CN111455067A

CN111455067A - 一种人10号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒

Info

Publication number: CN111455067A
Application number: CN202010306796.9A
Authority: CN
Inventors: 李贵喜; 李三华; 王少辉; 李艳敏; 胡娟; 霍清园; 齐华; 刘文弟
Original assignee: Henan Celnovtebio Biotechnology Inc
Current assignee: Henan Celnovtebio Biotechnology Inc
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2020-07-28

Abstract

本发明属于染色体的检测领域，具体涉及一种人10号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒。该人10号染色体着丝粒探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的人10号染色体着丝粒探针，是针对人10号染色体着丝粒区的高重复、高特异性区域所设计，对人类的10号染色体着丝粒具有较好的识别效果。

Description

一种人10号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒

技术领域

本发明属于染色体的检测领域，具体涉及一种人10号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒。

背景技术

人10号染色体中含有816个基因和430个假基因，其中85个基因已被证实与乳腺癌、前列腺癌、脑部肿瘤和癫痫病有关，还与糖尿病、精神分裂症、肥胖症和阿尔茨海默症等疾病有关。10号染色体的计数对一些疾病的治疗和预后判断有重要意义。

目前，对于10号染色体荧光原位杂交检测所使用的探针，多为采用BAC克隆切口平移法标记或标记多条寡核苷酸法。BAC克隆切口平移法，其前期要进行菌体活化、摇菌、BAC克隆提取等复杂的准备工作；标记多条寡核苷酸法，需要对着丝粒特异性较高的多条寡核苷酸分别标记且效率低下。因此，采用BAC克隆切口平移法标记和标记多条寡核苷酸法费时、费力且效率低下。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人10号染色体着丝粒探针，其对于人类的10号染色体具有较好的检测效果。

本发明的第二个目的在于提供上述人10号染色体着丝粒探针的制备方法，该方法具有探针得率高，方法简单，无需纯化的特点。

本发明的第三个目的在于提供一种人10号染色体着丝粒探针试剂盒，其对10号染色体的检测特异性高，检测结果判读的准确性高。

为实现上述目的，本发明的人10号染色体着丝粒探针的技术方案是：

一种人10号染色体着丝粒探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的人10号染色体着丝粒探针，是针对人10号染色体着丝粒区的高重复、高特异性区域所设计，对人类的10号染色体着丝粒具有较好的识别效果。

本发明的人10号染色体着丝粒探针的制备方法所采用的技术方案是：

人10号染色体着丝粒探针的制备方法，是以人基因组DNA为模板，采用巢式PCR方法得到；其中首轮PCR所用引物为Chr10-1-F和Chr10-1-R，第二轮PCR所用引物为Chr10-2-F和Chr10-2-R；引物序列如下：

Chr10-1-F：5’-CGGGATTTCTTCATATAACGCTA-3’；

Chr10-1-R：5’-GTATTTCCAAACTGCTCGACT-3’；

Chr10-2-F：5’-TTCTCAGTAACTACTTTGTG-3’；

Chr10-2-R：5’-TTTGTCTAGTTTTAATAC-3’。

本发明提供的人10号染色体着丝粒探针的制备方法，探针得率高，方法简单，无需纯化，可以现标现用。可以对二轮PCR产物回收储存，探针标记可直接使用二轮PCR产物。

可以在PCR扩增时，进行颜色标记，以方便后续的荧光原位杂交(FISH)检测。优选的，首轮PCR和第二轮PCR的反应体系包括dNTP；所述dNTP为dATP、dTTP、dGTP、dCTP和荧光素标记的dUTP，如为dUTP-Green。荧光素标记的dUTP能够替代部分的dTTP插入在PCR扩增探针中，而dUTP带有荧光素标记，在FISH检测时，可直接使用，其能与10号染色体着丝粒杂交，并显出荧光颜色。SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中，T被带有荧光素标记的U随机部分替换。

优选的，所述dTTP与荧光素标记的dUTP的摩尔比为3：1，荧光素标记的dUTP的摩尔浓度为1mM。若荧光素标记的dUTP过多将严重阻滞PCR进程，导致PCR产物得率较低；若荧光素标记的dUTP过少则探针荧光素含量较低，信号亮度较弱。

所述dATP、dGTP、dCTP、dTTP、荧光素标记的dUTP的摩尔比为4：4：4：3：1。模板的浓度可依据常规PCR反应体系而定，优选的，首轮PCR和第二轮PCR中模板的浓度为10-50ng/μL。模板量过大则易造成非特异性扩增；模板量过少则产物浓度低。

为提高PCR扩增的准确度和效率，优选的，首轮PCR和第二轮PCR的反应程序为：

1)预变性94℃，2min；

2)变性94℃，20s；退火65℃，15s；延伸68℃，15s；变性-退火-延伸共进行10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃，10个循环后退火温度降低至60℃；

3)变性94℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，10s；变性-退火-延伸共进行25个循环；

4)72℃延伸2min。

本发明的人10号染色体着丝粒探针试剂盒的技术方案是：

一种人10号染色体着丝粒探针试剂盒，包括含有上述人10号染色体着丝粒探针的工作液。

本发明提供的人10号染色体着丝粒探针试剂盒，对10号染色体的检测特异性高，亮度好，检测结果判读的准确性高。

从成本及检测效果方面综合考虑，优选的，所述工作液中，人10号染色体着丝粒探针的浓度为0.1-1ng/μL。

为进一步提高荧光原位检测的稳定性、减少干扰，优选的，所述工作液由人10号染色体着丝粒探针稀释液、1×TE缓冲液、Cot-1 DNA封闭剂、杂交缓冲液按体积比1:1:1:7制成，人10号染色体着丝粒探针稀释液的浓度为1-10ng/μL。

附图说明

图1为利用本发明实施例1的人10号染色体着丝粒探针进行荧光原位杂交的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。除特殊说明的之外，各实施例及实验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

以下实施例及试验例中所使用的10×PCR Buffer、25mM MgCl₂、DNA Taq聚合酶购自上海生工生物；dATP、dTTP、dGTP、dCTP购自Takara；荧光素dUTP-R购自江苏普诺生，其上标记有荧光素，显出绿色；封闭剂Cot-1 DNA购自上海英骏生物技术有限公司；杂交缓冲液配方为：10％硫酸葡聚糖、20％甲酰胺、1％SDS、2×SSC。

一、本发明的人10号染色体着丝粒探针的具体实施例

实施例1

本实施例的人10号染色体着丝粒探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

二、本发明的人10号染色体着丝粒探针的制备方法的具体实施例

实施例2

本实施例对实施例1的人10号染色体着丝粒探针的制备过程进行说明，其采用巢式PCR方法制得，包括如下步骤：

1)以人基因组DNA为模板，使用引物Chr10-1-F和Chr10-1-R进行首轮PCR反应；

所用引物序列如下所示：

Chr10-1-F：5’-CGGGATTTCTTCATATAACGCTA-3’；

Chr10-1-R：5’-GTATTTCCAAACTGCTCGACT-3’；

2)然后以首轮PCR产物稀释100倍后作为模板，使用引物Chr10-2-F和Chr10-2-R进行第二轮PCR反应，即得；

所用引物序列如下所示：

Chr10-2-F：5’-TTCTCAGTAACTACTTTGTG-3’；

Chr10-2-R：5’-TTTGTCTAGTTTTAATAC-3’。

首次及第二轮PCR反应程序都采用Touchdown PCR法。

引物Chr10-1-F和Chr10-1-R、引物Chr10-2-F和Chr10-2-R、首轮PCR扩增产物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

PCR反应体系(20μL)为：1、10×PCR Buffer：2.0μL；2、25mM MgCl₂：1.2μL；3、10μM引物1：1.5μL；4、10μM引物2：1.5μL；5、10ng/μL PCR模板：10ng；6、1mM AGCT(1：1：1：0.75)：4.0μL；7、1mM dUTP-G：1μL；8、5U/uL DNA Taq聚合酶：0.23μL；9、无核酸水：补足20μL。

Touchdown PCR反应程序：预变性94℃，2min；变性94℃，20s；退火65℃(每个循环降低0.5℃)，15s；延伸68℃，15s；经此变性-退火-延伸共10个循环后，变性94℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，10s；此过程进行25个循环。最后72℃延伸2min，并进行10℃保持。

简略模式图如下：

三、本发明的人10号染色体着丝粒探针试剂盒的具体实施例

实施例3

本实施例的人10号染色体着丝粒探针试剂盒，为含有实施例1探针的工作液。

工作液由人10号染色体着丝粒探针稀释液、1×TE缓冲液、Cot-1DNA封闭剂、杂交缓冲液按体积比1:1:1:7制成。人10号染色体着丝粒探针稀释液为实施例2的巢式PCR产物经1×TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA pH 8.0)按1:15稀释后制得，浓度为5ng/μL。具体地，将1μL人10号染色体着丝粒探针稀释液、1μL1×TE缓冲液缓冲液、1μLCot-1DNA封闭剂、7μL杂交缓冲液，各液体组分充分混匀即得。

四、实验例

以人外周血淋巴细胞为样本，使用实施例3的试剂盒采用快速荧光原位杂交法，检测10号染色体着丝粒探针荧光信号特异性和亮度，其中荧光信号特异性检测使用的细胞为淋巴细胞分裂相细胞滴片，通过分裂相细胞可以观察到分裂中期的染色体，检测是否是与10号染色体特异性结合，确定信号位置。荧光信号亮度检测使用的细胞为淋巴细胞滴片，检测结果如图1所示。

快速荧光原位杂交的过程如下：

一、样本收集：

1、取外周血或骨髓2～3ml(肝素钠抗凝)2000rpm离心5分钟，弃上清；

2、取1ml细胞加入10ml的0.075mol/L KCl轻轻吹打混匀，静置2分钟；

3、恒温水浴锅37±1℃低渗20分钟；

4、加入固定液1-2ml，吹打混匀，室温预固定10分钟；

5、吹打混匀，2000rpm离心5分钟；

6、弃上清，沉淀加入5ml固定液，吹打混匀，-20℃沉淀>30分钟；

7、2000rpm离心5分钟，弃上清；

8、可重复以上洗涤步骤，直至细胞沉淀洗白洗干净为止(重复洗涤则无需静置30分钟)。

二、制片：

1、取一张干净的载玻片；

2、重悬细胞后取5μl，悬液滴加到载玻片上，室温下晾干；

3、用10×物镜在相差显微镜下观察细胞密度，要求细胞无重叠，且单视野细胞数量在100～200个为宜；

3.1如果细胞密度及数目合适，继续步骤3；

3.2如果细胞有重叠，则加入适当新鲜固定液稀释细胞悬液；

3.3如果细胞密度低，则2000rpm离心5分钟，小心吸去适量上清液，混匀后另取3μl悬液制片，晾片，观察；

4、在相差显微镜下观察，如果细胞碎片太多，则需要预处理并且选择合适的杂交区域。

三、玻片预处理(以下两种处理方法均可)

方法一：快速处理

1、将滴好的玻片放置于室温的去离子水中浸泡2分钟；

2、然后依次在室温70％、90％、100％的乙醇中浸泡2分钟脱水；

3、最后取出玻片，室温晾干。

方法二：胃蛋白酶消化处理法

1、胃蛋白酶溶液配置：500μl 1M HCl，加入到50ml纯水中，置于37±1℃水浴锅中，使用前10分钟将0.1g胃蛋白酶用上述配制的胃蛋白酶溶液溶解后全部加入50ml胃蛋白溶液中，混匀，使用一天后更换；

2、玻片放入37±1℃的去离子水中孵育5分钟；

3、取出玻片，再将其放入37±1℃胃蛋白酶溶液中消化1～5分钟(可通过预实验确定酶效力)；

4、取出玻片，将其放入去离子水室温洗涤2～3分钟；

5、取出玻片，再将其放入70％、90％、100％梯度乙醇中各2分钟，取出玻片，室温晾干；

备注：当样本难处理时，如杂质过多、信号较弱等，可选择方法二进行玻片预处理。

四、样品与探针探针变性、杂交(注意避光)

1、将探针取出后混匀离心，加10μl探针加到杂交区域，盖上盖玻片、用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，注意封片完全以免杂交液挥发。

3、将玻片置于杂交仪上按照设定程序进行变性杂交(82℃变性6min，45℃杂交过夜或采用快速杂交：90℃变性2min，55℃杂交>3h)。

五、杂交后洗涤(注意避光)

1、洗涤前30分钟，将配制好的洗液I置于水浴锅中，预热到72±1℃；

2、取出载玻片，去除橡皮胶，将载玻片置于室温的洗涤液II中孵育5-10min移去盖玻片；

3、玻片放入72±1℃洗涤液I中处理2min；

4、取出玻片置于室温的洗涤液II中处理2min；

5、取出玻片后依次于在70％、85％的乙醇溶液中依次孵育切片2min，室温晾干。

6、DAPI染色、封片：滴加10μl DAPI复染液到细胞区，避免气泡，盖上盖玻片，用指甲油涂抹盖玻片边缘，室温孵育10min或暗处-20℃孵育10-20min。

7、镜检：荧光显微镜下计数(长期保存应避光置于-20℃)。

由图1可以看出，红色(灰度处理后表现为深色)为PTEN探针，PTEN探针为红色荧光探针，PTEN基因位于10号染色体，如果红绿信号位于同一条染色体，则可以确定10号染色体着丝粒探针的特异性。绿色(灰度处理后表现为浅色)为10号染色体着丝粒探针。本发明的10号染色体着丝粒探针试剂盒适用于细胞荧光原位杂交，荧光信号特异性好、亮度强，可实现10号染色体的快速准确检测。

<110> 河南赛诺特生物技术有限公司

<120> 一种人10号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 167

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 人10号染色体着丝粒探针序列

<400> 1

ttctcagtaa ctactttgtg ttgtctgtat tcaactcaca gagttgaacc tttctttaga 60

gagagcagag ttgaaacact ctttttgtgg aatttgctag tgcagatttc aaacgcttcg 120

aagacagtga tagaaaagga tatatcttcg tattaaaact agacaaa 167

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Chr10-1-F

<400> 2

tttttgtaaa gtctgcaag 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Chr10-1-R

<400> 3

tctgtctagt ttttatacga a 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Chr10-2-F

<400> 4

ttctcagtaa ctactttgtg 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Chr10-2-R

<400> 5

tttgtctagt tttaatac 18

<211> 281

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 首轮PCR扩增产物

<400> 6

cgggatttct tcatataacg ctaaacagaa gaattctcag taactacttt gtgttgtctg 60

tattcaactc acagagttga acctttcttt agagagagca gagttgaaac actctttttg 120

tggaatttgc tagtgcagat ttcaaacgct tcgaagacag tgatagaaaa ggatatatct 180

tcgtattaaa actagacaaa atcattcgca gaaaacactt tgtgatgtgt gtgttcaact 240

cacagagttt aacctttctt agtcgagcag tttggaaata c 281

Claims

1.一种人10号染色体着丝粒探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的人10号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，是以人基因组DNA为模板，采用巢式PCR方法得到；其中首轮PCR所用引物为Chr10-1-F和Chr10-1-R，第二轮PCR所用引物为Chr10-2-F和Chr10-2-R；引物序列如下：

Chr10-1-F：5’-CGGGATTTCTTCATATAACGCTA-3’；

Chr10-1-R：5’-GTATTTCCAAACTGCTCGACT-3’；

Chr10-2-F：5’-TTCTCAGTAACTACTTTGTG-3’；

Chr10-2-R：5’-TTTGTCTAGTTTTAATAC-3’。

3.如权利要求2所述的人10号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，首轮PCR和第二轮PCR的反应体系包括dNTP；所述dNTP为dATP、dTTP、dGTP、dCTP和荧光素标记的dUTP。

4.如权利要求3所述的人10号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，所述dTTP与荧光素标记的dUTP的摩尔比为3：1，荧光素标记的dUTP的摩尔浓度为1mM。

5.如权利要求3所述的人10号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，所述dATP、dGTP、dCTP、dTTP、荧光素标记的dUTP的摩尔比为4：4：4：3：1。

6.如权利要求2-5中任一项所述的人10号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，首轮PCR和第二轮PCR中模板的浓度为10-50ng/μL。

7.如权利要求2-5中任一项所述的人10号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，首轮PCR和第二轮PCR的反应程序为：

1)预变性94℃，2min；

4)72℃延伸2min。

8.一种人10号染色体着丝粒探针试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求1所述的人10号染色体着丝粒探针的工作液。

9.如权利要求8所述的人10号染色体着丝粒探针试剂盒，其特征在于，所述工作液中，人10号染色体着丝粒探针的浓度为0.1-1ng/μL。

10.如权利要求8或9所述的人10号染色体着丝粒探针试剂盒，其特征在于，所述工作液由人10号染色体着丝粒探针稀释液、1×TE缓冲液、Cot-1DNA封闭剂、杂交缓冲液按体积比1:1:1:7制成，人10号染色体着丝粒探针稀释液的浓度为1-10ng/μL。