CN103255201B - 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒 - Google Patents

一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒。本发明中，根据退火温度来设计相应的blocker引物，在blocker的退火温度下，Blocker引物与野生型模板结合，阻断野生型的扩增，同时使用ARMS技术来降低野生型背景的扩增。本发明通过将Blocker富集技术以及ARMS荧光定量PCR技术整合在一个反应体系中，一步即可实现对突变基因的富集和鉴定，减少了操作步骤，提高了检测灵敏度和特异性。

Description

一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种检测基因突变的方法和试剂盒。
背景技术
基因突变(gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变而引起的基因结构的改变。基因突变分为两种，性细胞突变以及体细胞突变。性细胞突变是指发生在性细胞的突变，是可遗传的突变类型。除性细胞外的体细胞发生的突变不会造成后代的遗传改变，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变。绝大部分体细胞突变无表型效应。体细胞突变是一种稀有突变，体细胞突变存在于大量的野生型背景DNA序列中，相对于野生型背景序列的含量，体细胞突变含量很少。如肿瘤患者组织和外周血内含有少量的肿瘤细胞DNA，初期出现的细菌和病毒耐药情况等。体细胞突变常与疾病的发病相关，可以作为疾病发病的标志物、预后判断的主要标志以及用药指导的标志物。因此，体细胞突变的检测对于疾病的诊疗和预后评价具有重要的意义。
肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因。其中以非小细胞肺癌(NSCLC)最常见。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌临床治疗的重要手段。易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药)作为表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变L858R和19外显子缺失(E746_A750)与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数携带EGFR基因突变L858R和19外显子缺失(E746_A750)的病人疗效显著。但几乎所有患者迟早均要发生EGFR-TKI性耐药，中位无进展时间只有6-12个月。而EGFR-TKI耐药存在明显的分子靶标，即T790M。EGFR野生型基因序列见Genbank No.NM_005228.3，T790M突变即该序列中第2369个碱基C突变为T。结合EGFR基因突变的检测信息制定出最为适合NSCLC病人个体的肿瘤治疗方案，为临床医生用药提供用药科学依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。
目前体细胞突变的检测方法主要有DNA测序法和突变体富集PCR等技术方法。DNA测序法是进行突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。测序法对取材和技术要求比较高，更重要的是，由于测序方法本身的限制，灵敏度不高，只能对含量大于20％的突变基因进行检测。突变体富集PCR是一种用限制性内切酶选择性消化野生型基因的两步法PCR，与测序法相比，由于突变体富集PCR有两次PCR扩增，检测突变灵敏性更高，特异性强更强，能从104～105个野生型拷贝中检测到一个突变基因。该方法的主要限制因素是，合适限制性内切酶的选择、操作复杂、耗时长、以及两次PCR容易污染。
探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)ARMS又名等位基因特异PCR(allele specific PCR，AS-PCR)。原理为：利用Taq DNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因。该方法的能够在103～104个野生型拷贝中检测到一个突变基因，检测灵敏度高。该方法的主要限制因素是，若突变的位点为弱错配碱基序列，该方法的特异性将受到影响。
基于Blocker技术来检测突变位点目前也已经有相应的文献报道。Blocker引物是一段与野生型完全匹配互补的核酸序列。目前Blocker引物的使用方法主要是有以下两种，一种是Blocker引物和扩增引物不重叠，Blocker引物位于突变位点区域，突变引物封闭野生型DNA，而不封闭突变型模板，因此突变型模板扩增；另一种是Blocker引物和扩增引物有重叠，利用Blocker引物封闭野生型DNA，降低野生型模板DNA的扩增。这种方法能够有效地降低野生型模板的扩增，提高野生型背景中突变型DNA模板的检出能力。但是这种方法也存在一个问题，在Blocker引物封闭的过程中，Blocker不能有效的区分突变型模板和野生型模板，尽管有一个碱基的差别(针对突变位点)，但是在引物的退火温度下(meltingtemperature，Tm)Blocker引物还是能够和突变型的模板接合，或者引物也能够与野生型模板接合，从而降低了野生型封闭的效率以及突变型的检测效率。因此，针对突变位点提供一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测方法成为目前临床上迫切的需要。
因此，为了进一步提高ARMS+Blocker技术中Blocker引物的封闭效率，我们设计的Blocker引物的退火温度要高于ARMS引物的退火温度。这样，在Blocker引物的退火温度下，Blocker引物优先与野生型模板结合，因为Blocker引物与突变型模板相差一个碱基，退火温度也有差异，所以在这个条件下，Blocker引物优先与野生型结合，而不与突变型结合，同时扩增引物也不与野生型结合。在扩增引物的退火温度条件下，扩增引物将与突变型模板结合。通过上述方法能够有效降低野生型背景的扩增，提高突变型的检测效率。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法，本方法整合了Blocker技术和ARMS荧光定量PCR技术。本发明能够检测的突变类型主要包括：点突变、缺失突变和插入突变等。
本发明的另一个目的是提供一种基因突变的检测试剂盒。本发明能够检测的突变类型主要包括：点突变、缺失突变和插入突变等。
因此，根据本发明的第一个方面，提供了一种用于基因突变检测的Blocker引物，所述Blocker引物为与所检测突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸的寡核苷酸，其中，所述Blocker引物的退火温度(Tm值)高于突变检测引物的退火温度(Tm值)。因此，在DNA模板变性双链打开之后，在Blocker引物的退火温度(Tm)下，Blocker引物与野生型模板优先结合从而阻断突变检测引物与野生型模板结合，然后在突变检测引物的退火温度(Tm)下，突变检测引物与突变型模板结合，通过PCR反应富集扩增样本DNA中待测基因突变的片段。
本发明中，优选地，所述Blocker引物的长度为15～35bp。
本发明中，优选地，所述Blocker引物的相关参数可为：Tm值65.0℃-85.0℃，GC值40.0％-65.0％，引物大小25±10bp。
本发明中，优选地，在所述Blocker引物的3’末端进行双脱氧碱基修饰，该末端修饰碱基与所检测序列的野生型序列的碱基互补，或者使用其他的化学基团进行修饰如：C3Spacer或磷酸化修饰。
本发明中，优选地，所述Blocker引物在合成过程中在其序列中直接引入化学基团提高其Tm值，例如，MGB修饰。
本发明中，优选地，在所述Blocker引物的5’末端进行去磷酸化修饰，以阻止其被Taq聚合酶酶切降解。
本发明中，优选地，使所述Blocker引物的退火温度比突变检测引物的退火温度高5～25℃。更优选地，所述Blocker引物的Tm值比所述突变检测引物的Tm值高20～25℃。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于检测EGFR基因点突变T790M的Blocker引物，所述Blocker引物的序列为5’-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ddC(SEQ ID NO：1)。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于检测EGFR基因19外显子缺失(E746_A750缺失突变)的Blocker引物，所述Blocker引物的序列为5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ddC(SEQ ID NO：9)。
根据本发明的第二个方面，提供了一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法，在包括样本DNA、Blocker引物、ARMS引物、TaqMan探针、聚合酶及缓冲液的同一反应体系中，依次进行阻断富集PCR反应和ARMS荧光定量PCR反应，该方法包括以下步骤：
1)首先在Blocker引物的退火温度(Tm)下，Blocker引物与野生型模板优先结合从而阻断ARMS引物与野生型模板结合，然后在ARMS引物的退火温度(Tm)下，ARMS引物与突变型模板结合，通过PCR反应富集扩增样本DNA中包含待测基因突变区域的片段，其中，所述Blocker引物为与所检测突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物3’末端位于突变区域处，可扩增包含待测基因突变区域的片段并且与突变型序列一致，其中，所述Blocker引物的退火温度高于ARMS引物的退火温度。其中，突变型序列是指点突变、缺失或者插入碱基的核苷酸序列。
2)在反应1)的基础上，ARMS引物及5’端FAM标记的Taqman探针通过荧光定量PCR反应对所述突变基因进行荧光检测。
Blocker引物
本发明的方法中，优选地，所述Blocker引物在突变区域附近(包含突变区域)设计，且Blocker引物与突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸。
本发明的方法中，优选地，所述Blocker引物的长度为15～35bp。
本发明的方法中，优选地，所述Blocker引物的相关参数可为：Tm值65.0℃-85.0℃，GC值40.0％-65.0％，引物大小25±10bp。
本发明的方法中，优选地，在所述Blocker引物的3’末端进行双脱氧碱基修饰，或者使用其他的化学基团进行修饰如：C3Spacer或磷酸化修饰。
本发明中，优选地，所述Blocker引物在合成过程中在其序列中直接引入化学基团提高其Tm值，例如，MGB修饰。
本发明中，优选地，在所述Blocker引物的5’末端进行去磷酸化修饰，以阻止其被Taq聚合酶酶切降解。
ARMS引物
本发明的方法中，优选地，所述ARMS引物可扩增一段60-150bp片段的产物，所述ARMS引物的相关参数可为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±5bp。
本发明的方法中，优选地，所述ARMS引物3’末端碱基与所述突变基因的突变碱基完全一致。
本发明的方法中，优选地，所述ARMS引物的3’末端可位于突变区域处，并与突变型基因的突变碱基序列一致。为提高特异性，优选地，可在所述ARMS引物的3’末端第2个、第3个碱基或第4个碱基处再引入一个错配碱基。具体而言，当所述突变为点突变时，ARMS引物的3’末端碱基可为突变位点处碱基；当所述突变为缺失突变时，ARMS引物的3’末端碱基可为与缺失碱基相邻的下一个碱基；当所述突变为插入突变时，ARMS引物的3’末端碱基可为插入碱基。
本发明的方法中，优选地，所述Blocker引物的退火温度比所述ARMS引物的退火温度高5～25℃。更优选地，所述Blocker引物的退火温度比所述ARMS引物的退火温度高20～25℃。
探针
在ARMS引物扩增片段内设计探针，所述探针的相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端FAM标记，3’端标记相应的淬灭荧光基团TAMAR或者BHQ。
在一个实施方式中，本发明提供了一种EGFR基因点突变T790M的一步检测方法，其特征在于，所述Blocker引物的序列为5’-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ddC(SEQ ID NO：1)，所述上游ARMS引物的序列为：5’-CACCGTGCAGCTCATTAT-3’(SEQ ID NO：2)，下游引物的序列为：5’-CACACACCAGTTGAGCAGGTACT-3’(SEQ ID NO：3)；所述Taqman探针的序列为：5’-CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’(SEQ ID NO：4)。优选地，反应条件为：1)95℃5分钟；95℃15秒、80℃20秒、60℃30秒、72℃20秒，共5个循环；2)95℃15秒、80℃20秒、60℃45秒(收集荧光)，共40个循环。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种EGFR基因19外显子缺失(E746_A750缺失突变)的一步检测方法，其特征在于，所述Blocker引物的序列为：5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ddC(SEQ ID NO：9)，上游ARMS引物的序列为：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’(SEQ ID NO：10)，下游引物的序列为：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO：11)，所述Taqman 探针的序列为：5’-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：12)。优选地，反应条件为：1)95℃5分钟；95℃15秒、80℃20秒、60℃30秒、72℃20秒，共5个循环；2)95℃15秒、80℃20秒、60℃45秒(收集荧光)，共40个循环。
根据本发明的第三个方面，提供了一种基因突变的检测试剂盒，包括：Blocker引物、ARMS引物以及5’端FAM标记的Taqman探针，其中，所述Blocker引物为与所检测突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物3’末端位于突变区域处，可扩增包含待测基因突变区域的片段并且与突变型序列一致，其中，所述Blocker引物的退火温度高于ARMS引物的退火温度。其中，突变型序列是指点突变、缺失或者插入碱基的核苷酸序列。
Blocker引物
本发明的试剂盒中，优选地，所述Blocker引物在突变区域附近(包含突变区域)设计，且blocker引物与突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸。
本发明的试剂盒中，优选地，所述Blocker引物的长度为15～35bp。
本发明的试剂盒中，优选地，所述Blocker引物的相关参数可为：Tm值65.0℃-85.0℃，GC值40.0％-65.0％，引物大小25±10bp。
本发明的试剂盒中，优选地，在所述Blocker引物的3’末端进行双脱氧碱基修饰。
本发明试剂盒中，优选地，所述Blocker引物在合成过程中在其序列中直接引入化学基团提高其Tm值，例如，MGB修饰。
本发明的试剂盒中，优选地，在所述Blocker引物的5’末端进行去磷酸化修饰，以阻止其被Taq聚合酶酶切降解。
ARMS引物
本发明的试剂盒中，优选地，所述ARMS引物可扩增一段60-150bp片段的产物，所述ARMS引物的相关参数可为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±5bp。
本发明的试剂盒中，优选地，所述ARMS引物的3’末端位于突变区域处，并与突变型基因序列一致。为提高特异性，可在所述ARMS引物的3’末端第2、或第3个碱基或第4个碱基处再引入一个错配碱基。具体而言，当所述突变为点突变时，ARMS引物的3’末端碱基可为突变位点处碱基；当所述突变为缺失突变时，ARMS引物的3’末端碱基可为与缺失碱基相邻的下一个碱基；当所述突变为插入突变时，ARMS引物的3’末端碱基可为插入碱基。
本发明中，优选地，所述Blocker引物的退火温度比所述ARMS引物的退火温度高5～25℃。更优选地，所述Blocker引物的退火温度比所述ARMS引物的退火温度高20～25℃。
探针
在ARMS引物扩增片段内设计探针，所述探针的相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端FAM标记，3’端标记相应的淬灭荧光基团TAMAR或者BHQ。
在一个实施方式中，本发明提供了一种EGFR基因点突变T790M的一步检测试剂盒，其特征在于，所述Blocker引物的序列为5’-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ddC(SEQ ID NO：1)，所述上游ARMS引物的序列为：5’-CACCGTGCAGCTCATTAT-3’(SEQ ID NO：2)，下游引物的序列为：5’-CACACACCAGTTGAGCAGGTACT-3’(SEQ ID NO：3)；所述Taqman探针的序列为：5’-CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’(SEQ ID NO：4)。优选地，反应条件为：1)95℃5分钟；95℃15秒、80℃20秒、60℃30秒、72℃20秒，共5个循环；2)95℃15秒、80℃20秒、60℃45秒(收集荧光)，共40个循环。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种EGFR基因19外显子缺失(E746A750缺失突变)的一步检测试剂盒，其特征在于，所述Blocker引物的序列为：5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ddC(SEQ ID NO：9)，上游ARMS引物的序列为：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’(SEQ ID NO：10)，下游引物的序列为：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO：11)，所述Taqman探针的序列为：5’-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：12)。优选地，反应条件为：1)95℃5分钟；95℃15秒、80℃20秒、60℃30秒、72℃20秒，共5个循环；2)95℃15秒、80℃20秒、60℃45秒(收集荧光)，共40个循环。
本文所用术语“突变型序列”是指点突变、缺失或者插入碱基的核苷酸序列。
本文所用术语“突变区域”是指突变位点、序列缺失或者序列插入位点。
本文所用术语“一致”是指与检测的突变区域的核苷酸序列相同或者互补，在本文具体实施方式中所列是与检测的突变区域的核苷酸序列相同的情况。
本发明中，根据退火温度来设计相应的blocker引物，在blocker的退火温度下，Blocker引物与野生型模板结合，阻断野生型的扩增，同时使用ARMS技术来降低野生型背景的扩增。
本发明通过将Blocker富集技术以及ARMS荧光定量PCR技术整合在一个反应体系中，一步即可实现对突变基因的富集和鉴定，减少了操作步骤，提高了检测灵敏度和特异性。
附图说明
图1显示T790位点野生型质粒在加入Blocker引物和未加入Blocker引物的情况下的扩增曲线。A：T790位点野生型质粒107个拷贝/μl背景下未加入Blocker引物，B：T790位点野生型质粒107个拷贝/μl背景下加入Blocker引物。
图2显示T790位点突变型质粒在未加入Blocker引物的情况下的扩增曲线。A：T790位点突变型质粒104个拷贝/μl，B：T790位点突变型质粒103个拷贝/μl，C：T790位点突变型质粒102个拷贝/μl，D：T790位点突变型质粒10个拷贝/μl。
图3显示T790位点突变型质粒在加入Blocker引物的情况下的扩增曲线。A：T790位点突变型质粒104个拷贝/μl，B：T790位点突变型质粒103个拷贝/μl，C：T790位点突变型质粒102个拷贝/μl，D：T790位点突变型质粒10个拷贝/μl。
图4显示T790位点突变型质粒混合在107个拷贝/μl野生型背景质粒在加入Blocker引物条件扩增曲线。A：T790位点突变型质粒104个拷贝/μl，B：T790位点突变型质粒103个拷贝/μl，C：T790位点突变型质粒102个拷贝/μl，D：T790位点突变型质粒10个拷贝/μl。
图5显示T790位点突变型质粒混合在107个拷贝/μl野生型背景质粒在未加入Blocker条件扩增曲线。A：T790位点突变型质粒104个拷贝/μl，B：T790位点突变型质粒103个拷贝/μl，C：T790位点突变型质粒102个拷贝/μl，D：T790位点突变型质粒10个拷贝/μl。
图6显示19缺失位点野生型质粒在加入Blocker引物和未加入Blocker引物的情况下的扩增曲线。A：19缺失位点野生型质粒107个拷贝/μl背景下未加入Blocker引物，B：19缺失位点野生型质粒107个拷贝/μl背景下加入Blocker引物。
图7显示19缺失突变型质粒在未加入Blocker引物的情况下的扩增曲线。A：19缺失突变型质粒104个拷贝/μl，B：19缺失突变型质粒103个拷贝/μl，C：19缺失突变型质粒102个拷贝/μl，D：19缺失突变型质粒10个拷贝/μl。
图8显示19缺失变型质粒在加入Blocker引物的情况下的扩增曲线。A：19缺失突变型质粒104个拷贝/μl，B：19缺失突变型质粒103个拷贝/μl，C：19缺失突变型质粒102个拷贝/μl，D：19缺失突变型质粒10个拷贝/μl。
图9显示19缺失突变型质粒混合在107个拷贝/μl野生型背景质粒在加入Blocker引物条件扩增曲线。A：T790位点突变型质粒104个拷贝/μl，B：T790位点突变型质粒103个拷贝/μl，C：T790位点突变型质粒102个拷贝/μl，D：T790位点突变型质粒10个拷贝/μl。
图10显示19缺失突变型质粒混合在107个拷贝/μl野生型背景质粒在未加入Blocker条件扩增曲线。A：T790位点突变型质粒104个拷贝/μl，B：T790位点突变型质粒103个拷贝/μl，C：T790位点突变型质粒102个拷贝/μl，D：T790位点突变型质粒10个拷贝/μl。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例
实施例1EGFR基因点突变T790M的突变阻断富集ARMS荧光定量PCR一步检测方法
1.引物和探针设计
1)Blocker引物设计
在突变位点附近(包含突变位点)设计引物，3’末端进行双脱氧碱基修饰，以阻止其延伸并提高其退火温度。相关参数为：Tm值63.0℃-80.0℃，GC值40.0％-65.0％，引物大小25±10bp。
所设计的Blocker引物序列如下：
Blocker引物：5’-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ddC (SEQ ID NO：1)
2)ARMS引物设计
设计可扩增一段60-150bp片段的引物，相关参数为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±3bp。上游ARMS引物的3’末端位于突变位点处，并与突变型基因相一致，为提高特异性，在其3’末端第3个碱基处再引入一个错配碱基，所设计的ARMS引物序列如下：
上游ARMS引物：5’-CACCGTGCAGCTCATTAT-3’(SEQ ID NO：2)
下游引物：5’-CACACACCAGTTGAGCAGGTACT-3’(SEQ ID NO：3)
3)探针设计
在ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
探针：5’-CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’(SEQ ID NO：4)
实施例1中的Blocker引物，ARMS引物，引物和探针均由上海生物工程有限公司制备。
2.待检测样品制备：
野生型质粒构建：分别使用含有T790位点的上游引物序列1(5’-TTCACAGCCCTGCGTAAAC-3’(SEQ ID NO：5))和下游引物序列1(5’-TTTCCACATGCAGATGGGAC-3’(SEQ ID NO：6))以人基因组为模板PCR扩增(PCR反应条件：1)95℃5分钟；95℃15秒、55℃30秒、72℃20秒，共35个循环；72℃10分钟)后，将产物克隆至Takara公司pMD19载体，经测序验证正确后将样本提取后备用。反应体系如表1所示。
表1
突变型质粒构建：分别使用含有T790位点的上游引物序列1(5’-TTCACAGCCCTGCGTAAAC-3’(SEQ ID NO：5))和下游引物序列2(5’-CATGAGCTGCaTGATGAGCTGCA-3’(SEQ ID NO：8))以野生型质粒为模板PCR扩增后回收产物1。然后使用上游引物序列2(5’-TGCAGCTCATCAtGCAGCTCATG-3’(SEQ ID NO：7))以野生型质粒为模板PCR扩增后回收产物2。以产物1和产物2为模板，使用含有T790位点的上游引物序列1(5’-TTCACAGCCCTGCGTAAAC-3’(SEQ ID NO：5))和下游引物序列1(5’-TTTCCACATGCAGATGGGAC-3’(SEQ ID NO：6))PCR扩增。将产物克隆至Takara公司pMD19载体，经测序验证正确后将样本提取后备用(上游引物序列2和下游引物序列1中的小写字母代表突变型位点790)。突变型质粒构建的PCR反应条件及反应体系和野生型质粒构建相同。
3.检测方法：本发明的突变阻断富集一步检测方法将Blocker技术应用于突变位点PCR阻断富集、ARMS荧光定量PCR，在一个反应体系中依次进行PCR阻断富集和ARMS荧光定量PCR鉴定，具体过程为荧光PCR仪上将20μl包括下表中组分的反应体系(含有待检样本的DNA模板)首先进行高温变性使基因组双链打开；在80℃退火温度下，Blocker引物与野生型基因模板结合阻断ARMS引物与其结合；60℃退火时ARMS引物与野生型模板的结合被阻扰，ARMS引物不能扩增野生型模板；而突变型模板与ARMS引物的结合，72℃延伸使得包含突变碱基的要检测部分被选择性扩增富集。然后运行突变位点的检测反应，同样由于Blocker引物对野生型的封闭作用，降低了野生型基因的扩增，减少其对突变型基因的干扰；在60℃延伸45秒，收集突变扩增的荧光信号。反应体系如表2所示。
表2
反应条件如下：1)95℃5分钟；95℃15秒、80℃20秒、60℃30秒、72℃20秒，共5个循环；2)95℃15秒、80℃20秒、60℃45秒(收集荧光)，共40个循环。所用荧光定量PCR仪为ABISTEPONE(Appliedbiosystem公司)。
实验过程分别设置野生型质粒模板不加入Blocker引物以及加入Blocker引物的实验组，同时对在野生型背景(107个拷贝/μl)下分别加入不同浓度的突变型质粒模拟突变类型样本进行检测，分别设置不加入Blocker引物以及加入Blocker引物的实验组；同时设置对应的突变型质粒模板使用不加入Blocker引物体系进行检测。
结果分析：实验结果如图1所示，没有加入Blocker引物的组的野生型样本有扩增曲线，加入Blocker引物后，野生型质粒的扩增曲线被封闭，没有扩增曲线。图2、图3、图4和图5表明，加入Blocker引物后野生型质粒背景信号能够有效的阻断，能够有效检测混合样本中突变型质粒；没有加入Blocker引物，反应体系不能有效区分的野生型质粒和突变型质粒样本；同时，加入Blocker引物之后反应体系对于野生型质粒的检测能力没有变化。
综上所述，该加入Blocker引物的反应体系能够在野生型质粒的背景浓度下有效的检测突变型。
实施例2EGFR基因19外显子缺失E746_A750缺失突变的突变阻断富集ARMS荧光定量PCR一步检测方法
1.引物和探针设计
1)Blocker引物设计
在缺失突变区域附近(包含缺失序列)设计引物，3’末端进行双脱氧碱基修饰，以阻止其延伸并提高其退火温度。相关参数为：Tm值65.0℃-80.0℃，GC值40.0％-65.0％，引物大小25±10bp。
所设计的Blocker引物序列如下：
Blocker引物：5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ddC (SEQ ID NO：9)
2)ARMS引物设计
设计可扩增一段60-150bp片段的引物，相关参数为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±3bp。上游ARMS引物的3’末端位于突变位点处，并与突变型基因相一致，为提高特异性，在其3’末端第3个碱基处再引入一个错配碱基，所设计的ARMS引物序列如下：
上游ARMS引物：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’(SEQ ID NO：10)
下游引物：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO：11)
3)探针设计
在ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
探针：5’-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：12)
上述Blocker引物，ARMS引物，引物和探针由上海生物工程有限公司。
2.样品制备：
野生型质粒构建：分别使用含有E746_A750缺失位点的上游引物序列1(5’-GCCTAGACGCAGCATCATTA-3’(SEQ ID NO：13))和下游引物序列1(5’-ATGCCTCCATTTCTTCATCC-3’(SEQ ID NO：14))以人基因组为模板PCR扩增(PCR反应条件：1)95℃5分钟；95℃15秒、55℃30秒、72℃20秒，共35个循环；72℃10分钟)后，将产物克隆至Takara公司pMD19载体，经测序验证正确后将样本提取后备用。反应体系如表3所示。
表3
突变型质粒构建：分别使用含有E746_A750缺失位点的上游引物序列1(5’-GCCTAGACGCAGCATCATTA-3’(SEQ ID NO：13))和下游引物序列2(5’-CGGAGATGTttTGATAGCGACGGGAATT-3’(SEQ ID NO：16))以野生型质粒为模板PCR扩增后回收产物1。然后使用上游引物序列2(5’-TCGCTATCAaaACATCTCCGAAAGCCAAC-3’(SEQ ID NO：15))和下游引物序列1(5’-ATGCCTCCATTTCTTCATCC-3’(SEQ ID NO：14))以野生型质粒为模板PCR扩增后回收产物2。以产物1和产物2为模板，使用含有E746_A750缺失位点的上游引物序列1(5’-GCCTAGACGCAGCATCATTA-3’(SEQ ID NO：13))和下游引物序列1(5’-ATGCCTCCATTTCTTCATCC-3’(SEQ ID NO：14))PCR扩增。将产物克隆至Takara公司pMD19载体，经测序验证正确后将样本提取后备用(上游引物序列2和下游引物序列1中的小写字母代表E746_A750缺失位点)。突变型质粒构建的PCR反应条件及反应体系和野生型质粒构建相同。
3.检测方法：本发明的突变阻断富集一步检测方法将Blocker技术应用于突变位点PCR阻断富集、ARMS荧光定量PCR，在一个反应体系中依次进行PCR阻断富集和ARMS荧光定量PCR鉴定，具体过程为荧光PCR仪上将20μl包括下表中组分的反应体系(含有待检样本的DNA模板)首先进行高温变性使基因组双链打开；在80℃退火温度下，Blocker引物与野生型基因模板结合阻断ARMS引物与其结合；60℃退火时ARMS引物与野生型模板的结合被阻扰，ARMS引物不能扩增野生型模板；而突变型模板与ARMS引物的结合，72℃延伸使得包含突变碱基的要检测部分被选择性扩增富集。然后运行突变位点的检测反应，同样由于Blocker引物对野生型的封闭作用，降低了野生型基因的扩增，减少其对突变型基因的干扰；在60℃延伸45秒，收集突变扩增的荧光信号。反应体系如表4所示。
表4
反应条件如下：1)95℃5分钟；95℃15秒、80℃20秒、60℃30秒、72℃20秒，共5个循环；2)95℃15秒、80℃20秒、60℃45秒(收集荧光)，共40个循环。所用荧光定量PCR仪为ABISTEPONE(Appliedbiosystem公司)。
实验过程分别设置野生型质粒模板不加入Blocker引物以及加入Blocker引物的实验组，同时对在野生型背景(107个拷贝/μl)下分别加入不同浓度的突变型质粒模拟突变类型样本进行检测，分别设置不加入Blocker引物以及加入Blocker引物的实验组；同时设置对应的突变型质粒模板使用不加入Blocker引物体系进行检测。
结果分析：实验结果如图6所示，没有加入Blocker引物的组的野生型样本有扩增曲线，加入Blocker引物后，野生型质粒的扩增曲线被封闭，没有扩增曲线。图7、图8、图9和图10表明，加入Blocker引物后野生型质粒背景信号能够有效的阻断，能够有效检测混合样本中突变型质粒；没有加入Blocker引物，反应体系不能有效区分的野生型质粒和突变型质粒样本；同时，加入Blocker引物之后反应体系对于野生型质粒的检测能力没有变化。
综上所述，该加入Blocker引物的反应体系能够在野生型质粒的背景浓度下有效的检测突变型。

Claims (3)

1.一种基因突变的检测试剂盒，包括：Blocker引物、ARMS引物以及5’端FAM标记的Taqman探针，其中，所述Blocker引物为与所检测突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物的3’末端位于突变区域处，可扩增包含待测基因突变区域的片段并且与突变型序列一致，其中，在所述ARMS引物的3’末端第2个、第3个碱基或第4个碱基处再引入一个错配碱基，其中，所述Blocker引物的退火温度比所述ARMS引物的退火温度高20～25℃；
所述基因突变为EGFR基因点突变T790M，其中，所述Blocker引物的序列为5’-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ddC(SEQ ID NO:1)，所述上游ARMS引物的序列为：5’-CACCGTGCAGCTCATTAT-3’(SEQ ID NO:2)，下游引物的序列为：5’-CACACACCAGTTGAGCAGGTACT-3’(SEQ ID NO:3)；所述Taqman探针的序列为：5’-CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’(SEQ ID NO:4)。
2.一种基因突变的检测试剂盒，包括：Blocker引物、ARMS引物以及5’端FAM标记的Taqman探针，其中，所述Blocker引物为与所检测突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物的3’末端位于突变区域处，可扩增包含待测基因突变区域的片段并且与突变型序列一致，其中，在所述ARMS引物的3’末端第2个、第3个碱基或第4个碱基处再引入一个错配碱基，其中，所述Blocker引物的退火温度比所述ARMS引物的退火温度高20～25℃；
所述基因突变为EGFR基因19外显子缺失E746_A750缺失突变，其中，所述Blocker引物的序列为：5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ddC(SEQ ID NO:9)，上游ARMS引物的序列为：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’(SEQ ID NO:10)，下游引物的序列为：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO:11)，所述Taqman探针的序列为：5’-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’(SEQ ID NO:12)。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中，在所述Blocker引物的3’末端进行双脱氧碱基修饰；和/或，在所述Blocker引物的5’末端进行去磷酸化修饰。
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