CN111471678A - 一种人8号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒 - Google Patents

一种人8号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Abstract

本发明涉及一种人8号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒，属于分子病理诊断技术领域。本发明的人8号染色体着丝粒探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的人8号染色体着丝粒探针，标记效率高，具有较高的特异性，对人8号染色体着丝粒具有良好的识别作用，缓解了现有8号染色体探针标记效率低下的技术问题。本发明还提供一种人8号染色体着丝粒探针的制备方法，该方法简单，容易操作，且制得的人8号染色体着丝粒探针无需纯化，可现标现用。

Description

一种人8号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒
技术领域
本发明涉及一种人8号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒，属于分子病理诊断技术领域。
背景技术
人类的8号染色体是23对染色体的其中之一，正常状况下每个细胞拥有两条。此染色体含有大约155百万个碱基对，占细胞内所有DNA的4.5％到5％。该染色体有两条臂(短臂和长臂：分别命名为8p和8q)。其中较短的8p臂有大约4500万个碱基对，有基因484个，假基因110个，约占总基因组数量的1.5％。这其中8％的基因和神经发育及功能有关，16％的基因和癌症有关，人8号染色体已被证实与韧带样型纤维瘤病、前列腺癌、髓系恶性血液病等疾病有关。8号染色体的计数对一些疾病的治疗和预后判断有重要意义。
目前，对于人8号染色体荧光原位杂交检测所使用的计数探针，多数采用BAC克隆切口平移法标记或标记多条寡核苷酸法。BAC克隆切口平移法的前期要进行菌体活化、摇菌、BAC 克隆提取等复杂的准备工作；标记多条寡核苷酸法，需要对着丝粒特异性较高的多条寡核苷酸分别标记且效率低下。也就是说，采用BAC克隆切口平移法标记和标记多条寡核苷酸法这两种现有常用的方法均费时、费力，且效率低下。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人8号染色体着丝粒探针，对人8号染色体着丝粒具有良好的识别作用。
本发明的第二个目的在于提供一种人8号染色体着丝粒探针的制备方法，该方法简单，容易操作，且制得的人8号染色体着丝粒探针无需纯化，可现标现用。
本发明的第三个目的在于提供一种人8号染色体着丝粒探针试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种人8号染色体着丝粒探针，所述人8号染色体着丝粒探针的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明的人8号染色体着丝粒探针，标记效率高，具有较高的特异性，对人8号染色体着丝粒具有良好的识别作用，缓解了现有8号染色体探针标记效率低下的技术问题。
一种人8号染色体着丝粒探针的制备方法，包括以下步骤：
以人基因组DNA为模板，采用PCR反应得到；其中，常规PCR方法所用引物为Chr8-1-F 和Chr8-1-R；引物序列如下：Chr8-1-F：5’-CTCAGAAACATGTTTATGCTG-3’；Chr8-1-R： 5’-CTGCTGTCTACTTTTGATA-3’。
应当理解的是，Chr8-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，Chr8-1-R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示。
本发明的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，只需要以人基因组DNA为模板，以Chr8-1-F和Chr8-1-R为引物，采用常规规PCR方法即可得到人8号染色体着丝粒探针。该方法简单，容易操作，且得到的人8号染色体着丝粒探针无需纯化，可现标现用，缓解了现有8号染色体探针制备过程繁琐的技术问题。
优选地，所述常规PCR的体系包括dNTP；所述dNTP为dATP、dGTP、dCTP、dTTP 和荧光素标记的dUTP。
应当理解的是，荧光素标记的dUTP能够替代部分的dTTP插入在PCR扩增探针中，而dUTP带有荧光素标记，在FISH检测时，可直接使用，其能与10号染色体着丝粒杂交，并显出荧光颜色。SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中，T被带有荧光素标记的U随机部分替换。
优选地，所述dATP、dGTP、dCTP与dTTP的摩尔比为4：4：4：3。
优选地，所述dTTP与荧光素标记的dUTP的摩尔比为3：1，荧光素标记的dUTP的摩尔浓度为1mM。
优选地，所述模板的浓度为10～50ng/μL。
优选地，所述PCR反应采用Touchdown PCR反应程序。
为了进一步提高PCR反应的准确度和效率，优选地，所述Touchdown PCR反应程序为： 1)预变性94℃，2min；2)变性94℃，20s；退火65℃，15s；延伸68℃，15s；变性-退火- 延伸共进行10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃，10个循环后退火温度降低至60℃；3) 变性94℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，10s；变性-退火-延伸共进行25个循环；4)72℃延伸2min。
一种人8号染色体着丝粒探针试剂盒，所述人8号染色体着丝粒探针试剂盒包括权利要求1所述的人8号染色体着丝粒探针的工作液。
本发明的人8号染色体着丝粒探针试剂盒，具有较量的特异性和准确度。
优选地，所述人8号染色体着丝粒探针在工作液中的浓度为0.1～1ng/μL。
优选地，所述工作液由人8号染色体着丝粒探针稀释液、1×TE缓冲液、Cot-1DNA封闭剂、杂交缓冲液按体积比1:1:1:7制成；其中，人8号染色体着丝粒探针稀释液的浓度为 1～10ng/μL。
附图说明
图1为实施例2中的Touchdown PCR反应简略模式图；
图2为试验例1中快速荧光原位杂交检测人8号染色体着丝粒探针的荧光信号特异性图；
图3为试验例1中快速荧光原位杂交检测人8号染色体着丝粒探针的荧光信号亮度图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
本发明的实施例中，所用的PCR Buffer、25mM MgCl2、DNA Taq聚合酶、引物Chr8-1-F、引物Chr8-1-R购自上海生工生物。
本发明的实施例中，所用的dATP、dGTP、dCTP、dTTP购自Takara。
本发明的实施例中，所用的荧光素dUTP-G购自江苏普诺生。
本发明的实施例中，所用的1×TE缓冲液配方为：10Mm Tris-HCl、1mM的EDTA。
本发明的实施例中，所用的Cot-1DNA封闭剂购自上海英骏生物技术有限公司。
本发明的实施例中，所用的杂交缓冲液的配方为：10％硫酸葡萄聚糖、20％甲酰胺， 1％SDS、2×SSC。
一、本发明的人8号染色体着丝粒探针的具体实施例如下：
实施例1
本实施例的人8号染色体着丝粒探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
二、本发明的人8号染色体着丝粒探针的制备方法的具体实施例如下：
实施例2
本实施例的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，制得的是实施例1的人8号染色体着丝粒探针，步骤如下：
以人基因组DNA为模板，以Chr8-1-F和Chr8-1-R为引物进行PCR反应。
引物Chr8-1-F和Chr8-1-R的序列如下：
Chr8-1-F：5’-CTCAGAAACATGTTTATGCTG-3’。
Chr8-1-R：5’-CTGCTGTCTACTTTTGATA-3’。
PCR反应体系(20)μL为：
1、10×PCR Buffer：2.0μL。
2、25mM MgCl2：1.2μL。
3、10μM引物1(引物Chr8-1-F)：1.5μL。
4、10μM引物2(引物Chr8-1-R)：1.5μL。
5、PCR模板：10ng。
6、1mM AGCT(1：1：1：0.75)：4.0μL。
7、1mM dUTP-R：0.87μL。
8、DNA Taq聚合酶：0.23μL。
9、无核酸水：补足20μL。
PCR反应采用Touchdown PCR反应程序，Touchdown PCR反应程序为：
预变性94℃，2min；变性94℃，20s；退火65℃(每个循环降低0.5℃)，15s；延伸68℃， 15s；经此变性-退火-延伸共10个循环后，变性94℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，10s；此过程进行25个循环。最后72℃延伸2min，并进行10℃保持。简略模式图如图1所示。
三、本发明的人8号染色体着丝粒探针试剂盒的具体实施例如下：
实施例3
本实施例的人8号染色体着丝粒探针试剂盒，为含有实施例2制得的人8号染色体着丝粒探针的工作液，其中工作液中人8号染色体着丝粒探针的浓度为0.5ng/μL。
工作液由1μL人8号染色体着丝粒探针的稀释液(人8号染色体着丝粒探针的浓度为 5ng/μL)、1μL 1×TE缓冲液、1μL Cot-1DNA封闭剂、7μL杂交缓冲液混匀离心制成。人8号染色体着丝粒探针的稀释液为实施例2制得的产物与1×TE缓冲液按1:15的体积比混合得到。
在人8号染色体着丝粒探针试剂盒的其他实施例中，工作液中人8号染色体着丝粒探针的浓度在0.1～1ng/μL之间进行调整。
四、相关试验例
试验例1
以外周血淋巴细胞为样本，利用实施例3的人8号染色体着丝粒探针试剂盒，采用快速荧光原位杂交法检测人8号染色体着丝粒探针荧光信号的特异性和亮度。
其中快速荧光原位杂交的具体过程如下：
一、样本收集
(1)取外周血2～3mL，在2000rpm条件下离心5min，弃上清液，得细胞；
(2)然后取1mL细胞加入到10mL的0.075mol/L KCl溶液中轻轻吹打混匀，静置2min后于恒温水浴锅(37±1℃)中低渗20min；
(3)然后加入固定液(甲醇：冰醋酸(体积比为1:3))1～2mL，吹打混匀后在室温下预固定10min；
(4)再次吹打混匀，然后在2000rpm的条件下离心5min；之后弃上清液得沉淀物，向沉淀物中加入5mL固定液，吹打混匀，之后在-20℃温度下静置30min，之后在2000rpm离心5min，得细胞沉淀。
二、制片
1、取一张干净的载玻片；
2、重悬细胞后取5μL，悬液滴加到载玻片上，室温下晾干；
3、用10×物镜在相差显微镜下观察细胞密度，要求细胞无重叠，且单视野细胞数量在 100～200个为宜；
3.1如果细胞密度及数目合适，继续步骤3；
3.2如果细胞有重叠，则加入适当新鲜固定液稀释细胞悬液；
3.3如果细胞密度低，则2000rpm离心5min，小心吸去适量上清液，混匀后另取3μL悬液制片，晾片，观察；
4、在相差显微镜下观察，如果细胞碎片太多，则需要预处理并且选择合适的杂交区域：
预处理方法为：将滴好的玻片放置于室温的去离子水中浸泡2min，然后依次在室温70％、 90％、100％的乙醇中浸泡2min脱水，最后取出玻片，室温晾干。
三、样品与探针探针变性、杂交(注意避光)
1、将探针取出后混匀离心，加10μL探针加到杂交区域，盖上盖玻片、用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，注意封片完全以免杂交液挥发；
2、将玻片置于杂交仪上按照设定程序进行变性杂交(82℃变性6min，45℃杂交过夜或采用快速杂交：90℃变性2min，55℃杂交>3h)。
四、杂交后洗涤(注意避光)
1、洗涤前30分钟，将配制好的洗涤缓冲液I置于水浴锅中，预热到72±1℃；
2、取出玻片，去除橡皮胶，将载玻片置于室温的洗涤缓冲液II中孵育5～10min移去盖玻片；
3、玻片放入72±1℃洗涤缓冲液I中处理2min；
4、取出玻片置于室温的洗涤缓冲液II中处理2min；
5、取出玻片后依次于在70％、85％的乙醇溶液中依次孵育切片2min，室温晾干；
6、DAPI染色、封片：滴加10μLDAPI复染液到细胞区，避免气泡，盖上盖玻片，用指甲油涂抹盖玻片边缘，室温孵育10min或暗处-20℃孵育10-20min；
7、镜检：荧光显微镜下计数(长期保存应避光置于-20℃)。
测试得到的结果如图2和图3所示，图2为快速荧光原位杂交检测人8号染色体着丝粒探针的荧光信号特异性图；图3为快速荧光原位杂交检测人8号染色体着丝粒探针的荧光信号亮度图。由图2和图3可知，实施例3的人8号染色体着丝粒探针试剂盒适用于荧光原位杂交检测，具有良好的特异性和亮度。
<110> 河南赛诺特生物技术有限公司
<120> 一种人8号染色体着丝粒探针及其制备方法、试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 163
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 人8号染色体着丝粒探针序列
<400> 1
ctcagaaaca tgtttatgct gtatctactc acctaactgt gctgaacatc tctattgata 60
gagcagtttt gagacactct tcttttggaa tctgcaagtg gatatttgga tagatttgag 120
gacttcgttg gcaacgggat tatatatcaa aagtagacag cag 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Chr8-1-F
<400> 2
ctcagaaaca tgtttatgct g 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Chr8-1-R
<400> 3
ctgctgtcta cttttgata 19

Claims (10)

1.一种人8号染色体着丝粒探针，其特征在于，所述人8号染色体着丝粒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以人基因组DNA为模板，采用PCR反应得到；
其中，常规PCR方法所用引物为Chr8-1-F和Chr8-1-R；引物序列如下：
Chr8-1-F：5’-CTCAGAAACATGTTTATGCTG-3’；
Chr8-1-R：5’-CTGCTGTCTACTTTTGATA-3’。
3.根据权利要求2所述的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，所述常规PCR的体系包括dNTP；所述dNTP为dATP、dGTP、dCTP、dTTP和荧光素标记的dUTP。
4.根据权利要求3所述的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，所述dATP、dGTP、dCTP与dTTP的摩尔比为4：4：4：3。
5.根据权利要求3所述的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，所述dTTP与荧光素标记的dUTP的摩尔比为3：1，荧光素标记的dUTP的摩尔浓度为1mM。
6.根据权利要求2所述的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，所述模板的浓度为10～50ng/μL。
7.根据权利要求2～6任一项所述的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，所述PCR反应采用Touchdown PCR反应程序。
8.根据权利要求7所述的人8号染色体着丝粒探针的制备方法，其特征在于，所述Touchdown PCR反应程序为：
1)预变性94℃，2min；
2)变性94℃，20s；退火65℃，15s；延伸68℃，15s；变性-退火-延伸共进行10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃，10个循环后退火温度降低至60℃；
3)变性94℃，15s；退火60℃，15s；延伸72℃，10s；变性-退火-延伸共进行25个循环；
4)72℃延伸2min。
9.一种人8号染色体着丝粒探针试剂盒，其特征在于，所述人8号染色体着丝粒探针试剂盒包括权利要求1所述的人8号染色体着丝粒探针的工作液。
10.根据权利要求9所述的人8号染色体着丝粒探针试剂盒，其特征在于，所述人8号染色体着丝粒探针在工作液中的浓度为0.1～1ng/μL。
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