尾部的二聚体RNA)；(c)衣壳；及(d)蛋白质，例如蛋白酶。美国专利第6,924,123号公开了某些逆转录病毒序列有利于整合至靶细胞基因组中。此专利教导了每一个逆转录病毒基因组都包含被称为gag、pol及env的基因，这些基因编码病毒颗粒蛋白质及酶。这些基因在两端侧接有称为长末端重复(LTR)的区域。LTR负责前病毒整合及转录。其也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA通过位于病毒基因组的5'端处的psi序列发生衣壳化。LTR自身是可分成三个组件(其称为U3、R及U5)的相同序列。U3是衍生自RNA的3'端的独特序列。R是衍生自重复于RNA的两端的序列，且U5是衍生自RNA的5'端的独特序列。三个组件的大小可在不同逆转录病毒中变化较大。对于病毒基因组而言，聚(A)加成(终止)位点位于右手侧LTR中的R与U5之间的边界处。U3含有前病毒的大部分转录控制组件，这些转录控制组件包含启动子及多个对细胞及在一些情形下的病毒转录活化蛋白具有反应的增强子序列。
就结构基因gag、pol及env自身而言，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白以蛋白水解方式被处理成成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)及NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，该逆转录酶含有调节基因组复制的DNA聚合酶、相关RNase H及整合酶(IN)。在一些实施方案中，这些结构基因中的一种或多种是由产生病毒载体的包装细胞(在本文中也称为宿主细胞)提供，而非提供于载体基因组本身中。
为产生病毒载体颗粒，将载体RNA基因组自编码其的DNA构建体表达于宿主细胞中。通过表达于宿主细胞中的其他核酸序列(“包装系统”，其通常包含gag/pol及env基因中的任一项或两项)反式提供未由载体基因组编码的颗粒组分。产生病毒载体颗粒所需的序列组可通过瞬时转染引入宿主细胞中，或其可整合至宿主细胞基因组中，或其可以混合方式提供。所涉及的技术是本领域技术人员已知的。
γ逆转录病毒是逆转录病毒科的一个属且可用于本文的公开内容中。示例性物种是莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)及猫类白血病病毒。γ逆转录病毒是直径介于80-100nm之间的球形、包膜病毒颗粒。其含有核衣壳、逆转录酶、整合酶、衣壳、蛋白酶、包膜及表面单元。核衣壳是病毒颗粒内的核酸蛋白组装体，且是病毒颗粒的子结构。逆转录酶是负责在病毒颗粒复制周期期间将RNA转变成DNA的酶。整合酶与逆转录酶一起用于将RNA转化成DNA。γ逆转录病毒的基因组是大约8.3kb大小的单链RNA(+)基因组。其具有5’帽与3’聚A尾部，且其在5’及3’端含有两个长末端重复区。这些长末端重复区具有U5、R及U3区以及聚嘌呤区(在3’端)及引物结合位点(在5’端)。典型γ逆转录病毒基因组含有gag基因、pol基因及env基因，这些基因在基因疗法载体中均可省去。衣壳是病毒颗粒的环绕基因组的蛋白质壳体，其主要功能是保护基因组且将其递送至宿主细胞中。病毒包膜是环绕病毒衣壳的膜，其是经宿主细胞衍生的脂质双层。作为基因疗法的潜在载体，γ逆转录病毒作为慢病毒载体相对于HIV具有一些优点。具体而言，γ逆转录包装系统无需并入与gag、pol或辅助基因的编码序列重叠的任何序列。例如参见Tobias Maetzig等人，Viruses.2011Jun；3(6):677-713.Epub 2011Jun 3。
如本文中所使用的，假型化是产生病毒或病毒载体与外来病毒包膜蛋白的组合的过程。其结果为假型病毒颗粒，也称为假病毒。使用此方法，可使用外来病毒包膜蛋白改变宿主向性或增加或降低病毒颗粒的稳定性。假型颗粒并不携带用于产生其他病毒包膜蛋白的遗传物质，从而表型变化不能传递至后代病毒颗粒。在一些情形下，不能产生病毒包膜蛋白导致假病毒无法复制。以此方式，可以在较低风险环境中研究危险病毒的性质。假型化使得可以控制包膜蛋白的表达。常用蛋白质是来自水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitisvirus，VSV)的糖蛋白G(VSV-G)，其调节通过LDL受体的进入。并入假病毒中的包膜蛋白使得病毒易于进入具有相应宿主受体的不同细胞类型中。
逆转录病毒使用特定受体来结合及进入细胞；含有RD114的逆转录病毒及含有BaEV包膜的逆转录病毒都使用中性氨基酸(aa)转运蛋白(ASCT2)。RD114假型病毒载体仅使用钠依赖性中性氨基酸转运蛋白(ASCT2)作为其进入受体，而BaEV使用两种受体(ASCT1及ASCT2)来进入细胞。IL-15-NK细胞及IL-21-NK细胞中的ASCT1及ASCT2mRNA都多于新分离NK且这可能是BaEV是用于NK转导的优选地逆转录病毒假型的原因(Colmartino等人，FrontImmunol.2019Dec 16；10:2873)。在本文中，申请者研发了表达BaEV及RD114包膜的逆转录病毒生产细胞系，该细胞系可产生在每一个病毒颗粒上具有两种包膜的病毒，从而有利于通过访问靶细胞上的两种受体来增加转导效率。
如本文所公开，使用γ逆转录病毒的两种外来重组包膜蛋白，其是修饰的RD114猫类内源性逆转录病毒包膜糖蛋白(RD114TR)及修饰的狒狒包膜糖蛋白(BaEVTR)。人类原代淋巴细胞的转导效率取决于用于包被逆转录病毒载体的包膜蛋白类型，且活化NK细胞高度表达受体中性氨基酸转运蛋白A(SLC1A4，其在本文中也称为ASCT-1)及中性氨基酸转运蛋白B(0)(SLC1A5，其在本文中也称为ASCT-2)，这些受体是用于进入靶标的狒狒包膜糖蛋白(BaEV-TR)。ASCT-2受体是用于进入细胞的猫类内源性逆转录病毒包膜糖蛋白(RD114TR)。
本文所用的术语“进入受体”意指在病毒(例如逆转录病毒)与细胞之间通过结合至病毒(例如病毒的包膜糖蛋白)来引起膜融合的受体。在一些实施方案中，逆转录病毒进入受体ASCT1、ASCT2及Pit1表达于人体造血系统的细胞上。在其他实施方案中，ASCT1、ASCT2或Pit1中的任一个或任两个或任三个表达于经活化及增殖的NK及T细胞上，这极大改进了包含相应包膜糖蛋白的病毒的转导效率。
丙氨酸/丝氨酸/半胱氨酸/苏氨酸转运蛋白1(ASCT1)也称为溶质载体家族1成员4(SLC1A4)或中性氨基酸转运蛋白A。在一些实施方案中，ASCT1是人类ASCT1。此蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可以参见基因卡片ID：GC02P064988、HGNC:10942、NCBIEntrez Gene:6509、Ensembl:ENSG00000115902、
Figure BDA0004112630850000271
600229或UniProtKB/Swiss-Prot:P43007，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。
2型钠依赖性中性氨基酸转运蛋白(ASCT2)也称为溶质载体家族1成员5(SLC1A5)或中性氨基酸转运蛋白B(0)。其是RD114/猿类D型逆转录病毒受体、狒狒M7病毒受体及RD114病毒受体。在一些实施方案中，ASCT2是人类ASCT2。此蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可参见基因卡片ID：GC19M051483、HGNC:10943、NCBI Entrez Gene:6510、Ensembl:ENSG00000105281、
Figure BDA0004112630850000272
109190或UniProtKB/Swiss-Prot:Q15758，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。
磷酸转运蛋白1(Pit1或PiT-1或PiT1)也称为溶质载体家族20成员1(SLC20A1)或钠依赖性磷酸转运蛋白1或长臂猿白血病病毒受体1或白血病病毒受体1同源物。其是使得人类细胞易于由长臂猿白血病病毒、猿类肉瘤相关病毒、猫类白血病病毒亚群B及10A1鼠类白血病病毒感染的逆转录病毒受体。在一些实施方案中，Pit1是人类Pit1。此蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可以参见基因卡片ID：GC02P118061、HGNC:10946、NCBI EntrezGene:6574、Ensembl:ENSG00000144136、
Figure BDA0004112630850000273
137570或UniProtKB/Swiss-Prot:Q8WUM9，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。
术语“4-1BBL”、“肿瘤坏死因子超家族成员9”、“TNFSF9”或“4-1BBL多肽”是发现于APC(抗原递呈细胞)上且结合至4-1BB(也称为CD137)的2型跨膜糖蛋白受体。4-1BB/4-1BBL复合物属于TNFR:TNF超家族且表达于活化的T淋巴细胞上。在一些实施方案中，4-1BBL是人类4-1BBL。此蛋白质或潜在基因的非限制性示例性序列可以参见基因卡片ID：GC19P006531、HGNC:11939、NCBI Entrez Gene:8744、Ensembl:ENSG00000125657、
Figure BDA0004112630850000281
606182或UniProtKB/Swiss-Prot:P41273，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。
CD56(也称为神经细胞黏附分子1(NCAM))是细胞黏附蛋白及免疫球蛋白超家族成员，其参与发育及分化期间的细胞-细胞相互作用以及细胞-基质相互作用。其已用作NK细胞标志物。例如参见Freud等人，Immunity.2017Nov 21；47(5):820-833。此蛋白质或潜在基因或用于检测蛋白质的适合的抗体的非限制性示例性序列可参见基因卡片ID：GC11P112961、HGNC:7656、NCBI Entrez Gene:4684、Ensembl:ENSG00000149294、
Figure BDA0004112630850000282
116930或UniProtKB/Swiss-Prot:P13591，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。在人类中，可区分两种主要NK细胞亚群且其特征在于黏附分子CD56及低亲和力Fc受体CD16(FcγRIIIa)的不同表达。其通常称为CD56bright及CD56dim NK细胞。CD56dim NK细胞在外周血中占主导地位，而CD56bright NK细胞构成次级淋巴样组织(例如淋巴结)及若干器官组织(例如肝、子宫及肾)中的NK细胞的大部分。
本文所提及的蛋白质或潜在基因或用于检测蛋白质的适合的抗体的非限制性示例性序列可参见公开可用的数据库，例如可获得于www.genecards.org/处的基因卡片或可获得于www.uniprot.org/uniprot处的UniProtKB。
在一些实施方案中，RD114TR包含RD114糖蛋白的胞外结构域及跨膜结构域及双嗜性鼠类白血病病毒(MLV-A)糖蛋白的细胞质结构域，或基本上由其组成或进一步由其组成。例如参见Sandrin等人，Blood(2002)100(3):823-832。在一些其他实施方案中，RD114TR包含MKLPTGMVILCSLIIVRAGFDDPRKAIALVQKQHGKPCECSGGQVSEAPPNSIQQVTCPGKTAYLMTNQKWKCRVTPKISPSGGELQNCPCNTFQDSMHSSCYTEYRQCRRINKTYYTATLLKIRSGSLNEVQILQNPNQLLQSPCRGSINQPVCWSATAPIHISDGGGPLDTKRVWTVQKRLEQIHKAMTPELQYHPLALPKVRDDLSLDARTFDILNTTFRLLQMSNFSLAQDCWLCLKLGTPTPLAIPTPSLTYSLADSLANASCQIIPPLLVQPMQFSNSSCLSSPFINDTEQIDLGAVTFTNCTSVANVSSPLCALNGSVFLCGNNMAYTYLPQNWTRLCVQASLLPDIDINPGDEPVPIPAIDHYIHRPKRAVQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSHQLISDVQVLSGTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYANKSGIVRNKIRTLQEELQKRRESLATNPLWTGLQGFLPYLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVFNRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP(SEQ ID NO:172)或其等效物，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，BaEVTR包含狒狒包膜糖蛋白(BaEV)的胞外结构域及跨膜结构域及MLV-A糖蛋白的细胞质结构域，或基本上由其组成或进一步由其组成。例如参见Girard-Gagnepain,Blood(2014)124(8):1221-1231。在其他实施方案中，BaEVTR包含MGFTTKIIFLYNLVLVYAGFDDPRKAIELVQKRYGRPCDCSGGQVSEPPSDRVSQVTCSG KTAYLMPDQRWKCKSIPKDTSPSGPLQECPCNSYQSSVHSSCYTSYQQCRSGNKTYYTATLLKTQTGGTSDVQVLGSTNKLIQSPCNGIKGQSICWSTTAPIHVSDGGGPLDTTRIKSVQRKLEEIHKALYPELQYHPLAIPKVRDNLMVDAQTLNILNATYNLLLMSNTSLVDDCWLCLKLGPPTPLAIPNFLLSYVTRSSDNISCLIIPPLLVQPMQFSNSSCLFSPSYNSTEEIDLGHVAFSNCTSITNVTGPICAVNGSVFLCGNNMAYTYLPTNWTGLCVLATLLPDIDIIPGDEPVPIPAIDHFIYRPKRAIQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSNQLISDVQILSSTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYVNKSGIVRDKIKTLQEELERRRKDLASNPLWTGLQGLLPYLLPFLGPLLTLLLLLTIGPCIFNRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP(SEQ ID NO:173)或其等效物，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，野生型MLV-A包含MAARSTLSKPPQDKINPWKPLIVMGVLLGVGMAESPHQVFNVTWRVTNLMTGRTANATSLLGTVQDAFPKLYFDLCDLVGEEWDPSDQEPYVGYGCKYPAGRQRTRTFDFYVCPGHTVKSGCGGPGEGYCGKWGCETTGQAYWKPTSSWDLISLKRGNTPWDTGCSKVACGPCYDLSKVSNSFQGATRGGRCNPLVLEFTDAGKKANWDGPKSWGLRLYRTGTDPITMFSLTRQVLNVGPRVPIGPNPVLPDQRLPSSPIEIVPAPQPPSPLNTSYPPSTTSTPSTSPTSPSVPQPPPGTGDRLLALVKGAYQALNLTNPDKTQECWLCLVSGPPYYEGVAVVGTYTNHSTAPANCTATSQHKLTLSEVTGQGLCMGAVPKTHQALCNTTQSAGSGSYYLAAPAGTMWACSTGLTPCLSTTVLNLTTDYCVLVELWPRVIYHSPDYMYGQLEQRTKYKREPVSLTLALLLGGLTMGGIAAGIGTGTTALIKTQQFEQLHAAIQTDLNEVEKSITNLEKSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYADHTGLVRDSMAKLRERLNQRQKLFETGQGWFEGLFNRSPWFTTLISTIMGPLIVLLLILLFGPCILNRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP(SEQ ID NO:174)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，野生型MLV-A的信号肽包含MAARSTLSKPPQDKINPWKPLIVMGVLLGVGMA(SEQ ID NO:174的氨基酸(aa)1至aa 33)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型MLV-A的胞外结构域包含SEQ ID NO:174的aa 1至aa 599，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型MLV-A的跨膜区包含LISTIMGPLIVLLLILLFGPCIL(SEQ ID NO:174的aa 600至aa 622)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型MLV-A的细胞质结构域包含NRLVQFVKDRISVVQAL(SEQ ID NO:174的aa 623至aa 639)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，MLV-A的细胞质结构域野生型包含NRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP(SEQ ID NO:174的aa 623至aa 655)，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，在提及蛋白质时，BaEV意指狒狒内源性病毒的包膜糖蛋白。此蛋白质的非限制性示例性序列可参见UniProtKB-P10269或NCBI参考序列：YP_009109691.1，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，野生型BaEV包含MGFTTKIIFLYNLVLVYAGFDDPRKAIELVQKRYGRPCDCSGGQVSEPPSDRVSQVTCSGKTAYLMPDQRWKCKSIPKDTSPSGPLQECPCNSYQSSVHSSCYTSYQQCRSGNKTYYTATLLKTQTGGTSDVQVLGSTNKLIQSPCNGIKGQSICWSTTAPIHVSDGGGPLDTTRIKSVQRKLEEIHKALYPELQYHPLAIPKVRDNLMVDAQTLNILNATYNLLLMSNTSLVDDCWLCLKLGPPTPLAIPNFLLSYVTRSSDNISCLIIPPLLVQPMQFSNSSCLFSPSYNSTEEIDLGHVAFSNCTSITNVTGPICAVNGSVFLCGNNMAYTYLPTNWTGLCVLATLLPDIDIIPGDEPVPIPAIDHFIYRPKRAIQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSNQLISDVQILSSTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYVNKSGIVRDKIKTLQEELERRRKDLASNPLWTGLQGLLPYLLPFLGPLLTLLLLLTIGPCIFNRLTAFINDKLNIIHAMVLTQQYQVLRTDEEAQD(SEQ ID NO:175)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，野生型BaEV的信号肽包含MGFTTKIIFLYNLVLVYA(SEQID NO:175的氨基酸(aa)1至aa 18)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型BaEV的胞外结构域包含SEQ ID NO:175的aa 1至aa 506，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型BaEV的跨膜区包含YLLPFLGPLLTLLLLLTIGPCIF(SEQ ID NO:175的aa 507至aa 529)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型BaEV的细胞质结构域包含NRLTAFINDKLNIIHAM(SEQ ID NO:175的aa 530至aa546)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型BaEV的细胞质结构域包含NRLTAFINDKLNIIHAMVLTQQYQVLRTDEEAQD(SEQ ID NO:175的aa530至aa 563)，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，在提及蛋白质时，RD114意指RD114逆转录病毒的包膜糖蛋白。此蛋白质的非限制性示例性序列可以参见基因库：CAA61093.1、CBI参考序列：YP_001497149.1或基因库：BAM17308.1，其中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，野生型RD114包含MKLPTGMVILCSLIIVRAGFDDPRKAIALVQKQHGKPCECSGGQVSEAPPNSIQQVTCPGKTAYLMTNQKWKCRVTPKISPSGGELQNCPCNTFQDSMHSSCYTEYRQCRRINKTYYTATLLKIRSGSLNEVQILQNPNQLLQSPCRGSINQPVCWSATAPIHISDGGGPLDTKRVWTVQKRLEQIHKAMTPELQYHPLALPKVRDDLSLDARTFDILNTTFRLLQMSNFSLAQDCWLCLKLGTPTPLAIPTPSLTYSLADSLANASCQIIPPLLVQPMQFSNSSCLSSPFINDTEQIDLGAVTFTNCTSVANVSSPLCALNGSVFLCGNNMAYTYLPQNWTRLCVQASLLPDIDINPGDEPVPIPAIDHYIHRPKRAVQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSHQLISDVQVLSGTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYANKSGIVRNKIRTLQEELQKRRESLATNPLWTGLQGFLPYLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVFSRLMAFINDRLNVVHAMVLAQQYQALKAEEEAQD(SEQ ID NO:176)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，野生型RD114的信号肽包含MKLPTGMVILCSLIIVRA(SEQ ID NO:176的氨基酸(aa)1至aa 18)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型RD114的胞外结构域包含SEQ ID NO:176的aa 1至aa 504，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型RD114的胞外结构域包含SEQ ID NO:176的aa 1至aa 507，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型RD114的跨膜区包含FLPYLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVF(SEQ ID NO:176的aa 505至aa 530)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型RD114的跨膜区包含YLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVF(SEQ ID NO:176的aa 508至aa 530)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型RD114的细胞质结构域包含SRLMAFINDRLNVVHAM(SEQ ID NO:176的aa 531至aa 547)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型RD114的细胞质结构域包含SRLMAFINDRLNVVHAMVLAQQYQALKAEEEAQD(SEQ ID NO:176的aa 531至aa 564)，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，在提及蛋白质时，GALV意指长臂猿白血病病毒包膜糖蛋白的包膜糖蛋白。此蛋白质的非限制性示例性序列可以参见UniProtKB-P21415(ENV_GALV)，其全部内容以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，野生型GALV包含MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLLSTIAGPLLLLLLLLILGPCIINKLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL(SEQ ID NO:183)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型GALV包含SEQ ID NO:183的aa 42至aa 685，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，GALV的信号肽野生型包含SEQ ID NO:183的aa 1至aa 41，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型GALV的胞外结构域包含SEQ ID NO:183的aa 1至aa 489或SEQ IDNO:183的aa 42至aa 489，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型GALV的跨膜区包括SEQ ID NO:183的aa 490至aa 670，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，野生型GALV的细胞质结构域包含SEQ ID NO:183的aa 671至aa685，或基本上由其组成或进一步由其组成。
如本文中所使用，感染复数(MOI)是指在感染期间添加至每一个细胞中的病毒颗粒数。
RetroNectin试剂是增强慢病毒及逆转录病毒调节的基因转导的效率的63kD重组人类纤连蛋白片段(也称为rFN-CH-296)。这对于造血细胞及其他难以转染的细胞类型尤其重要。转导增强被认为是源于病毒颗粒及靶细胞的共定位。这是通过使病毒颗粒直接结合至肝素结合结构域中的序列且使靶细胞整联蛋白与rFN-CH-296中的两个其他结构域相互作用来达成。RetroNectin可以高度有效地用于表达整联蛋白中的整联蛋白α4β1(VLA-4)和/或整联蛋白α5β1(VLA-5)的细胞。VLA-4表达细胞包含T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞、骨髓单核细胞细胞及淋巴样祖细胞。胸腺细胞、活化T细胞及肥大细胞表达VLA-5。
在基因转移是由慢病毒载体调节的方面中，载体构建体是指包含慢病毒基因组或其部分及治疗基因的多核苷酸。如本文中所使用，“慢病毒调节的基因转移”或“慢病毒转导”涵盖了相同含义，且是指通过进入细胞并将其基因组整合至宿主细胞基因组中的病毒将基因或核酸序列稳定转移至宿主细胞中的过程。病毒可以通过其正常感染机制进入宿主细胞或被修饰以便其结合至不同宿主细胞表面受体或配体以进入细胞。逆转录病毒携带RNA形式的其基因信息；然而，一旦病毒感染细胞，RNA就逆转录成DNA形式且整合至感染的细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式称为前病毒。如本文中所使用，慢病毒载体是指能够通过病毒或病毒样进入机制将外源核酸引入细胞中的病毒颗粒。“慢病毒载体”是本领域内众所周知的一类逆转录病毒载体，其在转导非分裂细胞方面与其他逆转录病毒载体相比具有某些优点。参见Trono D.(2002)Lentiviral vectors,New York:Spring-Verlag BerlinHeidelberg。
本发明的慢病毒载体是基于或衍生自致癌逆转录病毒(含有MLV的逆转录病毒的亚群)及慢病毒(含有HIV的逆转录病毒的亚群)。实例包含ASLV、SNV及RSV，它们都被分成用于慢病毒载体颗粒产生系统的包装组分及载体组分。本发明的慢病毒载体颗粒可以基于特定逆转录病毒的基因或其他(例如通过特定选择包装细胞系统)改变形式。
本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指与此名称有关且属于小病毒科(Parvoviridae)的依赖性小病毒属的病毒种类的成员。已知此病毒的多种血清型适用于基因递送；所有已知血清型皆可感染来自各种组织类型的细胞。至少11种依序编号的AAV血清型是本领域内已知的。可用于本文所公开的方法中的非限制性示例性血清型包含11种血清型中的任一个，例如AAV2、AAV8、AAV9或变异或合成血清型(例如AAV-DJ及AAV PHP.B)。AAV颗粒包括三种主要病毒蛋白：VP1、VP2及VP3、或基本上由其组成或进一步由其组成。在一个实施方案中，AAV是指血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV PHP.B或AAV rh74。这些载体可商购获得或已描述于专利或技术文献中。
本发明的载体颗粒是“基于”特定逆转录病毒意指，载体衍生自该特定逆转录病毒。载体颗粒的基因组包含来自该逆转录病毒的组分作为骨架。载体颗粒含有与RNA基因组相容的必需载体组分，包含逆转录及整合系统。通常，这些组分包含衍生自特定逆转录病毒的gag蛋白及pol蛋白。因此，载体颗粒的大部分结构组分通常衍生自该逆转录病毒，但其可以基因改变或以其他方式改变以提供所期望的有用的性质。然而，某些结构组分及尤其env蛋白可以源自不同病毒。可以通过使用载体颗粒产生系统中的不同env基因赋予载体颗粒不同特异性来改变所感染或转导的载体宿主范围及细胞类型。
如本文中所使用，细胞可以是原核或真核细胞。在其他实施方案中，细胞是免疫细胞。
如本文中所使用，“免疫细胞”包含例如可衍生自骨髓中所产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞，例如粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞)、单核细胞及淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞及NKT细胞))、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞及NKT细胞)及骨髓样衍生的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。在一些实施方案中，免疫细胞是衍生自下列各项中的一种或多种：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生的细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生的细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞。在一些实施方案中，HSC源自对象的脐带血、对象的外周血或对象的骨髓。
“宿主细胞”不仅是指特定对象的细胞，也指该细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响可能使后续各代发生某些改变，因此，该后代实际上可能与母细胞不同但却仍包含于本文所用术语的范围内。
“包装细胞”是指通过使用异源核苷酸序列稳定或瞬时转染或转导而具有包含病毒辅助构建体的核酸分子的宿主细胞，其中所述构建体能够提供包装功能的稳定或瞬时表达，例如复制和包壳所需的蛋白质，所述包装功能可以反式提供以生产病毒颗粒。病毒辅助体的功能的表达可以是组成型或诱导型，例如在辅助体的功能处于可诱导启动子的控制下时。
细胞的“富集群体”意指具有某些指定特性的实质上同源的细胞群体。细胞的指定特性的相同度大于70％、或大于75％、或大于80％、或大于85％、或大于90％、或大于95％、或大于98％。
术语“繁殖”意指细胞或细胞群体的生长。术语“生长”也指细胞在支持培养基、营养物、生长因子、支持细胞或获得期望数量的细胞或细胞类型所需的任何化学或生物化合物存在下的增殖。
术语“培养”是指细胞或生物体在各种培养基上或其中的体外繁殖。应当理解，培养生长的细胞的后代可能与亲代细胞不完全相同(即在形态上、在基因上或在表型上)。
未修饰细胞有时称为“源细胞”或“源干细胞”。细胞可为原核或真核细胞，且包含但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞及哺乳动物细胞(例如猫类、犬类、马类、鼠类、大鼠、猿类、牛类、猪类及人类的细胞)。
在一个实施方案中，“不成熟细胞”是指未拥有所期望(成熟)表型或基因型的细胞。例如，在一个实施方案中，成熟细胞是被代替的细胞。可以对不成熟细胞实施使细胞的表型或基因型变化、引发(变化)或改变成“成熟细胞”的技术，包含物理、生物或化学制作过程。“成熟细胞”是指拥有期望表型或基因型的细胞。
如本文中所使用，术语“NK细胞”(也称为自然杀伤细胞)是指源于骨髓中且在先天性免疫系统中发挥关键作用的一类淋巴细胞。NK细胞针对病毒感染细胞、肿瘤细胞或其他受应细胞提供快速免疫反应，甚至是在细胞表面上不存在抗体及主要组织兼容性复合物下。NK细胞可以从市售来源分离或获得。商业NK细胞系的非限制性实例包含细胞系NK-92(
Figure BDA0004112630850000341
CRL-2407TM)、NK-92MI(/>
Figure BDA0004112630850000342
CRL-2408TM)。其他实例包含但不限于NK细胞系HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90及YT。这些市售细胞系的非限制性示例性来源包含美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)或ATCC(www.atcc.org/)及德国微生物及细胞培养物保藏所(German Collection of Microorganisms and CellCultures)(www.dsmz.de/)。
如本文中所使用，细胞(例如NK细胞、NKT细胞、细胞毒性T细胞或γδT细胞)的功效包括细胞的细胞毒性(例如在杀死靶细胞方面)和/或细胞的细胞因子释放(例如IFN-γ，在本文中也称为IFNγ或IFN-伽马)。
天然抗原递呈细胞(APC)是指通过处理和递呈抗原以用于由某些淋巴细胞(例如T细胞、经典APC(包含树突状细胞)、巨噬细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)及B细胞)识别来调节细胞免疫反应的免疫细胞。如本文中所使用，人工抗原递呈细胞(aAPC)是这些APC的合成形式且通过将特定免疫细胞(例如T细胞和/或NK细胞)刺激信号附着至各种宏观及微观生物相容表面和/或细胞上来制得。这可以潜在地减小成本，且同时可控制生成大量用于疗法的功能性病原体特异性免疫细胞。
术语“干细胞”是指处于未分化或部分分化状态且能够自我更新和/或生成经分化后代的细胞。自我更新定义为干细胞能够增殖且产生更多这些干细胞，且同时维持其发育潜力(即全能、多潜能、多能等)。术语“体干细胞”在本文中用于指源自非胚胎组织(包含胎儿、幼年及成人组织)的任何干细胞。已从众多种成人组织(包含血液、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、胰脏、骨骼肌及心肌)分离出天然体干细胞。示例性天然体干细胞包含但不限于间质干细胞(MSC)及神经或神经元干细胞(NSC)。在一些实施方案中，干细胞祖细胞可以是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。如本文中所使用，“胚胎干细胞”是指衍生自形成于受精之后但在怀孕结束之前的组织的干细胞，该组织包含在怀孕期间(通常但未必在大约怀孕10-12周之前)的任何时间获取的胚胎前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织。最通常地，胚胎干细胞是源自早期胚胎或胚泡的多能细胞。胚胎干细胞可从适合的组织(包含但不限于人类组织)或从所确立的胚胎细胞系直接获得。“胚胎样干细胞”是指共有胚胎干细胞的一种或多种(但未必是所有)特性的细胞。
“分化”描述了非特殊细胞获得特殊细胞(例如心脏细胞、肝细胞或肌肉细胞)的特征的过程。“定向分化”是指操纵干细胞培养条件以诱导分化成特定细胞类型。“去分化”定义了恢复至细胞谱系内的较小定向性位置的细胞。如本文中所使用，术语“分化或经分化”定义呈现于细胞谱系内的较大定向性(“经分化”)位置上的细胞。如本文中所使用，“分化成中胚层(或外胚层或内胚层)谱系的细胞”定义分别隶属于特定中胚层、外胚层或内胚层谱系的细胞。分化成中胚层谱系或产生特定中胚层细胞的细胞的实例包含但不限于)脂肪原性细胞、平滑筋原性细胞、软骨原性细胞、心原性细胞、皮原性细胞、造血细胞、血管形成细胞、肌原性细胞、肾原性细胞、生殖器原性细胞、骨原性细胞、心包原性细胞或基质细胞。
如本文中所使用，术语“分化或经分化”定义了呈现于细胞谱系内的较大定向性(“经分化”)位置上的细胞。“去分化”定义了恢复至细胞谱系内的较小定向性位置的细胞。诱导性多能干细胞是去分化细胞的实例。
在一些实施方案中，衍生自第二细胞的第一细胞是指自第二细胞分化的第一细胞。另外或替代地，衍生自第二细胞的第一细胞是指自第二细胞工程化的第一细胞。
如本文中所使用，细胞的“谱系”定义了细胞的遗传性，亦即其前辈及后代。细胞谱系将细胞置于发育及分化的遗传方案内。
“多谱系干细胞”或“多能干细胞”是指繁殖本身及至少两种来自不同发育谱系的进一步分化的后代细胞的干细胞。这些谱系可来自相同胚层(即中胚层、外胚层或内胚层)或来自不同胚层。来自多谱系干细胞分化的具有不同发育谱系的两种后代细胞的实例是肌原性细胞及脂肪原性细胞(皆源自中胚层，但产生不同组织)。另一实例是神经原性细胞(外胚层来源)及脂肪原性细胞(中胚层来源)。
“前体”或“祖细胞”意指能够分化成特定类型的细胞的细胞。祖细胞可以是干细胞。祖细胞也可以比干细胞更具特异性。祖细胞可以是单能或多能的。与成熟干细胞相比，祖细胞可以处于细胞分化的后期中。祖细胞的实例包含但不限于祖神经细胞。
如本文中所使用，“多能细胞”定义了可产生至少两种不同(在基因型上和/或在表型上)的进一步分化的后代细胞的较小分化性细胞。在另一方面中，“多能细胞”包含诱导性多能干细胞(iPSC)，后者是来自非多能细胞(通常是成熟体细胞)的人工衍生性的干细胞，该非多能细胞在过去已通过诱导表达一种或多种干细胞特异性基因来产生。这些干细胞特异性基因包含但不限于八聚体转录因子家族，即Oct-3/4；Sox基因家族，即Sox1、Sox2、Sox3、Sox 15及Sox 18；Klf基因家族，即Klf1、Klf2、Klf4及Klf5；Myc基因家族，即c-myc及L-myc；Nanog基因家族，即OCT4、NANOG及REX1；或LIN28。iPSC的实例描述于以下文献中：Takahashi等人(2007)Cell advance online publication，2007年11月20日；Takahashi&Yamanaka(2006)Cell 126:663-76；Okita等人(2007)Nature 448:260-262；Yu等人(2007)Science advance online publication，2007年11月20日；及Nakagawa等人(2007)Nat.Biotechnol.Advance online publication，2007年11月30日。
“类胚胎体或EB”是在培养期间所形成促进后续分化的三维(3D)胚胎干细胞聚集体。在以悬浮培养方式生长时，EB细胞形成由内脏内胚层的外层环绕的小细胞聚集体。在生长及分化时，EB发育成充满液体的空腔及外胚层样细胞内层的囊状类胚胎体。
“诱导性多能细胞”意指自成熟细胞重新编程成不成熟表型的胚胎样细胞。本领域内已知各种方法，例如“Asimple new way to induce pluripotency:Acid.”Nature，2014年1月29日且可获得于sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445处，最后一次访问于2014年2月5日，及美国专利申请案公开文本第2010/0041054号。人类iPSC也表达干细胞标志物且能够生成所有三种胚层的特征性细胞。
“孤雌生殖干细胞”是指源自孤雌生殖卵活化的干细胞。产生孤雌生殖干细胞的方法是本领域内所已知的。例如参见Cibelli等人(2002)Science 295(5556):819及Vrana等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(增刊)11911-6。
如本文中所使用，术语“多能基因或标志物”意指与不成熟或未分化表型相关的表达的基因或蛋白质，例如Oct3/4、Sox2、Nanog、c-Myc及LIN-28。鉴别这些物质的方法是本领域已知的且用鉴别这些物质的系统可购自，例如EMD Millipore(
Figure BDA0004112630850000361
Map试剂盒)。
术语“表型”描述了可测量且仅表达于群体内的个体亚群中的个体特性或特性。在本发明的一方面中，个体表型包含单细胞、实质上同源的细胞群体、分化细胞群体或包括细胞群体的组织的表型。
在一些实施方案中，细胞群体意指一种以上在表型和/或基因型上相同(克隆)或不相同的细胞的集合体。群体可以是如本文所描述的纯化、高度纯化、实质上同源的或异源的。
术语有效时段(或时间)及有效条件是指使药剂或组合物达成其预期结果(例如将细胞分化或去分化成预定细胞类型)的所需或优选的时间段或其他可控条件(例如用于体外方法的温度、湿度)。
“实质上同源的”描述其中高于约50％、或高于约60％、或高于70％、或高于75％、或高于80％、或高于85％、或高于90％、或高于95％的细胞是相同或类似表型的细胞群体。可通过预选细胞表面标志物或其他标志物来测定表型。
如本文中所使用，术语“耗尽”是指实质上缺乏。例如，耗尽CD3+细胞的细胞群体是指包括小于约0.1％、小于约0.2％、小于约0.3％、小于约0.4％、小于约0.5％、小于约0.6％、小于约0.7％、小于约0.8％、小于约0.9％、小于约1.0％、小于约1.1％、小于约1.2％、小于约1.3％、小于约1.4％、小于约1.5％、小于约1.6％、小于约1.7％、小于约1.8％、小于约1.9％或小于约2.0％的CD3+细胞的细胞群体。
术语“可接受”、“有效”或“足以”在用于描述本文所公开的任何组分、范围、剂型等选择时意指该组分、范围、剂型等适用于本公开目的。
如本文中所使用，术语“治疗(treating、treatment)”等在本文中用于意指获得期望的药理学和/或生理学效应。在一些实施方案中，在完全或部分预防疾病或其症状方面，效果可以是预防性的，和/或可以在部分或完全治愈病症和/或归因于病症的副作用方面是治疗性的。“治疗”的实例包括但不限于：预防病症发生于有倾向患病症但尚未诊断为患有该病症的对象中；抑制病症，即阻止其发生；和/或减轻或改善病症症状。在一方面中，治疗是阻止发生疾病或病症(例如癌症)的症状。在一些实施方案中，其是指(1)在有倾向患疾病或尚未显示其症状的对象中预防症状或疾病发生；(2)抑制疾病或阻止其发生；或(3)改善疾病或疾病症状或使其消退。如本领域内所理解，“治疗”是获得有益或期望结果(包含临床结果)的方式。出于本发明技术的目的，有益或期望结果可以包含以下各项中的一种或多种，但不限于此：缓解或改善一种或多种症状、减弱病状(包含疾病)的程度、稳定(即不恶化)病状(包含疾病)的状态、延迟或减缓病状(包含疾病)的进展、改善或缓解病状(包含疾病)状态及缓解(不论部分或完全)，不论这些结果可检测或不可检测。在疾病是癌症时，下列临床终点是治疗的非限制性实例：肿瘤负荷减小、肿瘤生长减缓、整体存活期较长、肿瘤进展时间较长、转移抑制或肿瘤转移减少。在一方面中，治疗不包含预防。在一方面中，治疗不包含预防。
如本文中所使用，治疗性蛋白或多肽是指适用于治疗的蛋白质和/或多肽，包含但不限于抗体或其片段、酶、配体或受体。该治疗性蛋白或多肽可由医生或本领域技术人员基于待治疗的疾病来进行选择。例如，为了治疗癌症，可使用免疫检查点受体或其配体的抗体，例如抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体。
在一个实施方案中，本文所用的术语“疾病”或“病症”是指癌症、经诊断患有癌症的状态、怀疑患有癌症的状态或处于患有癌症的高风险下的状态。
如本文中所使用，“癌症”是特征在于在对象中存在显示异常地不受控制地复制的细胞的疾病状态，且在一些方面该术语可与术语“肿瘤”互换使用。术语“癌症或肿瘤抗原”是指已知与癌细胞或肿瘤细胞或组织相关且表达于其表面上的抗原，且术语“癌症或肿瘤靶向抗体”是指靶向该抗原的抗体。
“实体肿瘤”是通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。实体肿瘤可以是良性或恶性、转移性或非转移性。不同类型的实体肿瘤是针对形成其的细胞类型来命名。实体肿瘤的实例包含肉瘤、癌及淋巴瘤。
“组合物”意指活性剂和另一惰性(例如可检测试剂或标记)或活性化合物或成分(例如佐剂、稀释剂、黏合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等)的组合，且包含药学上可接受的载体。
载体也包含以下药用赋形剂及添加剂：蛋白质、肽、氨基酸、脂质及碳水化合物(例如糖，包含单糖、二糖、三糖、四糖及寡糖；衍生糖，例如醛糖醇、醛糖酸、酯化糖等；及多糖或糖聚合物)，其可单独或组合存在且单独或组合地占以重量或体积计的1-99.99％。示例性蛋白质赋形剂包含血清白蛋白(例如人类血清白蛋白(HSA))、重组人类白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可发挥缓冲能力功能的代表性氨基酸/抗体组分包含丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天(门)冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、阿斯巴甜(aspartame)等。碳水化合物赋形剂也旨在属于此技术的范围内，其实例包含但不限于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；及醛糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)及肌醇。
“药学上的组合物”旨在包含活性多肽、多核苷酸或抗体与惰性或活性载体(例如固体载体)的组合，该载体使得该组合物适用于体外、体内或离体的诊断或治疗性应用。
如本文中所使用，术语“药学上可接受的载体”涵盖任何一种标准药学载体，例如磷酸盐缓冲的盐水溶液、水及乳液(例如油/水或水/油型乳液)及各种类型的润湿剂。组合物也可包含稳定剂及防腐剂。关于载体、稳定剂及佐剂的实例，参见Martin(1975)Remington’s Pharm.Sci.，第15版(Mack Publ.Co.,Easton)。术语药学上可接受的载体(或介质)(其可与术语生物相容性载体或介质互换使用)是指如下试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型：其不仅与待治疗性施用的细胞及其他药剂相容，且也在合理医学判断范围内以合理地益处/风险比率适用于与人类及动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏性反应或其他并发症。适用于本发明中的药学上可接受的载体包含液体、半固体(例如凝胶)及固体材料(例如细胞支架及基质、管状体、片材及如本领域内已知且更详细描述于本文中的其他此类材料)。这些半固体及固体材料可以被设计以防止降解在身体内(非生物可降解)或其可以被设计成降解在身体内(生物可降解、生物可蚀)。生物可降解材料可以进一步为生物可再吸收或生物可吸收的，即，其可溶解及吸收至体液(实例是水溶性植入体)，或在身体中降解且最终消除(通过转化成其他材料或通过天然路径分解且消除)。
“药学上可接受的载体”是指可用于本文所公开的组合物中的任何稀释剂、赋形剂或载剂。药学上可接受的载体包含离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人类血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶状二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯啶酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇及羊毛脂。适合的药学载体描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company中，该文献是此领域中的标准参考文献。其可根据预期施用形式(即口服锭剂、胶囊、酏剂、糖浆等)进行选择，且应与常用药学实践一致。
用于本发明的组合物可以包装成剂量单位形式以便于施用且达成剂量均匀性。术语“单位剂量”或“剂型”是指适用于对象中的物理离散单位，每一个单位含有预定量的组合物，该预定量被计算以产生与施用(即适当的途径及方案)有关的期望反应。待施用的量根据治疗数量及单位剂量取决于期望的结果和/或保护。组合物的精确量也取决于从业人员的判断且对于每一个个体而言是独特的。影响剂量的因素包含对象的身体及临床状态、施用途径、预期治疗目标(缓解症状对比治愈)以及特定组合物的功效、稳定性及毒性。在调配后，以与剂量配方相容的方式且以治疗或防治有效量来施用溶液。配方易于以各种剂型来施用，例如本文所描述的可注射溶液的类型。
如本文中所使用，术语“接触”意指两种或更多种分子之间的直接或间接结合或相互作用。直接相互作用的特定实例是结合。间接相互作用的特定实例是其中一种实体作用于中间分子且该中间分子继而作用于第二种所提及的实体。本文所用的接触包含于溶液中、固相中、体外、离体、细胞中及体内。体内接触可称为施用或给药。
细胞或载体或其他药剂及含有其的组合物的“施用/给药”或“递送”能够以一个剂量连续或间歇性地实施于整个治疗过程中。测定最有效施用方式及剂量的方法是本领域技术人员所已知的，并将伴随用于疗法的组合物、疗法目的、所治疗靶细胞及所治疗对象而变化。可以使用由治疗医生或(在动物情形下)由治疗兽医选择的剂量值及模式来实施单一或多个施用。适合的剂量配方及药剂施用方法是本领域内已知的。也可以确定施用途径，且确定最有效的施用途径的方法为本领域技术人员已知的并将伴随用于治疗的组合物、治疗目的、所治疗对象的健康状况或疾病阶段及靶细胞或组织而变化。施用途径的非限制性实例包含口服施用、腹膜腔内施用、输注、鼻腔施用、吸入、注射和局部应用。
术语施用应包含但不限于通过口服、肠外(例如肌肉内、腹膜腔内、静脉内、脑室内(ICV)、鞘内、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)、通过鼻吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道(例如尿道栓剂)来施用，或者外用(topical)施用途径(例如凝胶、软膏、乳霜、气溶胶等)，且可单独或一起调配成含有适用于每一种施用途径的药学上可接受的常用的无毒载剂、佐剂、赋形剂及媒介的适宜剂量单位配方。本发明不受施用途径、配方或给药时间表的限制。
“施用”能够以一个剂量连续或间歇性地实施于整个治疗过程中。测定最有效施用方式及剂量的方法是本领域技术人员已知的，且将伴随用于疗法的组合物、疗法目的、所治疗靶细胞及所治疗个体而变化。可使用由治疗医生选择的剂量值及模式来实施单一或多个施用。适合的剂量配方及药剂施用方法是本领域内已知的。也可以确定施用途径，且确定最有效施用途径的方法是本领域技术人员已知的并将伴随用于治疗的组合物、治疗目的、所治疗对象的健康状况或疾病阶段及靶细胞或组织而变化。
可通过任何适合的施用途径将本发明药剂施用于疗法中。也应该了解，最优选的途径将随接受者的状况及年龄以及所治疗疾病而变化。
“对象”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，且是指脊椎动物、优选地哺乳动物、更优选地人类。哺乳动物包含但不限于鼠类、大鼠、兔、猿类、牛类、羊类、猪类、犬类、猫类、农场动物、运动动物、宠物、马类及灵长类动物、尤其人类。除可用于人类治疗外，本发明也可用于伴侣哺乳动物、境外动物及家养动物(包含哺乳动物、啮齿类动物)的兽医学治疗。在一个实施方案中，哺乳动物包含马、狗和猫。在本发明的另一个实施方案中，人类是胎儿、婴儿、青春期前对象、青少年、儿科患者或成人。在一方面中，对象是症状前哺乳动物或人类。在另一方面中，对象具有最少的临床疾病症状。对象可为男性或女性、成人、婴儿或儿科对象。在另一方面中，对象是成人。在一些情况下，成人是成年的人类，例如年龄大于18岁的成年人类。
与术语“治疗”相关的术语“患有”是指被诊断患有或有倾向患癌症综合征或病毒感染的患者或个体。也可称患者为“处于患有疾病的风险下”，这是因为他们携载一种或多种基因突变。该类患者尚未发生特征性疾病病况。
“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。有效量能够以一次或多次施用、应用或剂量来施用。该递送取决于诸多变量，包含待使用个体剂量单位的时间段、治疗剂的生物可用性、施用途径等。然而，应当理解，本发明治疗剂用于任何特定对象的具体剂量值取决于各种因素，包含所采用具体化合物的活性、对象的年龄、体重、一般健康状况、性别及饮食、施用时间、排泄速率、药物组合及所治疗特定病症的严重程度以及施用形式。通常可逐步增加治疗剂量以优化安全性及功效。通常，来自体外和/或体内测试的剂量-效应关系首先可以针对用于患者施用的适当剂量提供有用的指导。一般而言，化合物的期望施用量可以有效达到与体外有效浓度相当的血清含量。这些参数的测定在本领域内已众所周知。这些考虑以及有效配方和施用程序在本领域内已众所周知且描述于标准教科书中。
药物或药剂的“治疗有效量”是指药物或药剂足以获得药理学反应(例如被动免疫性)的量；或是药物或药剂在施用于患有指定病症或疾病的患者时足以具有预期效应(例如治疗、缓解、改善、缓解或消除患者中的指定病症或疾病的一种或多种表现)的量。治疗效果不一定通过施用一个剂量就出现，可以仅在施用一系列剂量后出现。因此，治疗有效量可以一次或多次施用来施用。
本文所用的“单独疗法”包含但不限于手术切除术、化学疗法、冷冻疗法、辐射疗法、免疫疗法及靶向疗法。用于减少细胞增殖的药剂是本领域内已知的且已广泛使用。仅在分裂时杀死癌细胞的化学疗法药物称为细胞周期特异性。这些药物包含作用于S期的药剂，包含拓扑异构酶抑制剂及抗代谢物。
拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(拓扑异构酶I及II)的作用的药物。在化学治疗的过程期间，拓扑异构酶控制复制所需的DNA结构的操纵，因此是细胞周期特异性的。拓扑异构酶I抑制剂的实例包含上文所列示的喜树碱(camptothecan)类似物、伊立替康(irinotecan)及托泊替康(topotecan)。拓扑异构酶II抑制剂的实例包含安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)及替尼泊苷(teniposide)。
抗代谢物通常是通常干扰染色体复制所涉及过程的正常代谢受质的类似物。其在周期中于极其特定的时期攻击细胞。抗代谢物包含叶酸拮抗剂，例如胺甲喋呤(methotrexate)；嘧啶拮抗剂，例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷(foxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、卡培他滨(capecitabine)及吉西他滨(gemcitabine)；嘌呤拮抗剂，例如6-巯基嘌呤及6-硫基鸟嘌呤；腺苷脱胺酶抑制剂，例如克拉屈滨(cladribine)、氟达拉滨(fludarabine)、奈拉滨(nelarabine)及喷司他汀(pentostatin)；等。
植物碱是源自某些类型的植物。长春花生物碱是从长春花属植物(长春花(Catharanthus rosea))制得。紫杉烷(taxane)是自太平洋紫杉树(Pacific Yew tree)(紫杉)的树皮制得。长春花生物碱及紫杉烷也称为抗微管剂。鬼臼毒素(podophyllotoxin)是衍生自鬼臼(May apple)植物。喜树碱类似物是衍生自亚洲“快乐树”(喜树(Camptothecaacuminata))。鬼臼毒素及喜树碱类似物也归类为拓扑异构酶抑制剂。植物碱通常是细胞周期特异性的。
这些药剂的实例包含长春花生物碱，例如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)及长春瑞滨(vinorelbine)；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西他赛(docetaxel)；鬼臼毒素，例如依托泊苷及替尼泊苷；及喜树碱类似物，例如伊立替康及托泊替康。
冷冻疗法包含但不限于涉及降低温度的疗法，例如低体温疗法。
辐射疗法包含但不限于如本领域内所已知的暴露于辐射(例如离子化辐射、UV辐射)。示例性剂量包含但不限于在至少约2Gy至不超过约10Gy范围内的离子化辐射剂量和/或在至少约5J/m2至不超过约50J/m2范围内，通常为约10J/m2的紫外辐射剂量。
词语“一线”或“二线”或“三线”是指患者所接受治疗的顺序。一线疗法方案是首先给予的治疗，而二线或三线疗法分别是在一线疗法之后或在二线疗法之后给予。美国国家癌症研究院(National Cancer Institute)将一线疗法定义为疾病或病症的“第一治疗”。在癌症患者中，主要治疗可为手术、化学疗法、辐射疗法或这些疗法的组合。一线疗法也被本领域技术人员称为“主要疗法及主要治疗”。参见美国国家癌症研究院网站www.cancer.gov(最后访问于2008年5月1日)。通常，因为患者没有展示出对一线治疗的积极临床或亚临床反应，或者一线治疗已经停止，随后患者会接受化疗方案。
实施本发明的方式
观察到如本文所公开的组合物和/或方法的一些优点且示例于附图以及实验方法中。这些优点包含但不限于基因向免疫细胞(例如NK细胞)的有效递送、递送基因的稳定性、细胞的成功扩增及转导的细胞的高生存率，由此促进且改进了转导的免疫细胞(例如表达CAR的免疫细胞)的研发及制造。
在一些实施方案中，由如本文所公开方法制得的细胞群体中的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞表达CAR和/或另一种治疗性蛋白或多肽。可以使用各种方法来评价该表达，例如荧光活化细胞分选(FACS)或另一种利用特异性识别及结合CAR和/或治疗性蛋白或多肽的抗体或其抗原结合片段的免疫染色方法。
在一些实施方案中，由如本文所公开方法制得的细胞群体例如在细胞培养物中表达CAR和/或另一种治疗性蛋白或多肽至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天、至少约1个月、至少约40天、至少约50天、至少约60天、至少约70天、至少约80天、至少约90天、至少约100天、至少约120天、至少约150天、至少约180天或更久。在一些实施方案中，由如本文所公开方法制得的细胞群体中的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞例如在细胞培养物中表达CAR和/或另一种治疗性蛋白或多肽至少约3天、至少约5天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天、至少约1个月、至少约40天、至少约50天、至少约60天、至少约70天、至少约80天、至少约90天、至少约100天、至少约120天、至少约150天、至少约180天或更久。
在一些实施方案中，如本文所公开的方法生成多于1×109个细胞、多于2×109个细胞、多于3×109个细胞、多于4×109个细胞、多于5×109个细胞、多于6×109个细胞、多于7×109个细胞、多于8×109个细胞、多于9×109个细胞、多于1×1010个细胞、多于2×1010个细胞、多于3×1010个细胞、多于4×1010个细胞、多于5×1010个细胞、多于6×1010个细胞、多于7×1010个细胞、多于8×1010个细胞、多于9×1010个细胞、多于1×1011个细胞、多于2×1011个细胞、多于3×1011个细胞、多于4×1011个细胞、多于5×1011个细胞、多于6×1011个细胞、多于7×1011个细胞、多于8×1011个细胞、多于9×1011个细胞、多于1×1012个细胞、多于2×1012个细胞、多于3×1012个细胞、多于4×1012个细胞、多于5×1012个细胞、多于6×1012个细胞、多于7×1012个细胞、多于8×1012个细胞、多于9×1012个细胞或多于1×1013个细胞、1×108个细胞或其当量。另外或替代地，如本文所公开的方法生成最多5×1010个细胞、最多6×1010个细胞、最多7×1010个细胞、最多8×1010个细胞、最多9×1010个细胞、最多1×1011个细胞、最多2×1011个细胞、最多3×1011个细胞、最多4×1011个细胞、最多5×1011个细胞、最多6×1011个细胞、最多7×1011个细胞、最多8×1011个细胞、最多9×1011个细胞、最多1×1012个细胞、最多2×1012个细胞、最多3×1012个细胞、最多4×1012个细胞、最多5×1012个细胞、最多6×1012个细胞、最多7×1012个细胞、最多8×1012个细胞、最多9×1012个细胞或最多1×1013个细胞、1×108个细胞或其等效物。在一些实施方案中，如本文所公开的方法生成约5×1010个细胞、约6×1010个细胞、约7×1010个细胞、约8×1010个细胞、约9×1010个细胞、约1×1011个细胞、约2×1011个细胞、约3×1011个细胞、约4×1011个细胞、约5×1011个细胞或约6×1011个细胞、1×108个细胞或其等效物。可由本领域技术人员通过将所生成的细胞数及初始细胞数除以或乘以相同正数来计算该等效物。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞群体的生存率可为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。可利用测试细胞生存率的多种方法，例如MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)分析或APT测量分析。
假型γ逆转录病毒颗粒
在一方面中，提供假型γ逆转录病毒颗粒。在一些实施方案中，γ逆转录病毒颗粒包含修饰的RD114猫类内源性逆转录病毒包膜糖蛋白(RD114TR)，或基本上由其组成或进一步由其组成。另外或替代地，γ逆转录病毒颗粒包括修饰的狒狒包膜糖蛋白(BaEVTR)，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，RD114TR糖蛋白包含RD114糖蛋白的胞外结构域及跨膜结构域和双嗜性鼠类白血病病毒(MLV-A)糖蛋白的细胞质结构域，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，BaEVTR糖蛋白包含狒狒包膜糖蛋白(BaEV)的胞外结构域及跨膜结构域及MLV-A糖蛋白的细胞质结构域，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，将RD114TR及BaEVTR作为膜蛋白并入颗粒包膜中。
在一些实施方案中，如本文所公开的假型γ逆转录病毒颗粒进一步包含封装于包膜中的载体基因组。在其他实施方案中，载体基因组包含侧接有两个长末端重复(LTR)的下列中的一种或多种，或基本上由其组成或进一步由其组成：(A)编码嵌合抗原受体(CAR)和/或另一种治疗性蛋白或多肽的多核苷酸；(B)(A)的反向互补序列；或(C)包含一个或多个识别位点的多核苷酸。在一些实施方案中，治疗性蛋白或多肽是选自抗体或其片段、酶、配体或受体。在一些实施方案中，识别位点由适用于将感兴趣的序列(例如(A)及(B)中的任一个或两个)插入多核苷酸中的限制酶的识别及切割。
在一些实施方案中，载体基因组进一步包含下列各项中的一种或多种：5’LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’LTR。
在一些实施方案中，如本文所公开的假型γ逆转录病毒颗粒进一步包含逆转录酶或整合酶中的任一个或两个。
在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒是基于或源自或是选自下列物种中的任一个：莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)或猫类白血病病毒。
人工抗原递呈细胞(aAPC)
在另一方面中，本文提供人工抗原递呈细胞(aAPC)。在一些实施方案中，aAPC表达如本文所公开的一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原或二者。在其他实施方案中，aAPC表达下列各项中的一种或多种：4-1BBL、膜结合(mb)IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25结合的mb IL-2突变体、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的mb IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)或调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物。在一个实施方案中，aAPC进一步表达mb IL-21及4-1BBL。在一些实施方案中，如本文所公开的aAPC表达活化和/或刺激免疫细胞(例如NK细胞或γδT细胞)的生长的肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原。
在一些实施方案中，aAPC是工程化K562细胞。
在一些实施方案中，aAPC缺乏细胞增殖和/或缺乏长期存活。可以由本领域技术人员例如通过培养活细胞并计数来评估细胞增殖及长期存活。在一些实施方案中，如本文所公开的aAPC并不实质上存活超过约5天、约7天、约10天、约14天、约15天、约21天或约30天。
在一些实施方案中，辐照aAPC以抑制细胞增殖和/或减少长期存活。在其他实施方案中，在50Gy或更高、60Gy或更高、70Gy或更高、75Gy或更高、80Gy或更高、90Gy或更高、100Gy或更高、110Gy或更高、120Gy或更高、130Gy或更高、140Gy或更高、150Gy或更高、160Gy或更高、170Gy或更高、180Gy或更高、190Gy或更高、200Gy或更高、210Gy或更高、220Gy或更高、230Gy或更高、240Gy或更高、250Gy或更高和/或300Gy或更高下辐照aAPC。另外或替代地，在1000Gy或更低、900Gy或更低、800Gy或更低、700Gy或更低、600Gy或更低、500Gy或更低、400Gy或更低、350Gy或更低、300Gy或更低、250Gy或更低、240Gy或更低、230Gy或更低、220Gy或更低、210Gy或更低、200Gy或更低、190Gy或更低、180Gy或更低、170Gy或更低、160Gy或更低、150Gy或更低、140Gy或更低、130Gy或更低、120Gy或更低、110Gy或更低、100Gy或更低、90Gy或更低、80Gy或更低、70Gy或更低或60Gy或更低下辐照aAPC。在一些实施方案中，在约50Gy至约300Gy(包含(但不限于)约50Gy至约100Gy、约50Gy至约150Gy、约50Gy至约200Gy、约50Gy至约250Gy、约100Gy至约150Gy、约100Gy至约200Gy、约100Gy至约150Gy、约150Gy至约200Gy、约150Gy至约250Gy、约200Gy至约250Gy)下辐照aAPC。在其他实施方案中，在约50Gy、约100Gy、约150Gy或约200Gy下辐照aAPC。在一些实施方案中，在一起培养aAPC与免疫细胞(例如NK细胞、NKT细胞和/或γδT细胞中的一种或多种)或其细胞群体之前实施辐照。
NK感染及扩增
在另一方面中，提供制备自然杀伤(NK)细胞的群体的方法。该方法包括将包括下列各项中的一种或多种的细胞群体与免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)一起培养，或基本上由其组成或进一步由其组成：NK细胞、能够衍生NK细胞的祖细胞或能够衍生NK细胞的干细胞。在一些实施方案中，该细胞群体在细胞群体中耗尽表达CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR中的一种或多种的细胞。
在与本文的任何公开内容相关的一些实施方案中，一种或多种免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)是选自下列各项中的一种或多种：人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原；一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别且结合NK细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖NK细胞；一种或多种因此活化或增殖NK细胞的细胞因子；和/或一种或多种因此活化或增殖NK细胞的化学部分，其任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)。
在一些实施方案中，刺激受体是下列各项中的一种或多种：CD2、NKp46、CD16、NKG2D、DNAM-1(CD226)、2B4(自然杀伤细胞受体2B4、CD244)、NTB-A(SLAM家族成员6，SLAMF6)和/或NKp46。例如参见Zamai L,Del Zotto G,Buccella F等人。Understandingthe Synergy of NKp46 and Co活化性Signals in Various NK Cell Subpopulations:Paving the Way for More Successful NK-Cell-Based Immunotherapy.Cells.2020；9(3):753.公开于2020Mar19.doi:10.3390/cells9030753。
在一些实施方案中，aAPC是如本文所公开的aAPC。在一些实施方案中，将aAPC与细胞群体以以下细胞数比(aAPC的细胞数:细胞群体的细胞数和/或aAPC的细胞数:细胞群体中免疫细胞(例如NK细胞、NKT细胞和/或γδT细胞中的一种或多种)的细胞数)一起培养：约100:1或更大、约50:1或更大、约20:1或更大、约10:1或更大、约9:1或更大、约9:1或更大、约8:1或更大、约7:1或更大、约6:1或更大、约5:1或更大、约4:1或更大、约3:1或更大、约2:1或更大、约1:1或更大、约1:2或更大、约1:3或更大、约1:4或更大、约1:5或更大、约1:6或更大、约1:7或更大、约1:8或更大、约1:9或更大、约1:10或更大、约1:20或更大、约1:50或更大或约1:100或更大。另外或替代地，将aAPC与细胞群体以以下细胞数比(aAPC的细胞数:细胞群体的细胞数和/或aAPC的细胞数:细胞群体中免疫细胞(例如NK细胞、NKT细胞和/或γδT细胞中的一种或多种)的细胞数)一起培养：约100:1或更小、约50:1或更小、约20:1或更小、约10:1或更小、约9:1或更小、约9:1或更小、约8:1或更小、约7:1或更小、约6:1或更小、约5:1或更小、约4:1或更小、约3:1或更小、约2:1或更小、约1:1或更小、约1:2或更小、约1:3或更小、约1:4或更小、约1:5或更小、约1:6或更小、约1:7或更小、约1:8或更小、约1:9或更小、约1:10或更小、约1:20或更小、约1:50或更小或约1:100或更小。在一些实施方案中，将aAPC与细胞群体以约10:1至约1:10、约5:1至约1:5、约3:1至约1:3、约2:1至约1:2的细胞数比(aAPC的细胞数:细胞群体的细胞数和/或aAPC的细胞数:细胞群体中免疫细胞(例如NK细胞、NKT细胞和/或γδT细胞中的一种或多种)的细胞数)一起培养。在一些实施方案中，将aAPC与细胞群体以约10:1、约5:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:5或约1:10的细胞数比(aAPC的细胞数:细胞群体的细胞数和/或aAPC的细胞数:细胞群体中免疫细胞(例如NK细胞、NKT细胞和/或γδT细胞中的一种或多种)的细胞数)一起培养。
在一些实施方案中，细胞因子是选自由以下组成的组：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、缺乏CD25结合的IL-2突变体、IL-7、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803可溶性)、IL-15、IL-18、IL-21、LEC、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)或MICA。
在一些实施方案中，细胞因子包括IL-2，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，将细胞群体与约1IU/mL至约1000IU/ml的IL2一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与约1IU/mL或更多、约2IU/mL或更多、约3IU/mL或更多、约5IU/mL或更多、约10IU/mL或更多、约20IU/mL或更多、约30IU/mL或更多、约40IU/mL或更多、约50IU/mL或更多、约60IU/mL或更多、约70IU/mL或更多、约80IU/mL或更多、约90IU/mL或更多、约100IU/mL或更多、约110IU/mL或更多、约120IU/mL或更多、约130IU/mL或更多、约140IU/mL或更多、约150IU/mL或更多、约160IU/mL或更多、约170IU/mL或更多、约180IU/mL或更多、约190IU/mL或更多、约200IU/mL或更多、约250IU/mL或更多、约300IU/mL或更多、约400IU/mL或更多、约500IU/mL或更多、约600IU/mL或更多、约700IU/mL或更多、约800IU/mL或更多、约900IU/mL或更多或约1000IU/mL或更多的IL2一起培养。另外或替代地，将细胞群体与约2000IU/mL或更少、约1500IU/mL或更少、约1000IU/mL或更少、约900IU/mL或更少、约800IU/mL或更少、约700IU/mL或更少、约600IU/mL或更少、约500IU/mL或更少、约400IU/mL或更少、约300IU/mL或更少、约250IU/mL或更少、约200IU/mL或更少、约100IU/mL或更少、约90IU/mL或更少、约80IU/mL或更少、约70IU/mL或更少、约60IU/mL或更少、约50IU/mL或更少、约40IU/mL或更少、约30IU/mL或更少、约20IU/mL或更少、约10IU/mL或更少、约5IU/mL或更少的IL2一起培养。在一些实施方案中，细胞因子包括IL-2。在其他实施方案中，将细胞群体与约1IU/mL至约1000IU/ml(包括但不限于约10IU/ml至约100IU/ml、约100IU/ml至200IU/ml、约200IU/ml至约300IU/ml、约300IU/ml至约400IU/ml、约400至约500IU/ml、约100IU/ml至约500IU/mlIL2)的IL2一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与约10IU/mL、约20IU/mL、约30IU/mL、约40IU/mL、约50IU/mL、约60IU/mL、约70IU/mL、约80IU/mL、约90IU/mL、约100IU/mL、约110IU/mL、约120IU/mL、约130IU/mL、约140IU/mL、约150IU/mL、约160IU/mL、约170IU/mL、约180IU/mL、约190IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约400IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL或约1000IU/mL的IL2一起培养。
在一些实施方案中，细胞因子包含IL-15，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，将细胞群体与约0.1ng/mL至约500ng/mL的IL15(包含落入其中的任何范围和/或数值)一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与约1ng/mL至约100ng/ml(包含但不限于约1ng/ml至约10ng/ml、约10ng/ml至约20ng/ml、约20ng/ml至约30ng/ml、约30ng/ml至约40ng/ml、约40ng/ml至约50ng/ml IL 15)的IL15一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与约1ng/mL、约5ng/ml、约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml或约100ng/ml的IL15一起培养。
在一些实施方案中，细胞因子包含IL-21，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，将细胞群体与约0.1ng/mL至约500ng/mL的IL21(包含落入其中的任何范围和/或数值)一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与约1ng/mL至约100ng/ml(包含但不限于约1ng/ml至约10ng/ml、约10ng/ml至约20ng/ml、约20ng/ml至约30ng/ml、约30ng/ml至约40ng/ml、约40ng/ml至约50ng/ml IL21)的IL21一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与约1ng/mL、约5ng/ml、约10ng/ml、约15ng/ml、约20ng/ml、约25ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约40ng/ml、约45ng/ml、约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml或约100ng/ml的IL 21一起培养。
在一些实施方案中，将细胞群体与一种以上的细胞因子(例如如本文所公开的细胞因子的组合)一起培养。在一些实施方案中，将细胞群体与100-500IU/ml IL-2、20ng/mlIL-15或25ng/mL IL-21中的任一项或任两项或所有三项一起培养。在其他实施方案中，将细胞群体与50IU/ml IL-2及0.5ng/ml IL-15中的任一项或两项一起培养。
在一些实施方案中，也可以使用化学部分作为免疫细胞活化剂(例如NK活化剂)，例如，已证实使用ADAM17抑制剂进行处理能够通过防止CD16受体脱落来增大NK细胞ADCC，且使用烟酰胺处理NK细胞会增强其L-选择素(已知其对于细胞输送而言是必需的)表达。例如参见Peled等人，Blood(2017)130(增刊1):657及Childs RW,Carlsten M.Nat Rev DrugDiscov.2015；14(7):487-498。其他实例是mTOR抑制剂、PI3K抑制剂和/或STING活化环状二核苷酸(CDN)。
在一些实施方案中，如本文所公开的方法进一步包含将编码CAR和/或另一种治疗性蛋白或多肽的多核苷酸引入培养的细胞群体中以用于表达。在一些实施方案中，CAR特异性识别且结合肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原。在其他实施方案中，由CAR识别及结合的肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原由aAPC表达。在一些实施方案中，治疗性蛋白或多肽是选自抗体或其片段、酶、配体或受体。
在一些实施方案中，如本文所公开的方法进一步包含在引入步骤之前和/或之后将细胞群体与免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)一起培养。在其他实施方案中，使用相同或不同的免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)或其组合重复培养步骤一次、两次、三次或更多次。
在一些实施方案中，在引入步骤之前及之后将活化剂与细胞群体一起培养。在其他实施方案中，在引入步骤之前及之后与细胞群体一起培养的两种活化剂是相同的。在一些实施方案中，在引入步骤之前及之后与细胞群体一起培养的两种活化剂彼此不同。
方法的一些实施方案包含将假型γ逆转录病毒颗粒引入培养的细胞群体中，由此将编码CAR和/或如本文所公开的另一种治疗性蛋白或多肽的多核苷酸引入培养的细胞群体中。在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒在本文中公开。在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒包含编码CAR和/或如本文所公开的另一种治疗性蛋白或多肽的多核苷酸和/或其反向互补序列。在其他实施方案中，编码多核苷酸和/或其反向互补序列侧接有两个长末端重复(LTR)。另外或替代地，假型γ逆转录病毒颗粒包含如本文所公开的RD114TR和/或BaEVTR。在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒包含载体基因组，该载体基因组包含5’LTR、5’帽、编码多核苷酸或其反向互补序列、3’聚-A尾部及3’LTR，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，如本文所公开的组分位于载体基因组中的5’至3’。在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒进一步包含逆转录酶及整合酶中的任一项或两项。在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒是基于和/或源自和/或是选自以下任何物种：莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)及猫类白血病病毒。
在一些实施方案中，以约0.01至约100(包含落入其中的任何范围和/或数值)的感染复数(MOI)将假型γ逆转录病毒颗粒引入培养的细胞群体中。在一些实施方案中，将以约0.1至约10、约0.2至约5、约1至约10或约1至约5的MOI将假型γ逆转录病毒颗粒引入培养的细胞群体中。在一些实施方案中，以约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的MOI将假型γ逆转录病毒颗粒引入培养的细胞群体中。
在一些实施方案中，在引入步骤之前将细胞群体培养至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天或至少约10天。另外或替代地，在引入步骤之前将细胞群体培养不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过15天、不超过3周或不超过1个月。在一些实施方案中，在引入步骤之前将细胞群体培养约1天至约180天(包含落入其中的任何范围和/或数值)。在一些实施方案中，在引入步骤之前将细胞群体培养约5天至约10天，例如约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。
在一些实施方案中，通过在RetroNectin存在下转导包含编码多核苷酸或其反向互补序列的病毒载体将编码多核苷酸引入细胞群体中。在一些实施方案中，将RetroNectin涂覆于转导细胞群体的容器的内表面上。在其他实施方案中，容器是适用于培养细胞的袋子。在其他实施方案中，容器是适用于培养细胞的板。在另一个实施方案中，容器是适用于培养细胞的烧瓶。在一些实施方案中，细胞群体表达整联蛋白α4β1(VLA-4)及整联蛋白α5β1(VLA-5)中的任一项或两项。
在一些实施方案中，细胞群体是分离自对象的生物样品(例如血液样品)。在一些实施方案中，细胞群体是分离自以下各项中的一种或多种：对象的脐带血、对象的外周血或对象的骨髓。在一些实施方案中，细胞群体包含以下各项，或基本上由其组成或进一步由其组成：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生的细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生的细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞。
在一些实施方案中，如本文所公开的方法进一步包含富集细胞群体中表达CD56、CD25、CD122、CD212、CD215、CD218、CD360、TGF-βR或IL-10R中的任一种或多种的细胞。在一些实施方案中，如本文所公开的方法进一步包含富集、衍生和/或生成CD56dim细胞。在其他实施方案中，CD56dim细胞以低密度表达CD56表面抗原且具有特殊细胞毒性功能。另外或替代地，如本文所公开的方法进一步包含富集、衍生和/或生成CD56bright细胞。在其他实施方案中，CD56bright细胞以高密度表达CD56表面抗原且具有特殊细胞因子分泌。例如参见Jacobs等人，Eur J Immunol.2001Oct；31(10):3121-7。在一些实施方案中，细胞群体包含外周血NK细胞和/或脐带血NK细胞，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，外周血NK细胞和/或脐带血NK细胞表达NCR、CD56、DNAM-1、CD16、IL-2R、CXCR4、KIRS、CD8、CD57、黏附分子、NKG2D、NKG2C和/或NKG2A中的任一种或多种。在其他实施方案中，外周血NK细胞和/或脐带血NK细胞的表达含量是不同的。在一些实施方案中，如本文所公开的方法进一步包含富集细胞群体中表达NCR、CD56、DNAM-1、CD16、IL-2R、CXCR4、KIRS、CD8、CD57、黏附分子、NKG2D、NKG2C和/或NKG2A中的任一种或多种的细胞。在一些实施方案中，如本文所公开的方法进一步包含富集细胞群体中的外周血NK细胞和/或脐带血NK细胞。
在一些实施方案中，任何步骤和/或实施方案和/或方面的细胞群体可以包含自然杀伤(NK)细胞或其实质上纯化的组合物，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，任何步骤和/或实施方案和/或方面的细胞群体(例如耗尽的细胞群体)可以包含下列各项中的一种或多种，或基本上由其组成或进一步由其组成：NK细胞、祖细胞、HSC、iPSC或其各自的实质上纯化的群体。
在一些实施方案中，NK细胞可以包含源自下列各项中的一种或多种的细胞，或基本上由其组成或进一步由其组成：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生的细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生的细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞。
在一些实施方案中，祖细胞、HSC或iPSC中的一种或多种能够衍生NK细胞。
在一些实施方案中，任何步骤和/或实施方案和/或方面的细胞群体实质上不含T细胞。在一些实施方案中，任何步骤和/或实施方案和/或方面的细胞群体实质上不含T调控细胞。
如本文所公开的方法的一些实施方案可以进一步包含分离、富集和/或纯化细胞群体。在一些实施方案中，任何步骤和/或实施方案和/或方面的细胞群体是分离的、富集的或纯化的。
在一些实施方案中，在培养步骤中将细胞群体及aAPC在选自以下的细胞培养基中一起培养：StemSpan(Stemcell#09960)、NK
Figure BDA0004112630850000501
培养基(Miltenyi research 30-114-429；GMP:170-076-356)、TexMACS(170-076-306GMP培养基)、Cellgenix无血清干细胞生长培养基(SCGM,#20806-0500)或ImmunoCultTM-XF培养基(来自Stemcell technologies)。
如本文所公开的方法的一些实施方案进一步包含以下步骤中的任一项或两项：配制如本文所公开的细胞群体(例如表达CAR组合物的那些)；和/或冷冻保存如本文所公开的细胞群体(例如表达CAR组合物的那些)。
如本文所公开的方法的一些实施方案进一步包含以下步骤中的任一项或两项：在一个或多个步骤之前或之后洗涤细胞群体，和/或在一个或多个步骤之前或期间或之后检测下列各项中的一种或多种：(i)细胞群体的生存率；(ii)细胞群体的无菌性；(iii)细胞群体中的支原体；(iv)细胞群体的人类白血球抗原(HLA)类型；(v)细胞群体的细胞数；(vi)细胞群体的细胞表型；(vii)细胞群体或包括细胞群体的组合物中的HHV6或HHV7或二者；(viii)细胞群体或包括细胞群体的组合物中的人类免疫缺陷病毒(HIV)1型及2型、人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型及II型、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、CMV、寨卡(Zika)、西尼罗(West Nile)或苍白密螺旋体(Treponema pallidum)中的一种或多种；(ix)aAPC的细胞表型；(x)包括细胞群体的组合物中的IL-15含量；(xi)细胞群体中的CAR表达；(xii)细胞群体或包括细胞群体的组合物中的内毒素；(xiii)残余肿瘤负荷和/或包括细胞群体的组合物的aAPC污染；(xiv)细胞群体的功效；(xv)细胞群体的IFN-γ、IL-15及TNF-α释放；(xvi)细胞群体的细胞毒性活性；(xvii)细胞群体的去颗粒；及(xviii)监测或测定培养物中的下列各项中的一种或多种：细胞聚集、葡萄糖或乳酸盐。在其他实施方案中，表型检测包括检测下列各项中的一种或多种的细胞表达和/或表达含量：CD3、CD56、抗原(例如CD19)、CD45、HLA、NKp46、NKG2D、NKG2A、NCR、DNAM-1、CD16、IL-2R、CXCR4、KIRS、CD8、CD57、黏附分子、NKG2C、CD107a、CAR或由细胞群体(例如aAPC和/或免疫细胞)表达的细胞表面标志物。
γδT细胞感染及扩增
在又一方面，提供制备γδT细胞的群体的方法。该方法包含将包含下列各项中的一种或多种的细胞群体与一种或多种免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)一起培养，或基本上由其组成或进一步由其组成：γδT细胞、能够衍生γδT细胞的祖细胞或能够衍生γδT细胞的干细胞。在一些实施方案中，该细胞群体在细胞群体中耗尽表达以下各项中的一种或多种的细胞：T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR。
在一些实施方案中，一种或多种免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)是选自下列中的一种或多种：人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原；一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别且结合γδT细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖γδT细胞；一种或多种因此活化或增殖γδT细胞的细胞因子；或一种或多种因此活化或增殖γδT细胞的化学部分，其任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)。
如本文所公开的方法的一些实施方案中进一步包含将编码CAR和/或另一治疗性蛋白或多肽的多核苷酸引入培养的细胞群体中以用于表达。在一些实施方案中，治疗性蛋白或多肽是选自抗体或其片段、酶、配体或受体。在一些实施方案中，CAR特异性识别且结合肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原。在其他实施方案中，由CAR识别及结合的肿瘤相关抗原(TAA)和/或病毒抗原表达于aAPC上。
如本文所公开的方法的一些实施方案进一步包括在引入步骤之后将细胞群体与免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)或其组合一起培养。在一些实施方案中，使用相同或不同的活化剂重复培养步骤一次、两次、三次或更多次。
在一些实施方案中，任何步骤和/或实施方案和/或方面的细胞群体可以包含下列各项中的一种或多种，或基本上由其组成或进一步由其组成：γδT细胞或其实质上纯化的组合物。在一些实施方案中，任何步骤和/或实施方案和/或方面的细胞群体(例如如本文所公开的耗尽的细胞群体)可以包含下列各项中的一种或多种，或基本上由其组成或进一步由其组成：γδT细胞、HSC、iPSC或其各自的实质上纯化的群体。
在一些实施方案中，祖细胞、HSC或iPSC中的一种或多种能够衍生γδT细胞。在一些实施方案中，γδT细胞包含衍生自下列各项中的一种或多种的细胞，或基本上由其组成或进一步由其组成：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生的细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生的细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞。在一些实施方案中，细胞群体实质上不含表达TCRα链或TCRβ链的细胞。
抗原及嵌合抗原受体(CAR)
在如本文所公开的任何方面的一些实施方案中，肿瘤相关抗原是选自下列各项或其各自的片段中的一种或多种：G蛋白偶合受体C类家族5成员D(GPRC5D)、B细胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7(CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)、表皮生长因子受体变体III(EGFRVIII)、FLT3、CD70、间皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人类表皮生长因子受体2(HER2)、ERBB2(Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1(CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、白介素13受体α2(IL13Ra2)、鸟苷酰基环化酶C(GUCY2C)、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、胸苷激酶1(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神经节苷脂G2(GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮细胞黏附分子前体(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、黏蛋白1(Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、纤维母细胞活化蛋白α(FAP)、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2前体(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位切断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、天冬酰胺内肽酶、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、FCRL5或IGLL1。
在如本文所公开的任何方面的一些实施方案中，如本文所公开的CAR包含以下部分，或基本上由其组成或进一步由其组成：(1)特异性识别且结合抗原的抗体的抗原结合结构域；(2)铰链结构域；(3)跨膜结构域；及(4)包括信号传导结构域的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR进一步包括信号肽。
在如本文所公开的任何方面的一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域特异性识别且结合下列各项中的一种或多种：G蛋白偶合受体C类家族5成员D(GPRC5D)、B细胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7(CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)、表皮生长因子受体变体III(EGFRVIII)、FLT3、CD70、间皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人类表皮生长因子受体2(HER2)、ERBB2(Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1(CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、白介素13受体α2(IL13Ra2)、鸟苷酰基环化酶C(GUCY2C)、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、胸苷激酶1(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神经节苷脂G2(GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮细胞黏附分子前体(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、黏蛋白1(Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、纤维母细胞活化蛋白α(FAP)、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2前体(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位切断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、天冬酰胺内肽酶、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、FCRL5或IGLL1。
在如本文所公开的任何方面的一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域包含特异性识别且结合下列各项中的一种或多种的抗体的6个CDR：G蛋白偶合受体C类家族5成员D(GPRC5D)、B细胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7(CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)、表皮生长因子受体变体III(EGFRVIII)、FLT3、CD70、间皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人类表皮生长因子受体2(HER2)、ERBB2(Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1(CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、白介素13受体α2(IL13Ra2)、鸟苷酰基环化酶C(GUCY2C)、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、胸苷激酶1(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神经节苷脂G2(GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮细胞黏附分子前体(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、黏蛋白1(Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、纤维母细胞活化蛋白α(FAP)、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2前体(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位切断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、天冬酰胺内肽酶、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、FCRL5或IGLL1。
在如本文所公开的任何方面的一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域包含选自以下的抗体或其各自的片段的6个CDR：抗EGFRwt及抗EGFRVIII抗体、抗FLT3抗体、抗BCMA抗体和/或抗CS1抗体。
在一些实施方案中，铰链结构域包含CD8α铰链结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，细胞内结构域进一步包含(1)一个或两个或更多个共刺激信号传导区或(2)包括JAK-STAT活化结构域的IL2Rβ或其片段或(1)及(2)。在其他实施方案中，共刺激信号传导区包含CD28共刺激信号传导区或4-1BB共刺激信号传导区或二者。
在一些实施方案中，信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，所引入的多核苷酸进一步表达细胞因子和/或抗体中的一种或多种，或其中该方法进一步包含将表达细胞因子和/或抗体中的一种或多种的另一多核苷酸引入耗尽的细胞群体中。
在其他实施方案中，由多核苷酸表达的细胞因子是选自下列各项中的一种或多种：B7.1(可溶的或膜结合的)、CCL19(可溶的或膜结合的)、CCL21(可溶的或膜结合的)、CD40L(可溶的或膜结合的)、CD137L(可溶的或膜结合的)、GITRL(可溶的或膜结合的)、GM-CSF(可溶的或膜结合的)、IL-12(可溶的或膜结合的)、IL-2(可溶的或膜结合的)、低毒性IL-2(可溶的或膜结合的)、缺乏cd25结合的IL-2类似物(可溶的或膜结合的)、IL-15-N72D超激动剂以及IL-15RαSushi-Fc融合蛋白(可溶的或膜结合的)、IL-15(可溶的或膜结合的)、IL-18(可溶的或膜结合的)、IL-21(可溶的或膜结合的)、LEC(可溶的或膜结合的)、OX40L(可溶的或膜结合的)、IL-7(可溶的或膜结合的)、ICOSL(B7H2、B7RP1，可溶的或膜结合的)或MICA(可溶的或膜结合的)。
另外或替代地，由多核苷酸表达的抗体是单特异性抗体或双特异性抗体或多特异性抗体。另外或替代地，由多核苷酸表达的抗体是免疫细胞活化剂，例如NK细胞活化剂。
在一些实施方案中，所制得表达CAR的细胞群体适用于抑制癌细胞生长且其中抗原是由癌细胞表达的肿瘤相关抗原(TAA)。
编码多核苷酸及载体
在一些实施方案中，编码CAR和/或治疗性蛋白或多肽的多核苷酸(其在本文中也称为编码多核苷酸)进一步编码信号肽。另外或替代地，编码CAR和/或治疗性蛋白或多肽的多核苷酸进一步包含自杀基因。在其他实施方案中，自杀基因产物是选自以下中的一种或多种：HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧基酯酶、细胞色素P450或PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)、截短的EGFR或可诱导的半胱天冬酶(caspase)(“iCasp”)。在一些实施方案中，编码多核苷酸进一步包含引导自杀基因表达的调控序列。在其他实施方案中，调控序列是可诱导的。
在一些实施方案中，编码多核苷酸进一步包含引导表达CAR或治疗性蛋白或多肽的调控序列。在其他实施方案中，引导表达CAR或治疗性蛋白的调控序列是诱导型或组成型活性的。
在一些实施方案中，通过载体将编码多核苷酸引入细胞群体中。在其他实施方案中，载体是病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或疱疹病毒载体。在另一实施方案中，病毒主链含有用于将编码多核苷酸整合至靶细胞的基因组中的必需核酸或序列。在一些实施方案中，整合靶细胞的基因组中所需的必需核酸在5’及3’端包含载体整合所需的最小LTR区域。
本发明也提供包含如本文所公开的多核苷酸(例如编码多核苷酸)，或基本上由其组成或进一步由其组成的载体，其任选地插入病毒主链中。在一些实施方案中，选择载体以用于表达于原核或真核细胞中。在一些实施方案中，载体包含如本文所描述的编码修饰的蛋白质的多核苷酸，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，载体包含如本文所描述的允许多核苷酸复制的多核苷酸，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，载体进一步包含操作性地连接至多核苷酸且引导多核苷酸复制的调控序列。在又一实施方案中，调控序列包含以下各项中的一种或多种，或基本上由其组成或进一步由其组成：启动子、内含子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、沉默子、TATA盒或土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus，WHP)转录后调控组件(WPRE)。
在一些实施方案中，通过如本文所公开的假型γ逆转录病毒颗粒将编码序列引入靶细胞中。
包装系统
本发明也提供一种病毒包装系统，其包括：如本文所描述的载体，任选地其中主链是衍生自病毒；包装质粒；及包膜质粒。包装质粒含有编码核苷、基质蛋白、衣壳及将载体基因组包装至病毒颗粒中所需的其他组分的多核苷酸。包装质粒描述于专利文献中，例如美国专利第7,262,049号、第6,995,258号、第7,252,991号及第5,710,037号，其以引用方式并入本文中。
该系统也可以含有编码由包膜质粒提供的假型包膜蛋白的质粒。假型病毒载体由具有衍生自其他包膜病毒的糖蛋白或含有功能部分的载体颗粒组成。例如参见美国专利第7,262,049号，其以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，包膜质粒编码任选地不会导致病毒颗粒非特异性结合至细胞或细胞群体的包膜蛋白。病毒颗粒的特异性可以由插入颗粒包膜中的蛋白质或多肽(例如抗体结合结构域)赋予。适合的包膜蛋白的实例包含但不限于含有VSVG或RD114结构域的那些。在一些实施方案中，本文所用的包膜蛋白包含但不限于RD114TR和/或BaEVTR。
本发明也提供适合的包装细胞系。在一方面中，包装细胞系是HEK-293细胞系。其他适合的细胞系是本领域内所已知的，如美国专利第7,070,994号、第6,995,919号、第6,475,786号、第6,372,502号、第6,365,150号及第5,591,624号(各自以引用方式并入本文中)中的专利文献中所描述的。在一些实施方案中，包装细胞系是选自或是源自以下各项中的一种或多种：293Vec-Galv、293Vec-Ampho、293Vec-RD114或293Vec-BaEV。例如参见Ghani等人，Gene Ther.2007Dec；14(24):1705-11；Dakiw Piaceski A等人，Eur CellMater.2018Feb 14；35:73-86；Ghani等人，Hum Gene Ther.2009Sep；20(9):966-74；美国专利公开文件第US20060270042号；及美国专利第8034335号。
本发明进一步提供产生如本文所公开的病毒颗粒的方法，其包含在适用于包装病毒载体的条件下使用如上文所描述的病毒系统转导包装细胞系，或基本上由其组成或进一步由其组成。这些条件是本领域内已知的且简述于本文中。可以使用本领域技术人员已知的方法(例如离心)从细胞上清液中来分离病毒颗粒。这些分离的颗粒进一步提供于本发明中。
本发明进一步提供通过此方法产生的分离的病毒颗粒。病毒颗粒包含如本文所公开的多核苷酸，或基本上由其组成或进一步由其组成。
本发明也提供制备包含如本文所公开的多核苷酸(例如如本文所公开的编码多核苷酸)的病毒颗粒(例如γ逆转录病毒颗粒)的方法，其是通过在有利于将载体包装至包膜颗粒中的条件下使用载体、包膜质粒及包装质粒转导如本文所描述的包装细胞系来达成。在一些实施方案中，病毒颗粒是假型病毒颗粒。在其他实施方案中，这些颗粒分离自细胞上清液且结合至抗体以用于细胞特异性靶向。
也提供产生逆转录病毒颗粒(例如γ逆转录病毒颗粒)的方法。该方法包含以下步骤、基本上由其组成或进一步由其组成：(i)将表达载体基因组的载体引入适用于将载体基因组包装至第一逆转录病毒颗粒中的第一包装细胞系中，(ii)将第一逆转录病毒颗粒转导至适用于复制第一逆转录病毒颗粒的第二包装细胞系中；及(iii)分离所复制的逆转录病毒颗粒。
在一些实施方案中，载体是非病毒载体。在其他实施方案中，载体是质粒。
在一些实施方案中，该方法进一步包含培养引入载体的第一包装细胞系。在其他实施方案中，该方法进一步包含从引入载体的第一包装细胞系的培养物(例如从上清液)分离第一逆转录病毒颗粒。
在一些实施方案中，该方法进一步包含培养转导的第二包装细胞系。
在一些实施方案中，使用以下两个步骤来产生载体：
步骤1：质粒(其表达逆转录病毒载体基因组)转染293Vec-GALV细胞以产生逆转录病毒载体。所产生的该逆转录病毒载体被包含GALV的脂质膜包膜。另外，由于293Vec-GALV细胞在此步骤中瞬时转染，所以所产生的逆转录病毒载体也称为瞬时载体且测试于图10中。
步骤2：所产生的逆转录病毒载体转导293Vec-BaEV细胞以复制逆转录病毒载体。所复制的逆转录病毒载体与亲代载体具有相同载体基因组，但被包含BaEV的脂质膜包膜。另外，由于293Vec-BaEV细胞在此步骤中稳定转导，所以此处的所复制的逆转录病毒载体也称为稳定载体且测试于图10中。
令人吃惊地，T细胞(使用RQR8编码的逆转录病毒载体基因组转导)使用稳定载体以高于瞬时载体的含量表达RQR8。另外，所生成的这些稳定病毒生产细胞(也称为生产者)较为稳定且与感兴趣的转基因整合。在一些实施方案中，由转基因编码的蛋白质产物无毒。因此，不期望受限于理论，与亲代包装细胞系一样，生产细胞可以在体外连续培养与其处于对数生长期中时一样多的世代。在一些实施方案中，生产者可以保持体外培养不超过30代。
在一些实施方案中，将细胞培养至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天或至少约10天。另外或替代地，将细胞培养不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过15天、不超过3周或不超过1个月。在一些实施方案中，将细胞培养约1天至约180天(包含落入其中的任何范围和/或数值)。在一些实施方案中，将细胞培养约5天至约10天，例如约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。
在一些实施方案中，第一包装细胞系及第二包装细胞系表达包装逆转录病毒颗粒所需的组分。在其他实施方案中，包装逆转录病毒颗粒所需的组分是选自以下中的一种或多种：逆转录病毒gag、逆转录病毒pol、逆转录病毒env、其各自的片段或其任何组合。
在一些实施方案中，第二包装细胞系在细胞膜中包含逆转录病毒包膜蛋白，但在细胞膜中不包含逆转录病毒包膜蛋白的进入受体。
另外，提供转导的第二包装细胞系、其细胞或其细胞群体。在一些实施方案中，细胞稳定产生逆转录病毒颗粒。
在一些实施方案中，逆转录病毒包膜蛋白是BaEV且其进入受体是ASCT1或ASCT2。在一些实施方案中，逆转录病毒包膜蛋白是RD114，且其进入受体是ASCT2。在一些实施方案中，逆转录病毒包膜蛋白是GALV且其进入受体是Pit1。
在一些实施方案中，第一包装细胞是包含第一逆转录病毒颗粒的逆转录病毒包膜蛋白的进入受体。在其他实施方案中，第一包装细胞是确实包含第一逆转录病毒颗粒的逆转录病毒包膜蛋白的进入受体。
在一些实施方案中，以约0.01至约100(包含落入其中的任何范围和/或数值)的感染复数(MOI)将载体引入第一包装细胞系中。在一些实施方案中，以约0.1至约10、约0.2至约5、约1至约10或约1至约5的MOI将载体引入第一包装细胞系中。在一些实施方案中，以约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的MOI将载体引入第一包装细胞系中。
在一些实施方案中，以约0.01至约100(包含落入其中的任何范围和/或数值)的感染复数(MOI)将第一逆转录病毒颗粒引入(例如转导至)第二包装细胞系中。在一些实施方案中，以约0.1至约10、约0.2至约5、约1至约10或约1至约5的MOI将第一逆转录病毒颗粒引入(例如转导至)第二包装细胞系中。在一些实施方案中，以约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的MOI将第一逆转录病毒颗粒引入(例如转导至)第二包装细胞系中。
因此，提供通过如本文所公开的方法产生的逆转录病毒颗粒。
在另一方面中，提供产生工程化的免疫细胞(例如表达CAR的免疫细胞)的方法。该方法包含将使用如本文所公开的方法产生的逆转录病毒颗粒引入(例如转导至)免疫细胞或其前体细胞中，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的基因信息(其在本文中也称为载体基因组或病毒基因组)是RNA，其在5’及3’端上包含载体整合所需的最小LTR区域及如本文所公开位于两个LTR区域之间的多核苷酸，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，在两个LTR区域之间进一步包含将载体RNA包装至颗粒中所需的衣壳化信号(psi区域)。在一些实施方案中，在psi区域之后是Rev反应性组件(RRE)及中心聚嘌呤区序列(cPPT)，这些结构通过将全长载体转录物运输出细胞核以用于有效包装至载体颗粒中来增强载体产生。
在一些实施方案中，将所列举的基因组件转录成全长RNA分子，该分子被包装至载体颗粒中且含有将整合至转导的细胞中的所有基因信息。
在一些实施方案中，全长RNA转录物包装于载体颗粒的衣壳内部，该载体颗粒含有从包装质粒生成的核衣壳、衣壳及基质蛋白。在一些实施方案中，从包装质粒生成的逆转录酶聚合酶也位于具有RNA转录物的衣壳内。在一些实施方案中，衣壳包封且保护全长RNA转录物。
在一些实施方案中，在转染之前24小时，将包装细胞系的细胞(例如HEK-293T细胞)以75％汇合度平铺于完全DMEM培养基中。在平铺细胞后至少24小时，制备转染混合物。将3毫升无血清培养基与150μl脂转染试剂在室温下一起培养20分钟。然后以一定比率(包装质粒:病毒载体质粒:包膜质粒)将质粒添加至培养基/脂转染试剂混合物中并培养30分钟。在该最终培养期中，然后将培养基/脂转染试剂/DNA混合物添加至HEK-293T细胞中并过夜以发生转染。第二天，去除转染培养基并添加新鲜完全DMEM。72小时后，可以收集细胞培养上清液并通过在20,000rpm下超离心1.5小时来浓缩。
在载体颗粒从包装细胞萌芽且释放至上清液中后，可以通过特异性识别或结合颗粒的抗体和/或通过在如本文所定义的颗粒包膜上结合抗体来分离和/或纯化此载体颗粒。
因此，在一方面中，本文提供用于产生假型γ逆转录病毒颗粒的病毒包装系统，其包括：(a)表达载体基因组的质粒；(b)包装质粒；及(c)一种或多种表达RD114TR及BaEVTR的包膜质粒。在一些实施方案中，包装系统进一步包含包装细胞系。在其他实施方案中，包装细胞系是293T细胞系。
在一些实施方案中，载体基因组包括下列侧接有两个长末端重复(LTR)者中的一种或多种：(A)编码嵌合抗原受体(CAR)和/或另一种治疗性蛋白或多肽的多核苷酸；(B)(A)的反向互补序列；或(C)包含一个或多个由适用于将编码序列或其反向互补序列插入多核苷酸中的限制酶识别的识别位点的多核苷酸。在一些实施方案中，治疗性蛋白或多肽选自抗体或其片段、酶、配体或受体。在一些实施方案中，载体基因组进一步包含下列各项中的一种或多种：5’LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’LTR。在其他实施方案中，编码多肽位于5’帽与3’聚-A尾部之间。
在一些实施方案中，假型γ逆转录病毒颗粒是基于和/或源自和/或选自以下任何物种：莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)及猫类白血病病毒。
在另一方面中，提供产生假型γ逆转录病毒颗粒的方法。该方法包含在适用于包装假型γ逆转录病毒颗粒的条件下使用如本文所公开的包装系统转导包装细胞系，或基本上由其组成或进一步由其组成。在其他实施方案中，包装细胞系是293T细胞系。
在一些实施方案中，以约5:5:1、5:4:1、5:3:1、5:2:1、5:1:1、4:5:1、3:5:1、2:5:1、1:5:1；4:4:1、4:3:1、4:2:1、4:1:1、3:4:1、2:4:1、1:4:1；3:3:1、3:2:1、3:1:1、2:3:1、1:3:1；2:2:1、2:1:1、1:2:1；1.5:1.5:1、1.5:1:1、1:1.5:1或1:1:1的比率使用(a)、(b)及(c)的质粒(即病毒载体质粒:包装质粒:包膜质粒)来转导细胞系。在其他实施方案中，包装系统包含至少两种包膜质粒，一种表达RD114TR且另一种表达BaEVTR。在其他实施方案中，以3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2或1:3的比率来转导RD114TR表达质粒及BaEVTR表达质粒。在一些实施方案中，以以下比率使用(a)的质粒、(b)的质粒、RD114TR表达质粒及BaEVTR表达质粒来转导细胞系：3:3:1:1、2:2:1:1、1.5:1.5:1:1、1:1:1:1、5:5:1:1、5:4:1:1、5:3:1:1、5:2:1:1、5:1:1:1、4:5:1:1、3:5:1:1、2:5:1:1、1:5:1:1、4:4:1:1、4:3:1:1、4:2:1:1、4:1:1:1、3:4:1:1、2:4:1:1、1:4:1:1；3:3:1:1、3:2:1:1、3:1:1:1、2:3:1:1、1:3:1:1、2:2:1:1、2:1:1:1、1:2:1:1、1.5:1.5:1:1、1.5:1:1:1、1:1.5:1:1或1:1:1:1、2.5:2.5:1:1:1、2.5:2:1:1、2.5:1.5:1:1、2.5:1:1:1、2.5:0.5:1:1、2:2.5:1:1、1.5:2.5:1:1、1:2.5:1:1、0.5:2.5:1:1、2:2:1:1、2:1.5:1:1、2:1:1:1、2:0.5:1:1、1.5:2:1:1、1:2:1:1、0.5:2:1:1、1.5:1.5:1:1、1.5:1:1:1、1.5:0.5:1:1、1:1.5:1:1、0.5:1.5:1:1、1:1:1:1、1:0.5:1:1、0.5:1:1:1、0.75:0.75:1:1、0.75:0.5:1:1、0.5:0.75:1:1或0.5:0.5:1:1。
细胞及细胞群体
在一方面中，提供如本文所公开的细胞群体和/或其后代。在一些实施方案中，细胞群体是克隆的。在一些实施方案中，细胞群体是分离的和/或富集和/或工程化的。
在一方面中，提供通过如本文所公开的方法产生或制备的免疫细胞(例如NK细胞和/或γδT细胞)或其群体。进一步提供包含细胞或其群体及载体、任选地药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，免疫细胞或其群体是分离的和/或富集和/或工程化的。
另外或替代地，如本文所公开的细胞衍生或分化自干细胞。在一些实施方案中，所衍生和/或分化细胞和/或其细胞群体包含免疫细胞，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些情况下，免疫细胞是选自B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、树突状细胞、骨髓样谱系细胞和/或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，T细胞不表达CD3，即是CD3-T细胞。在一些实施方案中，T细胞不表达CD4，即是CD4-T细胞。在一些实施方案中，T细胞不表达CD8，即是CD8-T细胞。在一些实施方案中，T细胞不表达以下各项中的任一种或多种：T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR。在一些实施方案中，T细胞表达TCRγ链。另外或替代地，T细胞表达TCRδ链。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些情况下，免疫细胞的分离的细胞或富集的群体包含单核细胞、巨噬细胞和/或小神经胶质细胞，或基本上由其组成或进一步由其组成。
在一些实施方案中，细胞群体实质上包含任选地衍生自干细胞(例如HSC和/或诱导性多能干细胞(iPSC))的免疫细胞。在一些实施方案中，细胞群体实质上包含任选地衍生成免疫细胞的干细胞(例如HSC和/或iPSC)。
在一些实施方案中，细胞群体实质上同源，例如，群体中的至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的细胞是相同的。
在另一方面中，提供通过如本文所公开的方法产生或制备的NK细胞或其群体。进一步提供包含细胞或其群体及载体、任选地药学上可接受的载体的组合物。
在另一方面中，提供通过如本文所公开的方法产生或制备的γδT细胞或其群体。进一步提供包含细胞或其群体及载体、任选地药学上可接受的载体的组合物。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物包含小于约0.1％、小于约0.2％、小于约0.3％、小于约0.4％、小于约0.5％、小于约0.6％、小于约0.7％、小于约0.8％、小于约0.9％、小于约1.0％、小于约1.1％、小于约1.2％、小于约1.3％、小于约1.4％、小于约1.5％、小于约1.6％、小于约1.7％、小于约1.8％、小于约1.9％或小于约2.0％的aAPC。
另外或替代地，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物具有不小于30％、不小于40％、不小于50％、不小于55％、不小于60％、不小于65％、不小于70％、不小于75％、不小于80％、不小于85％、不小于90％或不小于95％的存活率。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物是无菌的。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物包含小于致热阈剂量(TPD)的内毒素，该致热阈剂量以统计学方式评价在测试对象(例如兔，例如参见Wachtel及Tsuji,1976；Dabbah,等人，1980)中诱导发热所需的内毒素活性程度。该TPD可以基于施用途径来测定。在一个实施方案中，TPD是5EUKg-1h-1内毒素，例如用于静脉内或肌肉内施用。在一个实施方案中，TPD是0.2EUKg-1h-1内毒素，例如用于鞘内施用。
在一些实施方案中，所公开的细胞和/或其群体和/或组合物针对以下各项中的一种或多种为阴性：支原体、外来病毒或HHV(例如HHV6和/或HHV7)。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞群体和/或组合物在总细胞中包含大于约25％、大于约30％、大于40％、大于约45％、大于约50％、大于约55％、大于约60％、大于约65％、大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％或大于约95％的表达CAR的细胞。在其他实施方案中，如本文所公开的细胞群体和/或组合物在总细胞中包含约25％、约30％、40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的表达CAR的细胞。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞群体和/或组合物在总细胞中包含大于约25％、大于约30％、大于40％、大于约45％、大于约50％、大于约55％、大于约60％、大于约65％、大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％、大于约95％或大于约99％的表达CD56的细胞。在其他实施方案中，如本文所公开的细胞群体和/或组合物在总细胞中包含约25％、约30％、40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的表达CD56的细胞。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞群体和/或组合物在总细胞中包含小于约0.1％、小于约0.2％、小于约0.3％、小于约0.4％、小于约0.5％、小于约0.6％、小于约0.7％、小于约0.8％、小于约0.9％、小于约1.0％、小于约1.1％、小于约1.2％、小于约1.3％、小于约1.4％、小于约1.5％、小于约1.6％、小于约1.7％、小于约1.8％、小于约1.9％或小于约2.0％的表达CD3的细胞。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物包含小于约2、小于约3、小于约4、小于约5、小于约6、小于约7、小于约8、小于约9或小于约10个多核苷酸拷贝/细胞。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物在不存在IL-2和/或IL-21下缺乏增殖。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物具有强效能力(即功效)，例如与未通过如本文所公开的任何培养步骤和/或引入步骤制得的免疫细胞相比的1倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍或更高倍数。这些功效可以通过IFNγ和/或其他促发炎细胞因子的分泌和/或CD107(例如CD107a)的表达来测量。例如参见Orange等人，J Exp Med.1995Oct 1；182(4):1045-56；及McElroy等人，J ImmunolMethods.2007Dec 1；328(1-2):45-52。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物表达一种或多种抗原(例如CD19、NKp46或NKG2D)。
在其他实施方案中，这些细胞、细胞群体和/或组合物可以用于治疗和/或预防有需要的对象中的癌症或测试新疗法。
在一些实施方案中，如本文所公开的细胞和/或其群体和/或组合物，例如施用给有需要的对象，包含大于1×106个细胞/公斤待治疗对象的体重，包含但不限于大于2×106个细胞/公斤、大于3×106个细胞/公斤、大于4×106个细胞/公斤、大于5×106个细胞/公斤、大于6×106个细胞/公斤、大于7×106个细胞/公斤、大于8×106个细胞/公斤、大于9×106个细胞/公斤、大于1×107个细胞/公斤、大于2×107个细胞/公斤、大于3×107个细胞/公斤、大于4×107个细胞/公斤、大于5×107个细胞/公斤、大于6×107个细胞/公斤、大于7×107个细胞/公斤、大于8×107个细胞/公斤、大于9×107个细胞/公斤或大于1×108个细胞/公斤，或基本上由其组成或进一步由其组成。
治疗方法
在一方面中，提供抑制癌细胞生长的方法。该方法包含使例如有效量的通过如本文所公开的方法制得的CAR表达细胞的群体与癌细胞接触，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，由CAR识别的抗原是由癌细胞表达的肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，接触是在体内或在体外。
在另一实施方案中，提供治疗对象中的癌症的方法。该方法包含将例如有效量的通过如本文所公开的方法制得的CAR表达性免疫细胞的群体施用于对象，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，由CAR识别的抗原是由癌细胞表达的TAA。在一些实施方案中，施用是一线疗法、二线疗法、三线疗法或四线疗法。
在如本文所公开的方法的一些实施方案中，细胞群体包含NK细胞，或基本上由其组成或进一步由其组成。另外或替代地，细胞群体包含小于或等于约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％或约2.0％的CD3+细胞。
在一些实施方案中，向对象施用小于1×102、2×102、3×102、4×102、5×102、6×102、7×102、8×102、9×102、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104个T细胞/公斤体重。
在一些实施方案中，癌细胞是选自以下器官的癌细胞：循环系统，例如心脏(肉瘤[血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤]、黏液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤及脂肪瘤)、纵隔及胸膜及其他胸内器官、血管肿瘤及肿瘤相关血管组织；呼吸道，例如鼻腔及中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管及肺，例如小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、支气管癌(鳞状细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、肺泡(支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠道系统，例如食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胃、胰脏(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌肿瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌肿瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；出现于任何部位的胃肠道基质肿瘤及神经内分泌肿瘤；泌尿生殖道，例如肾(腺癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilm's tumor)[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和/或尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睪丸(精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质性细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、类腺瘤肿瘤、脂肪瘤)；肝，例如肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤、胰脏内分泌肿瘤(例如嗜铬细胞瘤、胰岛素瘤、血管活性肠肽肿瘤、胰岛细胞肿瘤及胰高血糖素瘤)；骨，例如成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞肿瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨黏液样纤维瘤、骨样骨瘤及巨细胞肿瘤；神经系统，例如中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、变形性骨炎)、脑膜癌(脑膜瘤、脑脊膜肉瘤、神经胶质过多)、脑癌(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性神经胶母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；生殖系统，例如妇科，子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(子宫颈癌、肿瘤前期子宫颈发育不良)、卵巢(卵巢癌[浆液囊腺癌、黏液囊腺癌、未分类癌]、粒层泡膜细胞肿瘤、支持-间质细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、胎盘、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄形肉瘤(胚胎型横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)及与女性生殖器官有关的其他部位；阴茎、前列腺、睪丸及与男性生殖器官有关的其他部位；血液系统，例如血液(骨髓样白血病[急性及慢性]、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、何杰金氏疾病(Hodgkin's disease)、非何杰金氏淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；口腔，例如唇、舌、齿龈、口底、上颚及其他口腔部分、腮腺及其他唾液腺部分、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状隐窝、下咽及唇、口腔及咽中的其他部位；皮肤，恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、结构不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤及瘢痕瘤；肾上腺：神经母细胞瘤；及其他组织，包括结缔组织及软组织、腹膜后腔及腹膜、眼睛、眼内黑色素瘤及附属结构、乳房、头或/及颈、肛门区、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺及其他内分泌腺及相关结构、淋巴结的继发性和非特异性恶性肿瘤、呼吸和消化系统的继发性恶性肿瘤、以及其他部位的继发性肿瘤。
在一些实施方案中，癌细胞是实体肿瘤细胞。在其他实施方案中，癌细胞并非实体肿瘤细胞。在其他实施方案中，癌细胞是白血病癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是原发性癌细胞或转移性癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是来自癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
其他有效疗法可以根据需要与本发明组合和/或被添加。如本文所公开的方法的一些实施方案进一步包含使细胞与单独疗法接触或施用单独疗法。在一些实施方案中，单独疗法包含手术切除术、化学疗法、辐射疗法、免疫疗法及靶向疗法，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，单独疗法是一线疗法、二线疗法、三线疗法或四线疗法。
在一些实施方案中，递送“有效量”，即其是足以实现有益或期望结果的量。有效量可以一次或多次施用、应用或剂量来施用。该递送取决于许多变量，包含待使用的单独地剂量单位的时间段、治疗剂的生物可用性、施用途径等。然而，应当理解，本发明治疗剂用于任何特定对象的具体剂量值取决于各种因素，包含所采用的具体化合物的活性、对象的年龄、体重、一般健康状况、性别及饮食、施用时间、排泄速率、药物组合及所治疗的特定病症的严重程度以及施用形式。通常可逐步增加治疗剂量以优化安全性及功效。通常，来自体外和/或体内测试的剂量-效应关系首先可以针对用于患者施用的适当剂量提供有用的指导。一般而言，基因或蛋白质的期望施用量可以有效达到与所发现的体外有效浓度相当的血清含量。这些参数的测定在本领域内已众所周知。这些考虑以及有效配方和施用程序在本领域内是众所周知的且描述于标准教科书中。与此定义一致，如本文中所使用，术语“治疗有效量”是足以提供治疗益处的量。
术语施用应包含但不限于通过口服、肠外(例如肌肉内、腹膜腔内、静脉内、脑室内(ICV)、鞘内、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)、通过鼻吸入喷雾、阴道、直肠、舌下、尿道(例如尿道栓剂)、颅内来局部或全身性施用，或者外用施用途径(例如凝胶、软膏、乳霜、气溶胶等)，且可单独或一起调配成含有适用于每一项施用途径的药学上可接受的常用的无毒载剂、佐剂、赋形剂及媒介的适宜剂量单位配方。本发明并不受施用途径、配方或给药时间表的限制。在一些实施方案中，施用是局部实施，例如施用骨髓或脑中。在一些实施方案中，全身性实施施用。在一些实施方案中，施用是例如约1小时、约1.5小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约12小时或约1天的输注。
进一步提供一种试剂盒，其包含一种或多种适用于如本文所公开的方法中的药剂及任选地说明，或基本上由其组成或进一步由其组成。在一些实施方案中，药剂是选自下列各项中的一种或多种：编码CAR或另一种治疗性蛋白的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、用于检测细胞表型的抗体、用于分离或富集或纯化免疫细胞的抗体、用于检测如本文所公开的多核苷酸、细胞因子及aAPC的引物。
下列实例旨在描述而不限制本文所公开的实施方案。
实验方法
1号实验：γ逆转录病毒载体(PCIR)调节的基因转移用于递送人类原代NK细胞中的嵌合抗原受体且测试其功能的独特用途
缺乏将基因递送至人类原代NK细胞中的有效方法、转基因不稳定及转导的CAR-NK细胞的生存率较低是成功CAR-NK研发及制造的主要障碍。静脉至静脉时间较为关键，这是由于患者中的不期望的等待时间与较差预后相关并且不是所有合格患者都可以接受疗法(因为较差的T细胞功能、准备时间和/或复发时间)。当前可用的疗法具有可变的功效和/或毒性。简而言之，患者中的受损T细胞可能影响产物功效。该可变性可能引起不可预测的治疗结果。另外，3-4级细胞因子释放导致综合症及神经毒性的情况并不罕见。鉴于物流复杂、规模效率低及可用性有限，生产成本较高。因此，制造失败包含但不限于不能在个别化疗法中产生库存且可能因患者起始材料有限而难以再治疗。
为解决这些问题，本文提供γ逆转录病毒载体(PCIR)调节的基因转移用于递送人类原代NK细胞中的嵌合抗原受体(CAR)并测试其功能的独特用途。
已证实，慢病毒及逆转录病毒载体调节的基因递送是用于基因工程化的安全方式。然而，在许多报导及甚至申请人的第一手实验中，常用的慢病毒载体调节的转导对于NK细胞而言效率较低，这是因为CAR-NK扩增期间的转基因表达显著减少。例如参见图5A及5C。因此，申请人所实施的许多尝试旨在寻找克服慢病毒载体的低效性的替代基因递送方法。
首先，测试莫洛尼鼠类白血病病毒衍生的SFGγ逆转录病毒载体针对外周血(PB)衍生的人类原代NK细胞的基因递送。
如图1中所示，用于本发明中的原代人类NK细胞是源自外周血(PB)，且使用MACSxpress人类全血NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,0.130-098-185)分离。通过使用CD56及CD3抗体将细胞染色来测定纯度(图2A)，且将NK细胞定义为CD56+/CD3-群体。将NK细胞与NK MACS培养基(130-114-429)在50IU/ml人类IL-2及辐照的K562-mb21-41BBL饲养细胞(比率为1:1)存在下一起培养。使用PEQ-PEM3(-E)包装所有γ逆转录病毒质粒(PCIR)并使用BaEVTR或RD114TR质粒以1.5:1.5:1比率包膜，且通过lipofectamine3000试剂(InvitrogenL3000075)或PEI MAX 40K(Polysciences,Inc，目录号：24765)瞬时转染至293T细胞(ATCC CRL-3216)中。与由RD114TR识别的ASCT-2相比，BaEVTR质粒在实践中有益于将较大插入体递送至表达两种病毒进入受体ASCT-1及ASCT-2的活化NK细胞中。使用retronectin试剂(TakaRa,T100A/B)涂覆的非组织培养板，申请人通过将上述逆转录病毒颗粒感染至活化NK细胞中(培养7天)来直接实施滴定测定且使用MOI 3来生成CAR-NK。显而易见，在分离并培养5天之后，原代NK细胞进入显著增殖状态，由此使用第6-10天时的活化NK细胞进行基因递送(图2B)。
然后在感染后第3天评价转导效率。实施富集、扩增、功能及其他治疗性应用。
实验结果展示，在感染之后存在具有显著较高存活率(介于73.51％-82.81％之间)的NK细胞(可以通过排除低正向散射(FSC)及高侧向散射(SSC)事件来获得大致活细胞门)(图3B)，三个供体中的EGFR CAR基因(Fab-AF647阳性)转导效率介于65.11％-72.75％之间(图3C)，且在感染后第8天三个供体中的高增殖状态产率是初始感染NK数量的25、34及45倍(图3D)。这样的广泛优化使得能够以50％-80％效率在原代人类NK细胞中持续转导CAR构建体；将CAR NK细胞从1至2千万在8天内25～45倍离体扩增至数亿万；且达成CAR fll保留与NK细胞离体扩增。
测试更长培养。例如参见图7。如本文所公开的这样广泛优化使得能够在17-24天内从数千万个NK细胞扩增至数百亿个NK细胞，且提供在解冻时具有极佳生存率的真正现成的冷冻产品。商业制造成本至少为约$2000/剂量且每批次具有大于500个剂量。
基于使用相同递送策略直接感染相同增殖状态的活化NK细胞的逆转录病毒滴定提供于图4中。
另外，在分选后第10天，对于PCIL-EGFR-CAR-NK及PCIL-GFP空载体对照而言，GFP阳性细胞从约100％显著减少至39％(图5A及5C)。然而，流动分析证实，在分选后第10天、第14天及第25天，PCIR-EGFR-CAR-NK具有高度稳定的转导基因表达(图5B及5C)。
另外观察到，空载体截短的CD19(EV-Tcd19)及EGFR转基因的转导速率分别为平均85％(CD19-PE阳性)及79.6％(山羊抗小鼠Fab-AF647阳性)(图6A)。另外，与具有最低活细胞指数的空载体模拟转导组及未转导NK组相比，工程化EGFR-CAR-NK具有动态实时杀伤性(图6B)。
其次，申请人优化所扩增的原代NK细胞的逆转录病毒转导的时间点。由于γ-逆转录病毒能够有效地感染分裂细胞，故申请人确定了生长曲线及原代NK细胞进入显著增殖状态以用于基因递送时的时间点。
第三，若干研究已明确展示，人类原代淋巴细胞的转导效率取决于用于包被逆转录病毒载体的包膜蛋白的类型，以及活化的NK细胞高度表达受体ASCT-1及ASCT-2(其是用于进入靶标的狒狒包膜糖蛋白(BaEV-TR))。ASCT-2受体是用于进入细胞的猫类内源性逆转录病毒包膜糖蛋白(RD114TR)，由此测试BaEVTR及RD114TR。BaEVTR质粒在实践中用于较大插入体递送，例如串联CAR、双重CAR及BiTE CAR。
接下来，已证实RetroNectin试剂可以通过辅助共定位靶细胞及病毒颗粒来增强逆转录病毒调节的基因转导。具体而言，病毒颗粒通过与H结构域相互作用来结合RetroNectin试剂，且靶细胞主要通过细胞表面整联蛋白受体VLA-5及VLA-4分别与纤连蛋白C结构域及CS-1位点的相互作用来进行结合。通过促进邻近性，RetroNectin试剂可以增强针对表达整联蛋白受体VLA-4和/或VLA-5的靶细胞的逆转录病毒调节的基因转移。
另外，申请人确定了基于使用相同递送策略直接感染相同增殖状态的活化NK细胞的逆转录病毒滴定，其旨在避免高估或低估来自基于不同细胞类型的间接量测方法所计算的滴定。
如本文所公开的发现展示，组合使用RD114-TR或BaEV-TR假型γ逆转录病毒颗粒与RetroNectin是用于将治疗基因递送至人类原代NK细胞中的成功策略，且具有较高转导效率、持续转基因表达及较大细胞生存率及扩增速率。
在一些实施方案中，从健康新生儿的脐带血收集NK细胞。如所公开的来选择最佳NK细胞候选者。然后使用饲养细胞(例如如本文所公开的aAPC)扩增NK细胞。扩增的NK细胞发生转导以表达CAR和/或其他组分(例如自杀开关、抗体及细胞因子)。持续离体扩增也由外源IL-2驱动。然后收获最终细胞产物，冷冻保存，并以高生存率解冻以用于现成地给患者施用。
在一些实施方案中，这些方法允许选择最佳的脐带血产物以用于NK细胞扩增。与如本文所公开的aAPC一起共培养可达成大规模NK细胞扩增。产生方法显著减少所需逆转录病毒的量且使NK细胞扩增时间减少20％。达到表达CAR的高转导效率。
2号实验：细胞疗法：过程研发研究
测试支持NK生长和/或扩增的培养基和/或添加剂，包含但不限于StemSpan(Stemcell#09960)、NK
Figure BDA0004112630850000671
培养基(Miltenyi research 30-114-429；GMP:170-076-356)、TexMACS(170-076-306GMP培养基)及Cellgenix无血清干细胞生长培养基(SCGM,#20806-0500)。
比较细胞因子添加剂以优化产率，例如比较下列各项中的一种或多种：100-500U/ml IL-2、20ng/ml IL-15、25ng/mL IL-21或其任何组合。
实施NK细胞富集。测试下列市售试剂盒并加以比较：Stemcell NKdepletionEasySep NK分离试剂盒(17955RF)、RosetteSep NK富集混合剂(#15065)以及Miltenyi NK分离试剂盒(130-092-657)及CD56+NK细胞分离试剂盒(130-092-660)。
测试将CD3+细胞减少至<0.3％(即小于0.3％的经耗尽的细胞群体)的各种CD3耗尽试剂盒。这些试剂盒包含例如Miltenti 130-096-535。
生成工程化的K562细胞(例如表达膜结合IL-15(sushi结构域)和/或IL-21的那些)。根据当前良好制造实践来研发工程化细胞的原始细胞库(MCB)和/或工作细胞库(WCB)。
另外，完成K562 MCB及WCB库的释放测试，包含但不限于测试下列各项中的一种或多种：无菌性、内毒素、支原体、外来病毒测试(体外及体内)、基于PCR的病毒测试、同功酶分析、核型分析、S+L-等。另外，测定K562标志物共表达(例如CD64/FcγRI、CD86/B7-2、CD137L/4-1BBL、截短的CD19及膜结合IL-21)在4周培养时间中及在辐照(21天培养)之后的稳定性。测试K562细胞辐照以确保辐照剂是合格/有效的。在以50、100、150Gy辐照进行辐照后第1-14天时，在平铺之后测试生长和/或生存率的动力学。
使用辐照的K562细胞在各种NK:K562比率(例如1:2、1:1、1:3、1:5比率)下测试脐带血衍生的NK细胞的扩增。
使用RetroNectin涂覆的AFC袋与RetroNectin涂覆的板比较转导效率。
然后例如通过比较G-Rex、Xuri、Bioflow及Xcellerex生物反应器系统来放大过程。
从1×108个CD56+细胞开始生成多于1×1011个CD56+细胞。首先使用较少培养物实施测试以定义生长及扩增参数且证实功能性。不期望受限于理论，细胞因高度扩增而损失功效，因此细胞扩增与功能之间的平衡是放大的主要考虑。
所用测试抗体/试剂包含但不限于：抗CD56亮紫(Brilliant Violet)605(BioLegend,San Diego,CA)、抗CD3 APC-H7、颗粒酶B-PE-CF594、CCR4-BV421、CXCR3-PerCPCy5.5、NKp46-BV711(BD Biosciences,San Jose CA)、CD57-PerCP(Bioss Woburn MA)、抗CD16亮紫650及抗CD19 PE(Miltenyi Biotec Inc.)、CD44-BV785、CXCR4-BV605、2B4-PE、NKG2D-PE、DNAM-FITC、TbetBV711、CD16-BV650、CX3CR1-PE-Cy7、CD62L-PE-Cy7、CXCR1-PE、CCR7-FITC、PD-1-BV421、NKp30-生物素(来自Biolegend)、NKp44-PerCP-eflour 710、脱中胚蛋白-efluor-660、KLRG-1-PE(eBiosciences San Diego CA)、DAP12-PE、CD158-FITC(R&D Minneapolis MN)、DAP10-FITC(Antibodies-Online Atlanta GA)、NKG2A-PE-Cy7(Beckman Coulter Irving,TX)。
表1示例性测试
Figure BDA0004112630850000681
Figure BDA0004112630850000691
如上文所陈述，实施K562测试，包含但不限于产生纯系K562-基因修饰细胞的库(若细胞并非纯系的，则再克隆)；测试库的生存率、无菌性、支原体、内毒素、HLA和/或基因修饰的表面标志物(例如mb IL-15、mb IL-21、CD64、CD86、CD137L等)；研发K562-基因修饰细胞的分析证明；确保辐照剂经校准且剂量施用经验证，以及测试在100Gy、200Gy细胞的辐照且测试14天的增殖/存活。
表2示例性表型分析
Figure BDA0004112630850000692
实施同种异体产物的供体合格性筛选及测试，包含但不限于测试下列各项中的一种或多种：人类免疫缺陷病毒(HIV)1型及2型；人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型及II型；B型肝炎病毒(HBV)；C型肝炎病毒(HCV)；CMV、寨卡、西尼罗；苍白密螺旋体；HHV6/HHV7。
脐带血含有总共大约5×108个有核细胞(TNC)，其中的30％是NK细胞。因此，每一个脐带血单元(60mL)含有约1～2×108个NK细胞。
表3示例性表征
测试 方法
生存率、细胞计数 7-AAD染色、流式细胞术
无菌性 Gram,21CFR610.12
内毒素 鲎阿米巴样细胞溶解物(Limulus amebocyte lysate)，Endosafe
支原体 MycoAlert快速检测试剂盒
HHV测试 测试HHV6、HHV7
残余肿瘤负荷 流式细胞术
细胞数 流式细胞术
CAR表达 CAR+细胞％，流式细胞术
纯度、表型 CD56+细胞％，流式细胞术
转基因拷贝数 Taqman PCR
功效 针对靶抗原+细胞的细胞毒性
属性 供体及最终产物的HLA匹配(低分辨率I类)
表4示例性过程中测试
Figure BDA0004112630850000701
Figure BDA0004112630850000711
表5示例性释放测试：NK-FLT3-CAR
Figure BDA0004112630850000712
Figure BDA0004112630850000721
测试NK纯度。不期望受限于理论，至关重要的是应减少来自NK产物的T细胞，这是因为患者在接受≥0.5×105个T细胞/kg体重时发生≥II级急性移植物抗宿主病(GvHD)，且在T细胞污染为0.03×105个T细胞/kg体重时NK细胞剂量充分耐受，由此定义≤0.3％CD3+细胞的接受准则。例如参见Stern M,Passweg JR,Meyer-Monard S等人，Preemptiveimmunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT:aprospective Phase II study in two centers.Bone Marrow Transplant 2013；48:433-438。
实施功效分析。利用CAR-NK细胞使用用于IFN-γ、IL-15及TNF-α的ELISA和/或用于细胞毒性活性的分析(例如杀死分析、去颗粒分析(例如用于CD107a去颗粒分析的FACS)及用于细胞内细胞因子IFN-γ和/或TNF-α的FACS)来测试CAR+及CAR-靶细胞。3号实验：用于生成具有大尺寸转基因的载体的稳定逆转录病毒生产者-293VEC-BaE
在293Vec-GalV及293Vec-BaEV包装细胞上评估逆转录病毒进入受体的表达，且使用两种细胞系Jurkat T及HT1080进行滴定。
在逆转录病毒中，狒狒内源性病毒(BaEV)及猫类内源性逆转录病毒(RD114)使用普通细胞表面受体ASCT2(钠依赖性中性氨基酸转运蛋白)进入细胞。除ASCT2外，BaEV也使用ASCT1作为细胞进入受体。长臂猿白血病病毒(GALV)使用钠依赖性磷酸转运蛋白(Pit1)作为其进入受体。参见图8A。在两种包装细胞系293Vec-GalV及293Vec-BaEV以及两种滴定细胞系Jurkat T及HT1080上实施针对ASCT1、ASCT2及Pit1的免疫染色。参见图8B中所展示的结果。可使用两种细胞系Jurkat T及HT1080来滴定三种逆转录病毒包膜蛋白BaEV、RD114及GALV，因为它们进入受体的普遍表达。对于基于293的包装细胞系293Vec GALV及293VecBaEV而言，仅GALV假型逆转录病毒可使用进入受体Pit1将其感染。
用于生成稳定逆转录病毒生产者-293VEC-BaEV的转导策略的工作流程提供于本文中。
使用基于莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo-MuLV)的逆转录病毒载体(PCIR)作为靶转基因递送媒介。使用BaEV假型化293Vec-BaEV包装细胞系来产生媒介以感染脐带血衍生的NK细胞。
使用以下两种包装细胞系进行此产生：293Vec-GALV(用于产生瞬时长臂猿白血病病毒(GALV)假型上清液)及293Vec-BaEV(用于生成最终载体)。两种细胞系都由BioVecPharma供应。
首先，通过使用试剂PEI MAX 40K(Polysciences,Inc，目录号：24765)瞬时转染包装细胞系293Vec-GALV来生成GALV假型逆转录病毒上清液。简而言之，在转染前一天，将60万个293Vec-GALV接种于6孔板的孔上的3ml完全DMEM培养基(含有10％热灭活胎牛血清)。在转染当天，293Vec-GALV应80％汇合。将总共2.5μg含有靶转基因的单一基于Mo-MuLV的逆转录病毒载体稀释于150μl Opti-MEMTM减血清培养基中。同时，也将总共10μg/10μl的PEIMAX 40K稀释于150μl Opti-MEMTM减血清培养基中。质粒/DNA与PEI MAX 40K的比率为1:4。然后将稀释的DNA添加至PEI 40K中，混合孔，并在室温下于通风橱中培养12分钟。在培养之后，将300μl DNA-PEI MAX 40K复合物轻轻逐滴添加至3ml培养物中的细胞中。
然后使用此上清液转导BaEV假型化包装细胞系293Vec-BaEV以生成批量生产者。对于高效价克隆生成而言，可通过限制性稀释进一步单细胞克隆该293Vec-BaEV批量生产者并筛选通过滴定从每一个克隆生成的上清液所选择的高效价克隆。
然后，可以从高效价稳定逆转录病毒生产者-293VEC-BaEV连续产生上清液。
从用于具有大尺寸转基因的载体的稳定逆转录病毒生产者-293VEC-BaEV观察到原始上清液的改进的效价。参见图10。
“多个靶标组合为一个”是由申请人研发的独特治疗策略。使用BaEV假型化293Vec-BaEV包装细胞系来产生媒介。用于具有较大转基因插入体(>11kb)的质粒的代表性逆转录病毒由293Vec-BaEV包装细胞瞬时及稳定地产生。将总共3.5百万个293Vec-BaEV包装细胞接种于100mm组织培养盘中，并在37℃下培养48-72h。板应达到90-100％汇合。然后收集原始上清液并在1500g下旋转5min。在Jurkat T细胞上滴定上述上清液。将一系列病毒上清液加载于RetroNectin预涂覆的非组织培养液处理的24孔板上并使用包括10％热灭活胎牛血清的完全DMEM培养基达到500μl。将板在32℃、2000g下旋转2小时，且添加10万个Jurkat T细胞，并在1000g下旋转5min。将板在37℃下培养48h，然后实施流式细胞术分析以根据下式测定效价(转导单位/ml)：转导单位(TU)/mL＝[(靶细胞数)×(阳性细胞％)]。在此实例中，通过针对人类CD34抗体(QBEnd/10)(别藻蓝蛋白)(Novus Biologicals,LLC,#FAB7227A)的流式抗体检测报告基因RQR8。B).与暂时产生的病毒(TU＝2.2E5)相比，来自用于具有大尺寸转基因的载体的稳定逆转录病毒产生者-293VEC-BaEV(TU＝7.2E5)的原始上清液具有改进的效价。
等效物
应当理解，尽管已联合上述实施方案描述了本发明，但前述描述及实例旨在进行说明且并不限制本发明的范围。本领域技术人员应了解本发明范围内的其他方面、优点及修改。
应当理解，尽管本发明已通过具体实施方案及任选地特征具体地公开，但本领域技术人员可采取对本文中所公开的实施方案的修改、改进及变化，且这些修改、改进及变化视为在本发明范围内。本文所提供的材料、方法及实例代表特定的实施方案，是示例性的且并不旨在限制本发明的范围。
本发明范围已经在本文中广泛地且一般性地予以描述。在一般公开内容内的更窄的种及亚属群中的每一个都形成本发明的一部分。此包含一般描述，条件或消极限制系将任何目标物从该类属中去除，而不管所除去材料是否在本文中具体叙述。
此外，当本发明的特征或方面以马库什组的形式描述时，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组成员的任何单个成员或子组的形式描述。
本文所提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献的全部内容都以引用方式明确地并入本文中，其并入程度如同每一个文献单独地以引用方式并入一样。如有冲突，则以本说明书(包括定义)为准。
部分序列表
IgG1铰链结构域：LEPKSCDKTHTCPPCPDPKGT(SEQ ID NO:1)
CD28跨膜及细胞质结构域：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:2)
CD3ζ信号传导结构域：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:3)
IL 2信号肽：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:4),
IgG1信号肽：MGWSSIILFLVATATGVH(SEQ ID NO:5)
抗NKG2D抗原结合结构域的CDR：
CDRL1:SGSSSNIGNNAVN(SEQ ID NO:6)
CDRL2:YDDLLPS(SEQ ID NO:7)
CDRL3:AAWDDSLNGPV(SEQ ID NO:8)
CDRH1:GFTFSSY(SEQ ID NO:9)
CDRH2:RYDGSN(SEQ ID NO:10)
CDRH3:DRGLGDGTYFDY(SEQ ID NO:11)
抗NKG2D轻链可变区：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:12)
抗NKG2D重链可变区：
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:13)
肽接头：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:14)
人类IgG4 Fc区：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:81)
具有F234A、L235A及N297Q突变(即分别是SEQ ID NO:81的aa 16、aa 17及aa79处的突变)的人类IgG4 Fc区等效物
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:82)
人类肌肉醛缩酶(HMA)肽接头：PSGQAGAAASESLFVSNHAY(SEQ ID NO:83)
可检测标志物：YPYDVPDYA(SEQ ID NO:84)
T2A肽：HVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:85)
编码信号肽的核苷酸序列：
ATGGGGTGGTCAAGCATTATTCTGTTTCTGGTCGCTACCGCTACAGGCGTCCAT(SEQ ID NO:86)
编码信号肽的核苷酸序列：
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACA GT(SEQ IDNO:87)
编码连接肽的核苷酸序列：
GGTGGGGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGAGGTGGCAGT(SEQ ID NO:88)
编码跨膜及细胞质结构域的核苷酸序列：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAG
TGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTA
CATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:89)
编码信号传导结构域的核苷酸序列：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCA
GCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG
ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:90)或其等效物；
编码可切割肽的核苷酸序列：
CACGTGGGTTCTGGAGAAGGACGCGGTTCCTTGTTGACGTGTGGCGATGTAGAGGAAAATCCGGGTCCA(SEQ ID NO:91)
编码接头的核苷酸序列：
CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTTGTGTCAAATCACGCCTAC(SEQ IDNO:92)
编码铰链结构域的核苷酸序列：
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCGGATCCCAAAGGTACC(SEQID NO:109)
肽接头：(甘氨酸-丝氨酸)n，其中n是1至6的整数，(SEQ ID NO:110)
6×His标签：His His His His His His(SEQ ID NO:111)
铰链结构域：IgG1重链铰链编码序列：
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG(SEQ ID NO:112)
CD28跨膜区编码序列：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG(SEQ ID NO:113)
4-1BB共刺激信号传导区编码序列：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:114)
CD28共刺激信号传导区编码序列：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:115)
CD3ζ信号传导区编码序列：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:116)
人类CD8α铰链结构域：
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY(SEQ ID NO:117)。
小鼠CD8α铰链结构域：
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY(SEQ ID NO:118)。
猫CD8α铰链结构域：
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY(SEQ ID NO:119)。
人类CD8α跨膜结构域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:120)。
小鼠CD8α跨膜结构域：IWAPLAGICVALLLSLIITLI(SEQ ID NO:121)。
大鼠CD8α跨膜结构域：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI(SEQ ID NO:122)。
4-1BB共刺激信号传导区：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:123)
CD28序列：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:124)
ICOS共刺激信号传导区编码序列：
acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgagagcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta(SEQ ID NO:125)
OX40共刺激信号传导区编码序列：
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCACAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGACCCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC(SEQ ID NO:126)
接头：GGGGS(SEQ ID NO:134)。
接头：(GGGGS)n，其中n可为整数1(SEQ ID NO:134)或2(SEQ ID NO:135)或3(SEQID NO:14)或4(SEQ ID NO:136)或5(SEQ ID NO:137)或6(SEQ ID NO:138)或7(SEQ ID NO:139)或8(SEQ ID NO:140)或9(SEQ ID NO:141)或10(SEQ ID NO:142)或11(SEQ ID NO:143)或12(SEQ ID NO:144)或13(SEQ ID NO:145)或14(SEQ ID NO:146)或15(SEQ ID NO:147)或更大。
EF1α启动子序列：
AAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGT
CCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGC
GCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTG
GGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTT
TGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCG
CCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGC
CTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAG
ACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCAC
GCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC(SEQ ID NO:148)
SEQ ID NO:71的反向序列：AVGTIVDQSAK(SEQ ID NO:151)
IgG1重链信号肽DNA
ATGGAATTTGGGCTGCGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGATGTCCAGTGT(SEQ ID NO:168)
蛋白质
MEFGLRWVFLVAILKDVQC(SEQ ID NO:169)
IgG1 FcDNA
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC
CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC
TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA
GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC
CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC
CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA
GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC
CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT
TCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC
TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGAGCTGCAACTGGAGGAGAGCTGTGCGGAGGCGCAGGACGGGGA
GCTGGACGGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCATCACACTCTTCCTGTTAAGCGTG
TGCTACAGTGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGATCTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAAGCAGACCATCATCCCCGACTACAGGAACATGATCGGACAGGGGGCC(SEQ ID NO:170)
由IgG1 FcDNA编码的蛋白质
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESCAEAQDGELDGLWTTITIFITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIIPDYRNMIGQGA(SEQ ID NO:171)
本发明的示例性实施方案
实施方案1.一种假型γ逆转录病毒颗粒，其包含经修饰的RD114猫类内源性逆转录病毒包膜糖蛋白(RD114TR)及经修饰的狒狒包膜糖蛋白(BaEVTR)，其中：
a.所述RD114TR糖蛋白包含RD114糖蛋白的胞外结构域及跨膜结构域以及双嗜性鼠类白血病病毒(MLV-A)糖蛋白的细胞质结构域；且
b.其中所述BaEVTR糖蛋白包含狒狒包膜糖蛋白(BaEV)的胞外结构域及跨膜结构域以及MLV-A糖蛋白的细胞质结构域。
实施方案2.根据实施方案1所述的假型γ逆转录病毒颗粒，其中所述RD114TR及所述BaEVTR作为膜蛋白并入所述γ逆转录病毒颗粒的包膜中。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的假型γ逆转录病毒颗粒，其进一步包含封装于所述包膜中的载体基因组，其中所述载体基因组包含下列侧接有两个长末端重复(LTR)中的一种或多种：
(A)编码嵌合抗原受体(CAR)或另一种治疗性蛋白或多肽的多核苷酸，所述治疗性蛋白或多肽任选地选自抗体或其片段、酶、配体或受体，
(B)(A)的反向互补序列，或
(C)包括一个或多个识别位点的多核苷酸，这些识别位点任选地由适用于将CAR编码序列或其反向互补序列插入所述多核苷酸中的限制酶识别及切割。
实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的假型γ逆转录病毒颗粒，其中所述载体基因组进一步包含下列各项中的一种或多种：5’LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’LTR。
实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的假型γ逆转录病毒颗粒，其进一步包含逆转录酶或整合酶中的任一种或两种。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的假型γ逆转录病毒颗粒，其是选自下列物种中的任一种：莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(friend murine embryonic stemcell virus，FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)及猫类白血病病毒。
实施方案7.一种制备自然杀伤(NK)细胞的群体的方法，其包含将包含下列各项中的一种或多种的细胞群体与免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)一起培养：NK细胞、能够衍生NK细胞的祖细胞或能够衍生NK细胞的干细胞，其中该细胞群体在细胞群体中耗尽表达以下各项中的一种或多种的细胞：CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR，且其中所述免疫细胞活化剂是选自下列(i)至(iv)中的一种或多种：
(i)人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原，
(ii)一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别且结合NK细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖NK细胞，任选地其中所述抗体是选自以下中的一种或多种：抗CD2抗体、抗CD16抗体、抗NKG2D抗体、抗DNAM-1抗体、抗2B4抗体、抗NTB-A抗体或抗NKp46(天然细胞毒性受体1(NCR1))抗体，
(iii)一种或多种因此活化或增殖NK细胞的细胞因子，或
(iv)一种或多种因此活化或增殖NK细胞的化学部分，其任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)。
实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其进一步包含将编码CAR或另一种任选地选自抗体或其片段、酶、配体或受体的治疗性蛋白或多肽的多核苷酸引入培养的细胞群体中以用于表达，其中所述CAR特异性识别且结合所述肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原。
实施方案9.根据实施方案8所述的方法，其进一步包含在实施方案8的所述引入步骤之后将所述细胞群体与免疫细胞活化剂一起培养，其中所述免疫细胞活化剂是选自下列(i)至(iv)中的一种或多种：
(i)人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原，
(ii)一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别且结合NK细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖NK细胞，
(iii)一种或多种因此活化或增殖NK细胞的细胞因子，或
(iv)一种或多种因此活化或增殖NK细胞的化学部分，其任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)，任选地其中使用相同或不同的免疫细胞活化剂或其组合重复所述培养步骤一次、两次、三次或更多次。
实施方案10.根据实施方案7至9中任一项所述的方法，其中这些aAPC进一步表达以下各项中的一种或多种：4-1BBL、膜结合(mb)IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25结合的mb IL-2突变体、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的mb IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)或调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物。
实施方案11.根据实施方案7至10中任一项所述的方法，其中这些aAPC进一步表达mb IL-21及4-1BBL。
实施方案12.根据实施方案7至11中任一项所述的方法，其中这些aAPC是工程化K562细胞。
实施方案13.根据实施方案7至12中任一项所述的方法，其中辐照这些aAPC，因此缺乏细胞增殖或缺乏长期存活。
实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中在50Gy、100Gy、150Gy或200Gy下辐照这些aAPC。
实施方案15.根据实施方案7至14中任一项所述的方法，其中以约10:1、约5:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:5或约1:10的细胞数比将所述aAPC与该细胞群体一起培养。
实施方案16.根据实施方案7至15中任一项所述的方法，其中这些细胞因子是选自由以下组成的组：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、缺乏CD25结合的IL-2突变体、IL-7、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803可溶性)、IL-15、IL-18、IL-21、LEC、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)或MICA。
实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中将所述细胞群体与100-500IU/mlIL-2、20ng/ml IL-15或25ng/mL IL-21中的任一项或任两项或所有三项一起培养。
实施方案18.根据实施方案16所述的方法，其中将所述细胞群体与50IU/ml IL-2和0.5ng/ml IL-15中的任一项或两项一起培养。
实施方案19.根据实施方案16所述的方法，其中将所述细胞群体与50IU/ml IL-2一起培养。
实施方案20.根据实施方案9至19中任一项所述的方法，其中在所述引入步骤之前和之后与所述细胞群体一起培养的所述活化剂是相同的。
实施方案21.根据实施方案9至19中任一项所述的方法，其中在所述引入步骤之前和之后与所述细胞群体一起培养的所述活化剂彼此不同。
实施方案22.根据实施方案8至21中任一项所述的方法，其包含将假型γ逆转录病毒颗粒引入所述培养的细胞群体中，由此将所述CAR编码多核苷酸引入所述培养的细胞中，其中所述颗粒包含侧接有两个长末端重复(LTR)的所述CAR编码多核苷酸或其反向互补序列、RD114TR及BaEVTR。
实施方案23.根据实施方案22所述的方法，其中所述假型γ逆转录病毒颗粒包含载体基因组，所述载体基因组包含5’LTR、5’帽、所述CAR编码多核苷酸或其反向互补序列、3’聚-A尾部及3’LTR。
实施方案24.根据实施方案22或23所述的方法，其中所述假型γ逆转录病毒颗粒进一步包含逆转录酶及整合酶中的任一项或两项。
实施方案25.根据实施方案22至24中任一项所述的方法，其中所述假型γ逆转录病毒颗粒选自以下任何物种：莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)及猫类白血病病毒。
实施方案26.根据实施方案22至25中任一项所述的方法，其中以约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的感染复数(MOI)将所述假型γ逆转录病毒颗粒引入所述培养的细胞群体中。
实施方案27.根据实施方案8至26中任一项所述的方法，其中将所述细胞群体在所述引入步骤之前培养至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天或至少约10天。
实施方案28.根据实施方案8至27中任一项所述的方法，其中将所述细胞群体在所述引入步骤之前培养不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过15天、不超过3周或不超过1个月。
实施方案29.根据实施方案8至27中任一项所述的方法，其中将所述细胞群体在所述引入步骤之前培养约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。
实施方案30.根据实施方案8至29中任一项所述的方法，其中通过在RetroNectin存在下转导包含所述CAR编码多核苷酸或其反向互补序列的病毒载体来将所述CAR编码多核苷酸引入所述细胞群体中。
实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中将所述RetroNectin涂覆于转导所述细胞群体的容器的内表面上。
实施方案32.根据实施方案30或31所述的方法，其中所述细胞群体表达整联蛋白α4β1(VLA-4)及整联蛋白α5β1(VLA-5)中的任一种或两种。
实施方案33.根据实施方案7至32中任一项所述的方法，其中所述细胞群体是分离自对象的血样。
实施方案34.根据实施方案7至33中任一项所述的方法，其中所述细胞群体分离自以下各项中的一种或多种：对象的脐带血、对象的的外周血或对象的骨髓。
实施方案35.根据实施方案7至34中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包括祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生的细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生的细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞。
实施方案36.根据实施方案7至35中任一项所述的方法，其进一步包含富集所述细胞群体中表达以下各项中的任一种或多种的细胞：CD56、CD25、CD122、CD212、CD215、CD218、CD360、TGF-βR或IL-10R，且任选地进一步包含富集CD56dim细胞及CD56bright细胞中的任一项或两项。
实施方案37.根据实施方案7至36中任一项所述的方法，其中任何细胞群体包含自然杀伤(NK)细胞或其实质上纯化的组合物。
实施方案38.根据实施方案7至37中任一项所述的方法，其中所述耗尽的细胞群体包含下列各项中的一种或多种：NK细胞、祖细胞、HSC、iPSC或其各自的实质上纯化的群体。
实施方案39.根据实施方案37或38所述的方法，其中这些NK细胞包含衍生自下列各项中的一种或多种的细胞：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生的细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生的细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞。
实施方案40.根据实施方案38所述的方法，其中这些祖细胞、HSC或iPSC中的一种或多种能够衍生NK细胞。
实施方案41.根据实施方案7至40中任一项所述的方法，其中任何细胞群体实质上不含T细胞。
实施方案42.根据实施方案7至41中任一项所述的方法，其中任何细胞群体实质上不含T调控细胞。
实施方案43.根据实施方案7至42中任一项所述的方法，其中任何细胞群体是分离的、富集或纯化的。
实施方案44.根据实施方案7至43中任一项所述的方法，其中在所述培养步骤中将所述细胞群体及这些aAPC在选自以下的细胞培养基中一起培养：StemSpan(Stemcell#09960)、NK
Figure BDA0004112630850000831
培养基(Miltenyi research 30-114-429；GMP:170-076-356)、TexMACS(170-076-306GMP培养基)、Cellgenix无血清干细胞生长培养基(SCGM,#20806-0500)或ImmunoCultTM-XF培养基(来自Stemcell technologies)。
实施方案45.根据实施方案7至44中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤中的任一项或两项：
将所述CAR表达群体调配成组合物；及
冷冻保存所述CAR表达群体。
实施方案46.根据实施方案7至45中任一项所述的方法，其自1×108个细胞生成大于1×1011个细胞。
实施方案47.根据实施方案7至46中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤中的任一项或两项：
在一个或多个步骤之前或之后洗涤所述细胞群体，及
在一个或多个步骤之前或期间或之后检测下列各项中的一种或多种：
(i)所述细胞群体的生存率；
(ii)所述细胞群体的无菌性；
(iii)所述细胞群体中的支原体；
(iv)所述细胞群体的人类白血球抗原(HLA)类型；
(v)所述细胞群体的细胞数；
(vi)所述细胞群体的细胞表型；
(vii)所述细胞群体或包括所述细胞群体的组合物中的HHV6或HHV7或二者；
(viii)所述细胞群体或包含所述细胞群体的组合物中的以下各项中的一种或多种：人类免疫缺陷病毒(HIV)1型及2型、人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)I型及II型、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、CMV、寨卡(Zika)、西尼罗(West Nile)或苍白密螺旋体(Treponema pallidum)；
(ix)这些aAPC的细胞表型；
(x)包含所述细胞群体的组合物中的IL-15含量；
(xi)所述细胞群体中的CAR表达；
(xii)所述细胞群体或包含所述细胞群体的组合物中的内毒素；
(xiii)包含所述细胞群体的组合物的残余肿瘤负荷和/或aAPC污染；
(xiv)所述细胞群体的后代；
(xv)由所述细胞群体释放的IFN-γ、IL-15及TNF-α；
(xvi)所述细胞群体的细胞毒性活性；
(xvii)所述细胞群体的去颗粒；及
(xviii)监测或测定培养物的下列各项中的一种或多种：细胞聚集、葡萄糖或乳酸盐。
实施方案48.根据实施方案47所述的方法，其中所述表型检测包含检测下列各项中的一种或多种的细胞表达或表达含量：CD3、CD56、抗原(例如CD19)、CD45、HLA、NKp46、NKG2D、NKG2A、NCRs、DNAM-1、CD16、IL-2R、CXCR4、KIRS、CD8、CD57、黏附分子、NKG2C、CD107a、CAR或由所述细胞群体表达的细胞表面标志物。
实施方案49.根据实施方案48所述的方法，其中所述表型检测包含检测所述细胞群体对CD56的细胞表达含量。
实施方案50.根据实施方案8至49中任一项所述的方法，其中所述CAR的抗原结合结构域特异性识别且结合下列各项中的一种或多种：
G蛋白偶合受体C类家族5成员D(GPRC5D)、B细胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7(CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)、表皮生长因子受体变体III(EGFRVIII)、FLT3、CD70、间皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人类表皮生长因子受体2(HER2)、ERBB2(Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1(CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、白介素13受体α2(IL13Ra2)、鸟苷酰基环化酶C(GUCY2C)、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、胸苷激酶1(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神经节苷脂G2(GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮细胞黏附分子前体(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、黏蛋白1(Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、纤维母细胞活化蛋白α(FAP)、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2前体(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位切断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、天冬酰胺内肽酶、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、FCRL5或IGLL1。
实施方案51.根据实施方案8至50中任一项所述的方法，其中所述抗原是选自下列各项或其各自的片段中的一种或多种：
G蛋白偶合受体C类家族5成员D(GPRC5D)、B细胞成熟抗原(BCMA)、SLAMF7(CS1或CD319)、EGFR、野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)、表皮生长因子受体变体III(EGFRVIII)、FLT3、CD70、间皮素、CD123、CD19、癌胚抗原(CEA)、CD133、人类表皮生长因子受体2(HER2)、ERBB2(Her2/neu)、CD22、CD30、CD171、CLL-1(CLECL1)、GTPase活化蛋白(GAP)、CD5、白介素13受体α2(IL13Ra2)、鸟苷酰基环化酶C(GUCY2C)、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、胸苷激酶1(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT1)、癌症/睪丸(CT)、CD33、神经节苷脂G2(GD2)、GD3、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、TAG72、CD38、CD44v6、上皮细胞黏附分子前体(EpCam或EPCAM)、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL-11Rα、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRSS21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、黏蛋白1(Muc1)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、纤维母细胞活化蛋白α(FAP)、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2前体(EphA2)、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺素、存活素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位切断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、天冬酰胺内肽酶、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、FCRL5或IGLL1。
实施方案52.根据实施方案8至51中任一项所述的方法，其中所述CAR包含(1)特异性识别且结合抗原的抗体的抗原结合结构域；(2)铰链结构域；(3)跨膜结构域；及(4)细胞内结构域，其包含信号传导结构域。
实施方案53.根据实施方案8至52中任一项所述的方法，其中所述CAR包含(1)特异性识别且结合抗原的抗体的抗原结合结构域；(2)铰链结构域；(3)跨膜结构域；及(4)细胞内结构域，其包括信号传导结构域及共刺激结构域。
实施方案54.根据实施方案8至53中任一项所述的方法，其中所述CAR进一步包含信号肽。
实施方案55.根据实施方案53或54所述的方法，其中所述铰链结构域包含CD8α铰链结构域。
实施方案56.根据实施方案53至55中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。
实施方案57.根据实施方案53至56中任一项所述的方法，其中所述细胞内结构域进一步包含(1)一个或两个或更多个共刺激信号传导区。
实施方案58.根据实施方案57所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包含CD28共刺激信号传导区或4-1BB共刺激信号传导区或二者。
实施方案59.根据实施方案53至58中任一项所述的方法，其中所述信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。
实施方案60.根据实施方案8至59中任一项所述的方法，其中所述所引入的多核苷酸进一步表达细胞因子及抗体中的一种或多种，或其中所述方法进一步包含将表达细胞因子及抗体中的一种或多种的另一多核苷酸引入耗尽的细胞群体中。
实施方案61.根据实施方案60所述的方法，其中由所述多核苷酸表达的所述细胞因子是选自下列各项中的一种或多种：B7.1(可溶的或膜结合的)、CCL19(可溶的或膜结合的)、CCL21(可溶的或膜结合的)、CD40L(可溶的或膜结合的)、CD137L(可溶的或膜结合的)、GITRL(可溶的或膜结合的)、GM-CSF(可溶的或膜结合的)、IL-12(可溶的或膜结合的)、IL-2(可溶的或膜结合的)、低毒性IL-2(可溶的或膜结合的)、缺乏cd25结合的IL-2类似物(可溶的或膜结合的)、IL-15-N72D超激动剂以及IL-15RαSushi-Fc融合蛋白(可溶的或膜结合的)、IL-15(可溶的或膜结合的)、IL-18(可溶的或膜结合的)、IL-21(可溶的或膜结合的)、LEC(可溶的或膜结合的)、OX40L(可溶的或膜结合的)、IL-7(可溶的或膜结合的)、ICOSL(B7H2、B7RP1，可溶的或膜结合的)或MICA(可溶的或膜结合的)。
实施方案62.根据实施方案60或61所述的方法，其中由所述多核苷酸表达的所述抗体是单特异性抗体或双特异性抗体或多特异性抗体。
实施方案63.根据实施方案60至62中任一项所述的方法，其中由所述多核苷酸表达的所述抗体是免疫细胞活化剂。
实施方案64.根据实施方案8至63中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸进一步编码信号肽。
实施方案65.根据实施方案8至64中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸进一步包含自杀基因。
实施方案66.根据实施方案65所述的方法，其中所述自杀基因产物是选自以下中的一种或多种：HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧基酯酶、细胞色素P450或PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)、截短的EGFR或可诱导的半胱天冬酶(caspase)(“iCasp”)。
实施方案67.根据实施方案65或66所述的方法，其中所述多核苷酸进一步包含引导表达所述自杀基因的调控序列且其中所述调控序列是可诱导的。
实施方案68.根据实施方案8至67中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸进一步包含引导表达所述CAR或所述治疗性蛋白的调控序列。
实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中引导表达所述CAR或所述治疗性蛋白的所述调控序列是诱导型或组成型活性的。
实施方案70.根据实施方案8至69中任一项所述的方法，其中通过载体将所述多核苷酸引入所述细胞群体中。
实施方案71.根据实施方案70所述的方法，其中所述载体是病毒载体或非病毒载体。
实施方案72.根据实施方案71所述的方法，其中所述非病毒载体是质粒。
实施方案73.根据实施方案71所述的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或疱疹病毒载体。
实施方案74.根据实施方案8至73中任一项所述的方法，其中所制备的表达CAR的细胞群体适用于抑制癌细胞生长且其中所述抗原是由所述癌细胞表达的肿瘤相关抗原(TAA)。
实施方案75.一种抑制癌细胞生长的方法，其包含使通过根据实施方案8至74中任一项所述的方法制得的CAR表达细胞群体与所述癌细胞接触，其中由所述CAR识别的所述抗原是由该癌细胞表达的TAA。
实施方案76.一种治疗对象的癌症的方法，其包含向所述对象施用通过根据实施方案8至74中任一项所述的方法制得的CAR表达性免疫细胞的群体，其中由所述CAR识别的所述抗原是由所述癌症的细胞表达的TAA。
实施方案77.根据实施方案76所述的方法，其中所述细胞群体包含NK细胞及小于或等于0.3％的CD3+细胞。
实施方案78.根据实施方案76或77所述的方法，其中向所述对象施用小于3×103个T细胞/公斤体重。
实施方案79.根据实施方案74至78中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是选自以下器官的癌细胞：循环系统，例如心脏(肉瘤[血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤]、黏液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤及脂肪瘤)、纵隔及胸膜及其他胸内器官、血管肿瘤及肿瘤相关血管组织；呼吸道，例如鼻腔及中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管及肺，例如小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、支气管癌(鳞状细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、肺泡(支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠道系统，例如食道(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胃、胰脏(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌肿瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌肿瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；出现于任何部位的胃肠道基质肿瘤及神经内分泌肿瘤；泌尿生殖道，例如肾(腺癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilm's tumor)[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和/或尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睪丸(精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质性细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、类腺瘤肿瘤、脂肪瘤)；肝，例如肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤、胰脏内分泌肿瘤(例如嗜铬细胞瘤、胰岛素瘤、血管活性肠肽肿瘤、胰岛细胞肿瘤及胰高血糖素瘤)；骨，例如成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞肿瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨黏液样纤维瘤、骨样骨瘤及巨细胞肿瘤；神经系统，例如中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、变形性骨炎)、脑膜癌(脑膜瘤、脑脊膜肉瘤、神经胶质过多)、脑癌(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性神经胶母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；生殖系统，例如妇科，子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(子宫颈癌、肿瘤前期子宫颈发育不良)、卵巢(卵巢癌[浆液囊腺癌、黏液囊腺癌、未分类癌]、粒层泡膜细胞肿瘤、支持-间质细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、胎盘、阴道(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄形肉瘤(胚胎型横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)及与女性生殖器官有关的其他部位；阴茎、前列腺、睪丸及与男性生殖器官有关的其他部位；血液系统，例如血液(骨髓样白血病[急性及慢性]、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增殖性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、何杰金氏疾病(Hodgkin'sdisease)、非何杰金氏淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；口腔，例如唇、舌、齿龈、口底、上颚及其他口腔部分、腮腺及其他唾液腺部分、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状隐窝、下咽及唇、口腔及咽中的其他部位；皮肤，例如，恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、结构不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤及瘢痕瘤；肾上腺：神经母细胞瘤；及其他组织，包括结缔组织及软组织、腹膜后腔及腹膜、眼睛、眼内黑色素瘤及附属结构、乳房、头或/及颈、肛门区、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺腺及其他内分泌腺及相关结构、淋巴结的继发性和非特异性恶性肿瘤、呼吸和消化系统的继发性恶性肿瘤、以及其他部位的继发性肿瘤。
实施方案80.根据实施方案74至79中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是实体肿瘤细胞。
实施方案81.根据实施方案74至79中任一项所述的方法，其中所述癌细胞并非实体肿瘤的细胞，任选地其中所述癌细胞是白血病癌细胞。
实施方案82.根据实施方案74至81中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是原发性癌细胞或转移性癌细胞。
实施方案83.根据实施方案74至82中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是来自癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
实施方案84.根据实施方案75及79至83中任一项所述的方法，其中所述接触是在体内或在体外进行。
实施方案85.根据实施方案74至84中任一项所述的方法，其进一步包含使所述细胞与单独疗法接触或施用单独疗法。
实施方案86.根据实施方案85所述的方法，其中所述单独疗法包含手术切除术、化学疗法、辐射疗法、免疫疗法及靶向疗法。
实施方案87.根据实施方案85或86所述的方法，其中所述单独疗法是一线疗法、二线疗法、三线疗法或四线疗法。
实施方案88.一种NK细胞或其群体，其是通过根据实施方案7至74中任一项所述的方法产生的或制备的。
实施方案89.一种组合物，其包含根据实施方案88所述的细胞或其群体及载体，任选地药学上可接受的载体。
实施方案90.根据实施方案88所述的细胞或其群体或根据实施方案89所述的组合物，其包含小于0.5％的aAPC。
实施方案91.根据实施方案88或90所述的细胞或其群体或根据实施方案89或90所述的组合物，其包含小于0.1％或小于0.2％或小于0.3％、小于0.4％或小于0.5％的aAPC。
实施方案92.根据实施方案88和90至91中任一项所述的细胞或其群体或根据实施方案89至91中任一项所述的组合物，其具有下列性质中的一种或多种：
(A)不小于70％的存活率；
(B)无菌；
(C)含有小于5EUKg-1h-1的内毒素；
(D)对于以下中的一种或多种为阴性：支原体、外来病毒或HHV(HHV6或HHV7)；
(E)包含大于1×106个细胞/公斤待治疗对象体重；
(F)在总细胞中包含大于40％的表达CAR的细胞；
(G)在总细胞中包含大于95％的表达CD56的细胞；
(H)在总细胞中包含小于0.3％的表达CD3的细胞；
(I)包含小于4个多核苷酸拷贝/细胞；
(J)在不存在IL-2或IL-21下无增殖；
(K)具有功效，例如在IFNγ分泌或CD107分析中具有10倍以上的增加；及
(L)表达一种或多种抗原(例如CD19、NKp46或NKG2D)。
实施方案93.根据实施方案92所述的细胞或其群体或根据实施方案92所述的组合物，其具有下列性质中的一项或两项：
(E’)包含大于1×107个细胞/公斤待治疗对象体重；或
(F’)在总细胞中包含大于50％的表达CAR的细胞。
实施方案94.一种工程化aAPC，其表达抗原及以下细胞表面标志物中的一种或多种：4-1BBL、膜结合(mb)IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25结合的mb IL-2突变体、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的mb IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)或调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物。
实施方案95.根据实施方案94所述的aAPC，其中这些aAPC是工程化K562细胞。
实施方案96.根据实施方案94或95所述的aAPC，其中辐照这些aAPC，因此缺乏细胞增殖或长期存活或缺乏二者。
实施方案97.根据实施方案96所述的aAPC，其中在50Gy、100Gy、150Gy或200Gy下辐照这些aAPC。
实施方案98.根据实施方案94至97中任一项所述的aAPC，其中这些aAPC并不实质上存活14天以上。
实施方案99.一种试剂盒，其包含一种或多种适用于根据实施方案7至87中任一项所述的方法的药剂和任选地说明。
实施方案100.根据实施方案99所述的试剂盒，其中这些药剂是选自下列各项中的一种或多种：编码CAR或另一种治疗性蛋白的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、用于检测细胞表型的抗体、用于分离或富集或纯化免疫细胞的抗体、用于检测多核苷酸的引物、细胞因子及aAPC。
实施方案101.一种制备γδT细胞的群体的方法，其包含将包含下列各项中的一种或多种的细胞群体与免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)一起培养：γδT细胞、能够衍生γδT细胞的祖细胞或能够衍生γδT细胞的干细胞，其中所述细胞群体在细胞群体中耗尽表达以下各项中的一种或多种的细胞：T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR，且其中所述活化剂是选自下列(i)至(iv)中的一种或多种：
(i)人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原，
(ii)一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别且结合γδT细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖γδT细胞，
(iii)一种或多种细胞因子，因此活化或增殖γδT细胞，或
(iv)一种或多种化学部分，因此活化或增殖γδT细胞，这些化学部分任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)。
实施方案102.根据实施方案101所述的方法，其进一步包含将编码CAR或另一种任选地选自抗体或其片段、酶、配体或受体的治疗性蛋白的多核苷酸引入培养的细胞群体中以用于表达，其中所述CAR特异性识别且结合所述肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原。
实施方案103.根据实施方案102所述的方法，其进一步包含在实施方案102的引入步骤之后将所述细胞群体与免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)一起培养，其中所述活化剂是选自下列(i)至(iv)中的一种或多种：
(i)人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原，
(ii)一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别且结合γδT细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖γδT细胞，
(iii)一种或多种细胞因子，因此活化或增殖γδT细胞，或
(iv)一种或多种化学部分，因此活化或增殖γδT细胞，这些化学部分任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)；
任选地其中使用相同或不同的活化剂重复培养步骤一次、两次、三次或更多次。
实施方案104.根据实施方案101至103中任一项所述的方法，其中所述细胞群体包含下列各项中的一种或多种：γδT细胞或其实质上纯化的组合物。
实施方案105.根据实施方案101至104中任一项所述的方法，其中所述耗尽的细胞群体包含下列各项中的一种或多种：γδT细胞、HSC、iPSC或其各自的实质上纯化的群体。
实施方案106.根据实施方案105所述的方法，其中这些祖细胞、HSC或iPSC中的一种或多种能够衍生γδT细胞。
实施方案107.根据实施方案101或106所述的方法，其中这些γδT细胞包含衍生自下列各项中的一种或多种的细胞：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生的细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生的细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞。
实施方案108.根据实施方案101至107中任一项所述的方法，其中所述细胞群体实质上不含表达TCRα链或TCRβ链的细胞。
实施方案109.一种用于产生假型γ逆转录病毒颗粒的病毒包装系统，其包含：(a)表达载体基因组的质粒；(b)包装质粒；及(c)一种或多种表达RD114TR及BaEVTR的包膜质粒。
实施方案110.根据实施方案109所述的病毒包装系统，其中所述载体基因组包含侧接有两个长末端重复(LTR)的下列中的一种或多种：
(A)编码嵌合抗原受体(CAR)或另一种治疗性蛋白的多核苷酸，所述治疗性蛋白任选地选自抗体或其片段、酶、配体或受体，
(B)(A)的反向互补序列，或
(C)包括一个或多个识别位点的多核苷酸，这些识别位点由适合于将CAR编码序列或其反向互补序列插入所述多核苷酸中的限制酶识别。
实施方案111.根据实施方案109至110中任一项所述的病毒包装系统，其中所述载体基因组进一步包含下列各项中的一种或多种：5’LTR、5’帽、3’聚-A尾部及3’LTR。
实施方案112.根据实施方案109至111中任一项所述的病毒包装系统，其中所述假型γ逆转录病毒颗粒是选自以下任何物种：莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)及猫类白血病病毒。
实施方案113.根据实施方案109至112中任一项所述的病毒包装系统，其进一步包含包装细胞系。
实施方案114.根据实施方案113所述的病毒包装系统，其中所述包装细胞系是293T细胞系。
实施方案115.一种产生假型γ逆转录病毒颗粒的方法，其包含在适合于包装所述假型γ逆转录病毒颗粒的条件下使用根据实施方案109至112中任一项所述的系统来转导包装细胞系。
实施方案116.根据实施方案115所述的方法，其中所述包装细胞系是293T细胞系。
实施方案117.根据实施方案115或116所述的方法，其中所述细胞系以1.5:1.5:1的比率使用(a)、(b)及(c)的质粒来转导。
实施方案118.根据实施方案115至116中任一项所述的方法，其中所述包装系统包含至少两种包膜质粒，一种表达RD114TR且另一种表达BaEVTR。
实施方案119.根据实施方案118所述的方法，其中该细胞系以1.5:1.5:1:1的比率使用(a)的质粒、(b)的质粒、RD114TR表达质粒及BaEVTR表达质粒来转导。

Claims (31)

1.一种假型γ逆转录病毒颗粒，其包含经修饰的RD114猫类内源性逆转录病毒包膜糖蛋白(RD114TR)和经修饰的狒狒包膜糖蛋白(BaEVTR)，其中：
a.RD114TR糖蛋白包含RD114糖蛋白的胞外结构域和跨膜结构域和双嗜性鼠类白血病病毒(MLV-A)糖蛋白的细胞质结构域；并且
b.其中BaEVTR糖蛋白包含狒狒包膜糖蛋白(BaEV)的胞外结构域和跨膜结构域和MLV-A糖蛋白的细胞质结构域，
任选地其中RD114TR和BaEVTR作为膜蛋白被并入γ逆转录病毒颗粒的包膜中；以及
另外任选地其中所述假型γ逆转录病毒颗粒进一步包含封装于所述包膜中的载体基因组、任选地逆转录酶和任选地整合酶，其中所述载体基因组包含侧接有两个长末端重复(LTR)的下列中的一个或多个：
(A)编码嵌合抗原受体(CAR)或另一种治疗性蛋白或多肽的多核苷酸，所述治疗性蛋白或多肽任选地选自抗体或其片段、酶、配体或受体，
(B)(A)的反向互补序列，或
(C)包括一个或多个识别位点的多核苷酸，所述识别位点任选地由适合于将CAR编码序列或其反向互补序列插入所述多核苷酸中的限制酶识别和切割。
2.根据权利要求1所述的假型γ逆转录病毒颗粒，其中所述载体基因组进一步包含下列中的一种或多种：5’LTR、5’帽、3’聚-A尾部和3’LTR。
3.根据权利要求1或2所述的假型γ逆转录病毒颗粒，其是选自下列物种中的任一种：莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)和猫类白血病病毒。
4.一种制备自然杀伤(NK)细胞的群体的方法，其包含将包含下列中的一种或多种的细胞群体与免疫细胞活化剂(例如NK细胞活化剂)一起培养：NK细胞、能够衍生NK细胞的祖细胞或能够衍生NK细胞的干细胞，其中所述细胞群体在细胞群体中耗尽表达下列中的一种或多种的细胞：CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR，并且其中所述免疫细胞活化剂选自下列(i)至(iv)中的一个或多个：
(i)人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原，
(ii)一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别和结合NK细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖NK细胞，任选地其中所述抗体选自下列中的一种或多种：抗CD2抗体、抗CD16抗体、抗NKG2D抗体、抗DNAM-1抗体、抗2B4抗体、抗NTB-A抗体或抗NKp46(天然细胞毒性受体1(NCR1))抗体，
(iii)一种或多种因此活化或增殖NK细胞的细胞因子，或
(iv)一种或多种因此活化或增殖NK细胞的化学部分，其任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包含下列步骤中的一项或两项：
将编码CAR或另一种任选地选自抗体或其片段、酶、配体或受体的治疗性蛋白或多肽的多核苷酸引入培养的细胞群体中用于表达，其中所述CAR特异性识别和结合所述肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原；或
在权利要求4的引入步骤之后将细胞群体与免疫细胞活化剂一起培养，其中所述免疫细胞活化剂是选自下列(i)至(iv)中的一个或多个：
(i)人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原，
(ii)一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别和结合NK细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖NK细胞，
(iii)一种或多种因此活化或增殖NK细胞的细胞因子，或
(iv)一种或多种因此活化或增殖NK细胞的化学部分，其任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)，
任选地其中使用相同或不同的免疫细胞活化剂或其组合重复培养步骤一次、两次、三次或更多次。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述aAPC进一步表达下列中的一种或多种：4-1BBL、膜结合(mb)IL-15、mbIL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)、MICA、CD 40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25结合的mb IL-2突变体、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的mb IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)或调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物，任选地其中所述aAPC进一步表达mb IL-21和4-1BBL，任选地其中所述aAPC是工程化K562细胞，任选地其中所述aAPC被辐照，因此缺乏细胞增殖或缺乏长期存活，另外任选地其中在50Gy、100Gy、150Gy或200Gy下辐照所述aAPC，以及任选地其中以约10:1、约5:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:5或约1:10的细胞数比率将所述aAPC与所述细胞群体一起培养。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、缺乏CD25结合的IL-2突变体、IL-7、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803可溶的)、IL-15、IL-18、IL-21、LEC、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)或MICA，任选地其中将所述细胞群体与100-500IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15或25ng/mL IL-21中的任一种或任两种或所有三种一起培养，任选地其中将所述细胞群体与50IU/ml IL-2和0.5ng/ml IL-15中的任一种或两种一起培养，任选地其中将所述细胞群体与50IU/ml IL-2一起培养。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中在所述引入步骤之前和之后与所述细胞群体一起培养的活化剂是相同的，或者其中在所述引入步骤之前和之后与所述细胞群体一起培养的活化剂彼此不同。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其包含将假型γ逆转录病毒颗粒引入培养的细胞群体中，因此将CAR编码多核苷酸引入培养的细胞中，其中所述颗粒包含侧接有两个长末端重复(LTR)的所述CAR编码多核苷酸或其反向互补序列、RD114TR和BaEVTR，任选地其中所述假型γ逆转录病毒颗粒包含载体基因组，所述载体基因组包含5’LTR、5’帽、所述CAR编码多核苷酸或其反向互补序列、3’聚-A尾部和3’LTR，任选地其中所述假型γ逆转录病毒颗粒进一步包含逆转录酶和整合酶中的任一种或两种，任选地其中所述假型γ逆转录病毒颗粒选自以下任何物种：莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)和猫类白血病病毒，任选地其中以约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10的感染复数(MOI)将所述假型γ逆转录病毒颗粒引入所述培养的细胞群体中。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其中在引入步骤之前将所述细胞群体培养至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天或至少约10天，任选地其中在引入步骤之前将所述细胞群体培养不超过7天、不超过8天、不超过9天、不超过10天、不超过11天、不超过12天、不超过13天、不超过14天、不超过15天、不超过3周或不超过1个月，任选地其中在引入步骤之前将所述细胞群体培养约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中在RetroNectin存在下通过转导包含所述CAR编码多核苷酸或其反向互补序列的病毒载体来将所述CAR编码多核苷酸引入所述细胞群体中，任选地其中将所述RetroNectin涂覆于转导所述细胞群体的容器的内表面上，进一步任选地其中所述细胞群体表达整联蛋白α4β1(VLA-4)和整联蛋白α5β1(VLA-5)中的任一种或两种。
12.根据权利要求4至11中任一项所述的方法，其进一步包含富集所述细胞群体中表达CD56、CD25、CD122、CD212、CD215、CD218、CD360、TGF-βR或IL-10R中的任一种或多种的细胞，以及任选地进一步包含富集CD56dim细胞及CD56bright细胞中的任一种或两种。
13.根据权利要求4至12中任一项所述的方法，其中任何细胞群体包含自然杀伤(NK)细胞或其实质上纯化的组合物，任选地其中耗尽的细胞群体包含下列中的一种或多种：NK细胞、祖细胞、HSC、iPSC或其各自的实质上纯化的群体，任选地其中所述NK细胞包含衍生自下列中的一种或多种的细胞：祖细胞、胚胎干细胞、胚胎干细胞衍生的细胞、胚胎生殖细胞、胚胎生殖细胞衍生的细胞、干细胞、干细胞衍生的细胞、多能干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)或永生化细胞，进一步任选地其中所述祖细胞、HSC或iPSC中的一种或多种能够衍生NK细胞，任选地其中任何细胞群体实质上不含T细胞，任选地其中任何细胞群体实质上不含T调控细胞，任选地其中任何细胞群体是分离的、富集或纯化的。
14.根据权利要求4至13中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤中的任一个或两个：将CAR表达群体配制成组合物；或者冷冻保存所述CAR表达群体。
15.一种抑制癌细胞的生长的方法，其包含将通过权利要求5至14中任一项所述的方法制备的CAR表达细胞的群体与所述癌细胞接触，其中由CAR识别的抗原是由所述癌细胞表达的TAA。
16.一种治疗对象中癌症的方法，其包含向所述对象施用通过权利要求5至14中任一项所述的方法制备的CAR表达免疫细胞的群体，其中由CAR识别的抗原是由所述癌症的细胞表达的TAA。
17.一种NK细胞或其群体，其通过权利要求4至14中任一项所述的方法产生或制备。
18.一种组合物，其包含权利要求17的细胞或其群体和载体，任选地药学上可接受的载体。
19.根据权利要求17所述的细胞或其群体或根据权利要求18所述的组合物，其包含小于0.5％的aAPC、任选地小于0.1％或小于0.2％或小于0.3％、小于0.4％或小于0.5％的aAPC。
20.一种工程化aAPC，其表达抗原和下列细胞表面标志物中的一种或多种：4-1BBL、膜结合(mb)IL-15、mb IL-21、CD64、CD80、CD83、CD86、OX40L、ICOSL(B7H2、B7RP1)、MICA、CD40L、CD137L、mb IL-2、mb IL-18、mbIL-12、缺乏CD25结合的mb IL-2突变体、与IL-15RαSushi-Fc融合蛋白复合的mb IL-15-N72D超激动剂(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)或调节CD122/CD132信号传导的细胞表面标志物，任选地其中所述aAPC是工程化K562细胞，任选地其中所述aAPC被辐照，因此缺乏细胞增殖或长期存活或二者，进一步任选地其中在50Gy、100Gy、150Gy或200Gy下辐照所述aAPC，任选地其中所述aAPC实质上不会存活14天以上。
21.一种试剂盒，其包含一种或多种适用于如本文所公开的方法中的药剂和任选地说明，任选地其中所述药剂选自下列中的一种或多种：编码CAR或另一种治疗性蛋白的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、用于检测细胞表型的抗体、用于分离或富集或纯化免疫细胞的抗体、用于检测多核苷酸的引物、细胞因子及aAPC。
22.一种用于制备γδT细胞的群体的方法，其包含将包含下列中的一种或多种的细胞群体与免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)一起培养：γδT细胞、能够衍生γδT细胞的祖细胞或能够衍生γδT细胞的干细胞，其中所述细胞群体在细胞群体中耗尽表达下列中的一种或多种的细胞：T细胞受体(TCR)α链、TCRβ链或αβTCR，以及其中所述活化剂选自下列(i)至(iv)中的一个或多个：
(i)人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原，
(ii)一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别和结合γδT细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖γδT细胞，
(iii)一种或多种细胞因子，因此活化或增殖γδT细胞，或
一种或多种化学部分，因此活化或增殖γδT细胞，任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)。
23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包含将编码CAR或另一种任选地选自抗体或其片段、酶、配体或受体的治疗性蛋白的多核苷酸引入培养的细胞群体中用于表达，其中所述CAR特异性识别和结合所述肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原。
24.根据权利要求23所述的方法，其进一步包含在权利要求23的引入步骤之后将所述细胞群体与免疫细胞活化剂(例如γδT细胞活化剂)一起培养，其中所述活化剂是选自下列(i)至(iv)中的一个或多个：
(i)人工抗原递呈细胞(aAPC)，其表达任选地活化和/或刺激免疫细胞生长的肿瘤相关抗原(TAA)或病毒抗原，
(ii)一种或多种抗体或其抗原结合片段，其特异性识别和结合γδT细胞、祖细胞或干细胞中的一种或多种上的刺激受体，因此活化或增殖γδT细胞，
(iii)一种或多种细胞因子，因此活化或增殖γδT细胞，或
(iv)一种或多种化学部分，因此活化或增殖γδT细胞，任选地选自mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或STING活化环状二核苷酸(CDN)；
任选地其中使用相同或不同的活化剂重复培养步骤一次、两次、三次或更多次。
25.一种用于产生假型γ逆转录病毒颗粒的病毒包装系统，其包含：(a)表达载体基因组的质粒；(b)包装质粒；以及(c)一种或多种表达RD114TR及BaEVTR的包膜质粒，任选地其中所述载体基因组包含侧接有两个长末端重复(LTR)的下列中的一个或多个：
(A)编码嵌合抗原受体(CAR)或另一种治疗性蛋白的多核苷酸，所述治疗性蛋白任选地选自抗体或其片段、酶、配体或受体，
(B)(A)的反向互补序列，或
(C)包括一个或多个识别位点的多核苷酸，所述识别位点由适合于将CAR编码序列或其反向互补序列插入所述多核苷酸中的限制酶识别，
任选地其中所述载体基因组进一步包含下列中的一种或多种：5’LTR、5’帽、3’聚-A尾部和3’LTR，
任选地其中所述假型γ逆转录颗粒选自下列任何物种：莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)、鼠类干细胞病毒(MSCV)、弗里德鼠类胚胎干细胞病毒(FMEV)、嗜异性MuLB相关病毒、猫类肉瘤病毒、嗜异性鼠类白血病病毒相关病毒(XMRV)和猫类白血病病毒。
26.根据权利要求25所述的病毒包装系统，其进一步包含包装细胞系，任选地其中所述包装细胞系是293T细胞系。
27.一种用于产生假型γ逆转录病毒颗粒的方法，其包括在适合于包装所述假型γ逆转录病毒颗粒的条件下使用根据权利要求25或26所述的系统转导包装细胞系，任选地其中所述包装细胞系是293T细胞系，任选地其中所述细胞系是以1.5:1.5:1的比率使用(a)、(b)和(c)的质粒来转导，任选地其中所述包装系统包含至少两种包膜质粒，一种表达RD114TR且另一种表达BaEVTR，进一步任选地其中所述细胞系是以1.5:1.5:1:1的比率使用(a)的质粒、(b)的质粒、RD114TR表达质粒和BaEVTR表达质粒来转导。
28.一种用于产生逆转录病毒颗粒的方法，其包含
(i)将表达载体基因组的载体任选地质粒引入适合于将所述载体基因组包装至第一逆转录病毒颗粒中的第一包装细胞系中，
(ii)将所述第一逆转录病毒颗粒转导至适合于复制所述第一逆转录病毒颗粒的第二包装细胞系中；以及
(iii)分离经复制的逆转录病毒颗粒。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二包装细胞系在细胞膜中包含逆转录病毒包膜蛋白，但在所述细胞膜中不包含所述逆转录病毒包膜蛋白的进入受体，任选地其中所述逆转录病毒包膜蛋白是狒狒包膜糖蛋白(BaEV)且其进入受体是丙氨酸/丝氨酸/半胱氨酸/苏氨酸转运蛋白1(ASCT1)或钠依赖性中性氨基酸转运蛋白2型(ASCT2)，任选地其中所述逆转录病毒包膜蛋白是RD114逆转录病毒(RD114)的包膜糖蛋白且其进入受体是ASCT2，任选地其中所述逆转录病毒包膜蛋白是长臂猿白血病病毒包膜糖蛋白(GALV)且其进入受体是钠依赖性磷酸转运蛋白(Pit1)。
30.一种逆转录病毒颗粒，其通过权利要求28或29所述的方法产生。
31.一种用于产生工程化免疫细胞的方法，其包含将权利要求30所述的逆转录病毒颗粒转导至免疫细胞或其前体细胞中。
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