CN108992664A - 基于重组减毒绵羊李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于重组减毒绵羊李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗。本发明以减毒绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，简称Li)为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的T细胞免疫活化佐剂的特性，有效提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而清除机体持续性病毒感染，达到清除病灶，遏制肿瘤发展的良好治疗效果。其优势在于弥补了核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低的缺点，减毒的李斯特菌保留了原始菌株能在胞内生长，完成抗原递呈的特性的同时又具有更高的安全性。

Description

基于重组减毒绵羊李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于重组减毒绵羊李斯特菌的间皮素高表达癌症治

疗性疫苗。

背景技术

研究发现间皮素是一种细胞表面糖蛋白，其表达通常局限于间皮(腹膜，心包，和胸膜)，同时发现在间皮瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌中，间皮素蛋白显著高表达。(MesothelinA New Target for Immunotherapy，Raffit Hassan，Tapan Bera，and Ira Pastan doi:10.1158/1078-0432.CCR-03-0801Clin Cancer Res June 15,2004 10；3937)这种特征使得间皮素成为运用重组李斯特菌治疗肿瘤的工具抗原。

间皮瘤是一种主要出现在胸腔或腹腔内壁上的肿瘤，与工作环境中接触石棉纤维有关。在美国每年被诊断的患者是2500～3000个。目前手术和放疗效果都不理想，化疗效果较好。

胰腺癌是出现在胰脏且非常致命的癌症，患者5年内的存活率小于5％，根据世界卫生组织2014年数据，2012年胰腺癌在全球造成33万人死亡，是癌症患者的7种最常见的致死因素。且胰腺癌初期没有明显症状，发现症状后通常是疾病的晚期，绝大多数病人在发现时已经是局部侵袭性疾病或已发生转移，这时候在通过手术治疗只能是缓解症状而无法治愈患者。目前通过每周静脉给药的吉西他滨(美国FDA在1997年批准上市)只能改善患者生活质量，稍微延长患者生存时间。使用FOLFIRINOX化疗方案(5-氟尿嘧啶，亚叶酸钙，伊立替康，和奥沙利铂)则副反应明显，只能用于非常有限的患者。

卵巢癌是指出现在女性卵巢的癌症，2012年全球有23万患者并且造成15万人死亡。是7种常见癌症，并且是造成女性癌症患者死亡的常见原因。目前手术和化疗结合是治疗卵巢癌的常见方法。

肺癌是一种发生在肺组织内，细胞失去控制生长的非常致命的疾病。肺癌如不及时接受治疗，很容易转移到附近组织和机体其他器官。肺癌是癌症患者最主要的死亡原因，2012年造成全球156万人口死亡，患者5年内的存活率小于17％。目前手术，放疗和化疗协同治疗是对抗肺癌的常见方法。

治疗性疫苗与传统的治疗手段，如外科手术，放化疗相比具有伤害小，毒性低的特点。目前治疗性疫苗的存在形式主要有三种：蛋白质多肽疫苗、病毒(细菌)疫苗以及核酸疫苗。其成功的关键是引起足够的免疫应答，但是目前的核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低，缺陷明显。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组减毒绵羊李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于重组减毒绵羊李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗，其有效成分为携带间皮素基因的重组减毒绵羊李斯特菌。

优选的，所述减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，简称Li)完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。

优选的，所述重组减毒绵羊李斯特菌的制备方法，是以减毒绵羊李斯特菌为载体，携带间皮素基因而得。

进一步优选的，具体步骤如下：

(1)合成间皮素基因片段；

(2)构建打靶质粒；

(3)制备感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ；

(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；

(5)LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。

更进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询间皮素氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得。其中，密码子优化方法是将氨基酸序列提交到网站(如http://www.jcat.de/)，然后选择单增李斯特菌偏好密码子优化选项即可实现；DNA序列的合成方法是：使用ABI3900-Thermo Fisher Scientific等型号的基因合成仪直接合成DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。

更进一步优选的，步骤(2)的具体方法是：

用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pCW203HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-Meso，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建。切下中间质粒pCW203-Meso的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW154(专利CN103074361B)的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW154-Meso，如SEQID NO.3所示。

更进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：将LiΔactAplcB-lacZ(专利CN103074361B)用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A₆₀₀，当A₆₀₀＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A₆₀₀＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可。

更进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：接种LiΔactAplcB-lacZ(专利CN103074361B)于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12～16小时；将上述菌液转移至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，定期测定A₆₀₀，当A₆₀₀＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A₆₀₀＝0.7时，倒入50mL离心管，4℃10000rpm离心5分钟，弃上清；以0.5mol/L冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml0.5mol/L蔗糖溶液，4℃10000rpm离心10分钟，弃上清，洗涤3次；每管加0.5mol/L蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌EP管，-80℃保存。

进一步优选的，步骤(4)的具体方法是：取打靶质粒电转至LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞中，电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证。

更进一步优选的，步骤(4)的具体方法是：将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ，同时作ddH₂O阴性对照；温和混匀后，冰浴5分钟，再全部转入电转杯，冰浴5分钟，于电转仪中进行电转；电转完成后，冰浴5分钟，用37℃预热的枪头加入37℃预热的BHI肉汤750μl，混匀后全部转至EP管，摇床30℃，150rpm培养2小时；用无菌L形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素1～5μg/ml、X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板(以下简称BHI-Ery-X-gal，BEXI平板)，30℃培养48～72小时后，阳性菌为蓝色菌落，于BEXI平板上进行纯培养，30℃培养24小时，进行提质粒及PCR验证。

更进一步优选的，电转条件为：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。

更进一步优选的，提质粒的具体方法是：按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，SolutionⅠ使用前需加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为20mg/L，加入含溶菌酶的SolutionⅠ后重悬细菌，37℃水浴45min)，最后以30μl Elution Buffer洗脱后电泳；凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为10478bp。

更进一步优选的，PCR验证的具体方法是：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带间皮素，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃30秒，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：间皮素片段约1781bp。

上游引物MESO-f：5’-CCACAAGCTTTGTCCCGTACACTTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物MESO-r：5’-TATACTCGAGAGCAAGTGTAGAAGC-3’，如SEQ ID NO.5所示；

更进一步优选的，电泳条件为：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物。

进一步优选的，步骤(5)的具体方法是：将携带打靶质粒的绵羊李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证。

更进一步优选的，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的LiΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培养，挑取单个蓝色菌落接种BHI肉汤，30℃传代培养，待传到肉汤第3代开始，每代取培养物加入BHI稀释，分别涂布稀释菌液100μl于BEXI和BXI(含X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板)平板，30℃培养24小时。

更进一步优选的，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的LiΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培养2～3代(每代培养时间为48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5ml BHI肉汤，30℃，200rpm传代培养6代(每代培养时间为24小时)；待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl BHI肉汤(1:10稀释)，多次连续1:10稀释直到稀释10⁶倍，分别涂布10⁶倍稀释的菌液100μl于BEXI和BXI平板，30℃培养24小时；阳性菌落LiΔactAplcB-Meso在BXI平板上长成白色菌落，在BEXI平板上不生长。

更进一步优选的，PCR筛选的具体方法是：对蓝白斑及红霉素筛选结果正确的上述可疑重组菌进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因间皮素以及actA基因，鉴定相应疫苗菌株。

更进一步优选的，PCR筛选的具体方法是：用细菌基因组提取试剂盒提取LiΔactAplcB-Meso的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因间皮素以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LiΔactAplcB-Meso进行鉴定。

更进一步优选的，抗红霉素基因Ery以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：Ery基因片段约1471bp。

上游引物Ery-f：5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，如SEQ ID NO.6所示；

下游引物Ery-r：5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’，如SEQ ID NO.7所示。

更进一步优选的，Li actA基因以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：Li actA基因片段约600bp。

上游引物Li-actA-f：5’-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTCCC-3’，如SEQ ID NO.8所示；

下游引物Li-actA-r：5’-ATTTCTTTAATA CTGCGTTTGGGG-3’，如SEQ ID NO.9所示.

更进一步优选的，基因测序验证的具体方法是：经PCR鉴定正确的相应疫苗菌株，以基因组DNA作为模板，PCR扩增靶抗原基因间皮素，对扩增产物测序验证，对测序正确的菌株进行菌种保存。

本发明的有益效果在于：

本发明所制备的间皮素高表达治疗性疫苗携带间皮素融合基因，以减毒绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，在下文中简称Li)作为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的T细胞免疫活化佐剂的特性，有效提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而清除机体持续性病毒感染，达到清除病灶，遏制肿瘤发展的良好治疗效果。其优势在于弥补了核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低的缺点，减毒的李斯特菌保留了原始菌株能在胞内生长，完成抗原递呈的特性的同时又具有更高的安全性。

本发明的来源菌是LiΔactAplcB-lacZ，最后导致的减毒是actA和plcB这两个基因的全部基因的缺失减毒，缺失的基因与细菌在胞间的转移和细菌逃离次级溶酶体有关，缺失后细菌毒力减低，与仅缺失溶血素部分基因的减毒方式相比，具有更好的安全性，同时本发明缺失的基因不影响细菌在吞噬细胞内的抗原递呈作用。本发明插入的间皮素基因，经过了李斯特菌密码子优化，具有独特性。本发明插入的间皮素抗原基因可以提高免疫系统对肿瘤细胞的识别，攻击更多的肿瘤细胞，达到更好的治疗效果。本发明对阳性菌的筛选是通过温度、红霉素和蓝白斑筛选。本发明的蓝白斑筛选通过肉眼识别，简单易行，筛选成功率高。间皮素基因插入位点是在mpl基因下游，该位点不影响细菌其他重要蛋白的表达，尽量保留了原菌株的生物活性。

具体如下：

1)针对性：诱导特异性针对高表达间皮素癌症细胞的细胞因子，靶向治疗癌组织，不损伤正常细胞。

2)高效：疫苗菌株免疫活性高，诱导高效的细胞因子表达。李斯特菌株本身具有高效活化机体细胞免疫功能的作用，因此携带抗原的重组菌株能激活多种抗肿瘤免疫机制，激活特异的肿瘤杀伤性T细胞，打破免疫抑制重新激活有效的肿瘤杀伤机制。

3)安全：减毒菌株不会在体内长期存在，不会引起感染，在我们的临床前试验中表现了很好的耐受性，并经其他类似临床试验证实了其安全性，且能跟其他肿瘤治疗手段很好的兼容，如鸡尾酒式免疫抑制剂、外科手术、放疗和化疗。

4)稳定：本发明制备的疫苗菌株携带的抗原基因是整合到菌株基因组中的，抗原基因在菌株内稳定存在，不会丢失。

5)低成本：疫苗的生产成本低、快速、经济，使用标准的细菌发酵技术就可完成疫苗的大规模生产，无需细胞培养。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1Li打靶重组质粒结构图谱。为Li打靶质粒的一种结构图谱，含有两段Li同源基因(Li mpl和Li orfBAldh)、氨苄青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)、基因序列盒(gene cassette)：包含启动子phly、HA epitope基因、VSV-G epitope基因、GP33epitope基因、GP61epitope基因、间皮素基因。

图2为打靶质粒电转化LiΔactAplcB-lacZ后的PCR鉴定电泳结果图。1为电转后从细菌中扩增出的目的片段间皮素，M为DNA ladder。

图3为重组菌LiΔactAplcB-Meso的基因组中插入的外源基因及前后基因结构示意图。由此图可知外源基因的插入位点，重组后的细菌基因组敲掉了actA和plcB基因。插入的外源基因在自带的启动子phly的作用下表达融合蛋白，融合蛋白具有分泌信号肽、GP33和GP61抗原表位肽标签、HA和VSV-G western blot检测标签。

图4为通过流式细胞术检测，LiΔactAplcB-Meso菌株免疫小鼠后所诱导的细胞免疫应答。主要检测IFN-γ细胞因子的分泌水平，可见LiΔactAplcB-Meso菌株能够诱导特异性细胞免疫应答。

图5为疫苗菌株对肿瘤肺转移模型治疗效果的评价

对模型小鼠进行免疫治疗，实验设立阴性对照组：注射生理盐水(NS)；治疗组：治疗组：首次注射LiΔactAplcB-Meso，加强注射LiΔactAplcB-Meso。将12只模型小鼠随机分为2组。分别于CT26-Meso细胞注射后第3天进行第一次免疫治疗，以各菌株0.1×LD₅₀尾静脉接种小鼠，NS对照组尾静脉接种等体积NS。第10天进行第二次免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。每天观察小鼠的生存率情况，治疗组明显延长了间皮素模型小鼠的生存时间。

图6为在加强治疗时对模型小鼠使用同源或异源疫苗菌株，对肿瘤肺转移模型治疗效果的评价。效果可见相对于同源治疗组，异源治疗组能够显著提高治疗小组小鼠生存率。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1.疫苗菌LiΔactAplcB-Meso的制备

(1)间皮素基因片段合成

从NCBI上查询间皮素蛋白基因，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化，并在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，最后通过合成直接获得DNA序列(以公司提供克隆质粒pUC57-Meso的形式获得)，(序列如序列表序列1所示)。

(2)构建打靶质粒

①中间质粒pCW203-Meso的构建

按照质粒说明书提取质粒pUC57-Meso和pCW203，以30μL Elution Buffer洗脱。

pUC57-Meso和pCW203用HindⅢ和XhoⅠ双酶切，酶切体系20μL：pUC57-Meso或pCW203＜1ng，HindⅢ1μL，XhoⅠ1μL，10×NEB Buffer 2μL，ddH₂O将体系补足20μL。37℃水浴1h酶切质粒，载体片段需加0.5μL CIAP，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物与6×LoadingBuffer混合，电泳(1％琼脂糖，94V)并胶回收相应长度的片段(pUC57-Meso回收酶切后的小片段即间皮素基因片段，长度为1781bp；pCW203回收酶切后的大片段即载体片段，长度约>10Kb)，以30μL Elution Buffer洗脱。

分别取间皮素基因片段与载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝5:1，T4Ligase 1μL，10×Ligase Buffer 5μL，ddH₂O将体系补足10μl，22℃连接1h。将连接产物按体积1:10与大肠杆菌DH5α的感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴3min，加入预热的SOB肉汤500μL，混匀后于37℃，180rpm培养1h，涂布于LA平板(LB-Amp平板：含100μg/mL Amp的LB平板)，37℃培养16-20h。

PCR筛选：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带间皮素，上游引物MESO-f：5’-CCACAAGCTTTGTCCCGTACACTTG-3’，下游引物MESO-r：5’-TATACTCGAGAGCAAGTGTAGAAGC-3’，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察PCR结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：间皮素片段约1781bp。

酶切验证：PCR筛选验证的阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以HindⅢ和XhoⅠ进行酶切，将酶切混合物与6×Loading Buffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94V)。

测序验证：提取PCR及酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。

②打靶质粒的构建

提取质粒pCW154，以30μL Elution Buffer洗脱。将质粒pCW154及中间质粒pCW203-Meso分别用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ按照实施例(2)①的体系混匀(将HindⅢ酶替换为BamHⅠ酶)，进行酶切和去磷酸化，电泳后胶回收pCW203-Meso酶切后的小片段即插入片段(1840bp)及pCW154载体骨架(酶切后长片段，长度约8606bp)。按照(2)①的体系混匀进行连接并转化入大肠杆菌DH5α，涂布于LA平板，对长出的单个菌落进行PCR筛选、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证以及测序验证，具体操作同(2)①(将HindⅢ酶替换为BamHⅠ酶)。将测序验证后携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。打靶质粒的结构图谱见图1。

(3)电转化用LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞的制备

接种LiΔactAplcB-lacZ于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12～16h。将上述菌液转移至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，定期测定A₆₀₀，当A₆₀₀＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养。当A₆₀₀＝0.7时，倒入50mL离心管，4℃10000rpm离心5min，弃上清。以0.5mol/L冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml 0.5mol/L蔗糖溶液，4℃10000rpm离心10min，弃上清，洗涤3次。每管加0.5mol/L蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌EP管，-80℃保存。

(4)打靶质粒电转化LiΔactAplcB-lacZ

将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ，同时作ddH₂O阴性对照。温和混匀后，冰浴5min，再全部转入电转杯，冰浴5min，于电转仪中进行电转(电转条件：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm)。电转完成后，冰浴5min，用37℃预热的枪头加入37℃预热的BHI肉汤750μl，混匀后全部转至EP管，摇床30℃，150rpm培养2h。用无菌L形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素1～5μg/ml、X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板(以下简称BHI-Ery-X-gal，BEXI平板)，30℃培养48～72h后，阳性菌为蓝色菌落，于BEXI平板上进行纯培养，30℃培养24h，进行提质粒及PCR验证。

PCR验证：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带间皮素，上游引物MESO-f：5’-CCACAAGCTTTGTCCCGTACACTTG-3’，下游引物MESO-r：5’-TATACTCGAGAGCAAGTGTAGAAGC-3’，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察PCR结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：间皮素片段约1781bp，如图2所示。

按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，SolutionⅠ使用前需加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为20mg/L，加入含溶菌酶的SolutionⅠ后重悬细菌，37℃水浴45min)，最后以30μl Elution Buffer洗脱后电泳。凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为10478bp。

(5)LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组及筛选

①LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养

将已电转入打靶质粒的LiΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI板，42℃传代培养2-3代(每代培养时间为48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5ml BHI肉汤，30℃，200rpm传代培养6代(每代培养时间为24小时)。待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl BHI作1:10稀释，连续稀释10⁶倍，分别涂布10⁶倍稀释的菌液100μl于BEXI和BXI(含X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板)平板，30℃培养24h。阳性菌落LiΔactAplcB-Meso在BXI平板上长成白色菌落，在BEXI平板上不生长。

②PCR鉴定LiΔactAplcB-Meso

细菌基因组提取试剂盒提取LiΔactAplcB-Meso的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因盒以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LiΔactAplcB-Meso进行鉴定。LiΔactAplcB-Meso基因组DNA为模板扩增间皮素，其引物及反应条件见(2)①，扩增目的条带抗红霉素基因Ery，约1471bp，引物Ery-f/r(f:5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，r:5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，60℃30s，72℃2min)×30个循环→72℃10min→4℃；Li actA基因，约600bp，引物Li-actA-f/r(f:5’-GAAGCTAAAAGTGCAAATGTCCC-3’,r:5’-ATTTCTTTAATACTGCGTTTGGGG-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，55℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；。经PCR鉴定，LiΔactAplcB-Meso携带有间皮素融合基因，不携带抗红霉素基因，且actA基因被剔除。鉴定结果与预期吻合，LiΔactAplcB-Meso制备成功。

③基因测序验证

PCR鉴定后以疫苗组基因组DNA作为模板，PCR扩增靶抗原基因间皮素，对扩增产物测序验证，对测序正确的菌株进行菌种保存。最终获得的重组菌基因组插入的外源基因及插入位点前后的基因结构示意图如图3所示。

(6)LiΔactAplcB-Meso疫苗候选株LD₅₀的测定

将-20℃保存的LiΔactAplcB-Meso菌株置37℃水浴融化后，分别取10μl接种于5ml BHI肉汤中，37℃200rpm培养过夜。第二日，取复苏一次的菌液40μl于20ml BHI肉汤中，37℃200rpm培养过夜二次复苏。

取17.5ml二次复苏的各菌液接种350ml BHI肉汤，于37℃200rpm摇床培养，培养至A₆₀₀值为0.3～0.7之间时，根据李斯特菌生长曲线，确定此时A₆₀₀值所对应的菌量，并根据预计的细菌接种剂量进行浓缩或是稀释处理：取一定量菌液离心，13000rpm 2min，用生理盐水重悬后，再次离心，再用生理盐水将菌液重悬至染菌剂量，并置于冰上备用。

6～8周龄BALB/c雌鼠适应性喂养3d后，随机分为3组，每组6只，LiΔactAplcB-Meso免疫组尾静脉分别接种10¹⁰CFU/ml、2x10⁹CFU/ml、2x10⁸CFU/ml的菌液100μl；连续观察10天，统计小鼠死亡、存活情况，绘制各剂量组生存曲线，如图6所示；利用改良寇式法计算LD₅₀，并以0.1×LD₅₀作为最适后续免疫剂量。

(7)LiΔactAplcB-Meso免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

①C57BL/6雌鼠疫苗接种

6～8周龄的C57BL/6雌鼠适应性喂养3d后，选取3只免疫LiΔactAplcB-Meso疫苗，注射0.1×LD₅₀的LiΔactAplcB-Meso(注射剂量为2×10⁷CFU/只)。

②流式细胞术检测分泌特异性IFN-γ细胞因子的CD4+和CD8+T淋巴细胞数量

脾细胞悬液制备：颈椎脱臼处死小鼠，将小鼠用针固定四肢于解剖板，75％酒精喷至其毛湿润，无菌操作取脾脏，放于装有1ml RPMI Medium 1640(含1％双抗)的5ml离心管中，置冰浴备用。加5ml RPMI Medium 1640(含1％双抗)于一灭菌平板，其中放一张无菌200目尼龙膜，用无菌眼科镊取脾脏放于尼龙膜上，并用尼龙膜将脾脏包裹，用无菌研棒轻研脾脏至其泛白(脾细胞脱落后剩下的被膜及未剔除干净的结缔组织)，用枪头将所有脾细胞悬液收集至灭菌15ml EP离心管。

红细胞裂解：将装有脾细胞悬液的离心管放入低温离心机中，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，使沉淀在离心管底部的细胞分散，向离心管中加入4ml经过滤除菌的红细胞裂解液，上下颠倒离心管，使细胞与红细胞裂解液充分接触，静置5min后，立即加入4ml RPMI 1640Medium(含1％双抗)终止裂红反应，1300rpm/min 4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，向离心管中加入5ml RPMI 1640Medium(含1％双抗)，上下颠倒离心管以洗去残余的红细胞裂解液，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，重复洗涤一次。震荡离心管后，向离心管中加入2ml RPMI 1640Medium(含10％胎牛血清)重悬，将离心管置于冰上，备用。

刺激物配制：1.gp33-41储备液：1mg的肽段中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；4.流式PMA储备液：0.1mg的PMA中加入1ml DMSO，配制成0.1mg/ml的储配液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；5.流式Ionomycine储备液：1mg的Ionomycine中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；6.流式阳性刺激混合液：吸取100μl RPMI 1640Medium(含10％胎牛血清)、0.2μl Golgi Stop、0.2μl Ionomycine储备液和0.2μl PMA储备液于EP管，用枪头吹打混合均匀；7.流式实验刺激混合液：吸取100μlRPMI 1640Medium(含10％胎牛血清)、0.2μl gp33-41储备液和0.2μl Golgi Stop于EP管中，用枪头吹打混合均匀。

刺激：每个样品同时做阴性对照(不刺激)和实验处理(GP33肽段)2个孔；各组随机选取2个样品用阳性刺激物(PMA+Ionomycine)刺激作为阳性质控。于96孔板中，每孔加入50μl脾细胞悬液和50μl相应刺激物，5％CO₂培养箱37℃刺激5h。

表面抗体染色：刺激完毕后，将96孔板取出，4℃1300rpm/min离心5min，弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散，于避光处将表面抗体Anti-Mouse CD8a PE、Anti-Mouse TCR beta PerCP-Cyanine5.5、Anti-Human/Mouse CD44FITC、Anti-Mouse IFN gamma APC用PBS(含体积浓度2％胎牛血清)在灭菌EP管中分别按照体积稀释为1:200。每孔加入50μl表面抗体混合液重悬，4℃避光孵育30min后，于避光向每孔细胞中加入150μl PBS(含体积浓度2％胎牛血清)终止孵育，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，加200μl PBS(含2％胎牛血清)重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。

破膜：每孔加入100μl Cytofix/Cytoperm重悬，4℃避光静置20min后避光加入100μl Buffer Perm/Wash终止，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，每孔加200μl Buffer Perm/Wash重悬洗涤，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。

胞内抗体染色：于避光处用1×perm/wash buffer在灭菌EP管中将抗体Anti-Mouse IFN gamma APC按1:200体积比稀释。每孔分别加入混合抗体50μl重悬，4℃避光孵育45min后，于避光向每孔细胞中加入150μl 1×perm/wash buffer终止孵育，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清震荡96孔板，加200μl 1×perm/wash buffer重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，每孔细胞加入200μl 2％多聚甲醛溶液重悬收集，4℃避光保存准备上机。

上机检测结果：用Research Beads进行Performance QC以校正光路和流路，去离子水为样品冲洗流式仪约10min，至Threshold Rate在20evts/sec以下。调试上机参数，选取所使用的荧光，确定样品收取数(10⁶events)，用空白孔(不做任何处理的细胞)调节测试电压，使FSC A-FSC H散点图、FSC A-SSC A散点图中细胞群与横坐标轴呈约45°夹角，每一种染料在峰状图中的出峰值(阴性峰峰值)均小于10²；测定样品并进一步调节电压，使分析某种荧光染料孵育的细胞时，该荧光染料的双峰峰值(阴性峰峰值、阳性峰峰值)以10²为界，其余荧光染料峰值小于10²。

如图4所示；为小鼠脾细胞IFN-γ细胞因子的分泌水平，可见相比未加GP33肽段组，LiΔactAplcB-Meso能够诱导特异性GP33细胞免疫应答。

实施例2：疫苗菌株对间皮素高表达肿瘤治疗效果评价

(1)CT26-MESO肿瘤细胞培养及肿瘤模型的建立

用含10％胎牛血清、1％青霉素、链霉素的RPMI1640Medium在37℃5％CO₂培养箱内培养CT26-MESO细胞，待其密度达到80％左右，用Hank’s液润洗细胞2～3次后，胰酶消化并用PBS重悬计数，将细胞配制成浓度为5×10⁶/ml的细胞悬液，6～8周龄的BALB/c雌鼠尾静脉注射100μl细胞悬液，建立小鼠肿瘤模型，观察生存率。

(2)对建模小鼠进行免疫治疗

实验设立阴性对照组：分别于造模第3、10天注射与治疗组同等体积生理盐水(NS)；治疗组：分别于造模第3、10天注射0.1×LD₅₀的LiΔactAplcB-Meso(注射剂量为2×10⁷CFU/只)。

将造模小鼠随机分为2组，每组6只。分别于CT26-MESO细胞尾静脉注射后第3天进行第一次免疫治疗，按实施例1(6)配制菌液，各菌株尾静脉接种100μl，NS对照组尾静脉接种等体积NS。第10天进行第二次加强免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。每天观察生存状况。可见治疗组比阴性对照组小鼠生存率显著更高。实验制备疫苗株对间皮素高表达肿瘤起到有效的控制和治疗作用(图5)。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 南京颂悦生物科技有限公司

<120> 基于重组减毒绵羊李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1781

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagctttgtc ccgtacactt gctggtgaaa ctggtcaaga agctgctcca ctagatggtg 60

ttttagccaa tccacctaat atttcgagtt taagcccacg tcaattacta ggttttcctt 120

gtgcagaagt atctggcctt tctacagaac gtgttcgtga attagcagtt gcattagcac 180

aaaaaaacgt taaactatct acagaacaac ttcgttgttt agctcatcgt ctatctgaac 240

cgccagaaga tcttgatgca cttcctcttg atttattact atttcttaac ccagatgcat 300

tcagcggtcc gcaagcctgt acacatttct tctctcgtat tactaaagca aatgttgacc 360

tacttccgcg tggcgctcca gaacgtcaac gtttgctacc agcagcgcta gcatgttggg 420

gtgtacgtgg tagtctttta tccgaagcag atgtacgtgc tcttggtggt ttagcctgtg 480

atcttccagg tcgtttcgtt gctgaatcgg cagaagttct attaccacgt ttggtttcat 540

gtccaggtcc acttgaccaa gaccaacaag aggcagcacg tgcagctttg caaggtggtg 600

gcccaccata cggcccgcca tctacctgga gtgtatccac tatggatgcg cttcgtggtc 660

tattaccagt acttggccaa ccgattatcc gtagcatccc acaaggtatc gttgcagctt 720

ggcgtcaacg ctctagcaga gatccatctt ggcgtcaacc tgaacgtaca atccttcgtc 780

cacgttttcg tcgtgaagtt gaaaaaacag catgtccttc tggtaaaaaa gctcgtgaaa 840

ttgatgaatc cttaattttt tacaaaaaat gggaattgga agcatgcgtt gatgctgctt 900

tacttgcaac tcaaatggac agagtcaatg caatcccatt tacttacgaa caacttgacg 960

ttcttaaaca taaacttgat gaattatacc cacaaggtta tccagaatct gttattcaac 1020

acctaggcta cctattcctt aaaatgtctc cggaagacat tcgcaaatgg aatgtaacta 1080

gcctggaaac tttaaaagca ttattagaag tgaataaagg ccatgaaatg tcaccacaag 1140

tagcaacatt aattgatcgt tttgtcaaag gtcgtggaca acttgacaag gatactttag 1200

atactttgac agcattctat ccaggttact tatgttcact ttctccagaa gaattatcct 1260

ctgtaccacc atcctcgatc tgggctgtac gccctcaaga tcttgataca tgcgatccgc 1320

gtcaacttga tgttctatat cctaaagctc gtttagcatt tcaaaatatg aacggctctg 1380

aatattttgt aaaaatccaa tccttccttg gtggtgctcc tacagaagac cttaaagctc 1440

tatctcaaca aaacgtaagt atggatttag cgactttcat gaaattaaga acggatgcag 1500

tactaccttt aacggtagca gaggttcaaa aattactagg cccacacgtt gaaggtctta 1560

aagctgagga acgtcaccgc ccagtacgtg attggatttt acgtcaacgc caagatgatc 1620

ttgatacctt ggggttaggt ttacaaggtg gtatcccaaa tggttatctt gtacttgatt 1680

taagtgtaca agaagctctt agcggtacac cttgcttatt gggtcctggc ccagttttga 1740

cagttttagc attgttatta gcttctacac ttgctctcga g 1781

<210> 2

<211> 14828

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcggccgcc agtgtgatgg atatctgcag aattaattcg gctttctaga gtgactttta 60

tgttgaggca ttaacatttg ttaacgacga taaagggaca gcaggactag aataaagcta 120

taaagcaagc atataatatt gcgtttcatc tttagaagcg aatttcgcca atattataat 180

tatcaaaaga gaggggtggc aaacggtatt tggcattatt aggttaaaaa atgtagaagg 240

agagtgaaac ccatgaaaaa aataatgcta gtttttatta cacttatatt agttagtcta 300

ccaattgcgc aacaaactga agcaaaggat gcatcggatc catatccata tgatgttcca 360

gattatgcat cattgaattc aatgagaagt gaaagaccac aagctttgtc ccgtacactt 420

gctggtgaaa ctggtcaaga agctgctcca ctagatggtg ttttagccaa tccacctaat 480

atttcgagtt taagcccacg tcaattacta ggttttcctt gtgcagaagt atctggcctt 540

tctacagaac gtgttcgtga attagcagtt gcattagcac aaaaaaacgt taaactatct 600

acagaacaac ttcgttgttt agctcatcgt ctatctgaac cgccagaaga tcttgatgca 660

cttcctcttg atttattact atttcttaac ccagatgcat tcagcggtcc gcaagcctgt 720

acacatttct tctctcgtat tactaaagca aatgttgacc tacttccgcg tggcgctcca 780

gaacgtcaac gtttgctacc agcagcgcta gcatgttggg gtgtacgtgg tagtctttta 840

tccgaagcag atgtacgtgc tcttggtggt ttagcctgtg atcttccagg tcgtttcgtt 900

gctgaatcgg cagaagttct attaccacgt ttggtttcat gtccaggtcc acttgaccaa 960

gaccaacaag aggcagcacg tgcagctttg caaggtggtg gcccaccata cggcccgcca 1020

tctacctgga gtgtatccac tatggatgcg cttcgtggtc tattaccagt acttggccaa 1080

ccgattatcc gtagcatccc acaaggtatc gttgcagctt ggcgtcaacg ctctagcaga 1140

gatccatctt ggcgtcaacc tgaacgtaca atccttcgtc cacgttttcg tcgtgaagtt 1200

gaaaaaacag catgtccttc tggtaaaaaa gctcgtgaaa ttgatgaatc cttaattttt 1260

tacaaaaaat gggaattgga agcatgcgtt gatgctgctt tacttgcaac tcaaatggac 1320

agagtcaatg caatcccatt tacttacgaa caacttgacg ttcttaaaca taaacttgat 1380

gaattatacc cacaaggtta tccagaatct gttattcaac acctaggcta cctattcctt 1440

aaaatgtctc cggaagacat tcgcaaatgg aatgtaacta gcctggaaac tttaaaagca 1500

ttattagaag tgaataaagg ccatgaaatg tcaccacaag tagcaacatt aattgatcgt 1560

tttgtcaaag gtcgtggaca acttgacaag gatactttag atactttgac agcattctat 1620

ccaggttact tatgttcact ttctccagaa gaattatcct ctgtaccacc atcctcgatc 1680

tgggctgtac gccctcaaga tcttgataca tgcgatccgc gtcaacttga tgttctatat 1740

cctaaagctc gtttagcatt tcaaaatatg aacggctctg aatattttgt aaaaatccaa 1800

tccttccttg gtggtgctcc tacagaagac cttaaagctc tatctcaaca aaacgtaagt 1860

atggatttag cgactttcat gaaattaaga acggatgcag tactaccttt aacggtagca 1920

gaggttcaaa aattactagg cccacacgtt gaaggtctta aagctgagga acgtcaccgc 1980

ccagtacgtg attggatttt acgtcaacgc caagatgatc ttgatacctt ggggttaggt 2040

ttacaaggtg gtatcccaaa tggttatctt gtacttgatt taagtgtaca agaagctctt 2100

agcggtacac cttgcttatt gggtcctggc ccagttttga cagttttagc attgttatta 2160

gcttctacac ttgctctcga gtatacagat attgaaatga atagattagg aaaatgataa 2220

gtcgacgatt cacaaaaaat aggcacacga aaaacaagtt aagggatgca gtttatgcat 2280

cccttaactt acttattaaa taatttatag ctattgacaa gagataagaa ttgttcaaag 2340

ctaatattgt ttaaatcgtc aattcctgca tgttttaagg aattgttaaa ttgatttttt 2400

gtaaatattt tcttgtattc tttgttaacc catttcagaa cgaaataatt atacttttgt 2460

ttatctttgt gtgatattct tgattttttt ctacttaatc tgataagtga gctattcact 2520

ttaggtttag gatgaaaata ttctcttgga accatactta atatagaaat atcaacttct 2580

gccattaaaa gtaatgccaa tgagcgtttt gtatttaata atcttttagc aaacccgtat 2640

tccacgatta aataaatctc attagctata ctatcaagaa caattttgcg tattatatcc 2700

gtacttatgt tataaggtat attaccatat attttatagg attggttttt aggaaattta 2760

aactgcaata tatccttgtt taaaacttgg aaattatcgt gatcaacaag tttattttct 2820

gtagttttgc ataatttatg gtctatttca atggcagtta cgaaattaca cctctttact 2880

aattcaaggg taaaatggcc ttttcctgag ccgatttcaa agatattatc atgttcattt 2940

aatcttatat ttgtcattat tttatctata ttatgttttg aagtaataaa gttttgactg 3000

tgttttatat ttttctcgtt cattataacc ctctttaatt tggttatatg aattttgctt 3060

attaacgatt cattataacc acttattttt tgtttggttg ataatgaact gtgctgatta 3120

caaaaatact aaaaatgccc atattttttc ctccttataa aattagtata attatagcac 3180

gagctctgat aaatatgaac atgatgagtg atcgttaaat ttatactgca atcggatgcg 3240

attattgaat aaaagatatg agagatttat ctaatttctt ttttcttgta aaaaaagaaa 3300

gttcttaaag gttttatagt tttggtcgta gagcacacgg tttaacgact taattacgaa 3360

gtaaataagt ctagtgtgtt agactttatg aaatctttat acgtttatat atatttatta 3420

tccggaggtg tagcatgtct cattcaattt tgagggttgc cagagttaaa ggatcaagta 3480

atacaaacgg gatacaaaga cataatcaaa gagagaataa aaactataat aataaagaca 3540

taaatcatga ggaaacatat aaaaattatg atttgattaa cgcacaaaat ataaagtata 3600

aagataaaat tgatgaaacg attgatgaga attattcagg gaaacgtaaa attcggtcag 3660

atgcaattcg ccccgggact agtgcggccg ctaataatct tgcgcttcga tgacaacagc 3720

tgtaccagat gcagtgacca ttagcattcc gttatcagct ccaagcactt cataatcaat 3780

atcaacaccg ataacggcat ttgcgccaat atctttcgca cgttgttcca tttcacgaat 3840

tgcttcctcg cgagcattaa taagttcatc ttcatagcct tgcgaacggc ccccgaagaa 3900

atttcgaagt ccagccccaa tatctttcat aaagttaacg ccagtgatga cttcgccgaa 3960

aacgattttt ttatattcga taatttgttt gccttcaata tttggtgaag ttgttacaat 4020

catgagttat ccctacagtt tttcttttat catacctctt agtacttttt ctagtcaaag 4080

gatatccggt tatttcgtac gatttcgcgc tttttctata taagaaatag catctggaac 4140

tttacaagct gtatttccaa ggtttacatg aactttcccg actgatttcg cggcttccat 4200

cgctttttcg tgcaaatcgt ctttgtaaat tccacaagtg ataataaaac cgttcattga 4260

atagcgggtt ctattggttt ctgtttgcag cgtttctttc gcgcgttgaa gtaatgtctc 4320

tgcttcaggc aaattgttaa tatgttcgct gtaaatctgc cagcccatgg atttagttaa 4380

atcataatca ctttcaatcc atgttttggc gaaaaggagt gcatcatcac gtttgcttac 4440

aatcgatgct agtccaaaag ttagttgtga ccatgtttcg cgaaaagcga tattccattt 4500

ttcgatttgt tcggtggtta ttttgtttgg attaattgct agcaaaccga gataaatcaa 4560

gtcactatta tttgattcaa tcagttttac ggcgagttcg tgattttttg tcagtttttc 4620

tcggcggatg attttcttta aatcaccaat ttttagtccg taaagatcta atgaatccgg 4680

acaaccgtga ttacgaaaaa ttttgatcgt attggggttt tctaaggctt gtagctcggt 4740

gtcaagttgg tcaaaagtaa tcatacgcgt cactcctctc gaataaagta agtataacaa 4800

aaaaagcatg cgaaggcgca tgctttagga tttaagaata ttagtctatt tgtttcattg 4860

cgtcgtctag ctagaattaa ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 4920

taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 4980

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 5040

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 5100

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 5160

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 5220

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 5280

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc 5340

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 5400

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 5460

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 5520

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 5580

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg 5640

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 5700

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 5760

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 5820

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 5880

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 5940

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 6000

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 6060

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 6120

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 6180

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 6240

agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 6300

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 6360

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 6420

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 6480

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 6540

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 6600

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 6660

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 6720

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 6780

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 6840

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 6900

cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt 6960

acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact 7020

gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 7080

tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 7140

ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt 7200

cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca 7260

gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt 7320

tggtcacttg atgcctccgt gtaaggggga atttctgttc atgggggtaa tgataccgat 7380

gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga 7440

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gcagttctat ttgtaatgat catggcagtt atgttagtcg cgtgtgggga taaagaagaa 14400

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gcttcaaaag aagacgctga aaaaatgctt aaagcaacaa gcgataaatt ccaaggtatt 14580

gatggtttaa aagaaaagat tgaatataaa gatgataaag ctattgaaac actagaagta 14640

gattacacta aaatctcttc ggaagatatg aacaaaatcc ctggtatgtc ttcaaatggt 14700

gatacttcta aagggattag catggaggaa tctgcaaaaa tgctagaatc ccaaggctat 14760

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ttttttat 14828

<210> 3

<211> 10478

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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agagtgtctt gtgacaccta aattcaaaat ctatcggtca gatttatacc gatttgattt 120

tatatattct tgaataacat acgccgagtt atcacataaa agcgggaacc aatcatcaaa 180

tttaaacttc attgcataat ccattaaact cttaaattct acgattcctt gttcatcaat 240

aaactcaatc atttctttaa ttaatttata tctatctgtt gttgttttct ttaataattc 300

atcaacatct acaccgccat aaactatcat atcttctttt tgatatttaa atttattagg 360

atcgtccatg tgaagcatat atctcacaag acctttcaca cttcctgcaa tctgcggaat 420

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ttgctgattc tggatataaa acaaatgtcc aattacgtcc tcttgaattt ttcttgtttt 660

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taaaaaagta ggagaagcat gggaagaagt tggcgttaga taagggatgt cctccaagcc 3600

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aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga aaaaaataat gctagttttt attacactta 4080

tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa ctgaagcaaa ggatgcatcg gatcttaaag 4140

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tctctcgtat tactaaagca aatgttgacc tacttccgcg tggcgctcca gaacgtcaac 4620

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caatcccatt tacttacgaa caacttgacg ttcttaaaca taaacttgat gaattatacc 5220

cacaaggtta tccagaatct gttattcaac acctaggcta cctattcctt aaaatgtctc 5280

cggaagacat tcgcaaatgg aatgtaacta gcctggaaac tttaaaagca ttattagaag 5340

tgaataaagg ccatgaaatg tcaccacaag tagcaacatt aattgatcgt tttgtcaaag 5400

gtcgtggaca acttgacaag gatactttag atactttgac agcattctat ccaggttact 5460

tatgttcact ttctccagaa gaattatcct ctgtaccacc atcctcgatc tgggctgtac 5520

gccctcaaga tcttgataca tgcgatccgc gtcaacttga tgttctatat cctaaagctc 5580

gtttagcatt tcaaaatatg aacggctctg aatattttgt aaaaatccaa tccttccttg 5640

gtggtgctcc tacagaagac cttaaagctc tatctcaaca aaacgtaagt atggatttag 5700

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attggatttt acgtcaacgc caagatgatc ttgatacctt ggggttaggt ttacaaggtg 5880

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cttgcttatt gggtcctggc ccagttttga cagttttagc attgttatta gcttctacac 6000

ttgctctcga gggattaaat ggaccagata tttataaagg agtttatcaa tttaaaagtg 6060

ttgaatttga tgtcgagtat acagatattg aaatgaatag attaggaaaa tgataagtcg 6120

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cttgagcctc aataacaaca gcagtgccag atgctgtaac cattaacata ccattatccg 6240

ctccaagtac ttcataatcg atatccacac caattacggc atttgctccg atatctttgg 6300

cgcgctgttc catctcttta atagcttcct cacgtgcgtt aattaactcg tcttcataac 6360

cttgtgatcg tccaccgaaa aagtttctga ggccagctcc aatgtctttc ataaaattaa 6420

caccagtaat tacttctccg aaaacgattt ttttatattc gataatttgc ttgccttcaa 6480

tatttggtga ggtagttaca atcattatta aatccctcca gttttctttt atcatacctc 6540

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ctattgattc tgctgcttcc aatgcttttg tgtaaagttc ctctttataa attccgcaag 6720

cgatgatata actattcata gagtaacgag ttctgttcgt ttcagattgt aaagattctt 6780

ttgcgagttc cagtaattcc tcggcttcag gcaaagtcgc gatgtgttct gtgaaaattt 6840

gccagcccat tgatttagtt aaatcagcat cacttttaat ccatttccta gcaaaggtga 6900

gtgcgtcatc acgtttactt acaacggagg ctagcccaaa agttaacatc gtccaagcat 6960

ctcgaaaagc tatattccat ttctcgattt gtgaaacagc tactttttta gggttcacgg 7020

caagtaaacc aaggtaaatt aagtcgctat tattagactc gattaattgg agtgctaatt 7080

cgtgattttt attcaatttt tcacggcgaa taattttctt taaatcacca atctttaatc 7140

tctagaactt ttttaagtgt atctgcggag tttttcattt gttctttttc tttgtcattt 7200

aagttcattt caacaatatg gcgaacgcct tgacggttaa cgactgctgg tgcacctata 7260

taaatatcgt tcataccgta atggccatct aaataaacag aaagtggcaa aatcgcattt 7320

tcgttattta gaattgcttt tgtaatacga gcaagagctg cagcaacgcc gtagaatgta 7380

gcgccttttt tattaataat ttcataagct gcatcacgaa cacttacgaa aatagtatcc 7440

attgcacctt gttcatcttc gctaatccat tcagtaattg gaaggccgcc gacagttgtg 7500

tggctccatg ctgggaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag 7560

gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 7620

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 7680

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 7740

ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 7800

gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 7860

gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 7920

atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg 7980

caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 8040

gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 8100

accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 8160

ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 8220

gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgc agcaatggca 8280

acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 8340

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 8400

ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 8460

gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 8520

gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 8580

tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 8640

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 8700

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 8760

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 8820

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 8880

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 8940

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 9000

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 9060

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 9120

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 9180

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 9240

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 9300

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 9360

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 9420

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 9480

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 9540

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca 9600

atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg 9660

tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 9720

tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 9780

tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt 9840

gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa 9900

gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg 9960

tcacttgatg cctccgtgta agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 10020

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 10080

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 10140

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 10200

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 10260

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 10320

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 10380

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga 10440

cccaacgctg cccgacgatg ataagctgtc aaacatga 10478

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccacaagctt tgtcccgtac acttg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatactcgag agcaagtgta gaagc 25

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gataagtcga cgattcacaa aaaatag 27

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaactagtc ccggggcgaa ttg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaagctaaaa gtgcaaatgt ccc 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atttctttaa tactgcgttt gggg 24

Claims (9)

1.基于重组减毒绵羊李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗，其特征在于，其有效成分为携带间皮素基因的重组减毒绵羊李斯特菌。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述重组减毒绵羊李斯特菌的制备方法，是以减毒绵羊李斯特菌为载体，携带间皮素基因而得。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，具体步骤如下：

(1)合成间皮素基因片段；

(2)构建打靶质粒；

(3)制备感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ；

(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；

(5)LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询间皮素蛋白氨基酸序列，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得，如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-Meso，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建；切下中间质粒pCW203-Meso的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW154的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW154-Meso，如SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：将LiΔactAplcB-lacZ用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A₆₀₀，当A₆₀₀＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A₆₀₀＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可。

8.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(4)的具体方法是：取打靶质粒电转至LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞中，电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证。

9.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(5)的具体方法是：将携带打靶质粒的绵羊李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证。