CN107099546B

CN107099546B - 一种调控嵌合抗原受体表达的方法

Info

Publication number: CN107099546B
Application number: CN201710424933.7A
Authority: CN
Inventors: 应述欢; 高鹏; 李玉霞
Original assignee: Sheng Wu (beijing) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sheng Wu (beijing) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-06-07
Filing date: 2017-06-07
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2037-06-07
Also published as: CN107099546A

Abstract

本发明公开了一种调控嵌合抗原受体表达的方法，表达体系共表达嵌合抗原受体、将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA对，在编码嵌合抗原受体氨基酸序列中引入无义密码子UAG，用于编码非天然氨基酸，表达体系缺少该非天然氨基酸时，嵌合抗原受体无法表达，当向表达体系加入非天然氨基酸时，完整表达嵌合抗原受体。本发明所述的具有非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体保持了CAR‑T的靶向性和杀伤性的同时对此两种特性增加了控制性，将控制性开关选择为小分子化合物，为CAR‑T提高临床治疗癌症的安全性提供了重要途径。

Description

一种调控嵌合抗原受体表达的方法

技术领域

本发明涉及生物医学转化领域，尤其涉及一种具有非天然氨基酸依赖的调控嵌合抗原受体表达的方法。

技术背景

癌症作为公共健康问题，其发病率和死亡率逐年攀升，癌症已经成为最主要的死亡原因之一。过继性免疫疗法是在传统手术治疗、放射疗法和化学疗法之外，以提高人体对肿瘤的免疫效应的重要治疗方案。过继性细胞免疫治疗（adoptive cellularimmunotherapy，ACI）是指将体外激活的自体或异体免疫细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞，是目前治疗恶性肿瘤的重要手段之一，已在多种实体瘤和血液肿瘤的临床治疗中取得较好疗效。其中，嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞治疗法是近年来发展非常迅速的一种新的细胞免疫治疗技术，通过基因工程技术修饰效应T细胞，克服肿瘤局部免疫抑制微环境和宿主免疫耐受状态，提高了抗肿瘤的靶向性、杀伤性和持久性。

CAR结构由胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号转导区组成。胞外抗原结合区主要是抗原特异性单克隆抗体单链的重链（VL）和轻链（VH）的可变区组成，二者以铰链区连接形成单链抗体（single chain fragment varible，scFv）。CAR通过识别肿瘤抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activationmotifs，ITAM）”在体外进行基因重组，通过基因转染技术修饰患者的T淋巴细胞，使患者T淋巴细胞表达肿瘤抗原受体，经过纯化和大规模扩增修饰后的T淋巴细胞，称为嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞（CAR-T）。

CAR技术临床上在血液系统肿瘤甚至实体瘤的治疗上取得了显著成绩，目前已经发展到第三代。第一代CAR由单链抗体通过跨膜区域与胞内信号传导区（ITAM）相连，ITAM通常为CD3ζ或FcεRIγ；第二代CAR的胞内信号传导区引入了共刺激分子（costimulatorymolecule，CM），主要为CD28分子；第三代CAR引入了双共刺激分子（CM1和CM2），主要为CD28分子加上CD134或CD137等。第一代CAR-T淋巴细胞研究较多，但是大多数试验在细胞扩增、体外存活时间、细胞因子分泌等方面还存在不足，没有达到预期的临床效果。研究表明，T淋巴细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号，通过CD28/B7等重要的共刺激分子，促进IL-2合成，并使T淋巴细胞充分活化及免于凋亡。即使T淋巴细胞与抗原接触，如果没有协同刺激信号，细胞难以发挥正常功能。相应的，仅含有CD3ζ序列的嵌合抗原受体，如果没有协同刺激信号，也难以高效激活CAR-T淋巴细胞。因此，依照T淋巴细胞活化的双信号学说，第二代和第三代CAR在嵌合抗原受体上加上如CD28、CD137等共刺激分子，以提高T淋巴细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T淋巴细胞应答，延长T淋巴细胞存活时间等。研究证实第二代的CAR-T淋巴细胞在杀伤肿瘤活性和体内存活时间均优于第一代。目前，第三代CAR-T淋巴细胞临床应用还比较少，故其安全性和有效性是否就一定优于第二代CAR-T淋巴细胞，以及选择怎样的共刺激分子组合，还需要进一步观察。

虽然CAR-T靶向治疗肿瘤细胞是目前最有前景的癌症治疗方案之一，但是，当太多的信号转导达到阈值后，强烈引发的体内免疫应答可能会产生“细胞因子风暴”等重症，甚至引发患者死亡。因此，增加CAR-T细胞的活性“开关”控制是解决CAR-T毒性问题的重要内容，为CAR-T在临床的推广应用具有重要意义。

发明内容

非天然氨基酸是区别于20种常见的天然氨基酸的人工合成氨基酸，现已有多种在蛋白合成过程中编码非天然氨基酸的方法，最常见的是利用无义密码子UAG对其进行编码。通常情况下蛋白转录遇到无义密码子UAG终止信号即终止，但在特定情况下，即含有将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性氨酰tRNA合成酶和tRNA组合以及非天然氨基酸的情况下，翻译在UAG密码子处不终止，继续通读直到蛋白翻译结束。因此，可通过非天然氨基酸的添加与否调控开放阅读框中间含有UAG密码子的蛋白的完整表达。

本发明针对现有技术不足，提供了一种嵌合抗原受体活性调控的解决方案，通过非天然氨基酸的添加与否来调控嵌合抗原受体的表达。

本发明具体技术方案如下：

一种调控嵌合抗原受体表达的方法，表达体系共表达嵌合抗原受体、将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA对，在编码嵌合抗原受体氨基酸序列中引入无义密码子UAG，用于编码非天然氨基酸，表达体系缺少该非天然氨基酸时，嵌合抗原受体无法完整合成表达，从而无法激活T细胞免疫反应；当向表达体系加入非天然氨基酸，且表达体系存在正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶正交性tRNA时，嵌合抗原受体能够正常合成，T细胞免疫应答通路完整。

本发明所述的嵌合抗原受体，所以依赖的非天然氨基酸选自人工合成的α-氨基酸，优选选自N ^ε-Boc-L-赖氨酸、N ^ε-乙酰-L-赖氨酸、N ^ε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸、N ^ε-烟酰基-L-赖氨酸、N ^ε-（N-甲基氨茴酰）-L-赖氨酸、N ^ε-苄氧羰基-L-赖氨酸中的一种或几种。

吡咯赖氨酸发现于产甲烷八叠球菌的甲烷甲基转移酶，区别于常见的20种的标准氨基酸，由终止密码子UAG有义编码写入蛋白。从吡咯赖氨酸的编码机制入手，科学家已经成功在细菌、哺乳动物细胞、真菌、昆虫、线虫等中编码超过70种人工合成的非天然氨基酸。例如N ^ε-Boc-L-赖氨酸、（N ^ε-苄氧羰基）-L-赖氨酸、N ^ε-乙酰-L-赖氨酸（N ^ε-acetyl-L-lysine，AcLys）、N ^ε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸（N ^ε-allyloxycarbonyl-L-lysine，AlocLys）、N ^ε-烟酰基-L-赖氨酸（N ^ε-nicotinoyl-L-lysine，NicLys）、N ^ε-（N-甲基氨茴酰）-L-赖氨酸（N ^ε-(N-me-anthraniloyl)-L-lysine，NmaLys）、N ^ε-苄氧羰基-L-赖氨酸（N ^ε-benzyloxycarbonyl-L-lysine，Z Lys）等，本发明优选使用吡咯赖氨酸类似物—N^ε-Boc-L-赖氨酸。

编码UAG密码子的非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸及其类似物氨酰化到识别UAG密码子的tRNA上。与非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶正交配对的tRNA能够识别UAG密码子且能够在配对氨酰tRNA合成酶的作用下将非天然氨基酸氨活化，形成tRNA^Pyl(Pyl-tRNA^Pyl)。本发明所述非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶源于天然可以编辑吡咯赖氨酸及其类似物的古生菌，包括但不限于Metbanosarcina barkeri，Metbanosarcina mazei。优选来源于Metbanosarcina barkeri的参与吡咯赖氨酸编码的氨酰tRNA合成酶和tRNA及其突变体。本发明所述的tRNA主要指与氨酰tRNA合成酶同种属来源的、携带吡咯赖氨酸及其类似物参与蛋白编码合成的tRNA，包括各种突变体，如U25C突变体增强了反密码子臂的稳定性和吡咯赖氨酸的编码能力。

本发明所述方法可以在表达体系共表达嵌合抗原受体、非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和与该合成酶正交配对的tRNA。

本发明所述的方法，所述嵌合抗原受体包含但不限于经典的CAR结构，通常包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域。也适用于各种升级型CAR结构，如iCasp9自杀型CAR、靶向双阳性细胞的双CAR、分别靶向肿瘤细胞和正常细胞的双CAR系统：CAR+iCAR、应用小分子将CART激活元件与CID融合表达实现精准调控的CART系统。所述各功能结构域可以直接相连，即通过克隆基因时加入酶切位点或者融合PCR技术将这些元件相连接后进行表达，也可以通过连接肽连接各功能结构域。优选连接肽是指1~50个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的柔性肽。

本发明所述的重组嵌合抗原受体，所述抗原结合区功能结构域选自人抗体、人源化抗体、抗原结合片段或其组合，可以是完整的抗体，Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv片段或者单链可变区片段scFv。

优选的，本发明所述抗原结合区功能结构域结合肿瘤抗原。所述肿瘤为前列腺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病（慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、腺癌、大肠癌、乳腺癌、实体瘤、头颈部癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、转移性癌、多形性胶质母细胞瘤等。

优选的，所述肿瘤抗原选自CD19，CD20，CD22，CD33，CD138，ROR1，Her2/neu，间皮素，CD33/IL3Ra，c-Met，PSMA，CAIX，CEA、PSCA，GD2，糖脂F77，EGFRvIII，GD-2，FAP，FBP，NY-ESO-1TCR，MAGEA3TCR或其任意组合。

优选的，所述细胞外铰链区是免疫球蛋白IgG铰链区或CD8蛋白分子的铰链区或其组合。

所述跨膜区选自CD3、CD4、CD8或CD28蛋白分子的跨膜区或其任意组合；

所述共刺激信号传导区选自CD27，CD28，CD137(4-1BB)，CD134(OX40)，CD30，CD40，PD-1，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3蛋白分子的共刺激信号传导区、与CD3ζ特异性结合的配体或其任意组合；

所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD28、CD137、FcεRIγ、ZAP70或CD3ζ蛋白分子的T细胞信号传导区中的一种或几种。T细胞信号传导区包含有免疫受体酪氨酸活化基序。

本发明所述方法选择在编码嵌和抗原受体氨基酸序列中引入UAG密码子用于编码非天然氨基酸，可以选择功能结构域内的氨基酸密码子进行突变，优选编码信号肽的氨基酸密码子，也可以选择连接肽中的氨基酸密码子进行突变。

一个优选的方案，所述嵌合抗原受体的N端具有信号肽，嵌合抗原受体由信号肽介导表达在质膜上。信号肽的氨基酸密码子被替换为非天然氨基酸密码子。所述信号肽分子优选CD8α，优选在其第一位氨基酸处将原有的甲硫氨酸替换编码为非天然氨基酸，优选的非天然氨基酸为H-Lys(Boc)-OH（图2），即AUG突变为琥珀密码子UAG。

本发明所述方法将目的基因构建在恰当质粒上。通过转基因修饰的方法修饰T细胞。转基因修饰方法包括病毒介导的转化、显微注射、离子轰击、基因枪转化、电穿孔以及其他新兴转化载体，如微环质粒、睡美人转座子。本发明优选病毒介导的转化方法。病毒介导的转化包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或者慢病毒为载体的表达体系可使用质粒或者病毒作为表达载体，优选微环质粒、逆转录病毒或者慢病毒作为表达载体。本发明更优选慢病毒表达载体pUltra-hUbC-MCS-PGK-Puro。

本发明一个优选方案，选择3代慢病毒表达载体，慢病毒载体3’LTR区的△U3位置具有克隆位点，本发明优选在该克隆位点插入tRNA表达盒（expression cassette），更优选插入两组拷贝。

本发明所述载体包含嵌合抗原受体开放阅读框、正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶开放阅读框和正交tRNA表达盒（expression cassette）的同时表达，其中嵌合抗原受体和正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶为翻译表达，正交tRNA为转录表达。正交tRNA表达基因拷贝数多于2。此三个表达元件以各种方式在慢病毒表达载体整合区域相互组合进行高效表达。本发明的一个优选方案，所述的重组嵌合抗原受体的蛋白开放阅读框和氨酰tRNA合成酶开放阅读框同处慢病毒表达载体启动子后方，优选使用“自剪切”的2A蛋白酶将重组嵌合抗原受体开放阅读框连接在氨酰tRNA合成酶开放阅读框后边，使用2A蛋白酶连接两蛋白编码区，所述的2A连接肽可以是P2A，T2A，E2A，F2A，BmIFV2A和BmCPV2A等“自剪切”连接肽，优选F2A。

本发明的一个优选方案，嵌合抗原受体的信号肽分子起始AUG密码子突变为UAG密码子，该重组嵌合抗原受体基因通过F2A“自剪切”基因连接在氨酰tRNA合成酶基因后面，构成同一启动子启动的两个蛋白基因，两组携带吡咯赖氨酸的tRNA的转录基因分别位于慢病毒载体的常规克隆位置和3’LTR区。具体的，载体包括基因表达盒1：启动子1—正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶编码区—F2A连接肽编码区—嵌合抗原受体编码区和基因表达盒2：启动子2—tRNA编码区。所述启动子1选自UbC、EF1α、CAG、CMV、PGK、MSCV、WJ6、SV40和GALVLTR、MSCV LTR中的一种或几种，启动子2选自类别3 RNA聚合酶III（type 3 Pol III），包括但不限于hU6、mU6、H1、SNR52、7SK、MRP/7-2等，优选使用U6启动子和H1启动子。

本发明一个具体的方案，所述启动子1核苷酸序列如SEQ ID.No：10所示，正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：3所示，氨基酸序列如SEQ IDNo：4所示， F2A连接肽编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：5所示，氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，嵌合抗原受体编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：1所示，氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，启动子2与tRNA编码区形成的tRNA表达盒（expression cassette）核苷酸序列如SEQID.No：8和SEQ ID.No：9所示。其中，SEQ ID.No：8所示的是U6启动的tRNA，SEQ ID.No：9所示的是H1启动的tRNA。

本发明的一个具体方案，表达载体为pUltra，重组载体命名为Lenti-RS/tRNA/CAR，具体为将吡咯赖氨酰tRNA合成酶与重组嵌合抗原受体基因插入hUbC启动子之后，两个蛋白用“自剪切”2A连接肽分离连接；将一组由U6启动子和H1启动子分别起始的tRNA插入常规克隆位点的蛋白基因表达盒（expression cassette）之后；将另一组U6启动子和H1启动子分别起始的tRNA插入慢病毒载体的3’LTR区的核苷酸序列如SEQ ID.No：7所示，其中有SnaBI酶切位点。

本发明所述方法，具体可包括以下步骤：

1）共表达载体的构建

运用分子克隆方法将正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA编码基因及起始位置具有UAG终止的重组嵌合抗原受体基因克隆入质粒pUltra的多克隆位点和长末端重复区中，构建具有非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体的共表达载体；

2）慢病毒载体的包装

利用293T细胞包装获得带有非天然氨基酸依赖的CAR分子的慢病毒载体。所述慢病毒载体为将上述共表达载体与慢病毒包装必须的结构蛋白表达质粒共转高效组装慢病毒的细胞中所得的具有表达重组基因的慢病毒。本发明的一个优选方案，将上述共表达载体与慢病毒结构蛋白表达载体pMDL g/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G共同转染HEK 293T细胞培养得到慢病毒载体；

3）慢病毒介导具有非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体转染细胞

本发明提供的方法包括如下步骤：构建目的基因慢病毒包装载体，包装慢病毒，慢病毒介导的T细胞转基因，重组CAR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤活性具有非天然氨基酸依赖性，即仅在环境具有非天然氨基酸的条件下被激活并释放细胞因子IL-2。

本发明的另一目的在于提供本发明方法相关的非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体的载体、基因表达盒（expression cassette）、慢病毒载体或细胞，以及含有上述重组嵌合抗原受体基因。所述细胞优选选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞，记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞。

本发明的另一目的在于提供一种非天然氨基酸在制备抗肿瘤药物中的应用，所述非天然氨基酸优选为N ^ε-Boc-L-赖氨酸、N ^ε-乙酰-L-赖氨酸、N ^ε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸、N ^ε-烟酰基-L-赖氨酸、N ^ε-（N-甲基氨茴酰）-L-赖氨酸、N ^ε-苄氧羰基-L-赖氨酸中的一种或几种，在CAR-T治疗方案中，非天然氨基酸，特别是N ^ε-Boc-L-赖氨酸、N ^ε-乙酰-L-赖氨酸、N ^ε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸、N ^ε-烟酰基-L-赖氨酸、N ^ε-（N-甲基氨茴酰）-L-赖氨酸、N ^ε-苄氧羰基-L-赖氨酸中的一种或几种作为药物调控嵌合抗原受体的表达。

本发明优点：

本发明提供了一种非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体合成的方法，用以调控T细胞激活通路。该嵌合抗原受体在无非天然氨基酸存在的情况下，在添加非天然氨基酸时，重组嵌合抗原受体同时，非天然氨基酸的插入为进一步修饰T细胞，提供了化学修饰位点。实验证明，该本发明所述嵌合抗原受体通过慢病毒载体在T细胞中表达后，T细胞的杀伤毒性受到非天然氨基酸添加与否的控制。本发明所述的具有非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体保持了CAR-T的靶向性和杀伤性的同时对此两种特性增加了控制性，将控制性开关选择为小分子化合物，为CAR-T提高临床治疗癌症的安全性提供了重要途径。

附图说明

图1 非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体的慢病毒基因结构示意图。

图2 非天然氨基酸BocLys的化学结构式。

图3 为非天然氨基酸依赖的CD19-CAR Jurkat细胞表达MmBocRS氨酰tRNA合成酶的Western Blot鉴定结果。

图4 为非天然氨基酸依赖的CD19-CAR Jurkat与靶细胞共培养后释放IL-2含量的测定结果。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体的表达载体设计

本发明选用目前研究、应用最为广泛的CD19-CAR分子作为示例，用质粒pUltra为骨架，构建非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体的慢病毒转染质粒如下（图1）：

Lentiviral Transfer Plasmids: Lenti-RS/tRNA/CAR

5’LTR(truncated)-ψ-RRE-UbC promoter-PylRS-2A-CD19CAR-(U6-tRNA-H1-tRNA)*2-3’LTR [△U3 ( U6-tRNA- H1-tRNA)-R-U5]

其中，CAR分子UAG—Signal peptide-scFv-hinge- transmembrane domain-4-1BB-CD3 zeta。

质粒构建交由北京奥科生物技术有限责任公司合成并测序确认序列正确。

实施例2、慢病毒载体的包装

在明胶预包被的15-cm培养皿中接种5×10⁶ 293T细胞，在37℃，CO₂培养箱中过夜培养。当汇合度达到70%时，准备质粒转染。在转染前2小时，更换新鲜无血清培养基，进行转染。

从冰箱中取出转染试剂100μM PEI（Polyethylenimine），在60℃水浴锅加热15min至完全溶解。从冰箱中取出质粒Lenti-RS/tRNA/CAR、pMDL g/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G，室温溶解。

制备PEI/DNA复合物：取2ml PBS，加入10μg Lenti-RS/tRNA/CAR、5μg pMDL g/pRRE、2.5μg pRSV-Rev、2.5μg pMD2.G，充分吹打混匀后，加入18μl 100μM PEI，立即吹吸混匀，室温静置10min。将静置后获得的PEI/DNA复合物逐滴加入已更换培养基的细胞培养物中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。在37℃，CO₂培养箱中培养6-8h后，将含有转染试剂的培养基换成新鲜的完全培养基。

在转染后48h收集含有病毒颗粒的细胞培养上清，并添加新的完全培养基。72h再次收集细胞培养上清，两次收集物通过0.45μm过滤膜过滤。采用Amicon UltraCentrifugal Filters 100KDa浓缩病毒颗粒，然后分装保存在-80℃超低温冰箱。

实施例3、慢病毒介导的细胞转染

在适量体积的无血清的RPMI 1640中加入Polybrene至终浓度为8μg/ml，用该培养基重悬离心收集的Jurkat细胞，并以5×10⁵/孔的密度接种在6孔板中。根据病毒滴度与细胞数目，加入MOI=10的慢病毒浓缩液，轻轻摇动培养板以混匀。放置在37℃，5%CO₂孵育箱培养，16-24h后换成含有10% FBS的RPMI 1640培养基继续培养。

实施例4、氨酰tRNA合成酶表达鉴定

Western blot anti-flag

通过Western Blot鉴定MmBocRS氨酰tRNA合成酶的表达，由于在氨酰tRNA合成酶N端偶联表达了Flag标签，所以通过Anti-Flag免疫反应鉴定MmBocRS氨酰tRNA合成酶的表达。收集2×10⁷细胞后使用1ml RIPA裂解液（PBS，1% Triton X100，0.5% 叠氮化钠，0.1%十二烷基磺酸钠）冰上裂解30min。离心取上清加入SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸即可上样。配置浓度为12%的分离胶与常规浓缩胶制版，凝固后于SDS-PAGE电泳缓冲液中电泳。90V恒压将样品压缩到分离胶与浓缩胶的临界面后更换为恒压120进行电泳。电泳结束后采用半干转法进行转膜，恒压12V转膜30min。5%脱脂奶粉室温封闭2小时后，用0.1%一抗（Anti Flag-Tag Mouse Monoclonal Antibody、Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody）进行4℃过夜孵育。使用TBST洗膜三次，然后用0.1%二抗（Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRPConjugate）室温孵育1h。再次使用TBST洗膜三次，在膜上滴加辣根过氧化物酶底物，然后曝光。结果如图3所示，图中上半部分为Anti-Flag指示吡咯赖氨酰tRNA合成酶的条带，与理论值50.9kDa相符。图中下半部分为Anti-β-actin的内参条带，显示在~50kDa处出现特异性条带，与MmBocRS氨酰tRNA合成酶预计大小52kDa相符。

实施例5、非天然氨基酸依赖的CD19-CAR Jurkat的细胞杀伤活性分析

本实施例分别展示了非天然氨基酸依赖的嵌合抗原受体在非天然氨基酸添加或不添加情况下与常规嵌合抗原受体T细胞在与靶细胞共培养的条件下T细胞激活、IL-2的分泌水平。

①IL-2分泌量检测

将K562细胞与K562-CD19细胞按照1×10⁵/孔的浓度铺板于96孔板中，每孔100ul靶细胞。K562-CD19细胞是稳定过表达CD19分子的K562细胞株。将非天然氨基酸依赖的CD19-CAR Jurkat T细胞按照靶细胞：效应细胞=1:2的比例，与靶细胞共培养。同时设置非天然氨基酸添加组和非天然氨基酸无添加组。非天然氨基酸添加组加入浓度为1 mmol/L的N^ε-Boc-L-赖氨酸（H-Lys(Boc)-OH），H-Lys(Boc)-OH购自瑞士Bachem公司。在37℃，5%CO₂培养箱共培养18-20h后，分别收集细胞培养悬液经过离心收取上清，使用人IL-2 ELISA kit检测IL-2含量，具体步骤参见人IL-2 ELISA kit使用说明书。

具体结果如图4所示，结果表明，在非天然氨基酸缺失的情况下，本发明所述的抗CD19的重组嵌合抗原受体修饰的T细胞白介素分泌量明显低于常规重组嵌合抗原受体修饰的T细胞。而在添加非天然氨基酸的情况下，非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体修饰的T细胞表现出IL-2分泌量的显著性升高。此结果表明，在非天然氨基酸依赖的重组嵌合抗原受体修饰的T细胞中，T细胞的激活依赖于非天然氨基酸的添加。

SEQUENCE LISTING

<110> 胜武（北京）生物科技有限公司

<120> 一种光诱导二聚体型嵌合抗原受体

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<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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taggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg

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gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg

tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt

tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc

agcgcagatg ctccagccta ccagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt

ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc

gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag

atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac

gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg

caggccctgc cgcctcggtg a

<210> 2

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

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Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser

Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

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Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

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Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

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Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

<210> 3

<211> 1386

<212> DNA

<213> Methanosarcina mazei

<400> 3

atggattaca aggacgacga tgacaaggat aaaaaaccac taaacactct gatatctgca

accgggctct ggatgtccag gaccggaaca attcataaaa taaaacacca cgaagtctct

cgaagcaaaa tctatattga aatggcatgc ggagaccacc ttgttgtaaa caactccagg

agcagcagga ctgcaagagc gctcaggcac cacaaataca ggaagacctg caaacgctgc

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gtaaaagtca aggtcgtttc tgcccctacc agaacgaaaa aggcaatgcc aaaatccgtt

gcgagagccc cgaaacctct tgagaataca gaagcggcac aggctcaacc ttctggatct

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tcaacatcaa tatcaagcat ttctacagga gcaactgcat ccgcactggt aaaagggaat

acgaacccca ttacatccat gtctgcccct gttcaggcaa gtgcccccgc acttacgaag

agccagactg acaggcttga agtcctgtta aacccaaaag atgagatttc cctgaattcc

ggcaagcctt tcagggagct tgagtccgaa ttgctctctc gcagaaaaaa agacctgcag

cagatctacg cggaagaaag ggagaattat ctggggaaac tcgagcgtga aattaccagg

ttctttgtgg acaggggttt tctggaaata aaatccccga tcctgatccc tcttgagtat

atcgaaagga tgggcattga taatgatacc gaactttcaa aacagatctt cagggttgac

aagaacttct gcctgagacc catgcttgct ccaaaccttt acaactacct gcgcaagctt

gacagggccc tgcctgatcc aataaaaatt tttgaaatag gcccatgcta cagaaaagag

tccgacggca aagaacacct cgaagagttt accatgctga acttctgcca gatgggatcg

ggatgcacac gggaaaatct tgaaagcata attacagact tcctgaacca cctgggaatt

gatttcaaga tcgtaggcga ttcctgcatg gtctttgggg atacccttga tgtaatgcac

ggagacctgg aactttcctc tgcagtagtc ggacccatac cgcttgaccg ggaatggggt

attgataaac cctggatagg ggcaggtttc gggctcgaac gccttctcaa ggttaaacac

gactttaaaa atatcaagag agctgcaagg tccgagtctt actataacgg gatttctacc

aacctg

<210> 4

<211> 462

<212> PRT

<213> Methanosarcina mazei

<400> 4

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Lys Lys Pro Leu Asn Thr

Leu Ile Ser Ala Thr Gly Leu Trp Met Ser Arg Thr Gly Thr Ile His

Lys Ile Lys His His Glu Val Ser Arg Ser Lys Ile Tyr Ile Glu Met

Ala Cys Gly Asp His Leu Val Val Asn Asn Ser Arg Ser Ser Arg Thr

Ala Arg Ala Leu Arg His His Lys Tyr Arg Lys Thr Cys Lys Arg Cys

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Ala Ile Pro Val Ser Thr Gln Glu Ser Val Ser Val Pro Ala Ser Val

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Ala Ser Ala Pro Ala Leu Thr Lys Ser Gln Thr Asp Arg Leu Glu Val

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Pro Ile Leu Ile Pro Leu Glu Tyr Ile Glu Arg Met Gly Ile Asp Asn

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Arg Glu Trp Gly Ile Asp Lys Pro Trp Ile Gly Ala Gly Phe Gly Leu

Glu Arg Leu Leu Lys Val Lys His Asp Phe Lys Asn Ile Lys Arg Ala

Ala Arg Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn Gly Ile Ser Thr Asn Leu

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccca

gggccc

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

<210> 7

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tggaagggct acgtaactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca

<210> 8

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg

ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct

tgtggaaagg acgaaacacc ggaaacctga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt

tcagccgggt tagattcccg gggtttccgg acaagtgcgg tttttcaatt

<210> 9

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgcgaggcca gaggccactt gtgtagcgcc aagtgcccag cggggctgct aaagcgcatg

ctccagactg ccttgggaaa agcgcctccc ctacccggta gaattcgaac gctgacgtca

tcaacccgct ccaaggaatc gcgggcccag tgtcactagg cgggaacacc cagcgcgcgt

gcgccctggc aggaagatgg ctgtgaggga caggggagtg gcgccctgca atatttgcat

gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt tgggaatctt

ataagttctg tatgagacca cagatccgga aacctgatca tgtagatcga acggactcta

aatccgttca gccgggttag attcccgggg tttccggtcc tttttttg

<210> 10

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg

ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag

cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag

gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg

aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat

gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt

cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct

ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc

caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg

cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga

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tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc

gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg

cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat

cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg

gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg

ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca

atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct

tttttgttag ac

Claims

1.一种体外调控嵌合抗原受体表达的方法，其特征在于表达体系共表达嵌合抗原受体、将非天然氨基酸编码到对应的UAG密码子的正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA对，在编码嵌合抗原受体核苷酸序列中引入无义密码子UAG，用于编码非天然氨基酸，表达体系缺少该非天然氨基酸时，嵌合抗原受体无法表达，当向表达体系加入非天然氨基酸时，完整表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域，所述信号肽的起始密码子AUG突变为UAG无义密码子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述非天然氨基酸选自N ^ε-Boc-L-赖氨酸、N ^ε-乙酰-L-赖氨酸、N ^ε-烯丙氧羰基-L-赖氨酸、N ^ε-烟酰基-L-赖氨酸、N ^ε-（N-甲基氨茴酰）-L-赖氨酸、N ^ε-苄氧羰基-L-赖氨酸中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用质粒或者病毒作为表达载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述表达载体包括嵌合抗原受体开放阅读框、正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶开放阅读框和正交tRNA表达盒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于使用慢病毒作为表达载体，所述载体包括基因表达盒1：启动子1—正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶编码区—2A连接肽编码区—嵌合抗原受体编码区；和基因表达盒2：启动子2—tRNA编码区。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述启动子1为三代慢病毒载体蛋白启动子，选自UbC、EF1α、CAG、CMV、PGK、MSCV、SV40和GALV LTR、MSCV LTR中的一种或几种；启动子2源于类别3 RNA聚合酶III，选自hU6、mU6、H1、SNR52、7SK、MRP/7-2中的一种或几种；所述2A连接肽选自P2A、T2A、E2A、F2A、BmIFV2A、BmCPV2A中的一种或几种。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述启动子1核苷酸序列如SEQ ID.No：10所示，正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：3所示，2A连接肽编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：5所示，嵌合抗原受体编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：1所示，启动子2与tRNA编码区形成的tRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID.No：8和SEQ ID.No：9所示。