CN103937747B - 重组多刺激分子细胞及其制备方法和在nkt细胞扩增中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组多刺激分子细胞ME64/CD137L/mIL-18及其制备方法和在NKT细胞体外扩增中的应用；该细胞以MEG-01细胞为载体，转染CD64真核表达载体，经筛选，分选，获得ME64细胞；再制备双表达CD137L和mIL-18的真核表达载体；将该载体转染ME64细胞，获得ME64/CD137L/mIL-18细胞；该细胞易于大量制备、成本低、重复性好、能够稳定表达外源蛋白。该细胞用于NKT细胞体外扩增中可刺激NKT细胞的大量扩增，提高NKT细胞的增殖次数及肿瘤细胞杀伤毒性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域及疾病免疫治疗领域，具体涉及一种重组多刺激分子细胞及其制备方法和在NKT细胞体外扩增中的应用。
背景技术
重组多刺激分子细胞的制备原理是模拟T细胞活化的双重信号机制，在一定的载体表面展现抗原肽-MHC分子复合物及共刺激分子、黏附分子的配体或抗体构建而成，它能有效活化和扩增抗原特异性T细胞，而且效率高、可行性好。
目前用于制备重组多刺激分子细胞的载体主要有磁珠、细胞和脂质体三类，以磁珠为载体构建重组多刺激分子细胞虽然来源方便，但价格昂贵，应用于体内，会引起铁中毒，约束了其医疗应用前景；以脂质体为载体制备过程较为繁琐，成本较高，涉及脂质材料的购买、不同孔径大小脂质体的形成及确定等等步骤，且每次应用时必须从头开始制备，限制其广泛应用。
CD64是特异性的细胞毒剂的传递者，CD64组成性表达于单核细胞、Mφ及DC细胞；IFN-γ可明显上调单核细胞CD64的表达，并可诱导中性粒细胞和嗜酸性粒细胞CD64的表达；CD64是高亲和力的IgFc-gamma受体（FcγR?），可介导ADCC，通过IgG的调理促进对颗粒性抗原的吞噬作用，增加吞噬细胞释放IL-1\IL-6和TNF-α等细胞因子；CD64结合IgFc段后参与信号的传递。
CD137是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员，主要参与T细胞的扩增，生成与发育，也可以诱导外周血单核细胞的增殖，在TCR/CD3诱导下可促进T细胞的凋亡，同时可以调节与CD28共刺激的Th1细胞应激反应。TRAF受体蛋白可以与它相互作用，引导信号通路转向NF-κB的激活；CD137L就是与CD137相互作用的蛋白，利用外源表达载体转染ME64细胞，使CD137L蛋白以及IL-18得以表达，获得的重组多刺激分子细胞，可以很好的与NKT细胞相互作用，增强NKT细胞的肿瘤细胞靶向杀伤性。
在免疫调节过程中，mIL-18可以抑制癌症发生，它可以与mIL-12协同作用，诱导Th1细胞生成INF-γ作用于肿瘤细胞；同时，协同mIL-15或者单独作用，诱导T淋巴细胞的杀伤作用或杀伤性T淋巴细胞的活化；与mIL-12一起可以诱导mIL-13或者其它T淋巴细胞因子的生成。
NKT细胞（naturalkillerT细胞，一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故称之为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点；因此，应用NKT细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
NKT细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%—5%，因此如何在体外有效的扩增出大量杀伤力强、数量多的NKT细胞成为临床应用的关键。目前，现有的NKT细胞的体外扩增主要应用外源性细胞因子，如抗CD3McAb和IL-2等，而在肿瘤细胞杀伤过程中，增强NKT细胞的靶向杀伤性以及杀伤效力，显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组多刺激分子细胞及其制备方法，解决现有技术中重组多刺激分子细胞制备过程复杂、成本高及重复性差的问题。
本发明的另一目的是提供上述重组多刺激分子细胞在NKT细胞体外扩增中的应用，该重组多刺激分子细胞可刺激NKT细胞的大量扩增，抑制NKT细胞的凋亡，提高NKT细胞的增殖次数及肿瘤细胞杀伤毒性。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
提供一种重组多刺激分子细胞，其为能在人急性髓系白血病细胞MEG-01细胞表面稳定表达CD64、CD137L和mIL-18的细胞，即ME64/CD137L/mIL-18细胞。
制备上述重组多刺激分子细胞的方法，包括以下步骤：
a、构建CD64真核表达载体，将该载体转染MEG-01细胞，再经筛选，分选，获得能够在MEG-01细胞表面稳定表达CD64的细胞，即ME64细胞；
b、制备双表达CD137L和mIL-18共刺激信号的真核表达载体；
c、将步骤b制得的真核表达载体转染所述ME64细胞，再经筛选，分选，获得能够在ME64细胞表面稳定表达CD137L和mIL-18的细胞，即ME64/CD137L/mIL-18细胞。
步骤a具体为：获取CD64的cDNA，再将CD64cDNA进行PCR扩增，获得CD64cDNA的PCR扩增产物；将所述CD64cDNA的PCR扩增产物与pGEMT载体连接，构建pGEMT-CD64原核表达载体；再分别对pGEMT-CD64和pcDNA3.1(+)进行NotⅠ和ApaⅠ双酶切，并对酶切产物进行连接，构建pcDNA3.1(+)-CD64真核表达载体，即CD64真核表达载体；再将CD64真核表达载体转染MEG-01细胞，经G418筛选，FACS分选，获得ME64细胞；
其中，扩增CD64cDNA的引物序列为：
上游序列：5'-TATGCGGCCGCATGGATTTCACTGCTCCCACC-3'
下游序列：5'-GGGGGGCCCAATAGATAGACCGTCACCCTT-3'。
所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃1分钟，72℃90秒，最终72℃延伸30分钟。
步骤b具体为：获取CD137L的cDNA，再将CD137LcDNA进行PCR扩增，获得CD137LcDNA的PCR扩增产物；将所述CD137LcDNA的PCR扩增产物与pGEMT载体连接，构建pGEMT-CD137L原核表达载体；其中，扩增CD137LcDNA的引物的序列为：
上游序列：5'-GGCCGCCATGGAATACGCCTCTGA-3'；
下游序列：5'-CAGCTGTGGGTGAGGAAGGGGTTC-3'；
Ⅱ、获取mIL-18的cDNA，再将mIL-18cDNA进行PCR扩增，获得mIL-18cDNA的PCR扩增产物；将所述mIL-18cDNA与pGEMT载体连接，构建pGEMT-mIL-18原核表达载体；其中，扩增mIL-18cDNA的引物的序列为：
上游序列：5'-GAATTCGCCTGGACAGTCAGCAAG-3'
下游序列：5'-GAGCTCTCTAACGTGGTAACGCGA-3'；
Ⅲ、用NotⅠ和SalⅠ酶分别对pGEMT-CD137L和pVitro-2进行酶切，并对酶切产物进行连接，构建pVCD137L真核表达载体；
Ⅳ、用EcoRI和XhoI酶分别对pGEMT-mIL-18和pVCD137L进行酶切，并对酶切产物进行连接，制得双表达CD137L和mIL-18的真核表达载体pVCD137L-mIL-18。
步骤Ⅲ中，所述pGEMT-CD137L的酶切产物与pVitro-2的酶切产物按照3:1的比例进行连接；
步骤Ⅳ中，所述pGEMT-mIL-18的酶切产物与pVCD137L的酶切产物按照3:1的比例进行连接。
上述重组多刺激分子细胞在NKT细胞体外扩增中的应用，具体为：
将重组多刺激分子细胞ME64/CD137L/mIL-18进行致死性照射或丝霉素处理后，再与人外周血单个核细胞按照1:1的比例混合，在RPM1640培养基中共培养5-10天后，再加入与处理前相同数量的重组多刺激分子细胞ME64/CD137L/mIL-18继续培养10-20天后，收集NKT细胞。
将ME64/CD137L/mIL-18进行丝霉素处理，具体步骤为：
取ME64/CD137L/mIL-18细胞用浓度为10μg/ml的丝裂霉素在37℃下作用2小时后，无血清1640培养基洗2遍，用RPM1640培养基悬浮，再加入CD3单克隆抗体，使ME64/CD137L/mIL-18细胞的终浓度为100ng/ml，室温下作用60分钟即可。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1）本发明的重组多刺激分子细胞易于制备、成本低、重复性好、效力高，能够稳定表达外源蛋白；该重组多刺激分子细胞用于NKT细胞体外扩增中可刺激NKT细胞的大量扩增，抑制NKT细胞的凋亡，提高NKT细胞的增殖次数及肿瘤细胞杀伤毒性。
2）本发明所选用的人急性髓系白血病细胞MEG-01细胞是很好的转染载体，它能够高效稳定表达外源基因，同时具备流动性膜结构，因此能更好地传递刺激信号；并且，在用于NKT细胞体外扩增共培养前，加入丝裂霉素或致死性照射便可抑制其增殖，共培养时由于NKT细胞的杀伤作用而凋亡，保证了其体内应用的安全性。
3）本发明的制备方法以细胞为载体构建重组多刺激分子细胞，在肿瘤过继免疫治疗中应用，比以磁珠和脂质体为载体等方法更具稳定性、特异性以及高效性；并且，本发明通过构建双信号刺激通路，用于NKT细胞体外扩增当中可刺激NKT细胞的大量增殖，缩短培养周期，同时抑制NKT细胞的凋亡，提高NKT细胞的杀伤毒性。
4）本发明通过构建稳定细胞系，能够很好地将mIL-18蛋白质进行细胞内折叠，而通过在细胞膜表面进行表达能够更有效地对NKT细胞进行刺激，得到的细胞可以表达更高的穿孔素和颗粒酶，细胞毒性更强，杀瘤性更强。
附图说明
图1为本发明-实施例的CD64cDNA的PCR产物电泳图；
图2为本发明-实施例的pGEMT-CD64的双酶切结果电泳图；
图3为本发明-实施例的pcDNA3.1(＋)-CD64双酶切结果电泳图；
图4-1和图4-2为本发明-实施例的CD64在MEG-01细胞中表达的荧光显微图；
图5-1和图5-2为本发明-实施例的流式细胞仪检测CD64在MEG-01细胞表达的示意图；
图6为本发明-实施例的pGEMT-CD137L双酶切鉴定图；
图7为本发明-实施例的pGEMT-mIL-18双酶切鉴定图；
图8为本发明-实施例的pVCD137L双酶切图；
图9为本发明-实施例的pVitro-mIL-18双酶切图；
图10-1、图10-2、图10-3和图10-4为本发明-实施例的FACS检测三种外源性分子在MEG-01细胞表面表达率的示意图。
图11-1和图11-2为本发明-实施例的重组多刺激分子细胞刺激NKT细胞的杀伤效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。
1、ME64细胞的制备：获取CD64cDNA，对CD64cDNA进行PCR扩增，获得CD64cDNA的PCR扩增产物，再构建原核表达载体pGEMT-CD64，进一步构建其真核表达载体pcDNA3.1(＋)-CD64，将重组质粒pcDNA3.1(＋)-CD64转染MEG-01细胞，G418筛选，FACS分选获得ME64细胞；具体为：
（1）CD64cDNA的获取及目的片段扩增：取对数期U937细胞，用Trizol常规抽提RNA，以Oligod(T)n为引物，反转录mRNA生成cDNA；再将cDNA进行PCR扩增，获得CD64cDNA的PCR扩增产物，片段大小为1000pb左右，与实验设计的949bp大致相符；如图1所示，1为CD64cDNA的PCR扩增产物；2为DNAladder；
其中，用primer5.0软件设计扩增CD64cDNA的引物，两端分别加NotⅠ和ApaⅠ的酶切位点及保护型碱基；扩增CD64cDNA的引物的序列为：
上游序列：5'-TATGCGGCCGCATGGATTTCACTGCTCCCACC-3'
下游序列：5'-GGGGGGCCCAATAGATAGACCGTCACCCTT-3'。
PCR扩增反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃1分钟，72℃90秒，最终72℃延伸30分钟。
（2）CD64真核表达载体pcDNA3.1(＋)-CD64的构建
a、CD64cDNA的PCR扩增产物经胶回收试剂盒纯化，定量Marker确定浓度后，与pGEMT载体按3:1比例4℃连接过夜，将连接产物转化入DH5α的感受态菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落，在含AMP抗生素液体培养基中摇过夜，抽提pGEMT-CD64重组质粒，该质粒经双酶切鉴定后，显示为3kb和1kb左右的片段（见图2），获得pGEMT-CD64真核表达载体；酶切纯化后测序，比对证明为CD64的正确目的片段序列；图2中，1为pGEMT-CD64双酶切产物；2为DNAladder。
b、用NotⅠ和ApaⅠ酶分别对pGEMT-CD64和pcDNA3.1(+)进行双酶切，酶切产物纯化后，进行连接，将连接产物转化入DH5α的感受态菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落，在含AMP抗生素液体培养基中摇过夜，抽提pcDNA3.1(+)-CD64重组质粒，该质粒经双酶切鉴定后，获得显示为5.4kb和1kb左右的片段（见图3），获得pcDNA3.1(+)-CD64真核表达载体；试验证实CD64已经成功地克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)-CD64中；图3中，1为DNAladder，2为pcDNA3.1(+)-CD64双酶切产物。
（3）稳定表达外源CD64的MEG-01细胞系及ME64细胞系的建立
重组质粒pcDNA3.1(＋)-CD64转染MEG-01细胞：在无菌条件下抽提pcDNA3.1(＋)-CD64重组质粒，按照Invitrogen公司的说明书进行转染操作，具体过程为：取对数期生长的MEG-01细胞用无血清培养基洗两遍，在24孔板的每个孔中加入1×105个细胞，共十孔；取16μg的pcDNA3.1(＋)-CD64质粒用质粒稀释液稀释至总量400μl，再取32μl的脂质体用无血清培养基稀释至总量400μl，二者混合，微混匀，室温孵育10分钟，制得混合物；八孔中的每个孔加入100μl的混合物，另外两孔作为阴性对照，37℃、5%CO2培养4小时后加入完全培养基，48小时后加入潮霉素和G418进行筛选；在此期间，每3-4天换夜一次，低速离心去除死细胞，3周后筛选出潮霉素及G418抗性的细胞；其中，潮霉素浓度为200μg/ml。
（4）荧光显微镜检测CD64的表达：取G418抗性的ME64细胞1×105，再用PE标记的CD64单抗4℃孵育30分钟，PBS洗涤三遍后，再用PBS悬浮，荧光显微镜下观察，可见红色的荧光细胞，见图4-2；图4-1为PE-CD64标记MEG-01细胞；图4-2为PE-CD64标记ME64细胞。
（5）流式细胞仪（FACS）分选CD64阳性的细胞：取G418抗性的ME64细胞5×106，PE-CD64单抗标记，PBS洗涤；流式细胞仪分选后，继续培养1周，再次用流式细胞仪定量检测CD64的表达情况；图5-2显示CD64的表达率为97.5%；图5-1为转染MEG-01表达CD64的阳性率；图5-2为ME64表达CD64的阳性率。
2、制备双表达CD137L和mIL-18共刺激信号的真核表达载体，将该真核表达载体转染ME64细胞，再通过潮霉素筛选，流式细胞仪分选得到稳定表达CD137L和mIL-18的ME64细胞，即为ME64/CD137L/mIL-18细胞；
（1）CD137L基因片段的获取及鉴定：取正常人外周血5ml，Ficoll常规分离单个核细胞，加入PMA培养3天后，抽提RNA逆转录为cDNA，再将cDNA进行PCR扩增，获得CD137LcDNA的PCR扩增产物；
其中，用primer5.0软件设计扩增CD137LcDNA的引物，扩增CD137LcDNA的引物的序列为：
上游序列：5'-GGCCGCCATGGAATACGCCTCTGA-3'；
下游序列：5'-CAGCTGTGGGTGAGGAAGGGGTTC-3'；
CD137LcDNA的PCR扩增产物经胶回收试剂盒纯化后与pGEMT载体连接，将连接产物转化入DH5α的感受态菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落，在含AMP抗生素液体培养基中摇过夜，抽提pGEMT-CD137L重组质粒，该质粒经NotⅠ和SalⅠ酶双酶切鉴定正确后，获得pGEMT-CD137L原核表达载体；测序结果证实pGEMT-CD137L的插入片段与人CD137L分子有99%的同源性，见图6；图6中，1为DNAladder；2为pGEMT-CD137L双酶切产物。
（2）mIL-18基因的基因片段的获取及鉴定：
无菌抽取健康人外周血，EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞，经PHA刺激，37℃、0.5%CO2孵育30h，使淋巴因子得以表达，按照Trizol说明书提取mRNA，再反转录得到编码mIL-18的cDNA；再将cDNA进行PCR扩增，获得mIL-18cDNA的PCR扩增产物；
其中，用primer5.0软件设计扩增mIL-18cDNA的引物，扩增mIL-18cDNA的引物的序列为：
上游序列：5'-GAATTCGCCTGGACAGTCAGCAAG-3'
下游序列：5'-GAGCTCTCTAACGTGGTAACGCGA-3'；
mIL-18cDNA的PCR扩增产物经胶回收试剂盒纯化后与pGEMT载体连接，将连接产物转化入DH5α的感受态菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落，在含AMP抗生素液体培养基中摇过夜，抽提pGEMT-mIL-18重组质粒，该质粒经EcoRI和XhoI双酶切鉴定正确后，获得pGEMT-mIL-18真核表达载体；测序结果证实pGEMT-mIL-18的插入片段与人mIL-18有99%的同源性，见图7；图7中，1为pGEMT-mIL-18双酶切产物；2为DNAladder。
（3）双表达CD137L和mIL-18的真核表达载体pVCD137L-mIL-18的构建
将用NotⅠ和SalⅠ酶切下pGEMT-CD137L原核表达载体的插入片段CD137L，与经同样酶切处理的pVitro-2原核表达载体按3:1的比例4℃连接过夜，将连接产物转化入DH5α菌株后，次日挑取菌落，在含潮霉素的液体LB培养基中摇过夜，抽提pVCD137L重组质粒，酶切鉴定，获得pVCD137L真核表达载体；用EcoRI和XhoI酶切下pGEMT-mIL-18原核表达载体的片段mIL-18，与同样经过酶切处理的pVCD137L真核表达载体按3：1的比例连接，连接产物转化入DH5α感受态菌株中，次日挑取菌落，抽取pVitro-CD137L-mIL-18质粒，酶切鉴定，获得双表达CD137L和mIL-18的载体pVitro-CD137L-mIL-18，命名为pVCD137L-mIL-18真核表达载体（见图8和图9）；其中，图8和图9分别显示pVCD137L和pVCD137L-mIL-18双酶切鉴定mIL-18和CD137L的插入片段图；图8中，1为双酶切的CD137L目的片段和pVCD137L真核表达载体；2为DNAmarker；图9中，1为DNAmarker；2为双酶切的mIL-18目的片段和pVCD137L-mIL-18真核表达载体。
（4）稳定转染pVCD137L-mIL-18的ME64细胞系建立
在无菌条件下抽提pVCD137L-mIL-18质粒，按照Invitrogen公司的说明书进行转染操作具体过程为：取对数期生长的ME64细胞用无血清培养基洗两遍，在24孔板的每个孔中加入1×105个细胞，共十孔；取16μg的pVCD137L-mIL-18质粒用质粒稀释液稀释至总量400μl，取32μl的脂质体用无血清培养基稀释至总量400μl，二者混合，微混匀，室温孵育10分钟，制得混合物；八孔中的每个孔加入100μl的混合物，另外两孔作为阴性对照；37℃、5%CO2培养4小时后加入完全培养基，48小时后加入潮霉素和G418筛选；在此期间，每3-4天换夜一次，低速离心去除死细胞，3周后筛选出潮霉素及G418抗性的细胞；其中，潮霉素浓度为200μg/ml。
（5）FACS分选CD64、CD137L和mIL阳性表达的细胞ME64/CD137L/mIL-18：
收集潮霉素和G418筛选出的稳定转染pVmIL-18-CD137L的对数生长期的ME64细胞，PBS洗涤后，PE-CD64单抗、FITC-IL-18及PE-CY5-CD137L单抗标记，用流式细胞仪检测细胞表面CD64、CD137L和mIL-18蛋白表达，经FACS分选的阳性细胞继续培养1周，再次用流式细胞仪检测CD64、CD137L和mIL-18的表达情况，如图10-1、图10-2、图10-3和图10-4所示，图10-1和图10-2显示FACS检测三种外源性分子在MEG-01细胞表面的表达情况；图10-3和图10-4显示经潮霉素筛选稳定转染MEG-01细胞表面三种外源性分子的表达情况。
3、ME64/CD137L/mIL-18细胞与人单个核细胞（PBMC）共培养，刺激NKT细胞的增殖与细胞杀伤毒性
（1）取ME64/CD137L/mIL-18细胞用浓度为10μg/ml的丝裂霉素在37℃作用2小时后，无血清1640培养基洗2遍，用RPM1640细胞培养基悬浮，加入CD3单克隆抗体，使ME64/CD137L/mIL-18细胞的终浓度为100ng/ml，室温作用60分钟备用；
（2）用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞（PBMC）并计数；
（3）经过处理的重组多刺激分子细胞ME64/CD137L/mIL-18与人单个核细胞按2:1的比例混合，加入自体血清，使ME64/CD137L/mIL-18细胞的终浓度为1%。37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，于1周后加入与初次加入数量相等的相同方法制备的重组多刺激分子细胞ME64/CD137L/mIL-18，15天后收集NKT细胞；
（4）将步骤（3）中收集的NKT细胞与A549细胞共培养，检测NKT细胞杀伤A549细胞的能力，见图11-1和图11-2；图11-2为NKT细胞与A549共培养的杀伤效果。
结果表明：构建的重组多刺激分子细胞ME64/CD137L/mIL-18可以高效刺激NKT细胞的增殖，大大提高NKT细胞的杀伤毒性，提高了NKT细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤性；此外，ME64/CD137L/mIL-18细胞可增强其余的T淋巴细胞，协同NKT同时杀伤靶细胞，加强对肿瘤的杀伤力。
虽然结合具体实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但并非是对本专利保护范围的限定。在权利要求书所限定的范围内，本领域的技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改或调整仍受本专利的保护。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
序列表_CD64.txt
SEQUENCELISTING
<110>成都康景生物科技有限公司
<120>重组多刺激分子细胞及其制备方法和在NKT细胞扩增中的应用
<130>2014
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Claims (5)
1.重组多刺激分子细胞，其特征是：其为能在人急性髓系白血病细胞MEG-01细胞表面稳定表达CD64、CD137L和mIL-18的细胞，即ME64/CD137L/mIL-18细胞。
2.制备权利要求1所述的重组多刺激分子细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：
a、构建CD64真核表达载体，将该载体转染MEG-01细胞，再经筛选，分选，获得能够在MEG-01细胞表面稳定表达CD64的细胞，即ME64细胞；
b、制备双表达CD137L和mIL-18共刺激信号的真核表达载体；
c、将步骤b制得的真核表达载体转染所述ME64细胞，再经筛选，分选，获得能够在ME64细胞表面稳定表达CD137L和mIL-18的细胞，即ME64/CD137L/mIL-18细胞；
步骤a具体为：获取CD64的cDNA，再将CD64cDNA进行PCR扩增，获得CD64cDNA的PCR扩增产物；将所述CD64cDNA的PCR扩增产物与pGEMT载体连接，构建pGEMT-CD64原核表达载体；再分别对pGEMT-CD64和pcDNA3.1(+)进行NotⅠ、ApaⅠ双酶切，并对酶切产物进行连接，构建pcDNA3.1(+)-CD64真核表达载体，即CD64真核表达载体；再将CD64真核表达载体转染MEG-01细胞，经G418筛选，FACS分选，获得ME64细胞；
其中，扩增CD64cDNA的引物的序列为：
上游序列：5'-TATGCGGCCGCATGGATTTCACTGCTCCCACC-3'
下游序列：5'-GGGGGGCCCAATAGATAGACCGTCACCCTT-3'；
所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃1分钟，72℃90秒，最终72℃延伸30分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，步骤b具体为：
Ⅰ、获取CD137L的cDNA，再将CD137LcDNA进行PCR扩增，获得CD137LcDNA的PCR扩增产物；将所述CD137LcDNA的PCR扩增产物与pGEMT载体连接，构建pGEMT-CD137L原核表达载体；其中，扩增CD137LcDNA的引物的序列为：
上游序列：5'-GGCCGCCATGGAATACGCCTCTGA-3'
下游序列：5'-CAGCTGTGGGTGAGGAAGGGGTTC-3'；
Ⅱ、获取mIL-18的cDNA，再将mIL-18cDNA进行PCR扩增，获得mIL-18cDNA的PCR扩增产物；将所述mIL-18cDNA与pGEMT载体连接，构建pGEMT-mIL-18原核表达载体；其中，扩增mIL-18cDNA的引物的序列为：
上游序列：5'-GAATTCGCCTGGACAGTCAGCAAG-3'
下游序列：5'-GAGCTCTCTAACGTGGTAACGCGA-3'；
Ⅲ、用NotⅠ和SalⅠ酶分别对pGEMT-CD137L和pVitro-2进行酶切，并对酶切产物进行连接，构建pVCD137L真核表达载体；
Ⅳ、用EcoRI和XhoI酶分别对pGEMT-mIL-18和pVCD137L进行酶切，并对酶切产物进行连接，制得双表达CD137L和mIL-18的真核表达载体pVCD137L-mIL-18。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤Ⅲ中，所述pGEMT-CD137L的酶切产物与pVitro-2的酶切产物按照1:3的比例进行连接；
步骤Ⅳ中，所述pGEMT-mIL-18的酶切产物与pVCD137L的酶切产物按照3:1的比例进行连接。
5.权利要求1所述的重组多刺激分子细胞在NKT细胞体外扩增中的应用；
具体为：
将重组多刺激分子细胞ME64/CD137L/mIL-18进行致死性照射或丝霉素处理后，再与人外周血单个核细胞按照1:1的比例混合，在RPM1640培养基中共培养5-10天后，再加入与处理前相同数量的重组多刺激分子细胞ME64/CD137L/mIL-18继续培养10-20天后，收集NKT细胞；
将ME64/CD137L/mIL-18进行丝霉素处理，具体步骤为：
取ME64/CD137L/mIL-18细胞用浓度为10μg/ml的丝裂霉素在37℃下作用2小时后，无血清1640培养基洗2遍，用RPM1640培养基悬浮，再加入CD3单克隆抗体，使ME64/CD137L/mIL-18细胞的终浓度为100ng/ml，室温下作用60分钟即可。
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