CN104561250A - 伊马替尼靶向用药基因的检测方法及其引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了伊马替尼靶向用药相关基因突变的方法及其引物。本发明对胃肠道间质瘤用药靶基因c-kit基因与PDGFRA基因外显子突变位点相关核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增后，最后以Ion？Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快的优点。为伊马替尼靶向用药的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为筛选敏感个体的个性化用药提供理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对靶向用药基因突变位点检测的引物，特别涉及用Ion Torrent半导体芯片测序技术对伊马替尼靶向用药基因突变进行定性、定量检测的相关引物及其试剂盒。
背景技术
伊马替尼(Imatinib Mesylate，商品名：格列卫，Glivec)是一种BCR-ABL,ARG,KIT,PDGFRA和PDGFRB酪氨酸激酶竞争性抑制药。2001年5月10日经美国食品药品管理局(FDA)批准在美国上市用于Ph+慢性粒细胞白血病加速期、急变期以及α-干扰素治疗失败后的慢性期治疗，实现分子靶向治疗的目标。其后FDA又批准增加该药新的适应证：用于治疗无法切除的或转移性的恶性胃肠道间质肿瘤。2002年4月中国国家食品药品监督管理局批准伊马替尼在国内应用于临床。
肿瘤分子靶向用药是以肿瘤细胞中所具有的特异性分子作为靶点，利用分子靶向药物特异性阻断该靶点的生物学功能，从而从分子水平逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为，达到抑制肿瘤的目的。
胃肠道间质瘤(GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤，其发病机制关键在于c-kit基因或PDGFRA基因功能获得性的突变以及由此导致的KIT蛋白和PDGFR蛋白的异常活化。KIT和PDGFR是位于细胞表面的跨膜糖蛋白。正常生理条件下，KIT和PDGFR的胞外部分通过结合相应的配体(干细胞因子和血小板衍化生长因子)，使其形成二聚体，并激活其胞内部分的络氨酸激酶活性，启动下游细胞信号的传递，引起细胞增殖。然而，当c-kit和IPDGFRA基因发生突变后，其无需与配体结合，便能激活其络氨酸激酶活性，导致细胞增殖失调，扰乱细胞正常凋亡过程，进而产生肿瘤。
伊马替尼是一种高效特异的络氨酸激酶抑制剂，可以通过结合KIT和PDGFR的络氨酸激酶活性中心，抑制其活性，进而达到治疗肿瘤的目的。临床研究表明，c-kit和PDGFRA基因突变与伊马替尼治疗胃肠道间质瘤(GIST)的疗效密切相关。c-kit基因外显子11突变的GIST患者使用伊马替尼治疗的疗效比外显子9突变及没有突变的患者疗效更好，其无事件生存率和总生存率更高。c-kit基因外显子9发生突变的患者使用高剂量伊马替尼治疗的疗效比使用低剂量的疗效更好，而c-kit基因外显子11突变患者的疗效与伊马替尼使用剂量无关。c-kit基因外显子13、14、17、18以及PDGFRA基因外显子18中的某些突变则会导致产生伊马替尼抗性，是患者对伊马替尼无应答。
通过检测c-kit和PDGFRA这两个基因的突变碱基，可以判断胃肠道间质瘤(GIST)患者个体对伊马替尼的敏感性和耐药性，筛选靶向治疗的最适合人群，优化治疗方案，从而避免因为不合理用药而引起不必要的不良反应和经济损失。
目前，已报道的用于伊马替尼靶向用药相关基因突变的方法主要为传统的PCR产物直接测序法。
Ion Torrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H+，H+在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。
Ion Torrent半导体芯片测序技术与传统测序技术比较，Ion Torrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对H+的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1G通量的测序检测仅需2～3小时，是传统测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷；此外，Ion Torrent技术大通量测序可以实现定量检测，实现对肿瘤相关基因稀有突变的定量检测，提高检测的灵敏度，降低常规检测方法的假阴性率。
目前尚无报道Ion Torrent半导体芯片测序技术专门用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的检测。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对消化道间质瘤(GIST)药物伊马替尼的靶向用药相关基因突变进行定性、定量检测的方法及其引物。
为解决上述问题，本发明采取以下技术方案：
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的胃肠道间质瘤用药靶基因c-kit基因的外显子9、11、13、14、17、18和PDGFRA基因外显子12、18的相关基因序列的突变位点，用PrimerPremier5.0软件设计PCR引物。
用于检测c-kit基因外显子9突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgattcaagcacaatggcacg-3’ SEQ ID No：1
下游引物：5’-gacagaccctaaacatcccct-3’ SEQ ID No：2
用于检测c-kit基因外显子11突变区域1的引物，是由序列表中SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgaggtgttctatttttccctttctc-3’ SEQ ID No：3
下游引物：5’-tcataaggaagttgtgttgggtc-3’ SEQ ID No：4
用于检测c-kit基因外显子11突变区域2的引物，是由序列表中SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgtttatccctttctccccacag-3’ SEQ ID No：5
下游引物：5’-gattcttggaaactcccatttg-3’ SEQ ID No：6
用于检测c-kit基因外显子13突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgccatttgacagaacgggaag-3’ SEQ ID No：7
下游引物：5’-gtttggacacggctttacctc-3’ SEQ ID No：8
用于检测c-kit基因外显子14突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgtatctcaccttctttctaaccttttc-3’ SEQ ID No：9
下游引物：5’-cttcctgctctgaacaaataaatg-3’ SEQ ID No：10
用于检测c-kit基因外显子17突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcggccagaactatcctccttactcat-3’ SEQ ID No：11
下游引物：5’-gactgtcaagcagagaatgggt-3’ SEQ ID No：12
用于检测c-kit基因外显子18突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgattattgactctgttgtgcttctattac-3’ SEQ ID No：13
下游引物：5’-aaaatcccataggaccagacg-3’ SEQ ID No：14
用于检测PDGFRA基因外显子12突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgcaagttacctgtcctggtcattta-3’ SEQ ID No：15
下游引物：5’-ccattttgagtcataaggcagc-3’ SEQ ID No：16
用于检测PDGFRA基因外显子18突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgcccaaggaaaaattgtgaagat-3’ SEQ ID No：17
下游引物：5’-gcctgaccagtgagggaagt-3’ SEQ ID No：18
采用多重PCR的方法用上述引物组对待检测样本进行PCR扩增。
将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建、ISP(Ion SphereTM Particles，Ion微球)模板的制备，在Ion Torrent PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
本发明所能检测的c-kit基因和PDGFRA基因突变位点包括：c-kit基因的exon9(Ala502_Tyr503dup)，exon11(delM552-Y553)，exon11(delM552-E554insK)，exon11(delM552-W557)，exon11(delM552-W559)，exon11(delY553-W557)，exon11(delY553-K558)，exon11(delQ556-W557.K558N)，exon11(delW557-K558)，exon11(delQ556-V560)，exon11(delW557-E561)，exon11(delV559.K558I)，exon11(delK558-V560.W557C)，exon11(delV559)，exon11(Q556H)，exon11(W557S)，exon11(W557G)，exon11(W557R)，exon11(V559A)，exon11(V559C)，exon11(V559D)，exon11(V559E)，exon11(V559F)，exon11(V560D)，exon11(V560E)，exon11(V560F)，exon11(V560G)，exon13(V654A)，exon13(K642E)，exon14(T670I)，exon17(D816H)，exon17(D816V)，exon17(D816E)，exon17(D816A)，exon17(D816G)，exon17(D820E)，exon17(D820V)，exon17(D820G)，exon17(D820A)，exon17(D820Y)，exon17(N822H)，exon17(N822K)，exon17(N822Y)，exon17(Y823D)，exon18(A829P)，以及PDGFRA基因的exon12(V561D)，exon18(D842V)。
本发明利用多重PCR方法结合Ion Torrent半导体芯片测序技术同时对决定伊马替尼靶向用药的基因序列的突变位点——c-kit和PDGFRA基因外显子突变位点进行并行检测，其优势在于该方法检测通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快。
具体实施方式
本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1、用于伊马替尼靶向用药相关基因突变检测引物的设计
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的胃肠道间质瘤用药靶基因c-kit基因的外显子9、11、13、14、17、18和PDGFRA基因外显子12、18的相关基因序列的突变位点，用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，引物序列为：
用于检测c-kit基因外显子9突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgattcaagcacaatggcacg-3’ SEQ ID No：1
下游引物：5’-gacagaccctaaacatcccct-3’ SEQ ID No：2
用于检测c-kit基因外显子11突变区域1的引物，是由序列表中SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgaggtgttctatttttccctttctc-3’ SEQ ID No：3
下游引物：5’-tcataaggaagttgtgttgggtc-3’ SEQ ID No：4
用于检测c-kit基因外显子11突变区域2的引物，是由序列表中SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgtttatccctttctccccacag-3’ SEQ ID No：5
下游引物：5’-gattcttggaaactcccatttg-3’ SEQ ID No：6
用于检测c-kit基因外显子13突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgccatttgacagaacgggaag-3’ SEQ ID No：7
下游引物：5’-gtttggacacggctttacctc-3’ SEQ ID No：8
用于检测c-kit基因外显子14突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgtatctcaccttctttctaaccttttc-3’ SEQ ID No：9
下游引物：5’-cttcctgctctgaacaaataaatg-3’ SEQ ID No：10
用于检测c-kit基因外显子17突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcggccagaactatcctccttactcat-3’ SEQ ID No：11
下游引物：5’-gactgtcaagcagagaatgggt-3’ SEQ ID No：12
用于检测c-kit基因外显子18突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的引物对。
上游引物：5’-agettaagcgattattgactctgttgtgcttctattac-3’SEQ ID No：13
下游引物：5’-aaaatcccataggaccagacg-3’ SEQ ID No：14
用于检测PDGFRA基因外显子12突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgcaagttacctgtcctggtcattta-3’ SEQ ID No：15
下游引物：5’-ccattttgagtcataaggcagc-3’ SEQ ID No：16
用于检测PDGFRA基因外显子18突变的引物，是由序列表中SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18组成的引物对。
上游引物：5’-agcttaagcgcccaaggaaaaattgtgaagat-3’ SEQ ID No：17
下游引物：5’-gcctgaccagtgagggaagt-3’ SEQ ID No：18
每个检测位点的上游引物5’端均包含一段用于识别样本信息的barcode序列5’-agcttaagcg-3’。
实施例2、伊马替尼靶向用药相关基因突变的检测
1)样本基因组DNA的获取
从肿瘤新鲜手术组织、穿刺组织或石蜡组织中抽提基因组DNA。肿瘤新鲜手术组织或穿刺组织用细胞裂解法提取DNA，将组织冷冻研磨后加入400μL细胞裂解缓冲液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0；0.1mol EDTA，pH8.0；0.5％SDS)，混匀后置50℃水浴中温育30min；冷却至室温后加等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25：24：1)，混匀，室温静置10min后5000×g离心10min；转移上层水相至另一离心管中，重复酚-氯仿-异戊醇抽提1次；再转移上层水相到另一离心管中，加1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，混匀；加入2.5倍体积的95％冷乙醇，混匀，-20℃沉淀DNA30min；10000×g离心15min，弃上清；加1mL70％冷乙醇清洗沉淀，10000×g离心15min，弃上清；37℃温箱30min烘干；将DNA沉淀溶于50μL TE缓冲液中。石蜡包埋组织则用石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒(天根)抽提基因组DNA。抽提所得基因组DNA均用紫外分光光度计测OD值分析后置4℃暂存或-20℃长期保存。
2)PCR的扩增和测序
以步骤1)提取的样本基因组DNA为模板，在实施例1所述引物组的引导下，进行多重PCR扩增(95℃5min；95℃15s，60℃1min，共40个循环)，获得的扩增产物依次进行扩增子文库的构建，ISP(Ion SphereTM Particles，Ion微球)模板的制备，以及芯片上样和在Ion TorrentPGM系统上进行测序。
3)分析并获得结论
用IGV2.0软件对测序结果进行分析，统计以下各检测位点的读序结果，包括c-kit基因和PDGFRA基因各突变位点测得的野生型测序数(W)和突变型测序数(M)：
c-kit基因和PDGFRA基因各检测位点包括：
c-kit基因的exon9(Ala502_Tyr503dup)，exon11(delM552-Y553)，exon11(delM552-E554insK)，exon11(delM552-W557)，exon11(delM552-W559)，exon11(delY553-W557)，exon11(delY553-K558)，exon11(delQ556-W557.K558N)，exon11(delW557-K558)，exon11(delQ556-V560)，exon11(delW557-E561)，exon11(delV559.K558I)，exon11(delK558-V560.W557C)，exon11(delV559)，exon11(Q556H)，exon11(W557S)，exon11(W557G)，exon11(W557R)，exon11(V559A)，exon11(V559C)，exon11(V559D)，exon11(V559E)，exon11(V559F)，exon11(V560D)，exon11(V560E)，exon11(V560F)，exon11(V560G)，exon13(V654A)，exon13(K642E)，exon14(T670I)，exon17(D816H)，exon17(D816V)，exon17(D816E)，exon17(D816A)，exon17(D816G)，exon17(D820E)，exon17(D820V)，exon17(D820G)，exon17(D820A)，exon17(D820Y)，exon17(N822H)，exon17(N822K)，exon17(N822Y)，exon17(Y823D)，exon18(A829P)；
PDGFRA基因的exon12(V561D)，exon18(D842V)。
进行基因检测位点的突变百分比判读时，应满足每个基因检测位点的测序数应大于或等于1000，才能统计检测到的相应基因位点突变比例；如该位点的测序数小于1000，则不判读。
突变百分比(R)＝(突变型的测序数(M)/总测序数(W+M))×100％
突变百分比分类评价：R＞＝2％为阳性；R＜2％为阴性。
本次检测共检测1个样本，检测结果及结论见下表。
Claims (4)
1.一种检测伊马替尼靶向用药基因突变的方法，其特征在于，具体步骤为：
利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的胃肠道间质瘤用药靶基因c-kit基因的外显子9、11、13、14、17、18和PDGFRA基因外显子12、18的相关基因序列的突变位点，用Primer Premier5.0软件设计PCR引物；
采用多重PCR的方法对待检测样本进行PCR扩增；
将PCR扩增产物进行扩增子文库的构建，ISP(Ion SphereTM Particles，Ion微球)模板的制备，在Ion Torrent PGM系统上进行测序，并用软件对相关测序序列进行分析。
2.如权利要求1所述的一种检测伊马替尼靶向用药基因突变的方法，其特征在于，所述的PCR引物包括针对两种基因序列的突变位点的引物，其序列分别为：SEQ ID No：1-SEQ ID No：18：
5’-agcttaagcgattcaagcacaatggcacg-3’ SEQ ID No：1；
5’-gacagaccctaaacatcccct-3’ SEQ ID No：2；
5’-agcttaagcgaggtgttctatttttccctttctc-3’ SEQ ID No：3；
5’-tcataaggaagttgtgttgggtc-3’ SEQ ID No：4；
5’-agcttaagcgtttatccctttctccccacag-3’ SEQ ID No：5；
5’-gattcttggaaactcccatttg-3’ SEQ ID No：6；
5’-agcttaagcgccatttgacagaacgggaag-3’ SEQ ID No：7；
5’-gtttggacacggctttacctc-3’ SEQ ID No：8；
5’-agcttaagcgtatctcaccttctttctaaccttttc-3’ SEQ ID No：9；
5’-cttcctgctctgaacaaataaatg-3’ SEQ ID No：10；
5’-agcttaagcggccagaactatcctccttactcat-3’ SEQ ID No：11；
5’-gactgtcaagcagagaatgggt-3’ SEQ ID No：12；
5’-agcttaagcgattattgactctgttgtgcttctattac-3’ SEQ ID No：13；
5’-aaaatcccataggaccagacg-3’ SEQ ID No：14；
5’-agcttaagcgcaagttacctgtcctggtcattta-3’ SEQ ID No：15；
5’-ccattttgagtcataaggcagc-3’ SEQ ID No：16；
5’-agcttaagcgcccaaggaaaaattgtgaagat-3’ SEQ ID No：17；
5’-gcctgaccagtgagggaagt-3’ SEQ ID No：18。
3.如权利要求1所述的一种检测伊马替尼靶向用药基因突变的方法，其特征在于，所述的PCR引物对待检测样本采用多重PCR扩增并测序，可检测的各基因突变位点包括：c-kit基因的exon9(Ala502_Tyr503dup)，exon11(delM552-Y553)，exon11(delM552-E554insK)，exon11(delM552-W557)，exon11(delM552-W559)，exon11(delY553-W557)，exon11(delY553-K558)，exon11(delQ556-W557.K558N)，exon11(delW557-K558)，exon11(delQ556-V560)，exon11(delW557-E561)，exon11(delV559.K558I)，exon11(delK558-V560.W557C)，exon11(delV559)，exon11(Q556H)，exon11(W557S)，exon11(W557G)，exon11(W557R)，exon11(V559A)，exon11(V559C)，exon11(V559D)，exon11(V559E)，exon11(V559F)，exon11(V560D)，exon11(V560E)，exon11(V560F)，exon11(V560G)，exon13(V654A)，exon13(K642E)，exon14(T670I)，exon17(D816H)，exon17(D816V)，exon17(D816E)，exon17(D816A)，exon17(D816G)，exon17(D820E)，exon17(D820V)，exon17(D820G)，exon17(D820A)，exon17(D820Y)，exon17(N822H)，exon17(N822K)，exon17(N822Y)，exon17(Y823D)，exon18(A829P)，以及PDGFRA基因的exon12(V561D)，exon18(D842V)。
4.如权利要求1所述的一种检测伊马替尼靶向用药基因突变的方法，其特征在于，所述的PCR引物组成一种检测伊马替尼靶向用药基因突变的试剂盒。
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