JP2019533983A - Ｆｉｓｈ試験において複数の遺伝子再構成を検知するためのプローブ - Google Patents
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Abstract
【課題】遺伝子座中の染色体再構成を検知するためのプローブシステムおよび方法を提供する。【解決手段】プローブシステムは、第1の遺伝子座8中の可能性のある転座切断点6の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブ4と、第1の遺伝子座8中の可能性のある転座切断点6の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブ10と、第2の遺伝子座16中の可能性のある転座切断点14の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブ12と、第2の遺伝子座16中の可能性のある転座切断点14の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブ18と、第1の遺伝子座または第2の遺伝子座（第1の遺伝子座および第2の遺伝子座の両方を除く）の中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズする第5の標識プローブとを備えている。第5のプローブは、第1、第2、第3および第4のプローブから識別可能に標識化されている。【選択図】図1
Description
蛍光in situハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ hybridization； FISH）は、高度の配列相補性を有する染色体のこれらの部分のみに結合する蛍光プローブを使用する、細胞遺伝学的な技術である。
FISHは、染色体再構成（chromosomal rearrangements）を検知するために長らく使用されており、染色体再構成はヒト癌において非常に一般的であるため、FISHは、悪性度を診断または評価するために、しばしば使用される。
染色体再構成は、多くのヒト癌を引き起こすと考えられているため、このような再構成の検知により、特定のやり方で患者を治療するための根拠を提供することができる。例えば、非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer）は、ALKまたはROS1における転座（translocation）と関連付けられており、可能性として患者を、同じ療法（例えば、ALKおよびROS1の両方を阻害するクリゾチニブ（crizotinib）（全体として、下記非特許文献1を参照））で治療することができる。
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特定の再構成を検知するための現行のFISH法には、このような再構成を1つ1つ確実に検知することができるのみである（例えば下記非特許文献2を参照）という点で、限界がある。これは、試料が限られている（limited sample）状況で問題となる場合があり、そうしたことは、しばしば起きている。さらに、2つの別個の検査を行うことで、診断に至る時間が倍加し、それは診断および治療の遅れにつながる場合がある。
FISHによる2つまたはそれ以上の異質な染色体再構成の多重検出は、癌の予後、徴候およびセラノスティックス（theranostics）に大きく貢献するであろうし、そのようなものとして、非常に望まれている。
本発明において、とりわけ、プローブシステムが提供される。プローブシステムは、第1の座（locus）中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブと、第1の座中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブと、第2の座中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブと、第2の座中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブと、第1の座または第2の座であって両方を除くものの中の可能性のある転座切断点の両側にハイブリダイズする第5の標識プローブとを備えている。
第1および第2のプローブは識別可能に標識化されており、第3および第4のプローブは識別可能に標識化されており、第5のプローブは、第1、第2、第3および第4のプローブから識別可能に標識化されている。
前記プローブシステムを使用して染色体再構成を検知するための方法も提供される。本方法は、（a）プローブシステムを、染色体とインサイチュにハイブリダイズして、標識化された試料を生成することと、（b）標識化された試料を解読して、標識プローブのハイブリダイゼーションを検知することと、（c）前記解読するステップ（b）から得られた結果を使用して、試料が第1の座または第2の座に再構成を含んでいるかを判定するステップとを含んでいる。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドといったヌクレオチドで構成される、例えば、約2塩基よりも大きい、約10塩基よりも大きい、約100塩基よりも大きい、約500塩基よりも大きい、約1000塩基よりも大きい、最大で約10,000またはそれ以上の塩基の、任意の長さのポリマーを記述するために、交換可能に使用される。2つの天然に存在する核酸の配列に類似した配列に特有の仕方で、天然に存在する核酸とハイブリダイズ（交雑）することができるもの、例えば、ワトソン・クリック塩基対相互作用に参与することができるものであって、酵素的または合成的に生成されてもよい（例えば、上記特許文献1およびその中で引用された引例に記載のPNA）。天然に存在するヌクレオチドは、グアニン、シトシン、アデニンおよびチミン（それぞれG、C、AおよびT）を含んでいる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される際、約2〜200またはそれ以上のヌクレオチド、最大で約500またはそれ以上のヌクレオチドの一本鎖のマルチマーを示す。オリゴヌクレオチドは合成であっても、または酵素的に形成されていてもよく、かつ、いくつかの実施形態では、長さが、10〜50個のヌクレオチド未満である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってもよく）またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、長さが、10〜20、11〜30、31〜40、41〜50、51〜60、61〜70、71〜80、80〜100、100〜150、または150〜200個のヌクレオチドであってもよい。
「配列特異的オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される際、半数体ゲノムにおいて単一サイトに結合されただけのオリゴヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、「配列特異的」オリゴヌクレオチドは、研究中の試料において特異な、相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズしてもよい。
「相補的な（complementary）」という用語は、本明細書で使用される際、対象となる標的核酸に非共有結合により塩基対合するヌクレオチド配列を指す。正規のワトソン・クリック塩基対合において、DNA中、アデニン（A）はチミン（T）と塩基対を形成し、グアニン（G）はシトシン（C）と塩基対を形成する。RNA中では、チミンはウラシル（U）に置き換えられる。このようにAはTと相補的であり、GはCと相補的である。RNA中、AはUと相補的およびその逆も成り立つ。通常、「相補的な」とは、配列中の各ヌクレオチドが、対応する位置にある標的核酸における各ヌクレオチドと相補的となるように、対象となる標的と完全に相補的であるヌクレオチド配列を指す。特定の場合、ヌクレオチド配列は、標的に対して一部相補的であってもよく、その際、すべてのヌクレオチドが、すべての対応する位置にある標的核酸における各ヌクレオチドと相補的となるわけではない。
「判定する」、「測定する」、「評価する」、「査定する」、「分析する」および「検査する」という用語は、本明細書で相互に交換可能に使用されて、任意の形態の測定を指し、かつ、要素が存在するか否かを判定することを含む。これらの用語は、定量的および/または定性的な判定の両方を含んでいる。査定は、相対的であっても絶対的であってもよい。「の存在を査定する」とは、存在するものの量を判定することを、それが存在するか存在しないかを判定することとともに、含んでいる。
「ハイブリダイゼーション（交雑）」という用語は、ワトソン・クリック塩基対合を介した、相補的な核酸への、核酸の特定の結合を指す。「インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション」という用語は、中期または間期染色体への、核酸プローブの特定の結合を指す。
「ハイブリダイズする」および「結合する」という用語は、核酸に関し、交換可能に使用されている。
「複数」、「セット」または「個体群」という用語は相互に交換可能に使用されて、少なくとも2、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも10,000、少なくとも100,000、少なくとも1000,000、少なくとも10,000,000またはそれ以上を意味する。
「染色体再構成」という用語は、本明細書で使用される際、染色体の１つまたはそれ以上の部分が、単一の染色体内で、または染色体の間で再構成される事象を指す。ある場合、染色体再構成は、染色体構造における異常を反映していることがある。染色体再構成は、例えば逆位、欠失、挿入または転座であってもよい。
「可能性のある転座切断点（potential translocation breakpoint）」という用語は、研究中の試料中に存在する、または存在しない転座切断点を指す。ある場合、可能性のある転座切断点は他の研究から公知であってもよく、病気または治療と相関されていてもよい。
「一方の側」および「他方の側」という用語は、可能性のある転座切断点の文脈において、可能性のある転座切断点の所在地の両側にある領域を指す。ある場合、「一方の側」および「他方の側」は、第1の側および第2の側として言及されることがあり、その際、第1および第2の側は、可能性のある転座切断点の所在地の両側にある。プローブが転座切断点の所在地の一方の側および他方の側に結合していれば、プローブは、可能性のある転座切断点から10MB（mega base）未満（例えば、5MB未満、1MB未満、500kb（kilo base）未満または100kb未満）離れた配列に結合していてもよい。ただし、可能性のある転座切断点から10MBよりも離れた配列に結合しているプローブが、ある状況では使用されてもよい。
「座」または「遺伝子座」という用語は、有機体のゲノム中のヌクレオチドの、切れ目のない長さを指す。染色体領域は、全染色体に対して、長さが100塩基の範囲（例えば100kb〜10MB）にあってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子座は、長さが100bp〜1MB（例えば1bp〜1MB）であってもよい。
「第１の座」または「第1の遺伝子座」（first locus）および「第２の座」または「第2の遺伝子座」（second locus）という用語は、非連鎖の（すなわち、異なる染色体上の）、または、FISHにより判別できる同一の染色体上で（例えば、異なる染色体腕上で）十分な距離のある、配列を指す。
「インサイチュ（in situ）」という用語は、インサイチュハイブリダイゼーションの文脈において、相対的に完全な染色体を含む（いくらかの断片化が処理中に起きる）間期（interphase）または中期（metaphase）細胞において、相補的な核酸への、核酸のハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。適切なインサイチュハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション条件および選択的な洗浄条件の両方を含んでいてもよく、それらは、温度、変性試薬の濃度、塩、培養時間などを含んでいる。こうした条件は、当該技術において公知である。
「試験細胞」という用語は、中期または間期染色体を含んでいてもよく、その際、そのような染色体はセントロメアを含んでおり、長腕はテロメアを含み、短腕はテロメアを含む。試験染色体は、逆位、転座、欠失挿入、または、転座を有さない基準染色体に対する他の再構成を含んでいてもよい。試験細胞は、研究中の試料からのものである。
「結合パターン」という用語は、インサイチュな、細胞の染色体に対する、標識プローブのセットの結合のパターンを指す。
「ALK」という用語は、未分化リンパ腫キナーゼ（ALKチロシンキナーゼ受容体またはCD246（分化抗原群246）としても知られる）をコードする遺伝子を指す。上記非特許文献3および上記非特許文献4を参照されたい。この遺伝子は受容体チロシンキナーゼをコードしており、受容体チロシンキナーゼはインスリン受容体スーパーファミリーに属している。このタンパク質は、細胞外領域、一回膜貫通領域に対応する疎水性ストレッチ、および、細胞内キナーゼドメインを備えている。これは、脳の発達において重要な役割を演じ、神経系における特定のニューロンにその影響を及ぼす。この遺伝子は、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫および非小細胞肺癌を含む一連の腫瘍において、再構成され、突然変異され、または、増幅されることが発見されている。染色体再構成は、この遺伝子における最も一般的な遺伝子変化であり、ALK（染色体2）/EML4（染色体2）、ALK/RANBP2（染色体2）、ALK/ATIC（染色体2）、ALK/TFG（染色体3）、ALK/NPM1（染色体5）、ALK/SQSTM1（染色体5）、ALK/KIF5B（染色体10）、ALK/CLTC（染色体17）、ALK/TPM4（染色体19）およびALK/MSN（染色体X）を含む、腫瘍形成における複数の融合遺伝子の形成につながる。遺伝子は、chr2:29.19〜29.92Mbでヒト染色体に配置されている。
「ROS1」という用語は、癌原遺伝子チロシンプロテインキナーゼROS（ROS1、MCF3、ROSおよびc-ros-1としても知られる）をコードする遺伝子を指す（例えば、上記非特許文献5および上記非特許文献6を参照）。ROS1遺伝子を含む遺伝子再構成は、膠芽細胞腫腫瘍および細胞株で初めて検知された。2007年に、ROS1再構成が、肺腺癌患者由来の細胞株で識別された。この発見以来、複数の研究により、肺癌において約1％の発生が実証されている。この遺伝子は、ヒト染色体2において、Chr6:117.29〜117.43Mbに配置されている。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明が、そのようなものとして勿論変化してもよい、記載された特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用する用語が、特定の実施形態のみを説明することを目的としており、限定することを意図していないことも理解されたい。これは、本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるからである。
値の範囲が与えられている場合、各介在値は、文脈が明らかに他のことを示していない限り、範囲の上限と下限との間で、下限の単位の十分の一までであり、その表示範囲中の他のいずれかの表示値または介在値は、本発明内に包含される。
他の仕方で規定されていない限り、本明細書で使用する技術的および科学的な用語すべては、本発明が属する技術の当業者により通常理解されているのと同じ意味を持つ。本明細書に記載されたものに類似または均等のいずれの方法および材料をも、本発明の実践および試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を、ここに記載する。
本明細書において引用する刊行物および特許は、あたかも個々のそれぞれの刊行物または特許が、参照により組み込まれることを詳細かつ個別に意図しているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が関連して引用される方法および/または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。いずれかの刊行物の引用は、出願日前のその開示についてであり、本発明が、先行発明により、そのような刊行物に先行する資格がないことの自認であると理解されるべきではない。さらに、示された刊行物の日付は、実際の刊行日と異なる場合があり、実際の刊行日は別途確認する必要のある場合がある。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される際、「1つの」および「前記」という単数形は、文脈が明らかに他のことを示していない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、選択的な要素を排除するよう記載されている場合のあることに留意されたい。そのようなものとして、この記述は、請求項要素の引用に関連する「単一の」、「唯一の」などのような排他的な専門用語の使用、または、「負の」限定の使用のために、先行する根拠となるよう意図されている。
この開示を読む際、当業者にとって明らかなように、本明細書に記載および例示した個々の実施形態のそれぞれは、別個の部品および特徴を有しており、別個の部品および特徴は、本発明の範囲または精神を逸脱することなしに、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されても、または、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に組み合わされてもよい。挙げられた方法は、挙げられた事象の順序で、または、論理的に可能な他の順序で、実行することができる。
〈プローブシステム〉
図1を参照して、プローブシステム2は、(a）第1の遺伝子座8中の可能性のある転座切断点6の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブ4と、(b）第1の遺伝子座8中の可能性のある転座切断点6の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブ10と、(c）第2の遺伝子座16中の可能性のある転座切断点14の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブ12と、(d）第2の遺伝子座16中の可能性のある転座切断点14の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブ18と、(e）第1の遺伝子座または第2の遺伝子座のいずれかの転座切断点（すなわち、転座切断点6または14のいずれかであって両方ではない）の両側にハイブリダイズする第5の標識プローブ20とを備えている。i. 第1および第2のプローブ4および10は識別可能に標識化されており（例えば、識別可能なフルオロフォアXおよびYでそれぞれ標識化されており）、ii. 第3および第4のプローブ12および18は識別可能に標識化されており（例えば、識別可能なフルオロフォアXおよびYでそれぞれ標識化されており）、iii. 第5のプローブ20は、第1、第2、第3および第4のプローブから識別可能に標識化されている（例えば、識別可能なフルオロフォアZで標識化されている）。
図1を参照して、プローブシステム2は、(a）第1の遺伝子座8中の可能性のある転座切断点6の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブ4と、(b）第1の遺伝子座8中の可能性のある転座切断点6の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブ10と、(c）第2の遺伝子座16中の可能性のある転座切断点14の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブ12と、(d）第2の遺伝子座16中の可能性のある転座切断点14の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブ18と、(e）第1の遺伝子座または第2の遺伝子座のいずれかの転座切断点（すなわち、転座切断点6または14のいずれかであって両方ではない）の両側にハイブリダイズする第5の標識プローブ20とを備えている。i. 第1および第2のプローブ4および10は識別可能に標識化されており（例えば、識別可能なフルオロフォアXおよびYでそれぞれ標識化されており）、ii. 第3および第4のプローブ12および18は識別可能に標識化されており（例えば、識別可能なフルオロフォアXおよびYでそれぞれ標識化されており）、iii. 第5のプローブ20は、第1、第2、第3および第4のプローブから識別可能に標識化されている（例えば、識別可能なフルオロフォアZで標識化されている）。
図1で、第5の標識プローブ20は、第1の遺伝子座8中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズするものとして示されていてもよく、あるいは、第5の標識プローブ20は、第2の遺伝子座16中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズしてもよい。
図1に示す実施態様では、第5のプローブが標的とする配列が、この遺伝子座にハイブリダイズする他のプローブ（すなわち、第1および第2のプローブまたは第3および第4のプローブ）と重複している。ある場合、図2Aに示す例に記載のように、第5のプローブが標的とする配列は、この遺伝子座にハイブリダイズする他のプローブ（すなわち、第1および第2のプローブまたは第3および第4のプローブ）と重複していなくてもよい。
これらの実施形態では、第5の標識プローブは、いずれかの遺伝子座（例えばALKまたはROS1）であって両方（ALKおよびROS1）を除くものの中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズし、i. 第1および第2のプローブは識別可能に標識化されており、ii. 第3および第4のプローブは識別可能に標識化されており、iii. 第5のプローブは、第1、第2、第3および第4のプローブから識別可能に標識化されており、第5のプローブがハイブリダイズする配列は、第1、第2、第3および第4のプローブがハイブリダイズする配列と重複していない。
明らかであろうが、第1および第2の遺伝子座は、哺乳類染色体、特にヒト染色体にある領域であってもよい。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子座および第2の遺伝子座は遺伝子、例えば、ALK、PET、ROS1、C-MYC、サイクリンD1、BCL-2、PAX8、ETO、ABL1、PML、TEL、JAK、API-2、FLI1およびFUSから選択された遺伝子であり、これらすべては、さまざまな癌と関連付けられた、可能性のある転座切断点を含んでいる。
特定の実施形態では、第1の遺伝子座はALKであってもよく、第2の遺伝子座はROS1であってもよい。これらの実施形態では、プローブシステムは、（a）ALK中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブと、（b）ALK中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブと、（c）ROS1中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブと、（d）ROS1中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブと、（e）ALKまたはROS1であるが両方を除くものの中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズする第5の標識プローブとを備えていてもよい。i. 第1および第2のプローブは識別可能に標識化されており、ii. 第3および第4のプローブは識別可能に標識化されており、第5のプローブは、第1、第2、第3および第4のプローブから識別可能に標識化されている。
未分化大細胞リンパ腫（ALCL）の約60％は、ALK転座と関連付けられている。これらの転座の多くにおいて、転座により、染色体5からのヌクレオフォスミン（NPM）遺伝子の染色体2'および5部分からのALK遺伝子の3'半からなる融合遺伝子が形成される。NPM−ALK融合遺伝子のこの生産物は腫瘍形成性である。他の転座では、ALKの3'半は、TPM3遺伝子の5’配列に融合し、fortropomyosin 3をコードする。まれには、ALKは、TFG、ATIC、CLTC1、TPM4、MSN、ALO17、MYH9などの、他の5'融合相手に融合する。EML4転座は、非小細胞肺癌（NSCLC）の約3〜5％について原因となる（responsible for）。
症例の大多数は腺癌である。ALK肺癌は、すべての年齢の患者に見られるが、平均して、これらの患者は、より若い傾向がある。ALK肺癌は、軽い喫煙者または非喫煙者で、より一般的であるが、この病気にかかった患者のかなりの数が、現役またはかつての喫煙者である。NSCLCにおけるEML4−ALK再構成は排他的であり、EGFRまたはKRAS変異腫瘍中には見られない。ALK転座は、神経芽細胞腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、成人および子供の腎細胞癌、食道扁平上皮癌、乳癌、特に炎症性の亜類型、結腸腺癌、膠芽細胞腫紅斑ならびに未分化甲状腺癌の家族性症例とも関連付けられている。
遺伝子再構成などの、ROS1中の遺伝子変化により、癌（上記非特許文献7）にもつながる可能性のある癌遺伝子が生成される。ROS1は、融合タンパク質（ROS1についての6つの異なる相手）の形態で、NSCLC患者内で発見されたものであり、NSCLCを有する患者の約2％で発見されている（上記非特許文献8）。他の2つのROS1遺伝子再構成が、膠芽細胞腫紅斑、胆管癌、卵巣癌、胃腺癌、大腸癌、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、血管肉腫および類上皮血管内皮腫を含む他のさまざまな癌で、検知されてきた。ROS1遺伝子再構成は、長引く腫瘍細胞生存を伴う細胞死に対する無制限増殖および抵抗を含む、細胞内の腫瘍形成特性につながる下流シグナル伝達経路を活性化する恒常的活性型のキナーゼドメインを有する融合タンパク質を生成する。これらの伝達経路は、細胞増殖用のRas-ERKならびにJAK-STATおよびPI3K/AKT伝達経路を含んでおり、これらは、細胞生存（抗アポトーシス）および増殖を調整する。ROS1融合タンパク質も、mTOR伝達経路を活性化する場合があり、これは、タンパク質翻訳の調整にとって枢要である。これらの伝達経路を活性化させる癌は、より悪性である傾向があり、浸潤および転移は、患者の生存を低下させる。
いくつかの実施形態では、第1および第3のプローブは、第1のフルオロフォア（すなわち、同じフルオロフォア）で標識化されている。第2および第4のプローブは、第2のフルオロフォア（第1のフルオロフォアから識別可能なフルオロフォア）で標識化されていてもよい。第5のプローブは、例えば第3の識別可能なフルオロフォアを使用して、第1、第2、第3および第4のプローブから識別可能に標識化されていなければならない。いくつかの実施形態では、第1および第3のプローブは第1のフルオロフォアで標識化されており、第2および第4のプローブは第2のフルオロフォアで標識化されており、かつ、第5のプローブは第3のフルオロフォアで標識化されている。
本明細書で使用する際、「識別可能に標識化された」という用語は、標識が、同じ個所にあったとしても、別個に検知できるという意味である。そのようなものとして、使用されるフルオロフォアは、識別可能であるように、すなわち、互いに独立して検知可能であるように、つまりは、標識が混ざったとしても、標識が独立して検知および測定できるように、選ばれねばならない。換言すれば、各標識の存在が、標識が同じ場所に配置されていたとしても、別個に判定できなければならない。
識別可能な標識の適切なセットには、RD1、FITCおよびEDC；PerCP、フィコエリトリンおよびフルオレセインイソチオシアネート；フルオレセイン、Cy3およびCy5；ならびに、ローダミン、フルオレセインおよびシアニン-5、ならびに、これらの均等物が含まれるが、これらに限定されない。対象となる特定の蛍光染料には、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、（一般にFAMおよびFという省略形で公知の）6-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2', 7'-ジメトキシフルオレセイン（JOEまたはJ）、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRAまたはT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROXまたはR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5またはG5）、6-カルボキシローダミン-6G（R6G6またはG6）およびローダミン110などの、例えばフルオレセインおよびローダミン染料といった、キサンテン染料、例えばCy3、Cy5およびCy7染料といったシアニン染料、例えばウンベリフェロンといったクマリン、例えばヘキスト33258といったbenzimide染料、例えばテキサスレッドといったフェナントリジン染料、エチジウム染料、アクリジン染料、カルバゾール染料、フェノキサジン染料、ポルフィリン染料、例えばBODIPY染料およびキノリン染料といったポリメチン染料が含まれる。
課題用途で一般に使用される、対象となる特定のフルオロフォアには、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、FAM、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、R110、エオシン、JOE、R6G、テトラメチルローダミン、TAMRA、リサミン、ナフトフルオレセイン、テキサスレッド、Cy3およびCy5などが含まれる。課題方法で有用な、適切で識別可能な蛍光染料標識対には、Cy3およびCy5（ニュージャージー州ピスカタウェイのAmersham Inc.社）、Quasar570およびQuasar670（カリフォルニア州ナバトのBiosearch Technology社）、Alexafluor555およびAlexafluor647（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes社）、BODIPY V-1002およびBODIPY V1005（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes社）、POPO-3およびTOTO-3（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes社）、ならびに、POPRO3およびTOPRO3（オレゴン州ユージーンのMolecular Probes社）が含まれる。さらなる適切で識別可能な検知可能な標識が、Kricka et al.（上記非特許文献9）、Ried et al.（上記非特許文献10）、Tanke et al.（上記非特許文献11）および他にも見られるであろう。
プローブのそれぞれがハイブリダイズする領域は、長さが少なくとも5kbであっても、例えば、長さが5kb〜100kb、100kb〜500kb、500kb〜1Mb、1Mb〜5Mb、5Mb〜10Mbまたは10Mb〜50Mb、10kb〜1mb、または10kb〜500kbなどの範囲内であってもよい。いくつかの実施形態では、各プローブは、核酸の複数の標識断片、例えば、核酸の少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500または少なくとも1000個の断片を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、プローブは、標識化された二本鎖核酸を備えていてもよい。プローブは、いずれかの適切な方法を使用して、例えば、細菌人工染色体、フォスミド、または、DNAの他の源の、ランダムプライミングまたはニックトランスレーションにより、形成してもよい。いくつかの実施形態では、プローブは、Yamada et al（上記非特許文献12および上記特許文献2）に記載の方法を使用して形成されていてもよく、これには、最も情報量の多い要素のみを標的とする長いオリゴヌクレオチド（＞150 mer）の高複雑度ライブラリを合成すること、ライブラリからのプローブを増幅すること、および、増幅中または増幅後に、これらのプローブを標識化することが含まれる。
ある場合、増幅は、標識ヌクレオチドの存在下でなされてもよい。プローブの分子用の結合部位が、（例えば、結合されたときに、プローブ分子の間に10％〜90％の重複があるよう）隣接する結合部位の間に重複があるように、または、1つの結合部位の5’端が、結合部位の3’端の次になるようこれらを端から端へと並べることができるように、領域を横切って並べられていてもよい。別の実施形態では、プローブの分子用の結合部位は、染色体領域内で分離および点在されていてもよい。プローブを標識化するために使用できる方法が、Ausubel, et al,（上記非特許文献13）およびSambrook, et al,（上記非特許文献14）である。いくつかの実施形態では、FISHプローブを、ユニバーサルリンケージシステム（ULS.TM., KREATECH Diagnostics; van Gijlswijk et al 上記非特許文献15）を使用し、ビオチンで標識化することができる。これは、核酸に対するプラチナ（II）の安定した結合特性に基づいている。
〈試料分析の方法〉
本発明によれば、試料分析の方法も提供される。この方法には、（a）プローブシステムを、染色体とインサイチュにハイブリダイズして、標識化された試料を生成するステップ、（b）例えば、各フルオロフォア用に適切なフィルタを装着した蛍光顕微鏡を使用して、または、トリプルバンドパスフィルタセットを使用して複数の各フルオロフォアを観察する（例えば上記特許文献3を参照）ことにより、標識化された試料を解読して、標識化されたプローブのハイブリダイゼーションを検知するステップ、および、（c）解読ステップ（b）から得られた結果を使用して、試料が第1の遺伝子座または第2の遺伝子座に再構成を含んでいるかを判定するステップを含んでいる。明らかであろうが、第1および第2の遺伝子座がALKおよびROS1である場合、この方法は、（c）解読ステップ（b）から得られた結果を使用して、試料がALKまたはROS1に再構成を含んでいるかを判定することを含む。
本発明によれば、試料分析の方法も提供される。この方法には、（a）プローブシステムを、染色体とインサイチュにハイブリダイズして、標識化された試料を生成するステップ、（b）例えば、各フルオロフォア用に適切なフィルタを装着した蛍光顕微鏡を使用して、または、トリプルバンドパスフィルタセットを使用して複数の各フルオロフォアを観察する（例えば上記特許文献3を参照）ことにより、標識化された試料を解読して、標識化されたプローブのハイブリダイゼーションを検知するステップ、および、（c）解読ステップ（b）から得られた結果を使用して、試料が第1の遺伝子座または第2の遺伝子座に再構成を含んでいるかを判定するステップを含んでいる。明らかであろうが、第1および第2の遺伝子座がALKおよびROS1である場合、この方法は、（c）解読ステップ（b）から得られた結果を使用して、試料がALKまたはROS1に再構成を含んでいるかを判定することを含む。
再構成は、解読ステップで生成された画像を考査することにより、判定できる。詳しくは、第5のプローブが、第1の遺伝子座中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズしている場合、
(a）「正常な」細胞（第1の遺伝子座または第2の遺伝子座（co-localize）に再構成を有していない細胞）中で、i. 第1および第2のプローブは、互いに共局在し、および第5のプローブと共局在し、かつ、ii. 第3および第4のプローブは、互いに共局在しているが、第5のプローブと共局在しておらず、
(b）第1の遺伝子座に転座を含んでいる細胞中で、i. 第1および第2のプローブは、第5のプローブと共局在しているが、互いに共局在しておらず、かつ、ii. 第3および第4のプローブは、互いに共局在しているが、第5のプローブと共局在しておらず、
(c）第2の遺伝子座に転座を含んでいる細胞中で、i. 第1および第2のプローブは、第5のプローブと共局在しており、および互いに共局在しており、ii. 第3および第4のプローブは、互いに共局在しておらず、第5のプローブとも共局在していない。
(a）「正常な」細胞（第1の遺伝子座または第2の遺伝子座（co-localize）に再構成を有していない細胞）中で、i. 第1および第2のプローブは、互いに共局在し、および第5のプローブと共局在し、かつ、ii. 第3および第4のプローブは、互いに共局在しているが、第5のプローブと共局在しておらず、
(b）第1の遺伝子座に転座を含んでいる細胞中で、i. 第1および第2のプローブは、第5のプローブと共局在しているが、互いに共局在しておらず、かつ、ii. 第3および第4のプローブは、互いに共局在しているが、第5のプローブと共局在しておらず、
(c）第2の遺伝子座に転座を含んでいる細胞中で、i. 第1および第2のプローブは、第5のプローブと共局在しており、および互いに共局在しており、ii. 第3および第4のプローブは、互いに共局在しておらず、第5のプローブとも共局在していない。
同様に、第5のプローブが、第2の遺伝子座中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズしている場合、
(a）「正常な」細胞（第1の遺伝子座または第2の遺伝子座に再構成を有していない細胞）中で、i. 第1および第2のプローブは、互いに共局在しているが、第5のプローブと共局在しておらず、かつ、ii. 第3および第4のプローブは、互いに共局在しており、および第5のプローブと共局在しており、
(b）第1の遺伝子座に転座を含んでいる細胞中で、i. 第1および第2のプローブは、互いに共局在しておらず、第5のプローブとも共局在しておらず、かつ、ii. 第3および第4のプローブは、第5のプローブと共局在し、および互いに共局在しており、
(c）第2の遺伝子座に転座を含んでいる細胞中で、i. 第1および第2のプローブは、互いに共局在しているが、第5のプローブと共局在しておらず、ii. 第3および第4のプローブは、第5のプローブと共局在しているが、互いに共局在していない。
(a）「正常な」細胞（第1の遺伝子座または第2の遺伝子座に再構成を有していない細胞）中で、i. 第1および第2のプローブは、互いに共局在しているが、第5のプローブと共局在しておらず、かつ、ii. 第3および第4のプローブは、互いに共局在しており、および第5のプローブと共局在しており、
(b）第1の遺伝子座に転座を含んでいる細胞中で、i. 第1および第2のプローブは、互いに共局在しておらず、第5のプローブとも共局在しておらず、かつ、ii. 第3および第4のプローブは、第5のプローブと共局在し、および互いに共局在しており、
(c）第2の遺伝子座に転座を含んでいる細胞中で、i. 第1および第2のプローブは、互いに共局在しているが、第5のプローブと共局在しておらず、ii. 第3および第4のプローブは、第5のプローブと共局在しているが、互いに共局在していない。
この方法の原理からすると、より複雑なプローブシステム、例えば、4つの、または5つもの、識別可能なフルオロフォアを含むプローブシステムを設計および実施することができる。
インサイチュハイブリダイゼーション方法は、細胞を支持体に載置すること、細胞を固定し、かつ透過性にすること、細胞中でプローブを染色体にインサイチュにハイブリダイズすること、結合していない細胞を洗い流すこと、および、蛍光顕微鏡検査を使用して標識細胞を撮像することを一般に含んでいて、当該技術分野で周知であり、そのようなものとして、本説明では、本方法を公知のプロトコルから採用してもよい。例えば、上記非特許文献16を参照されたい。実際、本説明では、方法のいくつかの実施形態を、ALK中の再構成を査定するための臨床的に承認された技法から採用してもよい（例えば、上記非特許文献17、上記非特許文献18、上記非特許文献19および上記非特許文献20を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、試料を、試料の複数の画像を生成するために使用する標識に対応する3つのチャネル中に準備してもよい。本方法により生成される画像は、横に並べて見てもよく、または、いくつかの実施形態では、画像を重ねても、もしくは組み合わせてもよい。ある場合、画像はカラーであってもよく、その際、画像で使用されるカラーは、使用された標識に対応していてもよい。
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも2つの画像を分析すること、比較すること、または重ね合わせることを、さらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本方法は、すべての画像を重ね合わせて、試料に対するすべてのプローブの結合のパターンを示す画像を生成することを、さらに含んでいてもよい。使用される画像分析モジュールは、各フルオロフォアからの信号を変換して、複数の疑似カラー画像を生成してもよい。画像分析モジュールは、複数の疑似カラー画像を重ね合わせて（例えば、各ピクセルで疑似カラーを重畳して）、多重化した疑似カラー画像を取得してもよい。（例えば、重み付けしていない、または重み付けした）複数の画像を単一の疑似カラーへと変換し、例えば、その結果、特定のプローブの結合により特徴付けられる、対象となる生物学的特徴を表してもよい。疑似カラーを、ユーザからの手動の入力に基づいて、特定のプローブまたはプローブの組み合わせに割り当ててもよい。画像分析モジュールは、信号強度もしくは疑似カラーの強度および/もしくはコントラストを調整するよう（例えば標準化するよう）、（強度もしくは疑似カラーのぼかしもしくは鮮明化などの）畳み込み（convolution）操作を行うよう、または、画像を向上させる他のいずれかの適切な操作を行うよう、さらに構成されている。画像分析モジュールは、連続した画像から得られたピクセルを整列するため、かつ/または、連続した画像から得られたピクセルにわたって、強度もしくは疑似カラーをぼかす、もしくは円滑化するために、上記操作のいずれかを行ってもよい。
本画像分析方法を、コンピュータ上で実施してもよい。特定の実施形態では、汎用のコンピュータを、本明細書で開示する方法およびプログラム用の機能的な仕組みとして構成してもよい。このようなコンピュータのハードウェアアーキテクチャは、当業者にとって周知であり、１つまたはそれ以上のプロセッサ（CPU）、ランダムアクセスメモリ（RAM）、読み取り専用メモリ（ROM）、内部または外部のデータ記憶媒体（例えばハードディスクドライブ）を含むハードウェアコンポーネントを備えていてもよい。コンピュータシステムは、グラフィック情報を表示手段へと処理および出力するために、1つまたはそれ以上のグラフィックボードをも備えていてもよい。上記部品は、コンピュータ内のバスを介して、適切に相互接続することができる。コンピュータは、モニタ、キーボード、マウス、ネットワークなどの、汎用の外付け部品と通信するために、適切なインターフェースをさらに備えていてもよい。
いくつかの実施形態では、コンピュータは、並列処理が可能であってもよく、または、本方法およびプログラム用に処理能力を向上するための並列または分散計算用に構成されたネットワークの一部であってもよい。いくつかの実施形態では、記憶媒体から読み出されるプログラムコードが、コンピュータにインサートされた拡張ボードに設けられたメモリ、または、コンピュータに接続された拡張ユニットに書き込まれてもよく、かつ、拡張ボードまたは拡張ユニットに設けられたCPUなどが、プログラムコードの指示に従って演算の一部または全部を実際に行ってもよく、その結果、以下に説明する機能が実現される。他の実施形態では、本方法は、クラウドコンピューティングシステムを使用して行われてもよい。これらの実施形態では、データファイルおよびプログラミングを、クラウドコンピュータにエクスポートすることができ、クラウドコンピュータがプログラムを実行し、かつ、ユーザに出力を返す。
いずれの種類の細胞も、本方法を使用して分析できる。特定の場合、分析される試料は、患者から取られた新しい、または埋め込まれた（例えば、FFPE埋め込みされた）組織生検体であってもよい。対象となる生検体は、皮膚（メラノーマ、癌など）、軟組織、骨、胸、結腸、肝臓、腎臓、副腎、胃腸組織、すい臓、胆嚢、唾液腺、頸部、卵巣、子宮、精巣、前立腺、肺、胸腺、甲状腺、副甲状腺、脳下垂体（腺腫など）、脳、脊髄、眼の組織、神経および骨格筋などの、腫瘍および非腫瘍性病変の両方を含んでいる。
いずれの実施形態においても、データ（例えば、細胞の画像）を「遠隔地」に転送でき、その際、「遠隔地」は、データが生成される場所ではない場所を意味している。例えば、遠隔地は、同じ街の別の場所（例えば、オフィス、研究室など）、異なる街の別の場所、異なる州の別の場所、異なる国の別の場所などであってもよい。そのようなものとして、1つの物が、別のものから「遠隔」であると示唆された場合、意味するのは、2つの物が同じ部屋にあるが別体であってもよいこと、または、少なくとも異なる部屋もしくは異なる建物にあること、および、少なくとも1マイル、10マイルもしくは100マイル離れていてもよいことである。「通信」情報は、適切な通信チャネル（例えば、私的な、または公共のネットワーク）を介した電気信号として、その情報を表すデータの送信を参照する。物を「転送する」とは、その物を、物理的に、または（可能であれば）他の仕方で輸送するかどうかにかかわらず、1つの場所から次へと得る手段に言及しており、かつ、少なくともデータの場合に、データを運ぶ、またはデータを通信する媒体を物理的に輸送することを含んでいる。
通信媒体の例には、ラジオもしくは赤外線送信チャネル、および、別のコンピュータもしくはネットワーク装置へのネットワーク接続、および、インターネットが含まれ、または、eメール送信、および、ウェブサイトなどに記録される情報を含んでいる。ある実施形態では、本方法により生成された1つまたはそれ以上の画像が、MDまたは他の資格ある医療専門家によって分析されてもよく、画像の分析の結果に基づく報告を、試料を得た患者に転送してもよい。
〈有用性〉
本方法は、さまざまな診断、創薬、ならびに、（第1または第2の遺伝子座中の再構成が病気または体調に関する指標であってもよい）病気または体調の診断または監視、（第1または第2の遺伝子座中の再構成が薬物療法用に標的とされていてもよい）薬剤標的の発見、（薬剤の効果が第1または第2の遺伝子座中の再構成によって監視される）薬剤スクリーニング、（薬剤感受性が第1または第2の遺伝子座中の再構成と関連付けられた）薬剤感受性の判定、および、（第1または第2の遺伝子座中の再構成を識別するのが望ましい）基本的な調査を含むがこれに限定されない調査用途において採用されてもよい。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、本方法は、試料が再構成を含んでいる場合に、診断、セラノシスまたは予後を提供することを含んでいてもよい。
本方法は、さまざまな診断、創薬、ならびに、（第1または第2の遺伝子座中の再構成が病気または体調に関する指標であってもよい）病気または体調の診断または監視、（第1または第2の遺伝子座中の再構成が薬物療法用に標的とされていてもよい）薬剤標的の発見、（薬剤の効果が第1または第2の遺伝子座中の再構成によって監視される）薬剤スクリーニング、（薬剤感受性が第1または第2の遺伝子座中の再構成と関連付けられた）薬剤感受性の判定、および、（第1または第2の遺伝子座中の再構成を識別するのが望ましい）基本的な調査を含むがこれに限定されない調査用途において採用されてもよい。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、本方法は、試料が再構成を含んでいる場合に、診断、セラノシスまたは予後を提供することを含んでいてもよい。
ある場合、本明細書に記載した方法を、患者についての治療計画を決定するために使用できる。第1または第2の遺伝子座中に再構成があるかないかは、患者が特定の療法に反応する、または無反応であることを示唆する場合がある。例えば、1つまたはそれ以上の生体指標があるかないかは、病気が特定の療法に無反応であり、代替的な療法を処方できることを示唆する場合がある。
第1および第2の遺伝子座がそれぞれALKおよびROS1である実施形態では、それぞれの遺伝子座中の再構成は、患者をクリゾチニブまたは別のキナーゼ阻害剤で治療すべきことを示唆する場合がある。これらの実施形態では、ALKまたはROS1中の再構成が識別されると、健康管理の専門家（例えばMDなど）が、クリゾチニブによる治療について推薦を与える場合がある。クリゾチニブは、ALK（未分化リンパ腫キナーゼ）およびROS1（c-ros癌遺伝子1）を阻害するよう働き（例えば、上記非特許文献21、上記非特許文献22、上記非特許文献23を参照）、米国および他の国でいくらかの非小細胞肺癌（NSCLC）の治療用に承認されており、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、ならびに、成人および子供の両方における他の進行した固形腫瘍における、その安全性および効能を試験する臨床試験を受けている、抗癌剤である。
〈代替的な実施形態〉
いくつかの代替的な実施形態では、本システムは、第5のプローブを含んでいない。これらの実施形態では、プローブシステムは、（a）第1の遺伝子座（例えばALK）中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブと、（b）第1の遺伝子座（例えばALK）中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブと、（c）第2の遺伝子座（例えばROS1）中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブと、（d）第2の遺伝子座（例えばROS1）中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブとを備えていてもよく、i.第1および第2のプローブは識別可能に標識化されており、ii.第3および第4のプローブは識別可能に標識化されている。このようなプローブシステムを使用する際に、染色体転座が識別されると、追跡作業を行って、どの遺伝子座が転座を有しているかを識別しなければならない場合がある。
いくつかの代替的な実施形態では、本システムは、第5のプローブを含んでいない。これらの実施形態では、プローブシステムは、（a）第1の遺伝子座（例えばALK）中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブと、（b）第1の遺伝子座（例えばALK）中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブと、（c）第2の遺伝子座（例えばROS1）中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブと、（d）第2の遺伝子座（例えばROS1）中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブとを備えていてもよく、i.第1および第2のプローブは識別可能に標識化されており、ii.第3および第4のプローブは識別可能に標識化されている。このようなプローブシステムを使用する際に、染色体転座が識別されると、追跡作業を行って、どの遺伝子座が転座を有しているかを識別しなければならない場合がある。
本明細書で引用したすべての刊行物および特許出願は、あたかも個々のそれぞれの刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることを詳細かつ個別に意図しているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。いずれかの刊行物の引用は、出願日前のその開示についてであり、本発明が、先行発明により、そのような刊行物に先行する資格がないことの自認であると理解されるべきではない。
〈予備的な請求の範囲〉
項1. a）第1の座中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブと、b）第1の座中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブと、c）第2の座中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブと、d）第2の座中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブと、e）第1または第2の座（両方の座を除く）の中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズする第5の標識プローブとを備える、プローブシステムであって、i.第1および第2のプローブは識別可能に標識化されており、ii.第3および第4のプローブは識別可能に標識化されており、iii.第5のプローブは、第1、第2、第3および第4の各プローブから識別可能に標識化されている、プローブシステム。
項1. a）第1の座中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブと、b）第1の座中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブと、c）第2の座中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブと、d）第2の座中の可能性のある転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブと、e）第1または第2の座（両方の座を除く）の中の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズする第5の標識プローブとを備える、プローブシステムであって、i.第1および第2のプローブは識別可能に標識化されており、ii.第3および第4のプローブは識別可能に標識化されており、iii.第5のプローブは、第1、第2、第3および第4の各プローブから識別可能に標識化されている、プローブシステム。
項2. 第1および第3のプローブは第1のフルオロフォアで標識化されている、項1に記載の方法。
項3. 第2および第4のプローブは第2のフルオロフォアで標識化されている、先行する項のいずれかに記載の方法。
項4. 第1および第3のプローブは第1のフルオロフォアで標識化されており、第2および第4のプローブは第2のフルオロフォアで標識化されており、第5のプローブは第3のフルオロフォアで標識化されている、先行する項のいずれかに記載の方法。
項5. プローブのそれぞれが、少なくとも10kbにわたっている、先行する項のいずれかに記載の方法。
項6. 各プローブが、核酸の複数の標識断片を備えている、先行する項のいずれかに記載の方法。
項7. 各プローブが、標識化された二本鎖核酸を備えている、先行する項のいずれかに記載の方法。
項8. 第1の座および第2の座が遺伝子である、先行する項のいずれかに記載の方法。
項9. 第1の座がALKであり、第2の座がROS1である、先行する項のいずれかに記載の方法。
項10. （a）項1記載のプローブシステムを、染色体を備える細胞とインサイチュにハイブリダイズして、標識化された試料を生成することと、（b）標識化された試料を解読して、標識プローブのハイブリダイゼーションを検知することと、（c）解読ステップ（b）から得られた結果を使用して、試料が第1の座または第2の座に再構成を含んでいるかを判定することとを含む、試料分析の方法。
項11. 解読は、蛍光顕微鏡検査により行われる、項10の方法。
項12. 細胞は哺乳類細胞である、いずれかの先行する項に記載の方法。
項13. 第1の座がALKであり、第2の座がROS1である、いずれかの先行する項に記載の方法。
項14. 試料が再構成を含んでいる場合に、診断、セラノシスまたは予後を提供することをさらに含む、いずれかの先行する項に記載の方法。
本発明をさらに例示するため、以下の特定の実施例を、これらが本発明を例示するために提供されており、その範囲を何らかの仕方で制限すると解釈されるべきではないという理解の下で、示す。
研究の目的は、単一のDNA FISHプローブ試験を使用して、ALKまたはROS1遺伝子再構成を隠している試料を識別できる（すなわち、それぞれが、特有の蛍光信号パターンを有しているであろう）ことを証明することであった。これを行うために、表1ならびに図2Aおよび図2Bに記載の個々の構成要素をなすプローブを生成し、ALKおよびROS1遺伝子座の両方を標的とする最終的なプローブを形成するために、組み合わせた。
ROS1について再構成された試料に関し、少なくとも1つの赤/青および/または緑/青の信号対が見られるであろう（図3Aおよび図3B）。ALKについて再構成された試料では、少なくとも1つの赤および/または緑の信号対が観察されるであろう（図4）。
表1に概要を示す領域を標的とする長鎖オリゴヌクレオチドライブラリを、設計および合成した。オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、標識化された構成要素をなすプローブを生成して、赤、緑または青のフルオロフォアを組み込むためのテンプレートとして使用した。標識化された構成要素をなすプローブを、FISHハイブリダイゼーションバッファと組み合わせ、かつ混合して、最終的なプローブを生成した。このプローブを、ALKまたはROS1遺伝子再構成を隠している細胞株にハイブリダイズした。ハイブリダイズした試料を、Cy3（赤）、FITC（緑）およびAqua（青）フィルタを装着したエピ蛍光顕微鏡を使用して、視覚化した。再構成された試料で観察された信号パターンを示す画像を捕捉した（図3および図4）。
表1は構成要素をなすプローブのそれぞれにより標的とされたゲノム領域を表す。座標はヒトゲノムビルド19（Hg19）に基づいている。
先行発明を、理解を明瞭にすることを目的とする説明および例示により、いくらか詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなくこれらにある程度の変更および修正を行えることは、本発明の教示に照らせば当業者には容易に理解される。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、2017年8月12日出願の米国特許出願第15/236,264の優先権を主張する。
Claims (12)
- （a）ALK中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第1の標識プローブと、
（b）ALK中の前記可能性のある前記転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第2の標識プローブと、
（c）ROS1中の可能性のある転座切断点の一方の側にハイブリダイズする第3の標識プローブと、
（d）ROS1中の前記可能性のある前記転座切断点の他方の側にハイブリダイズする第4の標識プローブと、
（e）ALKまたはROS1のいずれか（ALKおよびROS1の両方を除く）の可能性のある転座切断点の両方の側にハイブリダイズする第5の標識プローブとを備える、プローブシステムであって、
i. 前記第1および第2のプローブは識別可能に標識化されており、
ii. 前記第3および第4のプローブは識別可能に標識化されており、
iii. 前記第5のプローブは、前記第1、第2、第3および第4の各プローブから識別可能に標識化されている、プローブシステム。 - 前記第1および第3のプローブは第1のフルオロフォアで標識化されている、請求項1に記載のシステム。
- 前記第2および第4のプローブは第2のフルオロフォアで標識化されている、請求項1または請求項2に記載のシステム。
- 前記第1および第3のプローブは第1のフルオロフォアで標識化されており、
前記第2および第4のプローブは第2のフルオロフォアで標識化されており、
前記第5のプローブは第3のフルオロフォアで標識化されている、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記（a）〜（e）のプローブのそれぞれが、少なくとも10kb（キロベース）にわたっている、請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載のシステム。
- 各プローブが、核酸の複数の標識断片を備えている、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載のシステム。
- 各プローブが、標識化された二本鎖核酸を備えている、請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載のシステム。
- （a）請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のプローブシステムを、染色体とインサイチュにハイブリダイズして、標識化された試料を生成するステップと、
（b）前記標識プローブのハイブリダイゼーションを検知するために、前記標識化された試料を解読するステップと、
（c）前記解読するステップ（b）から得られた結果を使用して、前記試料がALKまたはROS1に再構成を含んでいるかを判定するステップとを含む、試料分析の方法。 - 前記解読するステップ（b）は、蛍光顕微鏡検査により行われる、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞は哺乳類細胞である、請求項8または請求項9に記載の方法。
- 前記試料が前記再構成を含んでいる場合に、診断、セラノシスまたは予後を提供するステップをさらに含む、請求項8または請求項9に記載の方法。
- 前記試料が前記再構成を含んでいる場合に、クリゾチニブによる治療を進めるステップをさらに含む、請求項8または請求項9に記載の方法。
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