CN109280086A - 一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体 - Google Patents

一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体 Download PDF

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Abstract

本发明属生物医学技术领域，涉及一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其结构域包含：（1）一个或多个靶抗原特异性结合的结构域；（2）细胞外间隔区结构域；（3）跨膜区结构域；（4）一个或多个共刺激信号结构域及细胞因子受体信号传导结构域；（5）细胞内信号传导结构域；（6）氧依赖降解结构域。一旦暴露在缺氧环境下，所述Hi‑CAR可高效表达在效应细胞膜上，特异性识别靶抗原，从而实现缺氧微环境特异激活的特性。由于肿瘤微环境较正常组织缺氧显著，本发明可显著降低对正常组织的损伤，同时提升特异性杀伤肿瘤的活性。

Description

一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体
技术 领域
本发明属生物医学技术领域，涉及一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体以及可表达肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体的基因工程化的细胞。
背景技术
基因工程化T细胞包括T细胞受体T细胞（TCR-T）和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）,基因工程化T细胞的过继转输已经成为癌症免疫疗法中极具前景的一种手段和方法，特别是近年来获得美国FDA批准上市的CAR-T细胞免疫疗法。嵌合抗原受体（CAR）为人工合成受体，由以下五个关键结构域构成，分别是胞外特异性识别肿瘤特异性抗原（TSA）或肿瘤相关抗原（TAA）的抗体单链可变片段（scFv）、配体或受体，铰链间隔区，跨膜结构域及胞内共刺激信号结构域和信号传导结构域。CAR区别于天然存在于T细胞受体（TCR），其不依赖主要组织相容性复合体（MHC）分子的限制性，可直接识别靶抗原，从而介导高水平的肿瘤细胞杀伤活性。
迄今为止，CAR-T细胞疗法已经在多个临床试验显示出了显著的疗效，特别是靶向CD19阳性的B淋巴细胞恶性肿瘤的CAR-T疗法的成功，极大激发了人们将CAR-T疗法应用于治疗实体瘤的兴趣，因为实体瘤约占所有肿瘤类型的90%。目前，已有多个临床试验正在测试CAR-T技术用于实体瘤治疗的方式。部分的临床试验结果显示，靶向HER2和CAIX的CAR-T技术在实体瘤治疗过程中带来了严重的副作用，甚至出现了致死病例。究其原因，CAR-T细胞靶向的抗原几乎都是肿瘤相关抗原（TAA），它们中的大多数还在正常组织低水平表达，导致“靶向非肿瘤细胞的毒副效应”（On-target off tumor），并可导致炎症因子风暴与中枢神经系统毒性。考虑到理想的肿瘤特异性抗原鉴定任务的极大挑战性和艰巨性，改善“靶向非肿瘤细胞的毒副效应”的一个潜在策略是工程化实体瘤的选择性机制至CAR结构中以允许区分肿瘤微环境中的靶抗原与正常组织的抗原。
T细胞免疫疗法已经成为黑色素瘤、B淋巴细胞恶性肿瘤及其它恶性肿瘤的一种有效治疗方法。其中，一种常用的T细胞免疫疗法为体外基因工程化T细胞以表达嵌合抗原受体（CAR），可识别肿瘤相关抗原且不依赖于MHC限制。这些CAR-T细胞具备强大的抗肿瘤活性，同时伴随增强的“靶向非肿瘤细胞的毒副效应”的毒性。因此需要着重降低上述毒副效应。
本发明专利描述了制备降低CAR-T细胞“靶向非肿瘤细胞的毒副效应”的组合物及方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供了一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体(Hi-CAR)用以降低现有技术中CAR-T细胞所伴随的“靶向非肿瘤细胞的毒副效应”的毒性。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体,所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体包括两部分组件，第一部分组件包括信号肽、胞外抗原特异性结合结构域、细胞外间隔区结构域、跨膜结构域、共刺激信号结构域、细胞因子信号传导结构域和胞内信号传导结构域；第二部分组件为氧依赖降解结构域。
优选的，所述胞外抗原特异性结合结构域包括但不限于鼠抗体、羊驼抗体、人源化抗体、人抗体、抗原结合片段、抗原特异性单链抗体Fv、配体、T细胞受体及其他受体胞外结构域及其组合。
优选的，该抗原受体N末端至C末端的结构排列为抗原特异性结合结构域-胞外间隔区结构域-跨膜结构域-共刺激信号结构域-胞内信号传导结构域-连接肽-氧依赖降解结构域。
优选的，所述细胞外间隔区结构域包括但不限于以下任何一种或多种：
（1）抗体的Fc片段或其功能等效物、片段或衍生物；
（2）抗体的铰链区或其功能等效物、片段或衍生物；
（3）抗体的CH2区；
（4）抗体的CH3区；
（5）免疫球蛋白Fc受体铰链区或其功能等效物、片段或衍生物
（6）人工间隔区序列及其组合。
优选的，所述细胞外间隔区结构域包括但不限于以下任何一种或多种：
（1）抗体IgG4的铰链区及其突变体；
（2）抗体IgG4的铰链区及其突变体和CH2区；
（3）抗体IgG4的铰链区及其突变体、CH2区和CH3区；
（4）抗体IgG1的铰链区及其突变体；
（5）抗体IgG1的铰链区及其突变体和CH2区；
（6）抗体IgG1的铰链区及其突变体、CH2区和CH3区；
（7）免疫球蛋白Fc受体的铰链区：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、FcαR（CD89）、FcεRI、FcεRII（CD23）；
（8）共刺激分子CD28铰链区、CD8α铰链区；
（9）或以上任何一种组合。
优选的，所述的跨膜结构域包括但不限于Ⅰ型跨膜蛋白跨膜区结构域、人工疏水跨膜区结构域及其组合。
优选的，所述的跨膜结构域包括但不限于以下任何一种或多种：T细胞受体复合物的CD3ξ链的跨膜区、CD28跨膜区、CD8α跨膜区、免疫球蛋白Fc受体跨膜区及其组合。
优选的，所述共刺激分子信号传导结构域包括但不限于以下任何一种或多种的信号传导结构域：CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、CD278（ICOS）、TLR2、Dap10、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFRI、TNFRII、Fas、CD30、CD40及其组合。
优选的，所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体还包括细胞因子信号传导结构域。
优选的，所述细胞因子信号传导结构域包括但不限于IL-7R、IL-15R、IL-21R及其组合。
优选的，所述胞内信号传导结构域包括但不限于以下一种或多种信号传导结构域：T细胞受体复合物的CD3ξ链、FcγRIII、FcεRI、Fc受体胞内信号传导域、携带免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）的信号传导域及其组合。
优选的，所述氧依赖降解结构域通过连接肽与嵌合抗原受体相连，该连接肽为1-50个富含甘氨酸（Gly）或丝氨酸（Ser）残基，其氨基酸序列为SEQ ID No：2的柔性连接肽。
优选的，所述氧依赖降解结构域（ODD）取自缺氧诱导因子1α（HIF-1α），包括但不限于全长型HIF-1α，氨基酸序列为SEQ ID No：1, 或其序列同源性至少为SEQ ID No：1的80%，且其23位为脯氨酸和185位为脯氨酸；以及C端截短型HIF-1α，氨基酸序列为SEQ ID No：16,或其序列同源性至少为SEQ ID No：16的80%，且其73位为脯氨酸。
优选的，针对肿瘤的特异性靶向抗原包括但不限于以下任意一种或多种：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、ROR1、CD38、CD123、CD133、NKG2D配体、ERBB2、MUC1、CD44v6、CD44v7、CD44v8、CEA、EpCAM、TAG72、KIT、IL-13Rα2、EGFR、EGFRvIII 、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、HMW-MAA、MAGE1、MAGEA3、GD2、CD171、NCAM、IL-11Rα、αFR、PSCA、PSMA、TARP、碳酸酐酶9（CAIX）、VEGFR2、BCMA、CTLA-4、PD-L1、GPC3、CD47、AXL、ROR2、FAP、HER2、整联蛋白α5β1、整联蛋白αvβ3、TGFβR、间皮素抗原（MSLN）。
优选的，所述抗原特异性结合结构域为抗人CD19蛋白分子的scFv，氨基酸序列为SEQ ID No：4；信号肽选自人CD8α信号肽，其氨基酸序列为SEQ ID No：3；胞外间隔区结构域为CD8分子的铰链区，氨基酸序列为SEQ ID No：5；跨膜结构域为CD8分子的跨膜结构域，其氨基酸序列SEQ ID No：6；共刺激信号结构域为4-1BB分子的共刺激信号结构域，其氨基酸序列为SEQ ID No：7；所述胞内信号传导结构域为CD3ξ分子的信号传导域，其氨基酸序列为SEQ ID No：8；所述的Hi-CAR第一部分组件通过柔性连接肽连接第二组件的氧依赖降解结构域，柔性连接肽为1-50个富含甘氨酸（Gly）或丝氨酸（Ser）残基，其氨基酸序列为SEQ IDNo：2，所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体为CD19 Hi-CAR，其氨基酸序列如SEQ ID No：11所示。
优选的，该载体编码如权利要求1所述的缺氧诱导型嵌合抗原受体。
优选的，所述病毒载体包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒及其组合。
优选的，所述细胞转导如权利要求17所述病毒载体。
优选的，包括但不限于未经分选纯化的T细胞、分选纯化的T细胞、分选纯化的PD-1+ T细胞、分选纯化的CD137+ T细胞、分选纯化的CD160+ T细胞、分选纯化的纯真T细胞（Tnaive）、分选纯化的中央记忆型T细胞（TCM）、分选纯化的效应记忆型T细胞（TEM）、分选纯化的效应T细胞（TEMRA）、分选纯化的过渡记忆型T细胞（Transitional Memory T cells，TTM）、分选纯化的组织记忆型T细胞（Tissue residential memory T cells，TRM）、天然杀伤细胞（Natural killer cells，NK）、天然杀伤T细胞（Natural killer T cells，NKT）、固有淋巴细胞（(Innate lymphoid cells, ILC）、造血干细胞、胚胎干细胞或多能干细胞。
优选的，所述方法包括：用如权利要求16所述的病毒载体转导一个或多个免疫细胞，额外添加抗人CD3刺激抗体和抗人CD28刺激抗体、表达抗原特异性结合结构域靶向抗原的靶细胞或靶向抗原的重组抗原刺激所述T细胞，所述T细胞从而大量增殖以产生大量的基因工程化T细胞。
本发明的有益效果是：提供了一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，该重组蛋白通过慢病毒载体在T细胞中表达后，T细胞的杀伤活性受到氧气的调控。本发明所述的缺氧诱导型嵌合抗原受体保持了CAR-T细胞靶向性和杀伤性，同时对此两种特性增加了安全开关，为CAR-T细胞临床治疗安全性的提高提供了一种全新的思路。本发明还提供了一种安全有效的Hi-CAR组合物的制备方法，包括构建Hi-CAR基因慢病毒表达载体，包装慢病毒载体、慢病毒载体介导的T细胞转基因以及Hi-CAR-T细胞的大量扩增三个步骤，所获得Hi-CAR-T细胞可用于治疗或延缓肿瘤患者的疾病进展。
此外，本发明的Hi-CAR构建体区别于前期研究的氧敏感性嵌合蛋白体，前期研究将ODD直接融合至抗原特异性单链Fv（scFv）上，不具备嵌合抗原受体的共刺激信号域和CD3ξ信号传导结构域，需要借助内源性的免疫球蛋白Fc受体的信号传导组分来完成氧敏感性嵌合蛋白体的信号传导，而本发明的Hi-CAR则不需要借助内源性信号传导组分，因为Hi-CAR本身具备共刺激信号分子和CD3ξ信号传导结构域，从而可直接进行信号传导，激活基因工程T细胞，此外，本发明将ODD置于CAR的C末端，使得CAR信号传导不受影响。其次，前期研究仅通过电转氧敏感性嵌合蛋白体信使RNA（mRNA）至T细胞中，仅获得瞬时表达氧敏感性嵌合蛋白体的基因工程T细胞，无法实现长期、持久的抗肿瘤目的。而本发明将Hi-CAR基因克隆到慢病毒载体中以制备长期稳定表达缺氧诱导型嵌合抗原受体（Hi-CAR）的基因工程T细胞。
附图说明
图1为缺氧诱导型和非缺氧诱导型的抗靶抗原的CAR构建体及其作用模式。其中，图1A为缺氧诱导型CAR提高肿瘤选择性的基本原理设计的示意图；图1B为缺氧诱导型嵌合抗原受体（Hi-CAR）构建体的示意图。
图2为氧依赖降解结构域（ODD）筛选和鉴定结果。
图3为CD19 CAR和缺氧诱导型CD19 Hi-CAR的氧气敏感特性比较。
图4描绘了在人原代T细胞中CD19 CAR和缺氧诱导型CD19 Hi-CAR的氧气敏感特性比较。
图5描绘了在肿瘤靶细胞刺激下，CD19 CAR-T细胞和缺氧诱导型CD19 Hi-CAR-T细胞的24h培养上清的细胞因子IFN-γ的分泌量。
图6描绘了CD19 Hi-CAR-T细胞针对不同比率的肿瘤靶细胞的体外杀伤作用。
具体实施方式
CAR-T细胞具备强大的抗肿瘤活性，同时伴随增强的“靶向非肿瘤细胞的毒副效应”。为了削弱所述副作用，我们设计出一种含有C末端氧依赖降解结构域（ODD）的嵌合抗原受体（CAR），所述氧依赖降解结构域（ODD）在常氧条件下降解了CAR分子，使基因工程T细胞失去结合靶标的能力，该测试靶标为CD19，它是在B淋巴细胞恶性肿瘤中高表达的靶抗原。氧依赖降解结构域（ODD）可由肿瘤缺氧微环境激发，由此使得Hi-CAR仅在缺氧微环境表达并富集在基因工程化T细胞的细胞膜上，从而有效识别肿瘤相关抗原。
以下结合实施例及说明书附图对本发明进一步说明。
实施例1肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体构建体及其作用模式
本发明提供了一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体（Hi-CAR），包括两部分组件，第一部分组件依次包括信号肽、胞外抗原特异性结合结构域、细胞外间隔区结构域、跨膜结构域、共刺激信号结构域和胞内信号传导结构域，第二部分组件为氧依赖降解结构域（ODD），其中，所述氧依赖降解结构域取自缺氧诱导因子1α（HIF-1α），其氨基酸序列为SEQ ID No：1，或其序列同源性至少为SEQ ID No：1的80%，且其23位为脯氨酸和185位为脯氨酸。
所述的肿瘤微环境特异性活化的Hi-CAR，在正常组织有氧环境下（氧分压21%），Hi-CAR在翻译后随即被泛素-蛋白酶水解复合体进一步降解，基本无法表达在T细胞膜，从而无法识别相应的靶抗原；而当Hi-CAR暴露在乏氧的肿瘤组织环境下，在翻译后则不被泛素化降解从而富集并表达在T细胞膜上，随后进一步识别相应的靶抗原而活化。
所述的Hi-CAR中抗原特异性结合结构域选自鼠抗体、羊驼抗体、人源化抗体、人抗体、抗原结合片段、配体、T细胞受体（TCR）、受体及其组合。优选抗人CD19蛋白分子的scFv,氨基酸序列为SEQ ID NO：4）。所述CD19 Hi-CAR包含特异性结合CD19的抗原特异性靶向结构域scFv，其CD19单抗可变轻链序列分别与SEQ ID NO：9序列同源性至少达到80%；可CD19单抗可变重链序列分别与SEQ ID NO：10序列同源性至少达到80%上述抗原特异性结合结构域，靶向肿瘤抗原包括淋巴瘤、神经母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、子宫颈癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、鼻咽癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、膀胱癌、骨癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑癌、横纹肌瘤、平滑肌瘤等。
所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、ROR1、CD38、CD123、CD133、NKG2D配体、ERBB2、MUC1、CD44v6、CD44v7、CD44v8、CEA、EpCAM、TAG72、KIT、IL-13R母细、EGFR、EGFRvIII、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、HMW-MAA、MAGE1、MAGEA3、GD2、CD171、NCAM、IL-11RA、αα-、PSCA、PSMA、TARP、碳酸酐酶9（CAIX）、VEGFR2、BCMA、CTLA-4、PD-L1、GPC3、CD47、AXL、ROR2、FAP、HER2、整联蛋白α整联蛋、整联蛋白α整联蛋、TGF蛋白、间皮素抗原（MSLN）及其组合。
所述信号肽优选自人CD8α信号肽，其氨基酸序列为SEQ ID No：3。
所述细胞外间隔区结构域选自免疫球蛋白IgG铰链区、CD28分子铰链区、CD8分子铰链区、Fc受体及其组合。优选CD8分子的铰链区（氨基酸序列为SEQ ID No：5）。
所述跨膜结构域选自T细胞受体复合物的CD3ξ链的跨膜区、CD28跨膜区、CD8α跨膜区、免疫球蛋白Fc受体跨膜区及其组合。优选CD8分子的跨膜结构域（氨基酸序列SEQ IDNo.6）。
所述共刺激信号结构域选自CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、CD278（ICOS）、TLR2、Dap10、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFRI、TNFRII、Fas、CD30、CD40及其组合。，优选4-1BB分子的共刺激信号结构域（氨基酸序列为SEQ ID No：7）。
所述胞内信号传导结构域选自T细胞受体复合物的CD3ξ链、FcγRIII、FcεRI、Fc受体胞内信号传导域、携带免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）的信号传导域及其组合。优选CD3ξ分子的信号传导域（氨基酸序列为SEQ ID No：8）。
本发明所述的Hi-CAR第一部分组件通过柔性连接肽连接第二组件的氧依赖降解结构域。优选柔性连接肽为1-50个富含甘氨酸（Gly）或丝氨酸（Ser）残基，其氨基酸序列为SEQ ID No：2。
综上所述，肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体（Hi-CAR）优选CD19Hi-CAR的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示。
图1所示为缺氧诱导型和非缺氧诱导型的抗靶抗原的CAR构建体及其作用模式。该抗原受体N末端至C末端的结构排列为抗原特异性结合结构域-细胞外间隔区结构域-跨膜结构域-共刺激信号结构域-胞内信号传导结构域-连接肽-氧依赖降解结构域。
图1A为缺氧诱导型CAR提高肿瘤选择性的基本原理设计的示意图。在正常组织的常氧环境下，与氧依赖降解结构域（ODD）融合表达的CAR分子由于氧气的存在而进行蛋白质泛素化途径降解。然而，在肿瘤缺氧微环境中，ODD的降解功能由于乏氧而被抑制，ODD融合表达的CAR开始富集表达在基因工程T细胞的细胞膜上，提供了识别肿瘤细胞靶抗原的分子基础，从而识别和杀伤肿瘤细胞。
图1B为缺氧诱导型嵌合抗原受体（Hi-CAR）构建体的示意图。抗原特异性靶向结构域来源于抗原特异性单链Fv（scFv）、配体或受体胞外结构域，图中的scFv序列来源于靶向CD19的单克隆抗体FMC63。scFv与CD8α铰链区和跨膜结构域相连，接着是共刺激信号分子4-1BB和CD3ξ信号传导结构域，最后通过柔性连接肽将ODD与CAR连接。
实施例2 氧依赖降解结构域（ODD）的筛选和鉴定
1.由上海捷瑞生物工程有限公司进行mCherry、mCherry-ODD（N-ter，1-112）、mCherry-ODD（C-ter，113-224）和mCherry-ODD（1-224）基因的合成，其核苷酸序列分别为SEQ ID No：12、SEQ ID No：13、 SEQ ID No：14和SEQ ID No：15。将合成好的基因克隆至慢病毒表达质粒pHAGE-EF-1α-MCS-IRES-ZsGreen中，从而获得以下四种重组慢病毒表达质粒，分别是pHAGE-mCherry、pHAGE-mCherry-ODD（N-ter，1-112）、pHAGE-mCherry-ODD（C-ter，113-224）和pHAGE-mCherry-ODD（1-224）；
2.将制备好的重组慢病毒质粒与慢病毒骨架质粒psPAX2、包膜质粒PMD2.G一并转染至人胚肾HEK293T细胞进行慢病毒的包装，48h收集病毒上清，0.45μM滤器过滤，获得慢病毒载体LV-mCherry、LV-mCherry-ODD（N-ter，1-112）、LV-mCherry-ODD（C-ter，113-224）和LV-mCherry-ODD（1-224）, -80℃冻存备用；
3. 将T淋巴细胞系Jurkat E6-1铺在48孔平底板中，每孔2×105个细胞；
4. 以感染复数MOI <=2的比例加入上述包装好的慢病毒载体LV-mCherry、LV-mCherry-ODD（N-ter，1-112）、LV-mCherry-ODD（C-ter，113-224）和LV-mCherry-ODD（1-224），32℃，1200g，离心感染2h后继续培养过夜，更换为新鲜培养基继续培养扩增；
5. 取适量的上述转导后的细胞分别置于常氧条件（21% O2）和两种化学缺氧条件下（终浓度50μM和200μM的CoCl2）培养24h；
6.第二天，取两组细胞进行流式细胞仪检测报告基因mCherry阳性率和表达水平；
实验结果如图2所示。图2A和图2B分别是mCherry阳性率和CAR表达水平统计图。常氧条件下，只有融合C端ODD（113-224位氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID No：16）和全长ODD（1-224位氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID No：1）的mCherry阳性率和表达水平都处于极低的水平，而缺氧诱导下可以大大提升mCherry阳性率和表达水平。其中，相对于融合C端ODD的mCherry，融合全长ODD（1-224位氨基酸）的mCherry阳性率和表达水平处于更低的水平。非缺氧诱导型Jurkat-mCherry细胞的mCherry阳性率和表达水平则没有显著性的变化。下面的实施方案中，均选用全长ODD（1-224位氨基酸）作为缺氧诱导型嵌合抗原受体的候选氧依赖降解结构域（ODD）。
实施例3缺氧环境下T淋巴细胞系CD19 Hi-CAR-Jurkat细胞的CAR变化情况
1.由上海捷瑞生物工程有限公司进行CD19 CAR和CD19 Hi-CAR基因的合成，其核苷酸序列分别为SEQ ID No:17和SEQ ID No:18, 将合成好的基因克隆至慢病毒表达质粒pHAGE-EF-1α-MCS-IRES-ZsGreen中，从而获得以下两种重组慢病毒质粒，分别是pHAGE-CD19 CAR和pHAGE-CD19 Hi-CAR；
2. 将制备好的重组慢病毒质粒与慢病毒骨架质粒psPAX2、包膜质粒PMD2.G一并转染至人胚肾HEK293T细胞进行慢病毒的包装，48h收集病毒上清，0.45μM滤器过滤，获得慢病毒载体LV-CD19 CAR和LV-CD19 Hi-CAR , -80℃冻存备用
3. 将T淋巴细胞系Jurkat E6-1铺在48孔平底板中，每孔2×105个细胞；
4. 以感染复数MOI <=2的比例加入上述包装好的慢病毒载体LV-CD19 CAR或LV-CD19Hi-CAR，32℃，1200g，离心感染2h后继续培养过夜，更换新鲜培养基继续扩增；
5. 取适量上述细胞（CD19 CAR-Jurkat和CD19 Hi-CAR-Jurkat）分别置于常氧条件（21% O2）和两种化学缺氧条件下（终浓度50μM和200μM的CoCl2）培养24h；
6. 第二天，取两组细胞进行表面分子染色。使用流式抗体PE-anti-DYKDDDDK常温条件下染色15min，收集细胞并洗脱两次，流式细胞仪检测CAR阳性率和表达水平。
实验结果如图3所示。图3A和图3B分别是T淋巴细胞系CD19 CAR-Jurkat细胞和CD19 Hi-CAR-Jurkat细胞的CAR阳性率和表达水平统计图。Jurkat E6-1为T淋巴细胞白血病细胞系，表达T细胞标志物CD3，具有T细胞的部分功能，可分泌细胞因子IL-2。常氧条件下，CD19 Hi-CAR-Jurkat细胞的CAR阳性率和表达水平都处于极低的水平，而缺氧诱导下可以大大提升CAR阳性率和表达水平。非缺氧诱导型CD19 CAR-Jurkat细胞的阳性率和表达水平则没有显著性的变化。
实施例4缺氧环境下原代CD19 Hi-CAR-T细胞的CAR变化情况
1.将健康人外周血单个核细胞（PBMC）铺在48孔平底板中，每孔1×106个细胞；
2.以感染复数MOI =5的比例加入上述实施例3所述包装好的慢病毒载体LV-CD19 CAR或LV-CD19 Hi-CAR，32℃，1200g，离心2h，培养过夜。第二天更换为新鲜的干细胞样记忆性T细胞诱导和扩增培养基继续培养扩增。活化5天后移除人CD3激活抗体和人CD28激活抗体耦联的磁珠并继续培养。在细胞培养的第2天，第4天，第7天和第10天补充含IL-7、IL-15和IL-21的干细胞样记忆性T细胞体外诱导和扩增培养基；
3. 待T细胞静息后，取适量的CD19 CAR-T细胞和CD19 Hi-CAR-T细胞分别置于常氧（21% O2）、化学缺氧（50μM的CoCl2）和生理性缺氧（1% O2）条件下培养24h；
4. 第二天，取两组细胞进行表面分子染色。使用流式抗体PE-anti-DYKDDDDK常温条件下染色15min，收集细胞并洗脱两次，流式细胞仪检测CAR阳性率和表达水平。
实验结果如图4所示。图4A和图4B分别是原代CD19 Hi-CAR-T细胞的CAR阳性率和表达水平统计图。实施例3中已经证明Hi-CAR可在T淋巴细胞系Jurkat中缺氧诱导表达，而Hi-CAR须最终应用在人的原代T细胞中，从而需要进一步验证其是否在人的原代T细胞中同样可以进行缺氧诱导。常氧条件下，4个健康人的CD19 Hi-CAR-T细胞的CAR阳性率和表达水平都处于极低的水平，而缺氧诱导下可以大大提升原代T细胞的CAR阳性率和表达水平，特别是生理性缺氧条件（1% O2）的诱导效果显著优于化学缺氧。非缺氧诱导型CD19 CAR-T细胞的阳性率和表达水平则没有显著性的变化。
实施例5缺氧环境下CD19 Hi-CAR-T细胞的体外活化
1.各取1×105个静息的CD19 CAR-T细胞、CD19 Hi-CAR-T细胞和靶细胞（K562-CD19），以效/靶细胞比1:1的比例铺入96孔U底板中，400g，离心1min，促进效/靶细胞的接触；
2. 置于常氧环境和化学缺氧（50μM的CoCl2）条件下共培养24h后，500g，离心5min，取上层细胞上清，进行细胞因子IFN-γ的ELISA测定。
实验结果如图5所示，CD19 Hi-CAR-T细胞仅在缺氧条件下，接触肿瘤靶细胞后更为有效地活化，分泌功能效应分子IFN-γ；而CD19 CAR-T细胞在不同的条件下均分泌大量的IFN-γ。
实施例6缺氧环境下CD19 Hi-CAR-T细胞体外杀伤
1. 取适量的CD19 Hi-CAR-T细胞，置于常氧和化学缺氧环境下，预先培养20h；
2. 取足量的肿瘤靶细胞（K562-CD19），首先采用细胞增殖染料eFluor 450标记细胞。用PBS或无血清RPMI1640培养基洗涤细胞两次，500g，离心5min，去除细胞中残余的血清。将细胞按2×107/mL的密度重悬在PBS中（PBS至少500μL，即使细胞数不足5×106）。用PBS稀释eFluor 450储存液至10μM，然后和细胞悬液1：1混合。37℃水浴，避光反应10min。加20%冷FBS终止反应（如反应体系为1mL，则加200μL的冷FBS），冰上孵育5min。用PBS洗涤3遍，进行细胞膜染料PKH26的标记。
3. 随后，采用细胞膜染料PKH26的标记K562-CD19细胞。制备2×单细胞悬液，细胞密度控制在2×107/mL。接着制备2×的PKH26染色液，以1:1的比例将2×单细胞悬液加入到2×的PKH26染色液中，室温反应5min后，加入等体积的FBS作用1min终止反应。用完全培养基RPMI1640（10%FBS）洗涤3遍，细胞待用。
4. 固定肿瘤靶细胞的数目为3×104，以效、靶比2：1、4：1和8：1的比率分别加入预先常氧或缺氧培养20h的CD19 Hi-CAR-T细胞，37℃，再继续置于常氧和化学缺氧环境下共孵育4h，收集细胞悬液，流式细胞仪检测杀伤效率。
实验结果如图6所示，缺氧条件下，CD19 Hi-CAR-T细胞在短时间内能够更为有效地杀伤肿瘤靶细胞。区别于先前研究的氧敏感嵌合蛋白体，其在低的效、靶比情况下的杀伤效果无显著性差异，本发明所形成的技术，即使在较低的效/靶比的情况下，常氧和缺氧条件下的杀伤效果仍有显著性差异，有效降低了“靶向非肿瘤细胞的毒副效应”（On-targetoff tumor）。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市公共卫生临床中心
<120> 一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 224
<212> PRT
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<220>
<221> CONFLICT
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
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Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
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gtgcacatgg aggggtccgt caacgggcac gagttcgaga ttgagggaga gggcgagggc 120
cgcccatacg agggaacaca gaccacaaag ctgaaggtca ctaagggcgg acctctgcct 180
ttcgcttggg acattctgtc tcctcagttt atgtacggat ctaaggctta cgtgaagcac 240
cctgccgata ttcccgatta cctcaagctc tcctttcctg aggggtttaa gtgggagcgc 300
gtgatgaatt ttgaggacgg cggcgtcgtg accgtgactc aggattcttc actccaggac 360
ggcgagttca tttacaaggt gaagctccgc ggaaccaact tcccatccga cggccctgtg 420
atgcagaaaa agactatggg gtgggaggca tctagcgagc gcatgtaccc tgaggacggg 480
gctctgaagg gagagattaa gcagcgcctc aagctgaagg atggcggcca ctacgacgca 540
gaggtcaaga caacatacaa ggcaaagaag ccagtccagc tgcccggagc ctacaacgtc 600
aatattaagc tcgatataac cagccacaat gaggactaca ccatcgtcga gcagtacgag 660
cgcgcagagg gccgccactc tactggcgga atggatgagc tgtacaagtg a 711
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<211> 1098
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<213> artificial
<220>
<223> artificial
<220>
<221> N_region
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atggtgtcta agggagagga ggataacatg gctattatca aggagttcat gcggtttaag 60
gtgcacatgg aggggtccgt caacgggcac gagttcgaga ttgagggaga gggcgagggc 120
cgcccatacg agggaacaca gaccacaaag ctgaaggtca ctaagggcgg acctctgcct 180
ttcgcttggg acattctgtc tcctcagttt atgtacggat ctaaggctta cgtgaagcac 240
cctgccgata ttcccgatta cctcaagctc tcctttcctg aggggtttaa gtgggagcgc 300
gtgatgaatt ttgaggacgg cggcgtcgtg accgtgactc aggattcttc actccaggac 360
ggcgagttca tttacaaggt gaagctccgc ggaaccaact tcccatccga cggccctgtg 420
atgcagaaaa agactatggg gtgggaggca tctagcgagc gcatgtaccc tgaggacggg 480
gctctgaagg gagagattaa gcagcgcctc aagctgaagg atggcggcca ctacgacgca 540
gaggtcaaga caacatacaa ggcaaagaag ccagtccagc tgcccggagc ctacaacgtc 600
aatattaagc tcgatataac cagccacaat gaggactaca ccatcgtcga gcagtacgag 660
cgcgcagagg gccgccactc tactggcgga atggatgagc tgtacaagct cgagggcgga 720
ggcgggtccg ggggcggggg ctccggcggc ggagggtcca gcgaggatac ctcatcactg 780
tttgacaagc tcaagaagga gcccgacgca ctcacactcc tcgcacccgc cgccggcgat 840
acaattatta gcctggactt tgggtctaac gatacagaga ccgacgacca gcagctggag 900
gaggtgcctc tgtacaatga tgtcatgctg ccttctccta atgagaagct gcaaaatatt 960
aatctggcta tgtcaccact gcctaccgcc gagacaccta agccactcag gtctagcgcc 1020
gatcccgctc tgaaccagga ggtggccctg aagctagagc caaacccaga gtctctggag 1080
ctttcattta ctatgtga 1098
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<211> 1098
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> artificial
<220>
<221> C_region
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atggtgtcta agggagagga ggataacatg gctattatca aggagttcat gcggtttaag 60
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cctgccgata ttcccgatta cctcaagctc tcctttcctg aggggtttaa gtgggagcgc 300
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aatattaagc tcgatataac cagccacaat gaggactaca ccatcgtcga gcagtacgag 660
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atggtgtcta agggagagga ggataacatg gctattatca aggagttcat gcggtttaag 60
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Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg
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Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val
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Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu
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Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr
50 55 60
Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp
65 70 75 80
Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser
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Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln
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atg gcc tta cca gtg acc gcc ttg ctc ctg ccg ctg gcc ttg ctg ctc 48
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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cac gcc gcc agg ccg gac tac aag gac gac gac gac aag ttc gaa gac 96
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Phe Glu Asp
20 25 30
atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga gac 144
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att agt aaa tat tta 192
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
aat tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc tac 240
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
cat aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc agt 288
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc aac ctg gag caa gaa 336
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt aat acg ctt ccg tac acg 384
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
ttc gga ggg ggg acc aag ctg gag atc aca ggt ggc ggt ggc tcg ggc 432
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
ggt ggt ggg tcg ggt ggc ggc gga tct gag gtg aaa ctg cag gag tca 480
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag agc ctg tcc gtc aca tgc act 528
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
gtc tca ggg gtc tca tta ccc gac tat ggt gta agc tgg att cgc cag 576
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
cct cca cga aag ggt ctg gag tgg ctg gga gta ata tgg ggt agt gaa 624
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
acc aca tac tat aat tca gct ctc aaa tcc aga ctg acc atc atc aag 672
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
gac aac tcc aag agc caa gtt ttc tta aaa atg aac agt ctg caa act 720
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
gat gac aca gcc att tac tac tgt gcc aaa cat tat tac tac ggt ggt 768
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
agc tat gct atg gac tac tgg ggc caa gga acc tca gtc acc gtc tcc 816
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
tca acc acg acg cca gcg ccg cga cca cca aca ccg gcg ccc acc atc 864
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
gcg tcg cag ccc ctg tcc ctg cgc cca gag gcg tgc cgg cca gcg gcg 912
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
ggg ggc gca gtg cac acg agg ggg ctg gac ttc gcc tgt gat atc tac 960
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
atc tgg gcg ccc ttg gcc ggg act tgt ggg gtc ctt ctc ctg tca ctg 1008
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
325 330 335
gtt atc acc ctt tac tgc aaa cgg ggc aga aag aaa ctc ctg tat ata 1056
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
340 345 350
ttc aaa caa cca ttt atg aga cca gta caa act act caa gag gaa gat 1104
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
355 360 365
ggc tgt agc tgc cga ttt cca gaa gaa gaa gaa gga gga tgt gaa ctg 1152
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
370 375 380
aga gtg aag ttc agc agg agc gca gac gcc ccc gcg tac aag cag ggc 1200
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
385 390 395 400
cag aac cag ctc tat aac gag ctc aat cta gga cga aga gag gag tac 1248
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
405 410 415
gat gtt ttg gac aag aga cgt ggc cgg gac cct gag atg ggg gga aag 1296
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
420 425 430
ccg aga agg aag aac cct cag gaa ggc ctg tac aat gaa ctg cag aaa 1344
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
435 440 445
gat aag atg gcg gag gcc tac agt gag att ggg atg aaa ggc gag cgc 1392
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
450 455 460
cgg agg ggc aag ggg cac gat ggc ctt tac cag ggt ctc agt aca gcc 1440
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
465 470 475 480
acc aag gac acc tac gac gcc ctt cac atg cag gcc ctg ccc cct cgc 1488
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
tga 1491
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<211> 2214
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> artificial
<220>
<221> CDS
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Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
cac gcc gcc agg ccg gac tac aag gac gac gac gac aag ttc gaa gac 96
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Phe Glu Asp
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atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga gac 144
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att agt aaa tat tta 192
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
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aat tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc tac 240
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
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cat aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc agt 288
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
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Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
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Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
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Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
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Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
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Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
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Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
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Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
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Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
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Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
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Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
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Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser
530 535 540
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Leu Asp Phe Gly Ser Asn Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu
545 550 555 560
gag gtg cct ctg tac aat gat gtc atg ctg cct tct cct aat gag aag 1728
Glu Val Pro Leu Tyr Asn Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys
565 570 575
ctg caa aat att aat ctg gct atg tca cca ctg cct acc gcc gag aca 1776
Leu Gln Asn Ile Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr
580 585 590
cct aag cca ctc agg tct agc gcc gat ccc gct ctg aac cag gag gtg 1824
Pro Lys Pro Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val
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Ala Leu Lys Leu Glu Pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr
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atg cca cag att cag gat cag act cca tct cca tcc gac gga tca act 1920
Met Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr
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agg cag tct tcc cct gag ccc aat tcc cca tcc gag tac tgc ttc tac 1968
Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr
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gtc gat agc gac atg gtg aat gag ttt aag ctg gag tta gtc gag aag 2016
Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys
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ctg ttc gca gag gat act gag gca aag aac cca ttt tca aca cag gac 2064
Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp
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Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp
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Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser
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agc gca agt cct gag agc gct tca cca cag tca acc gtg acc gtg ttc 2208
Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe
725 730 735
cag tga 2214
Gln
<

Claims (20)

1.一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体包括两部分组件，第一部分组件包括信号肽、胞外抗原特异性结合结构域、细胞外间隔区结构域、跨膜结构域、共刺激信号结构域和胞内信号传导结构域；第二部分组件为氧依赖降解结构域。
2.根据权利要求1所述一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外抗原特异性结合结构域包括但不限于鼠抗体、羊驼抗体、人源化抗体、人抗体、抗原结合片段、抗原特异性单链抗体Fv、配体、T细胞受体及其他受体胞外结构域及其组合。
3.根据权利要求1所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，该抗原受体N末端至C末端的结构排列为抗原特异性结合结构域-胞外间隔区结构域-跨膜结构域-共刺激信号结构域-胞内信号传导结构域-连接肽-氧依赖降解结构域。
4.根据权利要求1所述一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述细胞外间隔区结构域包括但不限于以下任何一种或多种：
（1）抗体的Fc片段或其功能等效物、片段或衍生物；
（2）抗体的铰链区或其功能等效物、片段或衍生物；
（3）抗体的CH2区；
（4）抗体的CH3区；
（5）免疫球蛋白Fc受体铰链区或其功能等效物、片段或衍生物人工间隔区序列及其组合。
5.根据权利要求1所述一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述细胞外间隔区结构域包括但不限于以下任何一种或多种：
（1）抗体IgG4的铰链区及其突变体；
（2）抗体IgG4的铰链区及其突变体和CH2区；
（3）抗体IgG4的铰链区及其突变体、CH2区和CH3区；
（4）抗体IgG1的铰链区及其突变体；
（5）抗体IgG1的铰链区及其突变体和CH2区；
（6）抗体IgG1的铰链区及其突变体、CH2区和CH3区；
（7）免疫球蛋白Fc受体的铰链区：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、FcαR（CD89）、FcεRI、FcεRII（CD23）；
（8）共刺激分子CD28铰链区、CD8α铰链区；
或以上任何一种组合。
6.根据权利要求1所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述的跨膜结构域包括但不限于Ⅰ型跨膜蛋白跨膜区结构域、人工疏水跨膜区结构域及其组合。
7.根据权利要求6所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述的跨膜结构域包括但不限于以下任何一种或多种：T细胞受体复合物的CD3ξ链的跨膜区、CD28跨膜区、CD8α跨膜区、免疫球蛋白Fc受体跨膜区及其组合。
8.根据权利要求1所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激分子信号传导结构域包括但不限于以下任何一种或多种的信号传导结构域：CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、CD278（ICOS）、TLR2、Dap10、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFRI、TNFRII、Fas、CD30、CD40及其组合。
9.根据权利要求1所述一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体还包括细胞因子信号传导结构域。
10.根据权利要求9所述一种肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述细胞因子信号传导结构域包括但不限于IL-7R、IL-15R、IL-21R及其组合。
11.根据权利要求1所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导结构域包括但不限于以下一种或多种信号传导结构域：T细胞受体复合物的CD3ξ链、FcγRIII、FcεRI、Fc受体胞内信号传导域、携带免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）的信号传导域及其组合。
12.根据权利要求1所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述氧依赖降解结构域通过连接肽与嵌合抗原受体相连，该连接肽为1-50个富含甘氨酸（Gly）或丝氨酸（Ser）残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2的柔性连接肽。
13.根据权利要求1所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述氧依赖降解结构域（ODD）取自缺氧诱导因子1α（HIF-1α），包括但不限于全长型HIF-1α，氨基酸序列为SEQ ID NO：1, 或其序列同源性至少为SEQ ID NO：1的80%，且其23位为脯氨酸和185位为脯氨酸；以及C端截短型HIF-1α，氨基酸序列为SEQ ID NO：16, 或其序列同源性至少为SEQ ID NO：16的80%，且其73位为脯氨酸。
14.根据权利要求1所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，针对肿瘤的特异性靶向抗原包括但不限于以下任意一种或多种：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、ROR1、CD38、CD123、CD133、NKG2D配体、ERBB2、MUC1、CD44v6、CD44v7、CD44v8、CEA、EpCAM、TAG72、KIT、IL-13Rα2、EGFR、EGFRvIII 、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、HMW-MAA、MAGE1、MAGEA3、GD2、CD171、NCAM、IL-11Rα、αFR、PSCA、PSMA、TARP、碳酸酐酶9（CAIX）、VEGFR2、BCMA、CTLA-4、PD-L1、GPC3、CD47、AXL、ROR2、FAP、HER2、整联蛋白α5β1、整联蛋白αvβ3、TGFβR、间皮素抗原（MSLN）。
15.根据权利要求1所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原特异性结合结构域为抗人CD19蛋白分子的scFv，氨基酸序列为SEQ ID No：4；信号肽选自人CD8α信号肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3；胞外间隔区结构域为CD8分子的铰链区，氨基酸序列为SEQ ID NO：5；跨膜结构域为CD8分子的跨膜结构域，其氨基酸序列SEQ ID NO：6；共刺激信号结构域为4-1BB分子的共刺激信号结构域，其氨基酸序列为SEQID NO：7；所述胞内信号传导结构域为CD3ξ分子的信号传导域，其氨基酸序列为SEQ ID NO：8；所述的Hi-CAR第一部分组件通过柔性连接肽连接第二组件的氧依赖降解结构域，柔性连接肽为1-50个富含甘氨酸（Gly）或丝氨酸（Ser）残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述肿瘤微环境特异性活化的缺氧诱导型嵌合抗原受体为CD19 Hi-CAR，其氨基酸序列如SEQ IDNO：11所示。
16.一种病毒载体，其特征在于，该载体编码如权利要求1所述的缺氧诱导型嵌合抗原受体。
17.根据权利要求16所述病毒载体，其特征在于，所述病毒载体包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒及其组合。
18.一种基因工程化免疫细胞，其特征在于，所述细胞转导有权利要求17所述病毒载体。
19.根据权利要求18所述的基因工程化免疫细胞，包括但不限于未经分选纯化的T细胞、分选纯化的T细胞、分选纯化的PD-1+ T细胞、分选纯化的CD137+ T细胞、分选纯化的CD160+ T细胞、分选纯化的纯真T细胞（Tnaive）、分选纯化的中央记忆型T细胞（TCM）、分选纯化的效应记忆型T细胞（TEM）、分选纯化的效应T细胞（TEMRA）、分选纯化的过渡记忆型T细胞（Transitional Memory T cells，TTM）、分选纯化的组织记忆型T细胞（Tissue residentialmemory T cells，TRM）、天然杀伤细胞（Natural killer cells，NK）、天然杀伤T细胞（Natural killer T cells，NKT）、固有淋巴细胞（(Innate lymphoid cells, ILC）、造血干细胞、胚胎干细胞或多能干细胞。
20.一种用于扩增表达缺氧诱导型嵌合抗原受体的T细胞的方法，所述方法包括：用如权利要求16所述的病毒载体转导一个或多个免疫细胞，额外添加抗人CD3刺激抗体和抗人CD28刺激抗体、表达抗原特异性结合结构域靶向抗原的靶细胞或靶向抗原的重组抗原刺激所述T细胞，所述T细胞从而大量增殖以产生大量的基因工程化T细胞。
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