CN109295175A - 用于检测人胃肠道间质瘤c-kit基因v559a突变的引物、检测方法及试剂盒 - Google Patents

用于检测人胃肠道间质瘤c-kit基因v559a突变的引物、检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于检测人胃肠道间质瘤C‑KIT基因V559A突变的引物、检测方法及试剂盒。本发明提供的检测引物能与C‑KIT基因的特异序列结合，扩增突变序列。本发明提供的检测方法采用检测荧光信号基团与扩增片段结合发出荧光信号，利用阻断剂与突变位点对应的野生型序列特异结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用竞争性等位基因特异性PCR扩增技术，建立基于实时荧光PCR的试剂盒，可准确检测C‑KIT基因V559A突变。本发明方法操作简单，结果易读；灵敏度高，能检出含0.001％C‑KIT基因V559A突变的样本，实现对C‑KIT基因V559A突变的超灵敏检测。

Description

用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的引物、检测 方法及试剂盒
本申请要求了2017年09月08日提交中国专利局的，申请号为201710806478.7，发明名称为“用于超灵敏检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因突变的引物、检测方法及试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A 突变的引物、检测方法及试剂盒。
背景技术
C-KIT是一种原癌基因，位于染色体4q11-12，大小约80kb，编码145KD的跨膜蛋白CD117，属于第Ⅲ类酪氨酸激酶受体家族，具有胞外配体结合区、跨膜区、膜内近膜区和酪氨酸蛋白激酶区。
胃肠道间质瘤(gastro in testina l stromal tumor，GIST)是消化道最常见的间叶性肿瘤，也是肿瘤生物靶向治疗中的典范。胃肠道间质瘤起源于胃肠道卡哈尔间质细胞(interstitial cell of Cajal，ICC)或向ICC分化的原始间充质细胞。
绝大多数GIST表达C-KIT编码的KIT蛋白(CD117)，且在许多病例中存在C-KIT基因突变，由此通过相互独立地获得传导性激活。即在无配体结合的情况下，KIT仍然能保持持续的自身酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号传导通路。C-KIT原癌基因表达产物C-KIT受体与其配体细胞因子结合后，可激发酪氨酸残基磷酸化，从而调节细胞的生长，对肿瘤的增殖、恶性演进及凋亡等方面都有重要作用。胃肠间质瘤的C-KIT突变区主要集中在4个外显子：9、11、13、17，最常见的为11外显子突变，约占65％。
目前研究表明，原癌基因C-KIT不仅参与了ICC分化发育及GIST的发生发展，而且C-KIT基因突变还与GIST危险度、基因靶向药物耐药性及预后有关，伊马替尼(Imatin ibmesy late ST I-571)或称为格列卫(G leevec)作为一种KIT酪氨酸激酶抑制剂，已应用于转移性和手术难于切除病例的治疗以及部分高度侵袭危险性病例的术后预防性化疗。
由于患者基因背景的不同，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在个体差异。因此，对药物作用相关基因的检测，可指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。
目前C-KIT基因突变检测的方法很多，如测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，高效液相色谱法，荧光定量PCR法等。其中最常见方法还是测序法，该法费用较高，操作耗时长。若能在癌症早期检测出癌基因，早发现早治疗。另外，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的基因突变，可以大大提高癌症患者的存活率。但由于癌症早期癌变样品特别是血液样品中的癌基因含量很少，而以上方法的检测灵敏度最多只能达到0.2％，远远还没达到从大量正常DNA背景下检测极其微量的异常DNA 分子的要求。因此，如何快速准确的检测C-KIT基因突变，就成为人们亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了用于检测C-KIT基因突变的引物、检测方法。本发明还提供了含有该引物和检测方法的试剂盒，通过特异性扩增技术，在抑制正常背景的情况下，把微量的异常DNA分子指数扩增，能从十万个正常DNA分子的背景之下，检测到一个异常DNA分子，其灵敏度达到0.001％，实现了基因突变的超灵敏检测。
为达到上述目的，本发明第一方面提供用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的检测方法，包括以下步骤：将用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的引物、阻断剂、检测荧光信号基团、待测基因样品混合，进行实时荧光定量PCR，获得检测结果；
其中，引物序列包括突变上游引物和突变下游引物，所述突变上游引物，其长度为15-40 个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测C-KIT基因V559A突变的一条链互补；所述突变下游引物，长度为15-40个碱基，与待测C-KIT基因V559A突变的另一条链互补；
所述阻断剂能与C-KIT基因V559A突变位点野生型序列特异结合，抑制野生型非特异扩增；
所述检测荧光信号基团能与PCR扩增片段结合并发出荧光信号。
在本发明一实施例中，所述突变上游引物，其长度为19个碱基，靠近3’末端的第3位的碱基为突变位点，与待测C-KIT基因V559A突变型的一条链互补。
在本发明一实施例中，所述突变下游引物，长度为15个碱基，与待测C-KIT基因V559A 突变型的另一条链互补。
在本发明一实施例中，所述突变上游引物的序列包括：GAAGTACAGTGGAAGGCTG(SEQ ID NO.1)，所述突变下游引物的序列：CTGTTATGTGTACCC(SEQ ID NO.2)。
在本发明一实施例中，所述阻断剂包括：匹配C-KIT野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团。
在本发明一优选实施例中，所述阻断剂中匹配C-KIT野生型基因的核酸序列包括：TACAGTGGAAGGTTGTTGAGGA(SEQ ID NO.3)；所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。
在本发明一实施例中，所述检测荧光信号基团包括：FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA、Cy5、SYTO 9、SYBR MIX中的一种或多种。
本发明第二方面提供用于检测人类C-KIT基因V559A突变的引物，包括突变上游引物和突变下游引物，所述突变上游引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、 4或5位的碱基为突变位点，与待测C-KIT基因V559A突变型的一条链互补；所述突变下游引物，长度为15-40个碱基，与待测C-KIT基因V559A突变型的另一条链互补。
在本发明一实施例中，所述突变上游引物，其长度为19个碱基，靠近3’末端的第3位的碱基为突变位点，与待测C-KIT基因V559A突变型的一条链互补。
在本发明一实施例中，所述突变下游引物，长度为15个碱基，与待测C-KIT基因V559A突变型的另一条链互补。
在本发明一优选实施例中，本发明中用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的引物，其序列包括：
突变上游引物的序列：GAAGTACAGTGGAAGGCTG(SEQ ID NO.1)，
突变下游引物的序列：CTGTTATGTGTACCC(SEQ ID NO.2)。
本发明第三方面提供用于检测人类C-KIT基因V559A突变的阻断剂，所述阻断剂能与C-KIT基因V559A突变位点野生型序列特异结合，抑制野生型非特异扩增。
在本发明一实施例中，所述阻断剂包括：匹配C-KIT野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团。
在本发明一优选实施例中，所述阻断剂中匹配C-KIT野生型基因的核酸序列包括：TACAGTGGAAGGTTGTTGAGGA(SEQ ID NO.3)；所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。
本发明第四方面提供用于检测人类C-KIT基因V559A突变的试剂盒，包括如本发明第二方面所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的引物、如本发明第三方面所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的阻断剂以及检测荧光信号基团。
在本发明一实施例中，所述检测荧光信号基团包括：FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA、Cy5、SYTO 9、SYBR MIX中的一种或多种。
本发明第五方面提供如本发明第一方面所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的检测方法、如本发明第二方面所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的引物、如本发明第三方面所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的阻断剂和/或如本发明第四方面所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的试剂盒在检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因突变中的应用。
在本发明一实施例中，所述应用中，所述被检测样品中，所述突变型基因的浓度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％。
进一步地，所述突变型基因浓度为变型基因占野生型基因数量或摩尔浓度的比例。
进一步地，所述突变型基因浓度为变型基因占样品总基因数量或摩尔浓度的比例。
本发明提供的用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因突变的检测方法能在10万个正常野生型DNA分子中，检测出存在的1个异常突变型DNA分子，即能检出含0.001％C-KIT基因突变的样本。
附图说明
图1为本发明实施例提供的原理示意图；
图2为为本发明实施例提供的加阻断剂体系与不加阻断剂体系扩增效果对比图，其中 A1为不加阻断剂体系扩增突变型基因的扩增曲线、B1为不加阻断剂体系扩增野生型基因的扩增曲线、A2为加阻断剂体系扩增突变型基因的扩增曲线、B2为加阻断剂体系扩增野生型基因的扩增曲线；
图3为本发明实施例提供的试剂盒的灵敏度检测，其中A、B、C、D分别为突变基因浓度为1％、0.1％、0.01％、0.001％的扩增曲线；
图4为本发明实施例提供的试剂盒的特异性检测，其中A为对突变异常基因扩增、B为对正常基因扩增、C为对PIK3CA基因扩增、D为EGFR基因扩增、E为对非目标基因混合物扩增。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
下面将结合图1，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
实施例1
1、用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的引物及阻断剂
根据NCBI数据库公布的C-KIT基因野生型序列，以C-KIT基因V559A突变位点为参考，设计特异性突变引物。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板，建立了实时荧光PCR突变(Mutation)检测体系，实现对C-KIT基因V559A突变的高灵敏度和高特异性检测。
用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的引物序列：
突变上游引物的序列包括：
5’-GAAGTACAGTGGAAGGCTG-3’(SEQ ID NO.1)
突变下游引物的序列包括：
5’-CTGTTATGTGTACCC-3’(SEQ ID NO.2)。
其中，突变上游引物，其长度为19个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与C-KIT基因V559A(c.1676T>C)突变位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列。突变下游引物，其长度为15个碱基，与C-KIT基因保守序列结合。
为了进一步区分野生型序列与突变型序列，本发明添加了阻断剂，包括匹配C-KIT野生型基因的核酸序列及化学修饰基团；
其中，所述阻断剂中匹配C-KIT野生型基因的核酸序列为：
5’-TACAGTGGAAGGTTGTTGAGGA-3’(SEQ ID NO.3)；
所述化学修饰基团为C3-spacer磷酸胺。
上述阻断剂能与C-KIT基因V559A位点野生型序列特异性结合，抑制野生型基因非特异扩增。
2、本发明提供的人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的检测试剂盒，其操作步骤如下：
2.1提取DNA样本，备用。
2.2按下表中组份的用量配制qRT-PCR反应体系：
试剂 用量
SYBR MIX 10μl
突变上游引物(4μM) 1.0μl
突变下游引物(4μM) 1.0μl
ddH2O 4.0μl
阻断剂(1μM) 2.0μl
DNA 2.0μl
2.3 qRT-PCR反应
qRT-PCR反应条件如下：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃延伸1min(不收集荧光)，进行5或10个循环，95℃变性15s，60℃延伸1min(收集荧光)，进行40个循环。
3、试剂盒的性能验证
3.1检测模板的制备：
取含有C-KIT基因V559A突变质粒的基因工程菌以及对应的野生型质粒基因工程菌分别培养，使用质粒纯化试剂盒(Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司)制备纯化的质粒作为检测模板。
3.2阻断剂的作用：
由于本试剂检测的目标基因片段C-KIT基因V559A突变只有一个碱基的点突变，本发明提供的检测引物在不加阻断剂的体系中在检测野生型基因时可能会出现假阳性，如图2 (横坐标为qPCR的CT值，纵坐标为所检测到的萤光增量)中扩增曲线B1所示，而在加入阻断剂的体系中由于阻断剂的存在，抑制了野生型基因的扩增，如图2扩增曲线B2(不扩增)所示，结果表明加入阻断剂可抑制野生型基因的扩增；而加入阻断剂的体系与不加阻断剂的体系，两者对检测突变型基因的灵敏性相近，扩增曲线A1(不加阻断剂)其CT值与扩增曲线 A2(加阻断剂)的CT值相接近，结果表明扩增突变基因时，加与不加阻断剂对突变基因的扩增影响很小，但加阻断剂可以明显抑制野生型基因的扩增，大大减少大量野生型基因对突变型基因检测的干扰，更利于突变型基因的检出。
3.3试剂盒的灵敏度
制备纯化的质粒并进行核酸定量，计算出拷贝数，10倍梯度稀释，取108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL的突变型质粒加入1010拷贝/μL的野生型质粒中得到突变型基因占野生型基因的比例为1％、0.1％、0.01％、0.001％的样品，分别取2μL各稀释度的质粒DNA作为模板，对试剂盒的灵敏度进行检测，结果如图3所示，本发明提供的用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的试剂盒在突变基因浓度为1％、0.1％、0.01％、0.001％时均能有效扩增，检测灵敏度可达到0.001％。
3.4试剂盒的特异性
分别以突变异常基因、正常基因、其他较为常见序列相似的突变非目标基因作为检测模板进行检测，以检测试剂盒的特异性。结果如图4所示，其中A为对突变异常基因扩增、B 为对正常基因扩增、C为对PIK3CA基因扩增、D为EGFR基因扩增、E为对非目标基因混合物扩增。结果表明本发明提供的用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的试剂盒可特异检测C-KIT基因V559A(c.1676T>C)位点突变。
综上所述，本发明提供的检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的试剂盒可检测C-KIT基因V559A(c.1676T>C)位点突变，且试剂盒具有较高的灵敏度及特异性，是检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的一种理想选择。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广州健天基因技术有限公司
<120> 用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的引物、检测方法及试剂盒
<150> 2017108064787
<151> 2017-09-08
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaagtacagt ggaaggctg 19
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgttatgtg taccc 15
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacagtggaa ggttgttgag ga 22

Claims (10)

1.用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的引物、阻断剂、检测荧光信号基团、待测基因样品混合，进行实时荧光定量PCR，获得检测结果；
其中，引物序列包括突变上游引物和突变下游引物，所述突变上游引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测C-KIT基因V559A突变的一条链互补；所述突变下游引物，长度为15-40个碱基，与待测C-KIT基因V559A突变的另一条链互补；
所述阻断剂能与C-KIT基因V559A突变位点野生型序列特异结合，抑制野生型非特异扩增；
所述检测荧光信号基团能与PCR扩增片段结合并发出荧光信号。
2.如权利要求1所述的用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的检测方法，其特征在于，所述突变上游引物，其长度为19个碱基，靠近3’末端的第3位的碱基为突变位点，与待测C-KIT基因V559A突变的一条链互补。
3.如权利要求1所述的用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的检测方法，其特征在于，所述突变下游引物，其长度为15个碱基，与待测C-KIT基因V559A突变的另一条链互补。
4.如权利要求1所述的用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的检测方法，其特征在于，所述突变上游引物的序列包括：
GAAGTACAGTGGAAGGCTG(SEQ ID NO.1)，
所述突变下游引物的序列包括：
CTGTTATGTGTACCC(SEQ ID NO.2)。
5.如权利要求1所述的用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的检测方法，其特征在于，所述阻断剂包括：匹配C-KIT野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团；
其中，所述阻断剂中匹配C-KIT野生型基因的核酸序列包括：
TACAGTGGAAGGTTGTTGAGGA(SEQ ID NO.3)；
所述化学修饰基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-TEG及C3-spacer中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的用于检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因V559A突变的检测方法，其特征在于，所述检测荧光信号基团包括：FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA、Cy5、SYTO 9、SYBR MIX中的一种或多种。
7.用于检测人类C-KIT基因V559A突变的引物，其特征在于，所述引物包括突变上游引物和突变下游引物，所述突变上游引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测C-KIT基因V559A突变型的一条链互补；所述突变下游引物，长度为15-40个碱基，与待测C-KIT基因V559A突变型的另一条链互补。
8.用于检测人类C-KIT基因V559A突变的阻断剂，其特征在于，所述阻断剂能与C-KIT基因V559A突变位点野生型序列特异结合，抑制野生型非特异扩增。
9.用于检测人类C-KIT基因V559A突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的引物、如权利要求8所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的阻断剂，还包括检测荧光信号基团。
10.如权利要求1所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的检测方法、权利要求7所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的引物和/或权利要求8所述的用于检测人类C-KIT基因V559A突变的试剂盒在检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因突变中的应用，所述应用在突变型基因浓度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％的样品检测人胃肠道间质瘤C-KIT基因突变中的应用。
CN201811043334.1A 2017-09-08 2018-09-07 用于检测人胃肠道间质瘤c-kit基因v559a突变的引物、检测方法及试剂盒 Pending CN109295175A (zh)

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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102776291A (zh) * 2012-08-16 2012-11-14 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法和试剂盒
CN103255201A (zh) * 2012-02-16 2013-08-21 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CN104031978A (zh) * 2013-03-06 2014-09-10 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法
CN104561250A (zh) * 2013-10-22 2015-04-29 联合基因生物医药有限公司 伊马替尼靶向用药基因的检测方法及其引物
CN105039534A (zh) * 2015-07-08 2015-11-11 广州和实生物技术有限公司 C-kit基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒
CN105349682A (zh) * 2015-12-07 2016-02-24 湖南圣维基因科技有限公司 一种c-kit基因d816v突变荧光pcr检测试剂盒
CN105441577A (zh) * 2016-01-13 2016-03-30 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类ckit基因7种突变的探针、引物及试剂盒
CN106715723A (zh) * 2014-08-07 2017-05-24 法马西斯特有限责任公司 测定样品中pik3ca突变状态的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103255201A (zh) * 2012-02-16 2013-08-21 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CN102776291A (zh) * 2012-08-16 2012-11-14 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法和试剂盒
CN104031978A (zh) * 2013-03-06 2014-09-10 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法
CN104561250A (zh) * 2013-10-22 2015-04-29 联合基因生物医药有限公司 伊马替尼靶向用药基因的检测方法及其引物
CN106715723A (zh) * 2014-08-07 2017-05-24 法马西斯特有限责任公司 测定样品中pik3ca突变状态的方法
CN105039534A (zh) * 2015-07-08 2015-11-11 广州和实生物技术有限公司 C-kit基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒
CN105349682A (zh) * 2015-12-07 2016-02-24 湖南圣维基因科技有限公司 一种c-kit基因d816v突变荧光pcr检测试剂盒
CN105441577A (zh) * 2016-01-13 2016-03-30 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类ckit基因7种突变的探针、引物及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINA YUN等: "KIT amplification and gene mutations in acral/mucosal melanoma in Korea", 《APMIS》 *
LUMING ZHOU等: "Rare allele enrichment and detection by allele-specific PCR, competitive probe blocking, and melting analysis", 《BIOTECHNIQUES》 *
陆国辉主编: "《产前遗传病诊断》", 31 October 2002 *

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