CN101970451A

CN101970451A - 高度可见的染色体特异性探针及相关方法

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Publication number: CN101970451A
Application number: CN2008801047050A
Authority: CN
Inventors: 菲利浦·T·小摩恩; 琼·奥里驰-科斯塔; 肖恩·P·布拉德利
Original assignee: Cellay LLC
Current assignee: Cellay LLC
Priority date: 2007-07-26
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2011-02-09
Also published as: WO2009015359A2; US20090215643A1; WO2009015359A3; EP2185573A4; EP2944647A1; EP2185573A2

Abstract

本文公开了染色体特异性的合成寡核苷酸和标记探针组合物，以及制备和使用这类组合物的相关方法。本文还公开了用于制备或使用标记探针的方法的试剂盒。

Description

高度可见的染色体特异性探针及相关方法

相关申请的交叉引用

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发明背景

特定染色体的检测对于多种诊断方法是重要的。例如，一种通常用于目标染色体检测的核酸杂交技术是荧光原位杂交(FISH)。高度的特异性和准确性和快速产生结果的能力，已经使得FISH成为鉴定例如染色体异常、遗传疾病和癌症的可选择的方法。(参见，Heim和Mitelman，Cancer Cytogenetics，Chromosomal and Molecular GeneticAberrations of Tumor Cells，1995；Klinger，Cytogenetics Analysis，Non-Isotopic Methods in Molecular Biology，A Practical Approach，1995；Timm等人，Cytometry 22：250-5，1995；Heselmeyer等人，Genes，Chromosomes & Cancer 19：233-40，1997；Sauer等人，Apmis111：444-50，2003)。在产前诊断中，FISH通常用于检测非整倍性。最近已经证明，通过FISH可以检测自然流产中存在的所有染色体异常中的83％。(参见，Jobanputra等人，Hum.Reprod.17：1166-70，2002)。一系列最近的出版物已经突出了FISH为较新的植入前遗传学诊断(PGD)领域中的一种重要的分析工具。(例如，参见，Munné等人，Reprod Biomed Online 7：91-7，2003)。用于生殖辅助方法的技术如体外授精(IVF)的越来越多的使用，使得有必要开发新的确定哪些受精卵是植入的最佳候选者的方法。令人惊讶的是，数据表明，尽管看起来形态正常，但是IVF产生的大多数胚胎显示不同程度的染色体非整倍性。(参见，Marquez等人，Reprod Biomed Online 1：729-31，2000；Abdelhadi等人，Reprod Biomed Online 6：226-31，2003)。此外，在IVF之前使用分裂间期FISH使植入的成功率增加了一倍。(参见，Gianaroli等人，Fertil Steril 72：837-44，1999)。

100多年前，von Hansemann(Von Hansemann D.，″Ueberasymmetrische Zelltheilung in epithelkrebsen und deren biologischebedeutung，″Virchow′s Arch Pathol Anat 119：299-326(1890))首次描述了在恶性肿瘤中观察到非整倍性。最近，有人提出，细胞中的非整倍性程度很好地反映了细胞的基因组不稳定性的倾向(Duesberg等人，″Genetic instability of cancer cells is proportional to their degree ofaneuploidy，″Proc Natl Acad Sci USA 95：13692-13697(1998))。20世纪初，Theodore Boveri认为，非整倍性导致癌症，但是在他于1915年去世之后没有人对他的理论感兴趣(Duesberg等人，″Aneuploidy thesomatic mutation that makes cancer a species on its own，″Cell Motil.Cytoskeleton 47：81-107(2000))。自那以后，非整倍性一直被认为是恶性转化中的遗传不稳定性的结果而不是原因。随着对实体瘤的遗传学的进一步了解，由于在超过20,000种实体瘤中发现的最常见的异常是染色体数目改变，非整倍性假说重新兴起(Bialy H.，″Aneuploidy andcancer：vintage wine in a new bottle？，″Nat Biotechnol，16(2)：137-8(1998)；Sen S.，″Aneuploidy and cancer，″Curr Opin Oncol，12(1)：82-8(2000))。在许多人类肿瘤中描述了非整倍性，其可以作为恶性肿瘤的标记。事实上，FDA已经批准了在利用最常改变的染色体3、7、9和17通过FISH的非整倍性检测中临床使用的膀胱癌检测试剂盒。Sokolova等人，J Mol Diagn.2(3)：116-23(2000)。目前在这些检测方法中使用的FISH探针来源于克隆到质粒或BACs中的基因组DNA片段，并需要整夜杂交，以获得最佳结果。

确定的着丝粒重复序列的存在允许使用更小和更精确的合成寡脱氧核苷酸探针(ODN探针)，而不是来源于大基因组DNA序列的更常用的探针(Matera等人，Genomics 18：729-31，1993)。ODN一般更快速地杂交，更保持一致，并且生产成本更低。在以下文献中描述了一些当前的染色体特异性寡核苷酸，例如，美国专利6,300,066；Pellestor等人(Cytogenet.Cell Genet.70：138-142(1995)；Anston等人(Eur.J.Hum.Genet.11：357-363，2003)；Paulasova等人(Mol.Hum.Reprod.10：467-472，2004)；及O′Keefe和Matera(Genome Res.10：1342-1350，2000)。

然而，设计用于靶向和/或检测重复序列的较小的ODN探针通常缺乏足够的检测灵敏性和/或特异性。例如，使用常规的染色体特异性寡核苷酸探针的检测通常需要成组的间接标记的特异性探针和/或信号放大、数字增强或整合，以检测信号。因此，本领域中需要新的染色体特异性寡核苷酸，其当被标记或用作染色体分析的探针时是高度可见的。这些高度可见的探针一般会使基于染色体的诊断方法具有更大的检测灵敏性，并且在一些应用中，将允许检测特定染色体，而不需要用于信号增强或整合的计算机辅助方法。

发明概述

本发明一般地涉及染色体特异性核酸序列。本发明的各个方面包括，例如，包含染色体特异性核酸序列的合成寡核苷酸和标记探针，用于选择这些序列的方法，用于制备寡核苷酸或标记探针的方法和试剂盒，以及用于检测特定人类染色体的方法和试剂盒。

一般地，本发明的合成寡核苷酸包括由25-35个与特定人类染色体(例如，2或4号染色体或Y染色体)上的重复序列(例如，着丝粒重复序列、近着丝粒(pericentromeric)重复序列、异染色质重复序列、端粒重复序列、α随体重复序列、β随体重复序列、γ随体重复序列或随体1、2或3重复序列)完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，该染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同。通常情况下，该合成寡核苷酸与人类基因组内的所有其它连续核酸序列不到84％相同。在某些实施方案中，该染色体特异性序列由25-50、25-45、25-40或25-30个与重复序列(例如，着丝粒重复序列、近着丝粒重复序列、异染色质重复序列、端粒重复序列、α随体重复序列、β随体重复序列、γ随体重复序列或随体1、2或3重复序列)完全互补的连续核苷酸组成。

本发明的合成寡核苷酸可以进一步包括可检测标记(例如，荧光团)。在某些实施方案中，标记通过连接体、交联剂或间隔物连接到染色体特异性序列上。

本发明的合成寡核苷酸可以进一步包括形成包括茎区和环区的发夹结构的寡核苷酸，其中，发夹结构中的多个核苷酸具有连接的可检测标记。在某些实施方案中，茎区包括16-40个核苷酸。在某些实施方案中，至少两个具有连接的可检测标记的核苷酸是相邻的。在某些实施方案中，具有连接的可检测标记的核苷酸间隔至少2、3、4、5、6、7、8或9个核苷酸。在某些实施方案中，标记是荧光团(如荧光素、罗丹明、得克萨斯红(Texas Red)、藻红素、Cy3、Cy5、Alexa532、Alexa 546、Alexa 568或Alexa 594)。在某些实施方案中，标记通过连接体、交联剂或间隔物连接到形成发夹结构的寡核苷酸上。

本发明的合成寡核苷酸可以进一步包括富含G的核酸序列。通常，富含G的核酸序列包括最少大约75％的G核苷酸。富含G的核酸序列可以包括，例如，大约20至大约100个核苷酸，通常为大约30至大约40个核苷酸。在包含染色体特异性序列和富含G的序列的寡核苷酸的某些变化形式中，寡核苷酸还包括连接富含G的序列与染色体特异性序列的第三核酸序列。富含G的序列可以是，例如，末端序列(例如，富含G的序列连接到染色体特异性序列的5′端或富含G的序列连接到染色体特异性序列的3′端)。

本发明的标记探针一般包括本文所述的寡核苷酸和可检测标记。该标记可以是，例如，直接标记。特别合适的直接标记包括荧光团，诸如，如荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568或Alexa 594。另外，该标记也可以是间接标记。

在标记探针包括本文所述的富含G的序列的某些实施方案中，标记探针还包括连接在富含G的序列中的G核苷酸上的铂标记络合物，该铂标记络合物包含可检测标记。在这些实施方案中的一些实施方案中，标记是铂络合物的铂。此外，在某些变化方案中，标记探针包括多个铂标记络合物(例如，至少3个)，每个络合物连接到富含G的核酸序列中的不同G核苷酸上。通常，铂络合物连接到G核苷酸N7的基团。

在某些方面，本发明还提供了探针混合组合物。一般来说，探针混合组合物包括多种不同的标记探针，每种不同的标记探针是本文所述的探针，且具有：(a)不同的染色体特异性序列，和(b)可与每种其它可检测标记区别的不同的可检测标记。在这些实施方案中的一些实施方案中中，每种可检测标记是具有光谱可区别的发射波长的荧光团。

本发明也提供了确定染色体特异性探针序列的方法。在某些实施方案中，该方法包括：(a)比较特定人类染色体(例如，染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色体或Y染色体)的重复序列与所有人类染色体的共有重复序列，和(b)确定由特定重复序列中的25-35个连续核苷酸组成并且与共有重复序列具有低于84％的同一性的核酸序列，从而确定潜在的染色体特异性探针序列。在某些实施方案中，步骤(b)的核酸序列由特定重复序列中的25-50、25-45、25-40或25-30个连续核苷酸组成。在某些实施方案中，重复序列包括着丝粒重复序列、近着丝粒重复序列、异染色质重复序列或端粒重复序列。在某些实施方案中，共有重复序列包括α随体重复序列、β随体重复序列、γ随体重复序列、端粒重复序列或随体1、2或3重复序列。在其它实施方案中，该方法一般包括：(a)比较特定人类染色体(例如，染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色体或Y染色体)的着丝粒重复序列与所有人类染色体的α-单体重复序列，和(b)确定由特定着丝粒重复序列中的25-35个连续核苷酸组成并且与所有其它α-单体重复序列具有低于84％的同一性的核酸序列，从而选择染色体特异性探针序列。在某些实施方案中，步骤(b)的核酸序列由特定重复序列中的25-50、25-45、25-40或25-30个连续核苷酸组成。这些方法可以进一步包括制备包含选择的染色体特异性核酸序列的寡核苷酸探针。

在某些实施方案中，所述方法包括：(e)用可检测标记标记染色体特异性探针序列；(f)在人类的分裂中期或分裂间期，使用标记探针进行原位杂交；(g)检测与标记相关的信号，其中，选择杂交时产生至少2倍高的信号的染色体特异性探针序列作为染色体特异性探针。在选择染色体特异性探针序列的方法的某些变化形式中，该方法包括如步骤(b)所述确定多种核酸序列，从而选择多种染色体特异性探针序列。这些变化形式中的一些还包括制备多种标记的寡核苷酸探针，每种探针包含可检测标记和不同的染色体特异性核酸序列，每种不同的序列是(b)中选择的染色体特异性序列之一；在人类的分裂中期或分裂间期，单独地用不同寡核苷酸探针中的每一种进行原位杂交；检测与每种杂交探针的标记相关的信号；以及根据检测信号的程度，选择一种或多种寡核苷酸探针。

在用于选择染色体特异性探针序列的方法的其它实施方案中，该方法还包括：(c)比较在(a)中确定的核酸序列的核苷酸序列与人类基因组中的所有其它连续核苷酸序列；和(d)保留与人类基因组中的另一种连续核苷酸序列具有低于84％的同一性的任何序列，或舍弃与人类基因组中的另一种连续核苷酸序列具有少于16％的错配的任何序列，其中，确定这些序列为潜在的染色体特异性探针序列。在某些实施方案中，所述方法进一步包括制备多种标记的寡核苷酸探针，每种探针包含可检测标记和不同的染色体特异性核酸序列，每种不同的序列是在(d)中未舍弃的染色体特异性序列中的一种；在人类的分裂中期或分裂间期，单独地用不同寡核苷酸探针中的每一种进行原位杂交；检测与每种杂交探针的标记相关的信号；以及根据检测信号的程度，选择一种或多种寡核苷酸探针。

本发明还提供了制备标记探针的方法。在某些实施方案中，这些方法包括将标记(例如，荧光团)直接连接到染色体特异性寡核苷酸的5′或3′末端上。在某些实施方案中，所述方法包括将标记(例如，荧光团)连接到包含发夹结构的染色体特异性寡核苷酸上。在某些实施方案中，所述方法一般包括：(1)将富含G的核酸序列的至少一个G核苷酸连接到铂络合物上，其中，所述铂络合物包括可检测标记或能够连接到可检测标记上，和(2)将富含G的序列连接到由与特定人类染色体上的重复序列完全互补的25-35个连续核苷酸组成的染色体特异性核酸序列上，其中该染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列(例如，α随体重复序列、β随体重复序列、γ随体重复序列、端粒重复序列或随体1、2或3重复序列)不到84％相同。步骤(2)可以在步骤(1)之前进行，或者相反。在某些实施方案中，步骤(2)的染色体特异性核酸序列由与特定人类染色体上的重复序列完全互补的25-50、25-45、25-40或25-30个连续核苷酸组成。在某些变化方案中，铂络合物能够连接到可检测标记上，并且所述方法还包括将铂络合物连接到可检测标记上。此外，该方法可以包括将所述富含G的核酸序列中的多个G核苷酸中的每一个连接到单独的铂络合物上。通常，富含G的核酸序列包括至少大约75％的G核苷酸。富含G的核酸序列可以包括，例如，大约20至大约100个核苷酸，通常为大约30至大约40个核苷酸。富含G的序列可以是，例如，末端序列(例如，富含G的序列连接到染色体特异性序列的5′端或富含G的序列连接到染色体特异性序列的3′端)。

根据本发明，一种检测特定人类染色体的方法一般包括将人类染色体制品与本文所述的标记探针接触；在足以允许探针与具有与探针的染色体特异性序列完全互补的重复序列的特定人类染色体(如果存在的话)杂交的条件下，孵育该染色体制品和探针；以及检测所述标记以检测特定人类染色体(如果存在的话)。在某些变化方案中，该方法是确定染色体异常的方法。可以使用本领域已知的任何方法，包括例如使用显微镜和CCD照相机的显微成像，实现标记的检测。在某些实施方案中，标记的检测包括使用计算机和CCD照相机的图像扫描显微镜术。在典型的实施方案中，染色体制品包括人类细胞，且杂交步骤在细胞内的染色体上原位进行。

在某些实施方案中，所述方法包括将人类细胞与多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种)不同的标记探针接触，每种不同标记探针具有：(a)不同的染色体特异性序列和(b)可与每种其它可检测标记区别的不同的可检测标记。在一些这样的实施方案中，每种可检测标记是具有光谱上可区分的发射波长的荧光团。

本发明还提供了各种用于制备标记探针的试剂盒，以及用于检测目标染色体的试剂盒。在某些实施方案中，该试剂盒包括提供包含染色体特异性序列的寡核苷酸的第一容器和提供标记(如荧光团)的第二容器。在某些实施方案中，包含染色体特异性序列的寡核苷酸进一步包括发夹结构。在某些实施方案中，该试剂盒包括提供包含染色体特异性序列和本文所述的富含G的核酸序列的寡核苷酸的第一容器，和提供铂络合物的第二容器。铂络合物包括特征在于能够被G核苷酸取代的第一离去基团和选自以下的基团：(i)可检测标记，(ii)连接到可检测标记上的连接体，(iii)能够连接可检测标记的连接体，和(iv)第二离去基团，其特征在于能够被(i)、(ii)和(iii)中的至少一种取代。在某些实施方案中，铂络合物包括(iii)的连接体，并且所述试剂盒还包括提供可检测标记的第三容器。在某些可替代的实施方案中，铂络合物包括第二离去基团，并且所述试剂盒还包括提供(i)、(ii)或(iii)的第三容器。

用于检测细胞中的目标染色体的试剂盒一般包括提供本文所述的标记探针的第一容器。在探针具有间接标记的某些变化方案中，试剂盒还包括提供用于检测间接标记的第二试剂的第二容器。

附图说明

图1显示了4种示例性的用于包含发夹结构的染色体特异性探针的标记策略。标记的核苷酸用黑体字表示。图1A显示每3个核苷酸进行标记，环结构除外。图1B显示最低限度标记的茎-环结构，其中，标记密度不应影响荧光团偶合或诱导猝灭。图1C显示每6个核苷酸和在环的顶点进行标记。标记的核苷酸处于茎螺旋的相对的位置。图1D显示除了环结构之外，只有一条茎链被标记。茎螺旋上的线性标记位置使氨基90°间隔，假定形成β-DNA。

发明详述

I.引言

本发明提供一般涉及使用具有高检测灵敏性和特异性的较小的染色体特异性寡核苷酸探针的组合物和方法。可以通过多种技术中的任何一种标记本文所述的染色体特异性寡核苷酸，以产生高度可见的、在特定实施方案中允许检测目标人类染色体(例如，染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色体或Y染色体)的探针，而无需计算机辅助的数字增强或整合。

II.定义

除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然任何与本文所述类似的方法和材料均可用于实践或测试本发明，但是只描述了示例性的方法和材料。为了本发明的目的，下列术语定义如下。

“染色体”是包含细胞的基因组的全部或一部分的染色质复合体。细胞的基因组通常用其核型进行表征，核型是包含细胞的基因组的所有染色体的集合。细胞的基因组可以包含一个或多个染色体。人类基因组包含23对染色体，包括染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22以及一对X和Y染色体。

“分裂间期”是指细胞分裂的一个阶段，此时，染色体伸长并且相互缠绕。术语“分裂间期(interphases)”指分裂间期染色体。

“分裂中期”是指细胞分裂中的任何阶段，此时，染色体凝缩或收缩，并且相互可以区分。术语“分裂中期(metaphases)”指分裂中期染色体。

“重复序列”是指人类基因组中的非编码的串联重复核苷酸序列，包括，例如，来自α随体、随体1、随体2、随体3、β随体、γ随体和端粒的重复序列。重复序列在本领域中是已知的，且在以下文献中描述，例如，(Allshire等人，Nucleic Acids Res 17(12)：4611-27(1989)；Cho等人，Nucleic Acids Res 19(6)：1179-82(1991)；Fowler等人，Nucleic Acids Res15(9)：3929(1987)；Haaf等人，Cell 70(4)：681-96(1992)；Lee等人，Chromosoma 109(6)：381-9(2000)；Maeda和Smithies，Annu Rev Genet 20：81-108(1986)；Meyne和Goodwin，Chromosoma 103(2)：99-103(1994)；Miklos(1985).Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrategenomes.Molecular evolutionary genetics.I.J.R.Macintyre.NY，PlenumPublishing Corp.：241-321(1985)；Tagarro等人，Hum Genet 93(2)：125-8(1994)；Waye和Willard，PNAS USA 86(16)：6250-4(1989)；及Willard和Waye，J Mol Evol 25(3)：207-14(1987))。重复序列位于，例如，染色体的着丝粒、近着丝粒、异染色质和端粒区域。以下文献描述了共有重复序列，例如，Willard和Waye，J Mol Evol 25(3)：207-14(1987)及Tagarro等人，Hum Genet 93(2)：125-8(1994).Vissel和Choo，Nucleic Acids Res.15(16)：6751-6752(1987)，Cho等人，Nucleic Acids Res 19(6)：1179-82(1991)。

术语“核苷酸”，除了指自然产生的核糖核苷酸或脱氧核苷酸单体外，在本文应被理解为是指其相关结构变异体，包括衍生物和类似物，其在使用该核苷酸的特定范围内在功能上相当(例如，与铂络合物连接，与互补性碱基杂交，或者两个不相邻的核酸序列之间的连接)，除非上下文清楚地表明并非如此。因此，核苷酸可以包括，例如，包含天然存在的碱基(例如，A、G、C或T)或修饰的碱基(例如，7-脱氮鸟苷或肌苷)的核苷酸。

术语“核酸”是指具有多个核苷酸单体的聚合物。核酸可以是单链或双链的，可以是DNA(cDNA或基因组DNA)、RNA、合成形式和混合聚合物，也可以是化学或生化修饰的，或可以包含非自然的或衍生的核苷酸碱基。这些修饰包括，例如，甲基化，用类似物取代一种或多种自然发生的核苷酸，核苷酸之间的修饰，如不带电的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链部分(pendent moieties)(如多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和修饰的连接(例如，α异头核酸等)。本发明还包括在通过氢键和其它化学相互作用结合指定序列方面模拟核酸的合成分子。通常，核苷酸单体通过磷酸二酯键连接，尽管核酸的合成形式可以包含其它连接(例如，肽核酸(本文也称为“PNA”)，如Nielsen等人，Science 254，1497-1500，1991所述)。核酸还可以包括，例如，构象限制的核酸(例如，“锁定核酸”或“LNA”，如Nielsen等人，J.Biomol.Struct.Dyn.17：175-91，1999所述)。“核酸”不限于任何特定长度的聚合物，因此，可以是基本上任何长度，一般为大约6个核苷酸至大约10⁹个核苷酸或更长。在双链聚合物情况下，“核酸”可以指任一条或两条链。

术语“寡核苷酸”指长度为大约6个核苷酸到大约175个核苷酸的一类核酸。寡核苷酸可以使用已知的方法合成(例如，使用自动寡核苷酸合成仪，例如，Applied BioSystems(Foster City，CA)制造的)。

术语“序列”当用于核酸时，是指连续的一系列核苷酸。

如本文中所用，术语“染色体特异性核酸序列”指对于细胞基因组内的特定染色体为特异性的核酸序列。如果核酸序列与基因组内的特定染色体上的核苷酸区段完全互补，但是该完全互补的核苷酸区段在该基因组的大部分或全部其它染色体上不存在，则该核酸序列对于该特定染色体是特异性的。

如本文中所用，“染色体特异性核酸”或“染色体特异性寡核苷酸”指包含染色体特异性核酸序列的核酸或寡核苷酸。

术语“发夹结构”或“发夹序列”指具有双链“茎”区和单链“环”区的核酸，其中，茎区和环区由具有以下区域的核酸单链形成：(1)互相基本上互补的两个区域，从而形成包含茎的双链序列(即，通过互补碱基配对)，和(2)插入两个互补区域之间的第三区域，其形成环。下面文献中描述了发夹结构，例如，Varani，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24：379-404，1995。发夹结构可包括修饰的核苷酸，包括，例如，氨基修饰的核苷酸，以提供用于连接标记如荧光团的反应性官能团。

术语“相邻的”在用于两个核酸序列(例如，染色体特异性核酸序列和发夹序列或染色体特异性核酸序列和富含G的核酸序列)时，意思是这两个序列是不重叠的(不共享限定这两个序列的一个或多个核苷酸)，并且没有被插入分子分隔开(即，没有被如下文定义的“连接体”分隔开)。

如本文中所用，术语“富含G的核酸序列”指本发明的合成寡核苷酸或探针的特定区域或部分，其连接染色体特异性核酸序列与一种或多种铂络合物。“富含G的核酸序列”指包含至少大约50％、一般至少大约60％、更通常至少大约75％的鸟嘌呤核苷酸的核酸序列。“鸟嘌呤核苷酸”，如在富含G的核酸序列中使用时，是指包含自然发生的鸟嘌呤碱基或者具有适合与铂络合物连接的受体基团的修饰鸟嘌呤碱基或鸟嘌呤类似物的核苷酸。通常，富含G的核酸序列是与结合目标的元件互相排斥的探针的部分或区域，即，富含G的序列通常不会设计为特异性结合目标。本发明的富含G的核酸序列通常为至少20个核苷酸的长度。在各个实施方案中，富含G的核酸序列在长度上是至少30个核苷酸、至少40个核苷酸或至少50个核苷酸。在其它非互相排斥的实施方案中，富含G的核酸序列在长度上不超过70、不超过80、也不超过90或不超过100个核苷酸。

在具有核酸目标结合序列的探针中，富含G的“末端”核酸序列意味着该富含G的序列是探针的末端区域，即，最5′区域或最3′区域。

在两个分子(不论是单体还是聚合分子)的连接中，“连接体”是指插入所连接的两个分子之间并且与它们相邻的分子(不论是单体还是聚合分子)。“连接体”可以用来连接例如染色体特异性核酸序列和标记，染色体特异性核酸序列和发夹结构，染色体特异性核酸序列和富含G的核酸序列，或可检测标记和铂络合物中的铂原子。连接体可以是核苷酸连接体(即，在非相邻的序列之间并且与它们相邻的核酸序列)或非核苷酸连接体。因此，例如，在染色体特异性核酸序列与不相邻也不重叠的富含G的核酸序列的连接中，“连接体”是指插入不相邻的染色体特异性序列与富含G的序列之间并且与它们相邻的分子。

如本文中所用，“探针”指能够结合互补的目标核酸的核酸。如本文进一步描述的，探针结合染色体中的互补目标位点。通常，探针是标记探针，具有一种或多种可检测标记，以允许探针在与互补目标杂交后被检测到。

如本文中所用，“铂络合物”或“含铂的化合物”指包含多价铂原子的分子，并且其已通过与鸟嘌呤核苷酸受体反应而与鸟嘌呤核苷酸形成加合物或具有此能力，从而将铂络合物与富含G的核酸序列的至少一个鸟嘌呤核苷酸连接。在本发明的典型的实施方案中，铂络合物是四价或六价。“铂标记络合物”或“铂标记化合物”是指包含可检测标记的铂络合物。以下文献描述了适用于本发明的含铂化合物，例如，国际专利公开WO 92/01699、美国专利5,714,327和美国专利6,825,330。

如本文中所用，术语“加合物”指通过铂络合物中的铂原子与G核苷酸的原子配位形成的复合物。在本文中所用的加合物中，铂原子直接参与铂络合物与G核苷酸的结合。

如本文中所用，术语“离去基团”是指可以从本文所述的铂络合物的铂原子处置换的部分，有利于受体分子在适当的条件下连接铂原子。例如，离去基团的特征为其能够被富含G的核酸序列的G核苷酸、被可检测标记、或被连接于或能够连接于可检测标记的连接体所取代。离去基团的选择在本领域的技术人员的能力之内，通过比较候选离去基团与受体分子的电负性进行选择(即，候选受体分子上的相对较高电负性的基团将趋向于取代相对较低电负性的离去基团)。例如，用于连接铂络合物与富含G的核酸序列的合适的离去基团包括在适当条件下允许在铂离子与鸟嘌呤核苷酸受体之间形成键的基团。离去基团包括，例如，F、NO₂、Ots、SOPO₄、Cl、Br、I、CN、N3、NR3、OAr、OR、SR、SO₂R和NH₂，其中R是有机残基，Ar是芳基有机残基。其它包括，例如，硫酸酯、硝酸酯、磷酸酯、碳酸酯和其低级烷基衍生物(如硝酸乙酯、硝酸丙酯等)。适于离去基团置换的条件是本领域公知的，并且随具体的离去基团和受体分子而变化。在某些变化方案中，合适的条件包括在0.5至120分钟加热到15-100℃的包含具有“软”配体的分子的溶液，所述配体如较重的卤素、膦、硫化物，氮化合物如胺、腺嘌呤、腺苷及其衍生物、鸟嘌呤、鸟苷及其衍生物、DNA、RNA、PNA、烯烃、炔烃和其它π-化合物。

如本文在包含标记的探针中所用，术语“可检测标记”指能够检测的试剂，这样它所结合的相应的探针的存在就可以检测出来。标记可以是间接或直接的。“间接标记”是可特异性结合的分子(“配体”)，使用特异性结合间接标记的标记的二级试剂(“结合配体的配偶体”)检测。相反，“直接标记”不利用结合配体的配偶体的相互作用即可检测。对于间接标记，二级试剂通常具有直接标记，或者，可选择地，二级试剂也可以被间接标记。典型的“直接标记”包括，例如，荧光团(如荧光素、罗丹明或酞菁染料)、生色团(如藻胆蛋白)、发光剂(luminescers)(例如，化学发光剂和生物发光剂)、镧系元素螯合物(如Eu³⁺或Tb³⁺的络合物)、酶(如碱性磷酸酶)、辅因子和包含放射性同位素如³H、³⁵S、³²P、¹²⁵I和¹⁴C的残基。典型的间接标记包括，例如，半抗原、生物素或其它可特异性结合的配体。

“半抗原”是指分离的表位，即具有抗原决定簇的分子。半抗原的例子包括二硝基苯酚(DNP)、洋地黄毒苷、生物素以及各种荧光团或染料(如荧光素、Alexa 405/Cascade蓝、Alexa 488、Bodiby FL、丹酰(Dansyl)、俄勒冈绿(Oregon Green)、萤光黄(Lucifer Yellow)、四甲基罗丹明/罗丹明红和得克萨斯红)。作为间接标记，半抗原通常使用抗半抗原抗体作为结合配体的配偶体进行检测。然而，也可以使用可选择的结合配体的配偶体(例如，在生物素的情况下，可以使用例如抗生物素抗体或链霉抗生物素作为结合配体的配偶体)检测半抗原。此外，在某些实施方案中，也可以直接检测半抗原(例如，在荧光素的情况下，可以使用抗荧光素抗体或直接检测荧光)。

本发明提供一般涉及使用具有高检测灵敏性和特异性的较小的、染色体特异性寡核苷酸探针的组合物和方法。可以通过多种技术中的任何一种标记本文所述的染色体特异性寡核苷酸，以产生高度可见的、在某些实施方案中允许检测目标人类染色体的探针，而无需计算机辅助的数字增强或整合。

III.染色体特异性寡核苷酸、探针和探针混合物

因此，在某些方面，本发明提供了新的具有染色体特异性序列的合成寡核苷酸。这样的合成寡核苷酸可用于，例如，制备用于检测特定目标染色体(包括例如，染色体2或4或Y染色体)的标记探针。一般来说，本发明的合成寡核苷酸包括由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列。通常情况下，染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列(例如，α随体重复序列、β随体重复序列、γ随体重复序列、端粒重复序列或随体1、2或3重复序列)不到84％相同。在某些实施方案中，染色体特异性序列与共有重复序列低于85％、低于84％、低于80％、低于78％、低于75％、小于73％或低于70％相同。优选地，合成寡核苷酸与人类基因组内的所有其它连续核酸序列不到84％相同。

根据本发明，合成寡核苷酸的染色体特异性序列对于特定人类染色体是特异性的。在某些变化方案中，染色体特异性序列对于人类染色体2或4或Y染色体是特异性的。示例性的染色体2、染色体4和Y染色体特异性的核酸序列在表1列出。

表1.示例性的染色体特异性核酸序列

SEQ ID NO：	名称	序列(5’-3’)
			1	Y1	CCAGTCGAATCCATTCGAGTACATACC
2	Y2	CCTTTTGAATCCATTCCATTGGAGTCC
			3	Y3	ATTCATTGCATTCCGTTTCATGAAATTCGA
4	Y4	CTGCATACAATTTCACTCCATTCGTTCCCA
			5	Y5	TCCATTGGAGTCAATTCCTTTCGACACCCA

6	Y6	TTGATCCTATTTTATTAAATTGCATTCTAT
			7	2.1.1	GTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTGAAGCTT
8	2.2.2	GAAACGGGATTGTCTTCATATAAACTCTAG
			9	2.5.1	GTATCTTCCAATAAAAGCTAGATAGAAGCA
10	2.6.1	ATGTCAGAAACTTTTTCATGATGTATCTAC
			11	2.7.3	TATGTGTGATGTGCGCCCTCAACTAAGAGT
12	2.8.4	TCTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTCAATT
			13	2.10.1	GGAATACGGTGATAAAGGAAATATCTTCCA
14	4.3.2	TCTTTGTGTTGTGTGTACTCATGTAACAGT
			15	4.6.2	TTTCTGCCCTACCTGGAAGCGGACATTTCG
16	4.7.5	GGTTATCTTCATATAAAATCCAGACAGGAG
			17	4.10.2	CGGCACTACCTGGAAGTGGATATTTCGAGC
18	4.18.7	TCTGCACTACCTGGAAGAGGCCATTTCGAG
			19	4.22.10	CCTACGGGGAGAAAGGAAATATCTTCAAAT

在某些实施方案中，寡核苷酸进一步包括包含茎区和环区的发夹结构，其中，发夹结构中的多个核苷酸具有连接的可检测标记，例如，荧光团。发夹结构可以包含具有有利于标记连接到发夹上的反应基团的修饰核苷酸。示例性的反应基团在下面的表2中列出。发夹区域通常包括大约18个至大约50个核苷酸，更典型地大约25个至大约40个核苷酸。发夹结构的形成是通过设计两个具有基本反平行的互补性的亚区实现的，即，在相反方向上的足够的互补性，以在严格的条件下特异性地杂交，从而形成茎区。在基本上互补的区域之间插入非互补序列，该序列没有分子内杂交，因此，在形成双链茎区时具有单链环构型。选择环区中的核苷酸的数目和碱基组成，以允许茎的互补亚区杂交。例如，环区设计为避免与茎区的任一链具有基本的互补性，典型地具有3至20个核苷酸，更典型地具有3至10个核苷酸，最典型地具有5至8个核苷酸。正如上文指出的，对于相反方向上的两个区域的基本互补性，选择茎区中的核苷酸的数目和碱基组成，使得在严格杂交条件下形成具有希望的相对稳定性的双链杂合体。通常，茎区典型地具有14至46个核苷酸(即，茎的每条链具有7至23个核苷酸)，更典型地具有16至40个核苷酸(即，茎的每条链具有8至20个核苷酸)，且最典型地具有20至32个核苷酸(即，茎的每条链具有10至16个核苷酸)。示例性的发夹结构如图1所示。

在某些实施方案中，特别是在有关染色体特异性探针的基于铂络合物的标记的变化方案中，合成寡核苷酸还包括富含G的核酸序列。优选地，富含G的核酸序列包括至少大约75％的G核苷酸。此外，富含G的核酸序列典型地包括大约20至大约100个核苷酸，更典型地包括大约30至大约60个核苷酸，大约30至大约50个核苷酸，大约30到大约40个核苷酸，或大约20至大约40个核苷酸。

染色体特异性核酸序列可以直接连接到富含G的序列上。在其它包含富含G的序列的变化方案中，染色体特异性寡核苷酸还包括介于富含G的序列和染色体特异性序列之间并且与它们相邻的连接体。连接体通常是一个或多个核苷酸，包括非自然的或衍生的核苷酸。选择核苷酸连接体的碱基数目和组成，以不干预目标结合区域与其目标的杂交。核苷酸连接体的长度典型地是1-20个核苷酸，更典型地是1-10个核苷酸，甚至更典型地是1-5个核苷酸。因此，第三核酸序列可以作为连接体起作用。可选择地，各种长度的非核苷酸连接体都可以使用。合适的非核苷酸连接体是本领域已知的，且包括，例如，间隔物亚磷酰胺C3、9和18(Glenn Research，分别是#10-1913、10-1909或10-1918)。富含G的序列可以连接到核酸目标结合序列的5′或3′端。通常，富含G的序列是末端序列。通常，富含G的序列是连接到染色体特异性序列的5′或3′端的末端序列。在某些实施方案中，染色体特异性序列的每个末端直接或通过连接体连接到富含G的序列上。

本发明的标记的寡核苷酸探针一般包括上述的染色体特异性寡核苷酸和可检测标记。可检测标记可以是直接或间接的。适用于本发明的标记是本领域已知的，通常包括通过其化学性质以直接或间接方式提供允许检测探针的可识别信号的任何分子。优选的直接标记包括荧光团，诸如，如荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红素、酞菁染料(例如，Cy3或Cy5)、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568或Alexa 594。其它直接标记可以包括，例如，放射性核素和酶，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶。可选择地，可以使用间接标记。例如，间接标记可以是生物素，其可以使用例如标记的链霉抗生物素(例如，与荧光素偶联的链霉抗生物素)进行检测。在其它的实施方案中，间接标记是可以使用抗半抗原抗体检测的半抗原。适用于本发明的典型的半抗原包括，例如，生物素、洋地黄毒苷、二硝基苯酚(DNP)，及荧光团或染料，例如，荧光素、Alexa 405/Cascade蓝、Alexa 488、Bodiby FL、丹酰、俄勒冈绿、萤光黄、四甲基罗丹明/罗丹明红和得克萨斯红。

在荧光标记的情况下，荧光团并不限于单一种类的有机分子，还包括无机分子、有机分子和/或无机分子的多分子混合物、晶体、杂聚物等等。例如，可以很容易地衍生包封在二氧化硅壳中的CdSe-CdS核心-外壳纳米晶体，用于与生物分子偶联(Bruchez等人，Science，281：2013-2016，1998)。同样地，高荧光量子点(硫化锌包封的硒化镉)已与生物分子共价偶联，用于超灵敏的生物检测(Warren和Nie，Science，281：2016-2018，1998)。

在其中标记探针包括本文所述的富含G的序列的某些实施方案中，标记探针可以进一步包括连接在富含G的序列中的G核苷酸上的铂标记络合物，该铂标记络合物具有可检测标记。在典型的变化方案中，铂标记络合物具有式{Pt^II(w)(x)(y)(z)}或{Pt^IV(u)(v)(w)(x)(y)(z)}，其结构分别如下式(1)和(2)所示：

在式(1)和(2)中，u、v、w、x、y和z代表铂原子的配体。式(1)代表具有正方形平面、四方晶系结构的四价铂化合物。式(2)代表具有八面体结构的六价化合物。在这些结构中，不超过一个的配体是富含G的核酸序列的鸟嘌呤核苷酸。通常，在铂离子本身不作为标记时，至少一个配体代表可检测标记，或者，可选择地，连接到可检测标记上的稳定取代基。任选地，可检测标记通过连接体连接到铂离子或稳定取代基上。合适的连接体的例子在下文中进一步描述。其余的配体是稳定取代基，并可以彼此相同或不同。两个或多个配体位点可以通过稳定配体、优选共价地相互连接，以形成希望的稳定桥。优选的相互连接基团包括脂肪族多胺。举例来说，配体的特别合适的相互连接基团包括脂肪族二胺(例如，乙二胺(-NH₂-CH₂-CH₂-H₂N-)或脂环族二胺)，当结合铂原子时，末端的氮占据2个配体位点。在以下文献中也描述了合适的用于连接可检测标记与G核苷酸的铂标记络合物，例如，国际专利公开WO92/01699、WO 96/35696、WO 98/15564、美国专利5,714,327和美国专利6,825,330。

在优选的实施方案中，富含G的序列中的多个G核苷酸各自连接到单独的铂标记络合物上。在这些实施方案中，每个铂络合物通常具有相同的可检测标记，虽然也可以使用不同的标记，这取决于特定应用。在特定的变化方案中，探针包括至少2个、至少3个、至少5个或至少7个铂标记络合物。通常，铂络合物连接到G核苷酸的N7基团上。

如前所述，在某些变化方案中，染色体特异性序列的每个末端直接或通过连接体连接到富含G的序列上。包含这样的寡核苷酸的标记探针通常具有连接到铂标记络合物上的每个富含G的序列的至少1个G核苷酸。在优选的实施方案中，每个富含G的序列的2个或多个G核苷酸，更优选至少3个、至少5个、或至少7个G核苷酸，连接到铂标记络合物上。

如前文指出的，铂标记络合物的可检测标记可以是直接或间接的。在某些变化方案中，铂原子本身是可检测标记。例如，可以通过使用铂作为用于沉积银或其它金属晶体的核，直接检测铂化合物。例如，铂化合物也可以作为电催化的标记发挥功能(例如，可以通过计时电流法测量由铂催化的析氢产生的电流来得到信号，参见，例如，Hernandez-Santos等人，Anal.Chem.77：2868-2874，2005)。

在本发明的某些方面，混合多种不同的标记探针，以提供探针混合组合物。一般地，该组合物的不同标记探针中的每一种具有不同的染色体特异性序列和可与其它可检测标记中的每一种区分的不同的可检测标记。例如，每种可检测标记可以是具有光谱上可区分的发射波长的荧光团。在一些变化方案中，通过混合一个或多个染色体特异性探针制备探针混合组合物。例如，根据各种探针的相对特异性，以及如在杂交试验中所确定的用于每种混合物的寡核苷酸探针的最佳数目，可以选择这些探针混合组合物。在特定的实施方案中，探针混合组合物是双色探针混合物。例如，可以制备双色染色体探针混合组合物，每种染色体特异性探针具有发射波长在光谱上可区分的荧光团。合适的用于这些双色探针混合组合物的荧光团包括，例如，Alexa 488(492nm处有最大激发，520nm处有最大发射)和Alexa 546(555nm处有最大激发，570nm处有最大发射)。

IV.寡核苷酸和探针组合物的制备

A.概述

本发明还提供了一种用于制备上文所述的合成寡核苷酸或标记探针的方法。可以使用已知的核酸合成方法合成本文所述的合成的染色体特异性寡核苷酸(参见，例如，Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press 1998)。可以使用溶液或固相技术。合成程序一般是自动化的，可以包括，例如，亚磷酰胺、亚磷酸三酯、H-磷酸酯或磷酸三酯方法。

B.制备标记探针

总的来说，按照本发明制备标记探针包括提供染色体特异性寡核苷酸并将标记连接到寡核苷酸上。适用于寡核苷酸探针的各种标记，以及用于将这些标记连接到寡核苷酸上以产生寡核苷酸探针的技术，是本领域已知的，且可以用于本发明。因此，例如，可以用各种常规方法中的任一种来标记探针，例如，使用特定的报道分子、荧光团、放射性物质或酶(例如，过氧化物酶、磷酸酶)。

在某些实施方案中，在合成过程中，或者，可选择地，在合成后，使用5′-端标记进行寡核苷酸标记，其包括使用末端转移酶将标记的核苷酸酶促添加到寡核苷酸的5′端。可以通过使用“链终止”核苷酸添加一个标记的核苷酸；可选择地，可以使用非终止核苷酸，导致添加多个核苷酸以形成“尾”。对于合成标记，另一种常用方法，在化学合成过程中将标记的核苷酸(例如，亚磷酰胺核苷酸)掺入寡核苷酸中。标记可以添加到寡核苷酸的5′、3′或两端(参见，例如，美国专利5,082,830)，或ODN内部的碱基位置。

在某些实施方案中，寡核苷酸包括标记的发夹结构。标记可以在发夹结构的茎部分、环部分或茎和环两部分上。在某些实施方案中，标记在发夹结构的环部分上。在某些实施方案中，标记在相邻的核苷酸上。在某些实施方案中，标记间隔2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。在某些实施方案中，标记在发夹结构的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸上。在示例性的实施方案中，包含发夹结构的寡核苷酸与荧光团偶联的N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯孵育，所述荧光团偶联的N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯只与寡核苷酸的发夹部分上的反应性胺基形成共价键。其它合适的键列于下面的表2中。

用于标记核酸的其它方法利用基于铂的标记。这样的方法包括通用连接系统(ULS，Kreatech Biotechnology B.V.，阿姆斯特丹，荷兰)。基于铂的标记方法及其应用在以下文献中有描述，例如，美国专利5,580,990、5,714,327和6,825,330；国际专利公开WO 92/01699、WO96/35696和WO 98/15546；Hernandez-Santoset等人，Anal.Chem.77：2868-2874，2005；Raap等人，BioTechniques 37：1-6，2004；Heetebrij等人，Chem Bio Chem 4：573-583，2003；Van de Rijke等人，AnalyticalBiochemistry 321：71-78，2003；Gupta等人，Nucleic Acids Research 31：e13，2003；Van Gijlswijk等人，Clinical Chemistry 48：1352-1359，2002；Alers等人，Genes，Chromosomes & Cancer 25：301-305，1999；Wiegant等人，Cytogenetics and Cell Genetics 87：7-52，1999；Jelsma等人，Journal of NIHResearch 5：82，1994；Van Belkum等人，BioTechniques 16：148-153，1994；及Van Belkum等人，Journal of Virological Methods 45：189-200，1993。

在本发明的某些变化方案中，基于铂的标记与包含富含G的核酸序列的染色体特异性探针一起使用。在包含富含G的核酸序列的标记探针的情况下，制备探针的方法一般包括将富含G的序列的至少一个G核苷酸连接到铂络合物上，和将富含G的核酸序列连接到染色体特异性核酸序列上。如前所述，用于制备本发明探针的富含G的核酸序列优选地包括至少大约75％的鸟嘌呤核苷酸，且典型地是大约20至大约100个核苷酸，更典型地是大约30至大约60个核苷酸、大约30到大约50个核苷酸、大约30至大约40个核苷酸或大约20至大约40个核苷酸。富含G的序列与染色体特异性序列的连接可以在G核苷酸与铂络合物的连接之前或之后进行。

可以利用本领域中的各种技术将富含G的序列连接到染色体特异性序列上。富含G的序列可以通过核苷酸或非核苷酸连接体连接到染色体特异性序列上，该连接体基本上可以是任何长度和组成，其不干扰结合目标的元件与相应的目标分子的相互作用。连接体可以连接到富含G的序列的5′或3′端，或者，可选择地，也可以连接到内部核苷酸上。在其它变化方案中，富含G的序列直接相邻地连接到染色体特异性序列上，不使用中间连接体。通常，使用如上所述的已知核酸合成技术，可以将富含G的序列和染色体特异性序列简单地合成为包含两个序列的一个寡核苷酸。在这种情况下，富含G的序列和染色体特异性序列连接，作为核酸合成过程的一部分，且可以在5′或3′连接到染色体特异性序列上，或者5′和3′都连接到染色体特异性序列上。可选择地，富含G的序列可以5′连接到染色体特异性序列上，例如，通过引物延伸。在这些实施方案中，富含G的序列包括3′引发序列，该3′引发序列与包含染色体特异性序列的核酸的5′区域基本上互补，或与位于该核酸的5′和邻近的核酸序列的区域互补。如本文所用，“基本上互补的”意味着，3′引发序列在通常用于引物延伸的杂交条件下能够与包含染色体特异性序列的核酸的5′区域杂交。在适于引物延伸的条件下，该引发序列能够与包含染色体特异性序列的核酸的基本互补区域杂交，或与相邻的核酸序列杂交。适于引物延伸的条件是本领域公知的。(例如，参见，Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(第4版，John Wiley & Sons 1999))。在其它的实施方案中，首先分别合成富含G的序列和染色体特异性序列(例如，使用已知的寡核苷酸合成方法)，随后通过适当的连接体连接。

铂络合物一般包括特征在于能够被富含G的核酸序列中的G核苷酸取代的离去基团。铂络合物进一步包括可检测标记或能够与可检测标记连接。因此，铂络合物包括选自以下的基团：

(i)可检测标记，

(ii)连接到可检测标记上的连接体，

(iii)能够连接到可检测标记上的连接体；和

(iv)第二离去基团，其特征在于它能够被上述(i)、(ii)和(iii)中的至少一种取代。

在某些实施方案中，(i)的可检测标记是铂原子本身。在这种情况下，铂络合物不需要包括包含可检测标记的单独的基团，也不需要用于连接它的连接体。

在典型的变化方案中，铂标记络合物具有式{Pt^II(w)(x)(y)(z)}或{Pt^IV(u)(v)(w)(x)(y)(z)}，其结构分别如上文的式(1)和(2)所示。如上所述，在式(1)和(2)中，u、v、w、x、y和z代表铂原子的配体。在用于制备具有富含G的序列的探针的方法中，不超过一个配体是离去基团，其特征为能够被富含G的核酸序列的鸟嘌呤核苷酸取代。在铂原子本身不作为可检测标记的某些实施方案中，至少一个配体代表：(a)可检测标记；(b)连接到可检测标记上的连接体；(c)能够连接到可检测标记上的连接体；(d)离去基团，其特征在于它能够被(a)、(b)或(c)取代；或(e)包含(a)至(d)中的任一种的稳定取代基。其余的配体是稳定取代基，并可能彼此相同或不同。两个或多个配体位点可以通过稳定配体、优选共价地相互连接，以形成希望的稳定桥。在以下文献中也描述了合适的用于连接可检测标记与G核苷酸的铂络合物，例如，国际专利公开WO 92/01699、美国专利5,714,327和美国专利6,825,330。

用于连接可检测标记与铂化合物的连接体可以是，例如，简单的烷基链或更复杂的包含芳基和/或杂原子的结构。在某些实施方案中，连接体至少4个原子长，优选至少4个碳原子长，且在碳链中具有至少1个杂原子。杂原子通常赋予连接体一定量的刚性。这种刚性提供了额外的保证：空间位阻因素不会阻碍鸟嘌呤核苷酸与可检测标记通过铂标记络合物的方便连接。特别合适的杂原子是氧原子，其正面影响连接体的亲水性。在一些变化方案中，连接体包括链中不超过20个碳原子，该链优选地是基本上不分支的链，从而使任何空间位阻最小化。

任何连接体必须具有的一种性质是与适于连接可检测标记的反应基团连接的能力。反应基团的非限制性的例子包括胺、羧酸基和硫醇基。具有胺的连接体，例如，可以与可检测标记的NHS酯(例如，荧光染料-NHS)反应，以生成铂标记络合物。

一种合适的连接体是1，8-二氨基-3，6-二氧杂辛烷，它是一种非常柔性的化合物，具有远端伯胺基和使其非常适于作为本发明的连接体的大小。

另一种可以使用的连接体是寡聚赖氨酸或聚赖氨酸。由于其结构和构象，这些分子产生对于可检测标记、鸟嘌呤核苷酸和铂之间的最佳相互作用有利的环境。使用赖氨酸链作为连接体的另一个好处是，通过改变链中的赖氨酸单位的数目，可以获得特定标记和核苷酸或核酸的最佳条件。对于某种应用，熟练的技术人员会常规地确定最佳结果需要多少赖氨酸单位。

合适的连接体的其它非限制性的例子包括以下：(CH₂)_n、(CH₂)_n(CH＝CH)_mO(CH＝CH)_p(CH₂)_q、CO(CH₂)_n(CH＝CH)_m(CH₂)_p、COAr(CH₂)_n(CH＝CH)_m(CH2)_p、NH₂(CH₂)_nQ、NH₂((CH₂)_nO)_m(CH₂)_tQ、NH₂(CH₂)_mAr(CH₂)_nQ，其中，m、n、p、q和t是0到8(含)的整数，且m、n、p、q和t相同或不同。在上述示例性的连接体通式中，Q选自CONH、NHCO、-S-S-、NHCSNH、NHCSO，其中Ar是芳基有机残基。例如，美国专利6,825,330描述了这些具有特定Ar基团的连接体的某些变化形式。

可检测标记或连接体连接到铂离子上(即，通过与铂离子上的位置直接配位)，或者，可选择地，连接到连接于铂离子上的稳定取代基(例如，参予稳定桥结构的取代基)上。例如，在其中铂络合物包括末端氮原子与铂离子结合的脂肪二胺桥的特定变化方案中，可检测标记或连接体可以连接到末端氮原子之一上。当可检测标记或连接体连接到铂离子时，可检测标记或连接体具有反应性基团，该反应性基团从铂离子取代离去基团，从而使可检测标记或连接体连接到铂离子上。在这些包括使用连接体的实施方案中，可检测标记例如荧光染料通常已连接到连接体的相反一端，从而使得连接体与铂化合物的反应产生铂标记络合物。

当连接体连接到脂肪族二胺的末端氮时(氮结合铂离子)，例如，连接体可以首先连接到可检测标记上(例如，通过连接体的羧酸基团与染料-NHS反应)，然后连接体可以与脂肪族二胺反应生成标记的脂肪族二胺，所述脂肪族二胺然后可以与铂反应生成铂标记络合物。

本领域的技术人员已知的标准化学合成技术可以用于制备本发明的铂标记络合物。例如，Houthoff等人的美国专利5,714,327描述了一种合适的产生包含乙二胺桥的铂标记化合物的可接受的方法。在这种方法中，四氯铂酸钾首先转化为四碘铂酸盐。四碘铂酸盐与乙二胺反应，生成乙二胺二碘化Pt(II)。该二碘化物通过配体交换转化为其硝酸盐衍生物，形成乙二胺二硝酸Pt(II)，其然后与具有活化的连接体的可检测标记(例如，荧光染料)反应。类似的方法可以用于其它铂标记络合物。例如，乙二胺可以用脂环二胺代替，以使这种方法适于产生具有脂环二胺桥的铂标记化合物，如Braman等人的美国专利6,825,330所述。此方法产生单官能化化合物，其中，可检测标记连接到不是脂肪族二胺稳定桥的一部分的氮上，这意味着只有一个功能性离去基团的空间。在以下文献中也描述了铂标记化合物的合成，例如，Heetebrij等人，Chem Bio Chem4：573-583，2003；WO 96/35696；WO 98/15564和美国专利5,580,990。

另一种合适的用于产生包含脂肪族二胺桥的铂标记络合物、且不需配体交换步骤的方法包括四氯铂酸钾(II)与具有可检测标记的脂肪族二胺(例如，乙二胺或脂环族二胺)直接反应。反应形成标记的脂肪族二胺二氯化铂。脂肪族二胺形成稳定桥，并且两个氯离子作为随后可与鸟嘌呤核苷酸反应的离去基团。例如，在美国专利6,825,330中也描述了该方法。

制备荧光染料或其它具有与各种官能团(例如胺)反应的活化基团的可检测标记的方法是本领域已知的。表2列出了许多常规地用于与某些官能团反应的反应基团。

表2.选择的反应性取代基和其相应的反应性官能团。

反应基团	相应的官能团
		琥珀酰亚胺酯	胺

酐	胺、醇
		酰基叠氮化物	胺
异硫氰酸酯	胺、硫醇、醇、酚
		磺酰氯	胺、酚
磺酰氟	醇
		取代的肼、取代的羟胺	醛、酮
酰基卤	氨基
		卤代乙酰胺、马来酰亚胺	硫醇、咪唑、酚、胺
碳二亚胺	羧基
		亚磷酰胺	醇基

可以使用本领域公知的方法制备如表2所列的具有反应基团的连接体或可检测标记。例如，(a)可以使用N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，从具有羧酸取代基的分子制备琥珀酰亚胺酯；(b)可以使用草酰氯或亚硫酰氯，从含有羧酸取代基的分子制备酰基卤；(c)可以使用光气从含有胺基团的分子制备异氰酸酯；(d)可以使用硫光气从含有胺取代基的分子制备异硫氰酸酯；(e)可以通过含胺的分子与已知的也包含胺反应基团的光亲和标记反应掺入光亲和标记；和(f)可以从含有胺的染料或其它可检测标记和马来酸酐制备马来酰亚氨基。

在某些实施方案中，用交联剂或间隔物连接标记的发夹结构与染色体特异性序列。交联剂可以是同双官能的或异双官能的。合适的同双功能交联剂包括，例如，在每个末端具有NHS酯的胺反应性交联剂(包括，例如，二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)；3，3′-二硫代二(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)；二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)；二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)；乙二醇二(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)；乙二醇二(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基EGS))；在两个末端具有酰亚胺酯的胺反应性交联剂(包括，例如，己二酰亚胺酸二甲酯(DMA)；庚二酰亚胺酸二甲酯(DMP)；辛二酰亚胺酸二甲酯(DMS)；3，3′-二硫代二丙二酰亚胺酸二甲酯(dimethyl3，3’-dithiobispropionimidate)(DTBP))；在每个末端具有二硫吡啶基的巯基反应性交联剂(包括，例如，1，4-二[3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰氨基]丁烷(DPDPB))；在每个末端具有马来酰亚胺基的巯基反应性交联剂(包括，例如，二马来酰亚胺基己烷(BMH))；在每个末端具有酰肼基的羧基反应性交联剂(包括，例如，己二酸二酰肼和碳酰肼)；在每个末端具有环氧基的多基团反应性交联剂(包括，例如，1，2：3，4-二环氧丁烷；1，2：5，6-二环氧己烷；二(2，3-环氧丙基)醚；1，4-(丁二醇)二缩水甘油醚)。合适的异双功能交联剂包括，例如，具有胺反应性末端和巯基反应性末端的交联剂(包括，例如，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)；长链SPDP(SPDP)；磺基-LC-SPDP；琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)；磺基-LC-SMPT；琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷(SMCC)；磺基-SMCC；琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(SIAX)；琥珀酰亚胺基6-(6-(((4-碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基)己酸酯(SIAXX))；具有羧基反应性末端和巯基反应性末端的交联剂(包括，例如，4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)；4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼盐酸盐(M2C2H)；3-(2-吡啶基二硫代)丙炔基酰肼(PDPH))；具有胺反应性末端和光反应性末端的交联剂(包括，例如，磺基琥珀酰亚胺基-2-(对-叠氮基水杨基氨基)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯(SASD)；磺基琥珀酰亚胺基-2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯(SAED))；具有巯基反应性末端和光反应性末端的交联剂(包括，例如，N-[4-(对-叠氮基水杨基氨基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺(APDP))；具有羰基反应性末端和光反应性末端的交联剂(包括，例如，4-(对-叠氮基水杨基氨基)丁胺(ASBA))。合适的间隔物包括5′-ODN修饰，如dNTP；和胺反应性间隔物，如氨基亚磷酰胺或磺基亚磷酰胺，包括，例如，丁基亚磷酰胺、戊基亚磷酰胺、己基亚磷酰胺、庚基亚磷酰胺、辛基亚磷酰胺、壬基亚磷酰胺、癸基亚磷酰胺、十一基亚磷酰胺、十二基亚磷酰胺、十五基亚磷酰胺、十八基亚磷酰胺。其它合适的胺反应性间隔物包括例如，活化的聚乙二醇(PEG)，如(单甲氧基)n二醇，其中n＝3-18个单位重复。另外的合适的交联剂和间隔物在Herman.″Bioconjuate Chemistry″.Academic Press.New York，NY.1996中描述。

本领域的技术人员可以容易地将具有反应性基团的可检测标记或连接体连接到寡核苷酸(例如，染色体特异性寡核苷酸或发夹寡核苷酸)上。同样，本领域的技术人员可以容易地将具有反应性基团的可检测标记或连接体连接到具有与其反应的相应官能团的铂络合物上(例如，包含胺反应性基团的连接体与脂肪二胺的反应)。例如，表1列出的任何胺反应性官能团，或本领域已知的与胺反应的其它任何基团，可用于将连接体或可检测标记与具有胺的铂络合物连接。作为非限制性的例子，一种常用的用于荧光染料的偶联方法包括染料-琥珀酰亚胺酯与目标分子上的氨基的反应。例如，通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与染料上的羧基反应，制备琥珀酰亚胺酯-染料。NHS修饰的染料或异硫氰酸酯修饰的染料也可以商购(例如，从Molecular Probes，Eugene OR)。如果需要，荧光染料或其它标记可以被修饰，以在染料和NHS活性基之间具有短连接体(例如，烷基链)，例如，通过NHS染料与6-氨基正己酸反应以形成染料-氨基羧酸。此产物然后在无水DMF中与NHS反应以形成在染料和活性NHS基团之间具有短连接体的染料-NHS化合物。这种染料-NHS化合物然后与具有胺基(例如，脂肪族二胺)的分子反应，以产生染料标记的胺。

可以使用本领域公知的用于以铂基化合物标记核酸的方法，进行铂络合物与富含G的核酸序列中的一个或多个G核苷酸的连接。例如，在典型的实施方案中，铂标记络合物与包括富含G的核酸序列的核酸水溶液简单混合，且铂化合物通过鸟嘌呤核苷酸碱基的N3或N7氮原子形成加合物。通过标准方法除去过量的标记化合物，标记的富含G的序列备用。在某些变化方案中，在连接到结合目标的元件之前，标记富含G的核酸序列。可选择地，在用铂络合物标记的过程中，富含G的序列已经连接到结合目标的元件上。在以下文献中描述了合适的用于标记核酸的方案，其可以容易地进行改变以标记富含G的核酸序列或包含这种富含G的序列的核酸，例如，Wiegant等人，Cytogenet.Cell Genet.87：47-52，1999；van Belkum等人，BioTechniques 16：148-153，1994；WO 96/35696；WO 98/15564；和美国专利5,580,990、5,714,327和6,825,330。通常，使用这些方法，富含G的核酸序列中的多个G核苷酸均连接到铂络合物上，以产生具有多个可检测标记的富含G的序列，或通过标记与铂络合物连接而具有被多重标记的能力。

V.选择染色体特异性探针序列的方法

在本发明的另一方面，提供了选择染色体特异性探针序列的方法。通过这种方法确定的染色体特异性探针序列可以用于制备以上列出的染色体特异性寡核苷酸或标记探针。

在某些实施方案中，该方法包括：

(a)比较特定人类染色体(例如，染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色体或Y染色体)的重复序列与所有人类染色体的共有重复序列；和

(b)将由该特定人类染色体的重复序列中的25-35个连续核苷酸组成并且与共有重复序列具有低于84％的同一性的核酸序列确定为潜在的染色体特异性探针序列。

该方法可进一步包括：

(c)比较在(b)中确定的染色体特异性探针序列与人类基因组中的所有其它连续核苷酸序列；和

(d)将与人类基因组中的另一种连续核苷酸序列具有低于84％的同一性的任何序列确定为潜在的染色体特异性探针序列。

该方法可进一步包括：

(e)化学合成并用可检测标记标记染色体特异性探针序列；

(f)在人类的分裂中期和分裂间期，使用(e)的标记探针序列进行原位杂交；

(g)检测与该标记相关的信号，其中，选择杂交时产生至少2倍高的信号的染色体特异性探针序列作为染色体特异性探针。

在某些实施方案中，用于选择染色体特异性探针序列的方法一般包括以下步骤：

(a)比较特定人类染色体(例如，染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色体或Y染色体)的着丝粒重复序列与所有人类染色体的着丝粒重复序列的共有α-单体重复序列；和

(b)确定由该特定着丝粒重复序列中的25-35个连续核苷酸组成且与共有α-单体重复序列具有低于84％的同一性的核酸序列，从而选择染色体特异性探针序列。

在其它实施方案中，用于选择染色体特异性探针序列的方法一般包括以下步骤：

(a)比较特定人类染色体(例如，染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色体或Y染色体)的着丝粒重复序列与所有人类染色体的α-单体重复序列；和

(b)确定由该特定着丝粒重复序列中的25-35个连续核苷酸组成且与所有其它α-单体重复序列具有低于84％的同一性的核酸序列，从而选择染色体特异性探针序列。

这些方法可以进一步包括制备包含选择的染色体特异性核酸序列的寡核苷酸探针的步骤。本文进一步讨论本发明的这种探针的制备(参见以上的第二部分)。

在本方法的某些变化形式中，该方法包括在上述步骤(b)中确定多种核酸序列，从而选择多种染色体特异性探针序列。一些这样的变化形式进一步包括以下步骤：

(i)制备多种标记的寡核苷酸探针，每种探针包含可检测标记和不同的染色体特异性核酸序列，每种不同的序列是选择的染色体特异性序列之一；

(ii)在人类的分裂中期或分裂间期，单独地用每种不同的寡核苷酸探针进行原位杂交；

(iii)检测与每种杂交探针的标记相关的信号；和

(iv)根据检测信号的程度，选择一种或多种寡核苷酸探针。

在另外的其它变化形式中，该方法进一步包括(c)比较在步骤(a)中确定的核酸序列的核苷酸序列与人类基因组中的所有其它连续核苷酸序列；和(d)舍弃与人类基因组中的另一种连续核苷酸序列具有超过84％的同一性的任何序列。这样的实施方案可以进一步包括以下步骤：

(i)制备多种标记的寡核苷酸探针，每种探针包含可检测标记和不同的染色体特异性核酸序列，每种不同的序列是步骤(d)中没有舍弃的染色体特异性序列之一；

(iii)检测与每种杂交探针的标记相关的信号；和

(iv)根据检测信号的程度，选择一种或多种寡核苷酸探针。

在确定特定着丝粒重复序列中与共有α-单体重复序列和/或所有其它α-单体重复序列具有低于84％的同一性的核酸序列时，可以根据本领域内熟知和易于使用的序列比对和比较方法确定同一性百分比。在这方面，术语“同一性”百分比在比较特定着丝粒重复序列与共有α-单体重复序列和/或所有其它α-单体重复序列时，是指两个或多个序列或子序列，当其在使用序列比较算法或通过手工比对和目视检查测量来比较和比对在比较窗口或指定区域上的最大一致性时，具有指定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％)的相同核苷酸。

对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列的坐标，如果必要，指定序列算法程序参数。可以使用程序的默认参数，或者，可以指定替代的参数。基于程序参数，该序列比较算法然后计算测试序列相对于参考序列的百分序列同一性或相似性。

用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的最佳序列比对可以如下进行，例如，通过Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1970)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行(例如，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过人工比对和目视检查(例如，参见，Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology(1995增刊))。有用的算法的例子包括，例如，PILEUP，其使用Feng和Doolittle(J.Mol.Evol.35：351-360，1987)的渐进比对方法的简化形式，且类似于Higgins和Sharp(CABIOS 5：151-153，1989)描述的方法。

一种有用的算法的例子是PILEUP，其使用Feng和Doolittle(J.Mol.Evol.35：351-360，1987)的渐进比对方法的简化形式，且类似于Higgins和Sharp(CABIOS 5：151-153，1989)描述的方法。适于确定百分序列同一性的算法的其它例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们在Altschul等人(Nuc.Acids Res.25：3389-402，1977)和Altschul等人(J.Mol.Biol.215：403-10，1990)中分别有描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

VI.染色体检测

上述的标记探针可用于包括核酸杂交试验的任何方法，所述核酸杂交试验需要或另外适于包含选择的可检测标记的染色体特异性探针。使用本发明的标记探针的优点包括，例如，相对较短的杂交时间(5-10分钟，相比基因组衍生的FISH探针的6-16小时)以及获得的信号和/或信噪比。

因此，在另一方面，本发明提供用于检测特定人类染色体的方法。该方法一般包括将人类染色体制品与本文所述的标记的染色体特异性探针接触；在足以允许该探针与具有与探针的染色体特异性序列完全互补的着丝粒重复序列的特定人类染色体(如果存在的话)杂交的条件下，孵育该染色体制品和探针；并检测该标记以检测特定人类染色体(如果存在的话)。该方法可以是例如，确定染色体异常的方法。在某些变化方案中，染色体制品包括人类细胞，且杂交步骤在细胞内的染色体上原位进行。

在典型的实施方案中，检测方法包括固定染色体样本，以获得染色体展开。可以使用多种合适的固定剂，包括，例如，酸性丙酮溶液、各种醛溶液(例如，甲醛、多聚甲醛和戊二醛)和酸性醇溶液等。例如，在Trask等人(Science 230：1401-1402，1985)中讨论了特定的染色体固定剂的例子。

优选地，处理染色体样本(例如，固定的染色体样本)以使目标DNA更容易接近探针。例如，用一种或多种从染色体上除去蛋白质的试剂处理染色体制品，可以提高探针接近染色体中的目标位点的能力。用于进行这种清除的试剂包括某些酶(例如，链霉蛋白酶和蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶)和弱酸。利用提高可接近性的酶浓度和时间进行去蛋白作用，以允许探针与目标位点之间杂交；然而，这段时间要足够短，以防止导致随后的染色体识别困难的形态细节损失。另一种方法是通过弱酸提取对染色体进行去蛋白化。因此，某些去蛋白方法包括用0.02-0.2NHCl接着通过高温(如70℃)清洗来处理染色体制品。可以利用任选的RNase预处理从染色体制品中除去残余的RNA。

此外，增加目标DNA对于探针的可接近性的处理通常包括使染色体变性。可以利用各种变性条件。某些变性方法包括在高pH、低pH、高温和/或各种有机溶剂(例如，甲酰胺、四烷基卤化铵)的存在下孵育。通常在染色体与探针接触前，使用确定的清洗程序除去变性剂。例如，当甲酰胺用作变性剂时，常用的清洗包括一系列的70％、80％和90％乙醇的冰冷乙醇冲洗。在杂交步骤前也可以在将探针置于玻片上并提高温度(75-85℃)5分钟之后进行变性。

一旦染色体制品与染色体特异性探针接触，在足以使探针与染色体中的互补序列杂交的条件下和时间内进行杂交。适于寡核苷酸探针特异性结合相应目标的条件是领域公知的。(参见，例如，Sambrook和Russell，同上；Ausubel等人，同上。也参见Tijssen，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.24：Hybridization with NucleicAcid Probes(Elsevier，NY 1993))。最佳杂交条件通常取决于一些因素，如盐的浓度、孵育时间和探针的浓度、成分和长度，这是本领域的普通技术人员可以理解的。基于这些和其它已知因素，很容易确定合适的结合条件，如有必要，为根据本发明的应用进行优化。

在允许核酸的基本互补链形成稳定和特异性结合的严格条件下，和任何除去探针的非特异性结合的清洗条件下，进行杂交。一般来说，在低于探针的解链温度(T_m)大约5℃至低于T_m大约20℃-25℃的范围内发生严格性。可以增加或降低严格性，以特异性地检测具有100％的互补性的目标核酸，或者，也检测具有低于100％的互补性的相关的核苷酸序列。在某些方法中，选择等于特定探针的T_m的非常严格的条件。考虑以下因素，如序列的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)、目标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或是固定的)及盐和其它成分(如甲酰胺、硫酸葡聚糖和/或聚乙二醇存在或不存在)的浓度，且杂交溶液可以变化，以产生低、中或高严格性的条件。清洗条件通常是从室温至60℃。

例如，高严格条件可以包括，例如，在37℃下、2xSSC、30％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖进行杂交，接着在45℃下，在30％甲酰胺、2xSSC中清洗3次，和在45℃下、在1xPBD(Na₂HPO₄0.1M，NaH₂PO₄0.6mM，NaN₃0.003％，Nonidet P400.05％)中清洗1次。其它合适的高严格条件包括：杂交步骤为大约45℃、6xNaCl/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃下2xSSC清洗；或在42℃下、在5xSSC、20mM NaPO₄、pH 6.8、50％甲酰胺中杂交，接着在42℃下、0.2xSSC清洗。其它合适的高严格条件包括50℃下、在0.5xSSC，0.1％SDS中进行2分钟。这些条件可以根据核苷酸碱基组成和长度和使用环境而变化，凭经验或根据确定这种变化的公式来确定(参见，例如，Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上)。根据目标核酸的碱基组成、来源和浓度，可以使用其它严格条件，包括，例如，低严格条件(例如，在37-45℃下、在4-6xSSC/0.1-0.5％w/vSDS中，进行2-3小时)或中等严格条件(例如，在45℃下、在1-4xSSC/0.25-0.5％w/v SDS中，进行2-3小时)。

一般来说，在杂交的特异性(严格性)和信号强度之间要进行权衡。在某些实施方案中，可以以依次较高严格性的溶液清洗杂交的样本，并在每次清洗之间读数。这样产生的数据组的分析揭示了清洗严格性，高于该严格性时杂交模式没有明显改变，并且该严格性提供了特定目标探针的足够的信号。

用于杂交和检测的条件的某些差异可能是由于所用的可检测标记的不同。例如，当使用生物素标记的探针时，杂交溶液中省略Denhardt溶液的组分——聚乙烯吡咯烷酮。作为另一个简单的例子，当用荧光标记标记探针时，探针一般避免亮光。这些差异和其它差异是本领域的技术人员在根据本发明使用各种可连接到探针上的可检测标记时已知的。

一旦探针已经与其互补序列退火，且根据需要洗去任何未结合的探针，可以根据探针上可检测标记的类型使用任何合适的方法，通过检测包含标记探针的杂交络合物的存在，来检测目标染色体。如上文第一部分所指出的，标记可以是直接的或间接的。典型的直接标记包括荧光团，诸如，如荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红素、酞菁染料(例如，Cy3或Cy5)、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568或Alexa 594。间接过程利用结合配偶体的相互作用进行检测。在这些变化方案中，探针一般用对二级试剂具有亲和力的分子标记。例如，生物素和半抗原，例如，洋地黄毒苷(DIG)、DNP或荧光素，是可以通过与作为二级试剂的链霉抗生物素(在生物素的情况下)或抗体的相互作用而检测的典型标记。在探针与目标结合后，可以通过使用例如直接标记的链霉抗生物素或抗体来检测目标-探针复合物。可选择地，未标记的二级试剂可以与直接标记的“三级”试剂一起使用，所述直接标记的“三级”试剂特异性地结合二级试剂(例如，可以使用未标记的抗DIG抗体，它可以用标记的对于第一抗体的种类和类别特异性的第二抗体检测)。二级试剂的标记典型地是非同位素标记，虽然也可以使用放射性同位素标记。典型的非同位素标记包括，例如，酶和荧光团，它们可以偶联到二级或三级试剂上。常用于DNA诊断的酶包括，例如，辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

可以使用任何适于特定标记的方法完成探针标记的检测。例如，可以使用任何本领域已知的用于检测所用的特定荧光团的发射波长的适当方法检测荧光团标记。用于检测荧光信号的典型方法包括，例如，荧光光谱分析法、表面荧光显微镜术(epifluorescence microscopy)、共聚焦显微镜术和流式细胞仪分析。检测低水平目标一般优选荧光标记，因为它们提供具有低背景的非常强的信号。此外，通过快速扫描程序，它是光学可检测的，具有高分辨率和灵敏性，并且，具有不同荧光发射波长的荧光团(例如，荧光素和罗丹明)的不同的杂交探针可用于单个样本。

此外，使用酶标记，检测可以如下进行，例如，通过颜色或染料沉积(例如，用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯或5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/氮蓝四唑，和用于辣根过氧化物酶的3，3′-二氨基联苯胺-NiCI₂)、荧光(例如，用于碱性磷酸酶的4-甲基伞花基磷酸酯(4-methyl umbelliferylphosphate))或化学发光(例如，来自Lumigen Inc.，Detroit Mich的碱性磷酸酶二氧杂环丁烷底物LumiPhos 530，或Tropix，Inc.的AMPPD和CSPD)。可以用X射线或Polaroid膜，或通过使用单光子计数光度计，进行化学发光检测。这是典型的碱性磷酸酶标记探针的检测形式。

在本方法的某些实施方案中，使用两个或多个探针的群体。探针群体在染色体特异性核酸序列方面可以是同质的。可选择地，探针群体可以包含两种或多种具有不同的染色体特异性序列的探针。在某些实施方案中，使用一大群不同的探针。在使用两种或多种不同的探针(即，具有不同的染色体特异性序列的探针)的典型的实施方案中，不同的探针具有不同的可检测标记。通过使用不同的用可区分的标记如光谱可区分的荧光团标记的探针，可以同时向染色体制品应用探针组合，以检查是否存在两种或多种特定的染色体。可以使用为区别可检测标记进行调整的标准探测和清洗条件。

在利用荧光探针的荧光原位杂交(FISH)程序的特定情况下，可以利用各种不同的光学分析检测杂交复合体。以下文献讨论了光谱检测方法，例如，美国专利5,719,024；Schroeck等人(Science 273：494-497，1996)；及Speicher等人(Nature Genetics 12：368-375，1996)。进一步的关于通用FISH程序的指导例如在Gall和Pardue(Methods in Enzymology21：470-480，1981)；Henderson(International Review of Cytology 76：1-46，1982)；及Angerer等人的Genetic Engineering：Principles and Methods(Setlow和Hollaender编，Plenum Press，New York，1985)中描述。

在某些实施方案中，在不存在数字增强或整合的情况下进行探针的检测。可选择地，使用数字增强或整合检测信号。

例如，在本方法的某些变化形式中，标记的检测包括应用使用安装在显微镜(例如，双目、单目或立体显微镜)目镜管上的CCD照相机的显微成像。在某些实施方案中，使用图像扫描显微镜术实现标记的检测。例如，计算机化图像扫描显微镜术的最新进展明显提高了使用荧光显微镜术检测稀有细胞的能力，允许在～6x10⁵个阴性细胞的环境中检测出1个阳性细胞(参见，例如，Mehes等人，Cytometry 42：357-362，2000)。已经开发了先进的图像扫描软件，其不仅可以检测多种颜色，而且可以检测融合的或共局部化的信号，可用于例如在DNA水平上检测易位(MetaSysterns Group，Inc.)。扫描速度通常取决于用于单阳性细胞的可靠检测的参数的数量。图像扫描还允许人工检查评分为阳性的细胞的图像以进行确认。已经开发了用于基于玻片的自动化分析的先进的图像扫描软件，其不仅可以检测检测多种颜色，而且可以检测融合的或共局部化的信号，可用于例如在DNA水平上检测易位(Meta Systerns Group，Inc.)。扫描速度通常取决于用于单阳性细胞的可靠检测的参数的数量。基于玻片的自动化扫描系统特别适合高通量测定。

在一种包括使用扫描玻片显微镜的示例性的实施方案中，使用MetaCyte自动生物成像系统(MetaCyte Automated Bio-Imaging System)(Meta System Group，Inc.)。该系统由下列部分组成：1)Carl Zeiss AxioPlan 2 MOT荧光显微镜，2)扫描8位置平台，3)计算机奔腾III处理器，4)Jai照相机，5)照相机接口，6)平台控制，7)轨迹球和鼠标，和8)打印机。焦点分析开始于装载于显微镜上的玻片装置。随平台移动扫描玻片，并捕获图像。整个玻片扫描之后，创建图库(gallery)。基于对于阳性或阴性的标准设置，图像分析导致阳性或阴性信号。如果为阴性，重新扫描玻片进行偶发事件的分析。如果为阳性，对适当的荧光信号更换滤色镜，并捕捉和分析5-7个平面。对于8玻片，可以离开/整夜操作(标准的或具有任选的托盘转换器的100个玻片)。自适应检测算法和自动曝光控制功能补偿不均匀的染色条件。可以同时检测几种标记物。标准光源覆盖从紫外到红外的广泛的光谱。如果细胞的荧光强度允许以1/1000秒的速度检测，高达每秒1000个细胞的扫描速度可用于检测罕见的细胞。对于强信号，较低的放大倍数可以用于提高扫描速度。

VII.用于探针制备、检测试验或引物延伸的试剂盒

在另一方面，提供了用于制备本发明的探针的试剂盒。通常情况下，为了便于使用，将试剂盒分区，并且试剂盒包含至少一个提供包含本文所述的染色体特异性序列的寡核苷酸的第一容器。

在提供染色体特异性寡核苷酸的试剂盒的某些实施方案中，第一容器提供包含本文所述的染色体特异性序列和富含G的核酸序列的寡核苷酸，且试剂盒进一步包括提供铂络合物的第二容器，其中，铂络合物包括(a)第一离去基团，特征在于能够被G核苷酸取代；并任选地包括(b)选自以下的基团：

(i)可检测标记，

(ii)连接到可检测标记上的连接体，

(iii)能够连接到可检测标记上的连接体；和

(iv)第二离去基团，其特征在于能够被上述(i)、(ii)和(iii)中的至少一种取代。

在其中铂络合物包括能够连接到可检测标记上的连接体的某些变化方案中，试剂盒还包括提供可检测标记的第三容器。在其中铂络合物包括第二离去基团的其它变化方案中，试剂盒还包括提供可检测标记、连接到可检测标记上的连接体或能够连接到可检测标记上的连接体的第三容器。

在另外的一方面，提供了利用本发明的标记探针检测样品中的特定人类染色体的试剂盒。通常情况下，为了便于使用，将试剂盒分区，且试剂盒包含至少一个提供包含本文所述的标记探针的第一容器。在某些实施方案中，试剂盒提供了多种不同的标记探针，它们混合在同一容器中，从而提供探针混合组合物，或者在不同的容器中，其可以用于例如提供探针混合组合物。在提供多种不同的标记探针的实施方案中，每种不同的标记探针通常具有不同的染色体特异性序列和可与其它可检测标记中的每一种区分的不同的可检测标记。例如，每种可检测标记可以是具有光谱可区别的发射波长的荧光团。用于试剂盒的这些变化形式的合适的荧光团包括，例如，Alexa 488(492nm处有最大激发，520nm处有最大发射)和Alexa 546(555nm处有最大激发，570nm处有最大发射)。

提供一种或多种用于检测标记探针的试剂的另外的容器也可以包括在提供标记探针的试剂盒中。这些另外的容器可以包含技术人员知道的、用于对应于探针上的标记类型的检测试验的任何试剂或其它元件。在一些变化方案中，例如，第一容器提供的探针包括间接标记(例如，生物素)，且试剂盒中还包括至少一个提供用于检测该间接标记的二级试剂的第二容器(例如，提供用荧光团标记的链霉抗生物素的容器)。

实施例

如前所述，本文所述的探针可用于需要或以其它方式适合于包含选择的可检测标记的探针的任何方法。提供下面的实施例来说明探针的一些具体应用和有关方法，但不是限制要求保护的发明。

实施例1：染色体特异性序列的选择

人类基因组中接近25％由重复序列组成(Miklos，MolecularEvolutionary Genetics Plenum Publishing Corp.：241-321，1985)。这些重复序列中的一些，如，Alu序列，在整个基因组中是高度代表的，而其它的重复序列，诸如α随体重复和端粒重复，分别局限于着丝粒和端粒。另外的重复DNA家族包括随体1、随体2、随体3和β-随体。该实施例描述了3种具体染色体-染色体2、4和Y染色体-特异性的探针的选择。

1.Y染色体的探针

人类Y染色体包含称为DYZ1的3.4Kb随体3重复(Nakagome等人，Cytogenet Cell Genet 56：74-7，1991)，DYZ1位于异染色质区组中的Yq12带，并以500至3000个拷贝存在。该随体3的DNA包含TTCCA五聚体，还包含对于Y染色体是高度特异性的短序列元件(参见，Fowler等人，Nucleic Acids Res 15：3929，1987)。在整个该重复序列中，大量的TTCCA随体3五聚体序列散布于各个不同长度的Y染色体特异性序列元件中(参见，Nakahori等人，Nucleic Acids Res 14：7569-80，1986；Weier等人，JHistochem Cytochem 38：421-6，1990；Nakagome等人，Cytogenet Cell Genet 56：74-7，1991)。随体3重复序列中存在这些离散的Y特异性序列允许产生特定的合成ODN杂交探针。

理想地，为了最佳杂交，合成的ODN Y-探针不能充分代表TTCCA五聚体，主要由包含大约50％的CG碱基的序列组成。设计针对随体3重复的30mer探针。为了确定与随体3重复五聚体(TTCCA)n具有低于84％的同源性的区域，使用可从NCBI网站获得的名称为b12seq的生物信息学工具进行比对(Tatusova等人，FEMS Microbiol Lett 174：247-50，1999)。为了排除所有与人类基因组的其它重复区域具有任何同源性的探针，使用可从NCBI网站公开获得的基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol 215：403-10，1990)，将同源性自由区域中可以获得的所有可能的30mer寡核苷酸与全基因组数据库(NCBI)进行比较。更具体地说，不使用过滤器，将序列与非冗余基因组数据库(nr)进行比较。表3描述了保留的6个探针。

表3.Y染色体特异性的寡核苷酸探针的核酸序列

SEQ ID NO：	序列	名称	GC含量
				1	5′-ccagtcgaatccattcgagtacatacc	Y1	48％
2	5′-ccttttgaatccattccattggagtcc	Y2	33％
				3	5′-attcattgcattccgtttcatgaaattcga	Y3	43％
4	5′-ctgcatacaatttcactccattcgttccca	Y4	47％
				5	5′-tccattggagtcaattcctttcgacaccca	Y5	47％
6	5′-ttgatcctattttattaaattgcattctat	Y6	58％

2.染色体4的探针

人类染色体4的近着丝粒区域的特征为完全由α随体DNA组成的3.2Kb串联重复DNA，该α随体DNA包含在不完全的、直接重复中排列的α随体单体(171bp)D1-D2的周期性二聚体。(参见，Waye等人，ProcNatl Acad Sci USA 86：6250-4，1989)。重复的3.2Kb序列在人类染色体4的着丝粒异染色质区出现数千次(Mashkova等人，Gene 140(2)，211-217，1994)。不完全的、直接重复可以方便地用于设计对于4种染色体α-随体重复是特异性的探针。为了避免我们的染色体4探针与其它染色体α-随体重复发生任何交叉杂交，使用与共有α-单体序列具有较低同源性的pYAM7-62克隆的序列设计探针。为了确定与α-单体具有低于84％同源性的区域，将共有α-单体序列与685bp染色体4着丝粒序列进行比对。使用可从NCBI网站获得的名称为b12seq的生物信息学工具进行比对(Tatusova等人，FEMS Microbiol Lett 174：247-50，1999)。然后，为了排除所有与人类基因组的其它重复区域具有任何同源性的探针，通过BLAST对非冗余数据库检测同源性自由区域中可获得的所有可能的30mer寡核苷酸。保留的4号染色体ODN探针在表4中描述。

表4.染色体4特异性的寡核苷酸探针的核酸序列

SEQ ID NO：	名称	序列
			14	4.3.2	TCTTTGTGTTGTGTGTACTCATGTAACAGT
15	4.6.2	TTTCTGCCCTACCTGGAAGCGGACATTTCG

16	4.7.5	GGTTATCTTCATATAAAATCCAGACAGGAG
			17	4.10.2	CGGCACTACCTGGAAGTGGATATTTCGAGC
18	4.18.7	TCTGCACTACCTGGAAGAGGCCATTTCGAG
			19	4.22.10	CCTACGGGGAGAAAGGAAATATCTTCAAAT

3.染色体2的探针

人类染色体2的近着丝粒区域的特征为完全由α随体DNA组成的1.05-2.9Kb串联重复DNA，该α随体DNA包含在不完全的、直接的重复中排列的α-随体单体(171bp)的三聚体、四聚体和五聚体。(Haaf和Willard，Genomics 13，122-128，1992)。重复的3.2Kb序列在人类染色体2的着丝粒异染色质区出现数千次(Rocchi等人，Genomics 8，705-709，1990)。不完全的、直接重复可以方便地用于设计对于染色体2的α-随体重复是特异性的探针。为了避免我们的染色体2探针与其它染色体α-随体重复发生任何交叉杂交，使用与共有α-单体序列具有较低同源性的pBS4D克隆的序列设计探针。为了确定与α-单体具有低于84％同源性的区域，将共有α-单体序列与685bp染色体4着丝粒序列进行比对。使用可从NCBI网站获得的名称为b12seq的生物信息学工具进行比对(Tatusova等人，FEMS Microbiol Lett 174：247-50，1999)。然后，为了排除所有与人类基因组的其它重复区域具有任何同源性的探针，通过BLAST对非冗余数据库检测同源性自由区域中可以获得的所有可能的30mer寡核苷酸。保留的染色体2的ODN探针在表5中描述。

表5.染色体2特异性的寡核苷酸探针的核酸序列

实施例2：直接标记的染色体特异性序列的表征

产生了含有用荧光团Alexa 546直接5′末端标记或G-尾标记的4种针对Y染色体(Y2、Y3、Y4和Y5)的ODN的2种探针混合物，并用作探针。表6中列出的数据证明这两种探针混合物之间没有显著差异。

表6.5′末端标记相对于G-尾标记的比较结果

	末端标记的	G-尾标记的
			信号/噪音(均值)	2.45	2.32
均值的标准误差(95％)	0.07	0.05

使用单独直接末端标记的或G-尾标记的探针进行另外的实验，以确定哪种标记方法具有更大的检测灵敏度。表7列出的数据表明末端标记探针产生更高的信噪比。

表7.比较末端标记探针与G-尾标记探针的检测灵敏度结果

	末端标记的	G-尾标记的
			DY549/KR547	3.7±0.06	2.8±0.05
DY590/KR590	2.5±0.07	1.8±0.07
			DY490/KR495	2.0±0.04	1.6±0.03

使用末端标记的寡核苷酸的一个优点是任何荧光团可用于末端标记。末端标记的寡核苷酸也可以在其5′末端用末端氨基标记，所述5′末端随后可以用任何荧光剂NHS-酯标记。对于G-尾标记，只可以使用适合ULS化学的荧光剂。

本文所述的寡核苷酸探针具有几个优点，包括用于原位杂交的明显缩短的杂交时间以及无需样品预处理步骤。明显缩短的杂交时间与探针的长度有关，即较短的探针可以迅速渗透到细胞内并与其目标杂交。目前可商购的针对相同重复序列的探针需要2-8小时的杂交时间，但本文所述的寡核苷酸探针在较短的孵育时间后显示较高的信噪比(例如，短至1分钟)。预处理步骤的省略导致信噪比只有很小的下降(约0.5)，证明本文所述的探针不需要这些处理。

实施例3：检测特定染色体的发夹探针

本实施例比较了包含图1所示的示例性发夹结构的发夹探针，它们在提供与可检测标记(例如，荧光团)相互作用的胺基的氨基修饰的dC和dT核苷酸的数目和位置方面不同。这些发夹结构每3个碱基、每6个碱基或更少的碱基包含1个氨基。一种发夹结构只在茎结构的1条链上包含氨基。包含不同的可检测标记的发夹探针可用于同时检测同一样品中的多个目标而无需杂交后检测。

用5′末端上的发夹结构D(图1)合成为Y染色体选择的4种ODN。用DY549-NHS酯(Dyomics，Jena，德国)标记该寡核苷酸。标记后，通过PAGE纯化探针，并纯化包含具有最大数量的染料分子的ODN的较高条带。标记的摩尔比表明，这些探针中每个寡核苷酸包含4种染料，并且合并在一起，并在来自染色体正常的男性的细胞遗传学涂片上杂交。如前所述计算信噪比，信噪比的均值为8.5±0.5，最大值为16.3。这些结果与末端标记的相同探针比较，表明信噪比随每个探针的染料数而增加，并且强调了用此标记获得的信号的高强度。

材料与方法

1.标记的发夹探针的合成

如上文实施例1所述选择染色体特异性寡核苷酸序列，并合成包含发夹序列的染色体特异性ODN探针。合成后，ODN探针与荧光团偶联的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯一起孵育，所述荧光团偶联的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯只与ODN的反应性胺基形成共价酰胺键，导致具有多个标记的ODN探针，其局限于非杂交茎-环结构。各种不同的荧光团-NHS酯制剂是可商购的，使得能够用不同的荧光团生产直接标记的ODN探针。合成后，可使用标准偶联化学将任何数量的不同的荧光团-琥珀酰亚胺酯与胺基连接，无需杂交后检测。

用荧光团Alexa 488标记ODN发夹探针构建体后，将它们在溶液中与偶联到微球体上的互补序列ODN(捕获探针)杂交，后者是通过使摩尔过量的互补ODN(在3′末端用一个生物素合成)与6微米链霉抗生物素包被的微球体(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)在室温下反应3小时而制备的。通过在2xSSC中清洗4次，接着以1500RPM离心5分钟回收微球体，除去未结合的ODN。等摩尔量的不同的标记反应物与捕获探针等份在37℃下、在40％甲酰胺/2xSSC中杂交2小时，接着在37℃下、在1xSSC和0.2xSSC中清洗，各15分钟。通过上述离心回收微球体。将具有结合的标记探针的微球体重悬浮于PBS中，并使用FACScan细胞仪(BD BioSciences，Inc.，Franklin Lakes，NJ)通过流式细胞术分析。通过前向和侧向散射特征确定微球体，并相应地门控。使用FL1通道检测门控区域内的Alexa 488荧光。对于结果，最大荧光强度(MFI)相对于标记反应作图。

2.原位杂交

通过在70％甲酰胺/2XSSC中72℃孵育2分钟，使细胞DNA变性。然后立即将玻片置于冷的70％乙醇中2分钟，并继续在80％、90％和100％乙醇中各脱水2分钟，接着风干。将探针溶液(5-10μl)置于每个斑点或涂迹(spread)上，并用Parafilm^TM盖玻片覆盖。在从15分钟到17小时(整夜)之间的几个时间点，在37℃进行杂交。探针溶液包含20-50％甲酰胺、2XSSC、10％硫酸葡聚糖以及0.02-0.1mM标记探针，及1μg超声处理的鲑精DNA。对于每种探针，根据经验确定最佳探针和甲酰胺的浓度。杂交后，在45℃下，在20-50％甲酰胺/2xSSC中清洗玻片3分钟3次，接着用2xSSC清洗2分钟5次，用含有去污剂的1x磷酸盐缓冲液(1xPBD：100mM Na₂HPO₄，6mM NaH₂PO₄，0.025％Nonidet P40，pH8)清洗一次。最后，玻片在室温下保持在1xPBD浴中。在封固并用含有DAPI 200ng/mL的苯二胺抗衰减(antifade)溶液进行DNA复染后，使用表面荧光显微镜术显现直接荧光标记的探针。

3.荧光显微镜术和图像获取

使用配备有冷却CCD照相机(Photometries Ltd.，Tucson，AZ)的Nikon Eclipse E600显微镜(Nikon Instruments，Melville，NY)进行荧光显微镜分析和数字图像获取。使用IP Lab Spectrum软件(Scanalytics，Inc.，Fairfax，VA)获取图像，并使用PhotoshopTM软件(Adobe Systems Inc.，SanJose，CA)合并最终图像。

利用流式细胞术精确测量荧光强度。在合成具有4种不同结构的相同的ODN，并在相同的条件下用Alexa488 NHS酯标记之后，AminoLoop^TM-ODN与通过孵育5′-生物素化的ODN与链霉抗生物素包被的微球体制备的结合到6μm微球上的互补序列ODN杂交。通过“材料和方法”中所描述的流式细胞术分析微球体/ODN复合物。用一种5′-荧光素合成的对照ODN作为荧光信号的对照。显示最高荧光强度的构建体用于所有进一步的ODN合成反应和标记。

4.计算分析特异性和灵敏性样本大小

根据ACMG的临床遗传学实验室的标准和指南(2003年11月)，通过分析来自5个染色体正常个体的200个分裂中期的细胞，评估FISH探针的分析特异性和分析灵敏性，在95％置信度产生≥98％的分析灵敏性和特异性值。这些指导方针是为常规的诊断FISH应用建立的，其中存在在可以分析的细胞数方面在统计学上较大的样本群体。随着近期对更加限制性的FISH应用的关注，如在PGD中，其中只有一个细胞可用于分析，我们建立了99％的分析灵敏性和特异性值，具有95％的置信度。

指定分析特异性和灵敏性的置信区间(p_低，1)，其中，我们的区间上限为100％的特异性和灵敏性(1)，下限(p_低)为99％，具有95％的置信区间(显著性α＝0.05)。

n = \frac{\ln (α)}{\ln (p_{low})}

n = \frac{\ln (0.05)}{\ln (0.99)} = 298.07

4.计算分析特异性和灵敏性

通过反向DAPI显带，接着通过FISH信号的物理定位，确定染色体。定位于正确的基因座的特征性双重信号(覆盖两个染色单体)的存在指示有效的信号。不正确的定位表明缺乏分析特异性。如下计算分析特异性：

分析灵敏性定义为目标基因座处具有正确的杂交信号数的样品中的细胞的百分比，计算如下：

分析了30个(统计分析所需要的最小数目)分裂间期的核的图像，以确定信噪比。使用IPLabSpectrum软件，通过将灰度定限以区分信号和细胞核，将在相同的条件下获得的FISH图像分成细胞信号和噪声区域。对于每个细胞，计算灰度平均值(测量的细胞像素灰度的总和除以细胞像素面积)。信号定义为包含大于细胞平均像素值的2S.D.的像素强度的区域。然后计算平均信号值，为测量的信号像素灰度总和除以信号像素面积。然后定义信噪比，为信号平均像素值除以背景平均像素值。

为了评估标记的发夹探针的表现，比较FISH结果与使用可商购的FISH探针获得的结果。为了定量评估标记的发夹探针的表现，测定分析特异性、分析灵敏性和信噪比，并与使用可商购的针对相同基因座的探针制剂获得的结果进行比较。根据美国医学遗传学学院(AmericanCollege of Medical Genetics)(ACMG)的指南和标准中所述的确定的标准，商品FISH探针必须显示大于或等于98％的分析特异性和灵敏性。

在使用20％、35％和50％的甲酰胺变性剂产生的三种不同的杂交严格条件下，通过对来自染色体正常男性的分裂中期染色体制品进行FISH，测试各个探针。注意到以前通过常规的核型分析证实了染色体常态。使用上述标准分析来自5人的各60个分裂中期染色体域；在每种严格条件下测量每个ODN探针的分析特异性、分析灵敏性和信号强度。选择产生针对目标区域的≥98％的分析特异性、≥98％的杂交效率和信/噪比＞商品探针的信/噪比的探针或探针混合物。

实施例4：G-尾标记的寡核苷酸探针在植入前遗传学诊断中的应用

A.引言

1.现有的PGD方法

当对卵裂球活检、固定并为FISH分析准备时，在IVF之后第3天进行PGD。只有一个细胞可以使用和在第4天胚胎必须置于患者中的要求代表了重大的限制条件(参见，Munne等人，Reprod Biomed Online7：91-7，2003)。对于倍性分析，通过FISH分析活检细胞，最少使用对于染色体X、Y、13、15、16、18、21和22特异性的探针。可以对固定的细胞进行最多3轮FISH，而不损害分析的可靠性，且目前只可使用用5种可见光谱内的荧光染料之一标记的探针。因此，为了分析8个染色体，目前进行两轮FISH。所有可商购的探针是包含某个染色体中的重复DNA序列的特定部分或对于定位于着丝粒附近的某个区域的特异性独特序列的大质粒或细菌人工染色体(BAC)基因组克隆。目前的探针需要杂交8至16小时。活检的分裂间期细胞核的斑点计数决定了胚胎的倍性，允许将胚胎分成以下五个类别之一(参见Munne等人，同上)：

1.正常，其中，检测到所有染色体的2个拷贝。

2.多倍体，其中，检测到所有染色体的3个或更多的拷贝。

3.单倍体，其中，检测到所有染色体的1个或更少的拷贝。

4.非整倍性，其中，检测到1个或2个具有异常拷贝数的染色体。

5.复杂的异常，其中，检测到3个或更多个具有异常拷贝数的染色体。

当然，只有分类为正常的胚胎被置于患者中。如前所述，PGD的可靠性完全依赖于对单细胞的FISH分析的准确性。检测灵敏性和探针特异性是成功的FISH的主要条件。(参见，Pinkel等人，Proc Natl Acad SciUSA 85：9138-42，1988)。为便于使用，优选直接荧光标记探针，因为它们不需要另外的步骤或试剂来显现靶序列。但是，它们不像半抗原如生物素或洋地黄毒苷标记的探针那样敏感。

2.在PGD中使用ODN探针的一般考虑

ODN探针的重要优势是其体积小和复杂性低，这是在探针制剂中包含的可能的序列组合数的量度。这些特性导致比需要6-16小时杂交的高复杂性探针更快的杂交动力学(～5分钟)。针对重复DNA消除了一些灵敏性问题，特别是如果重复序列单位以几千份拷贝存在时，如人类Y染色体的随体3区域(参见，Nakagome等人，Cytogenet Cell Genet 56：74-7，1991)或基因座DXZ1处的着丝粒α-随体重复(参见，Waye等人，ProcNatl Acad Sci USA 86：6250-4，1989)。

3.目前的ODN标记策略

目前可以使用多种合成方法和酶方法非放射性地标记ODN探针。这些方法包括：标记ODN的一端或两端，标记ODN内部的核苷酸，向一端酶促添加多个标记(加尾)，或者掺入分支的标记结构(参见，Brakel，End Labeled Nucleotide Probe，1992；van Gijlswijk等人，J HistochemCytochem 45：375-82，1997；Luehrsen等人，J Histochem Cytochem48：133-45，2000)。虽然多达30种标记可以通过这些方法掺入，但检测灵敏性是不同的，而不是仅仅依赖于掺入的标记数。在合成过程中标记能产生在标记的两端或任一端具有标记或在探针序列内部具有标记的探针。可以向ODN添加内部标记，但此方法已被证明降低了探针/目标复合物的稳定性，因此不是理想的方法(参见，Brakel，同上)。虽然酶加尾在分子探针上添加更多的标记，但是尾的长度随实验变化，导致不一致的结果。

一种最近由Kreatech(阿姆斯特丹，荷兰)开发的用于标记脱氧核苷酸的方法包括使用铂络合物试剂标记探针(参见van Belkum等人，Biotechniques 16：148-53，1994；Wiegant等人，Cytogenet Cell Genet87：47-52，1999；Heetebrij等人，Chembiochem 4：573-83，2003)。这种被称为“ULS”的技术与多种报道分子匹配，并且与铂配位试剂一起被广泛地分许可。虽然ULS已被用于标记合成寡核苷酸FISH探针，但由于较差的标记效率和标记只能连接到ODN内部序列上的缺陷，这种方法没有广泛使用。

在目前的研究中，使用具有染色体特异性重复序列的30个核苷酸和28mer G-尾的ODN靶向重复序列。检测了所有人类着丝粒，证实可获得充分的杂交信号，以显现人类基因组中的高度重复的DNA序列。以前曾经设计了6个Y染色体G-尾ODN探针，并与正常的人类分裂中期染色体杂交。对于ODN的设计，只考虑不存在典型的随体3五聚体TTCCA和探针中的GC％。按照这些标准，设计并测试了6个含有28merG-尾的Y特异性探针。虽然2个探针对于Y异染色质不是特异性的，但4个探针是特异性的。G-尾标记的ODN探针的信号比背景高2倍。可公开获得的生物信息学工具也支持，这些结果强调了最佳探针设计的重要性。

4.ODN的G-尾ULS标记

在本研究中，使用ODN探针的ULS标记的新方法。通过ULS标记具有富含G的长尾的合成ODN产生了针对定位于人类X和Y染色体上的特定重复基序的标记探针。通过在我们的探针设计中加入富含G的长5′尾，可以作为用于ULS标记的铂受体分子的鸟嘌呤核苷酸数明显增加了。已报道ULS系统的效率为每10个可用的鸟嘌呤核苷酸加入1个标记(参见，Wiegant等人，Cytogenet Cell Genet 87：47-52，1999；vanGijlswijk等人，Expert Rev Mol Diagn 1：81-91，2001；van deRijke等人，Anal Biochem 321：71-8，2003)。通过构建包含超过20个鸟嘌呤作为尾部分的G-尾ODN探针，在统计学上，探针中可以包含最多2个标记。内部的随机鸟嘌呤可以作为用于ULS的受体核苷酸，而尾部G含量比典型的探针序列中发现的数量高3倍。

ULS G-尾标记的ODN探针比目前的商品探针具有明显的优势。例如，相比需要至少9天才能产生成品的常规BAC探针，ODN探针可以在2天内合成、纯化、标记。此外，据估计，ULS G-尾标记的ODN探针的生产成本，包括许可费用，比常规探针的成本低35-50％。

B.材料与方法

1.重复序列特异性的ODN探针

如以上实施例1所述选择染色体特异性探针，并合成为包括由(gggh)重复的8个拷贝组成的28个碱基的G-尾，其中，h表示A、C或T核苷酸。G-尾寡核苷酸的设计如下所示：

5’-ggghggghggghggghggghggghggghgggh(特异性序列)-3′(H＝A、C或T)。

为了提高我们的探针的信号强度，确定G-尾的最佳长度。合成最灵敏和最特异性的探针，其包含分别含有30和39个G的40mer或52mer的G-尾。这些较长的尾允许在ODN探针中掺入另外的荧光标记。也合成在两端具有G-尾的28mer的探针。也可以合成在两端具有较长尾的ODN探针。

2.G尾寡核苷酸探针标记

根据制造者的说明书，使用通用标记系统(ULS，Kreatech)标记G-尾探针。为了最大化G-尾ODN的标记，对标记试剂与ODN探针质量的不同比例进行评价。如制造商的方案所述，标准的标记条件是1单位的ULS试剂标记1μg核酸(参见，van Gijlswijk等人，Expert Rev MolDiagn 1：81-91，2001)。评估每μg ODN的0.5、1和3单位的标记试剂，并使用FISH分析确定最佳标记。

3.常规探针

为了评估G-尾标记的探针的表现，比较FISH结果与使用可商购的FISH探针(Vysis/Abbott)获得的结果。

4.细胞遗传学玻片

通过采集5个染色体正常的男性的外周血组织获得人类染色体玻片。在37℃和5％的CO₂下，在10mL RPMI1640、2mM L-谷氨酰胺、FBS 10％、250μL PHA中，培养0.5至1毫升来自每个个体的外周血/25毫升培养瓶。培养72小时后，通过每毫升培养物加入6μL秋水仙酰胺(Karyomax，Invitrogen)，使这些细胞的有丝分裂受阻。在37℃下经过20分钟后，以1750rpm离心培养物10分钟，丢弃上清液，小心加入10mL低渗溶液、75mM KCl。在37℃孵育20分钟后，为了进行细胞的预固定和促进进一步固定而避免细胞结块，向管中加入数滴卡诺固定剂(Carnoy′s fixative)(甲醇∶乙酸3∶1)。离心后，将细胞重悬浮于卡诺固定剂中。重复固定步骤3次，直至沉淀物明显为白色。在最后的固定过程中，评估玻片制备所需的正确的固定剂用量。每个玻片使用一滴或两滴细胞悬浮液，在SuperFrost玻片上，在～22℃和～50％湿度下进行涂片。玻片在37℃保持过夜，然后在-20℃、具有干燥剂的密封箱中储存，直到进行FISH。

5.原位杂交

通过在72℃、在70％甲酰胺/2XSSC中孵育2分钟，使细胞DNA变性。然后将玻片立即置于冷的70％乙醇中2分钟，并继续在80％、90％和100％乙醇中各脱水2分钟，接着风干。将10μl探针溶液置于每个斑点或涂迹上，并用Parafilm^TM盖玻片覆盖。在从15分钟到17小时(整夜)之间的几个时间点，在37℃进行杂交。探针溶液包含20-50％甲酰胺、2XSSC、10％硫酸葡聚糖以及0.02-0.1mM标记探针，及1μg的超声处理的鲑精DNA。对于每种探针，根据经验测定最佳探针和甲酰胺的浓度。杂交后，在45℃下，在20-50％甲酰胺/2xSSC中清洗玻片3分钟3次，接着用2xSSC清洗2分钟5次，用含有去污剂的1x磷酸盐缓冲液(1xPBD：100mM Na₂HPO₄，6mM NaH₂PO₄，0.025％Nonidet P40，pH 8)清洗一次。最后，玻片在室温下保持在1xPBD浴中。在封固并用含有DAPI 200ng/mL的苯二胺防衰减溶液进行DNA复染后，使用表面荧光显微镜术显现探针。

6.荧光显微镜术和图像获取

7.G-尾标记探针对来自人类胚胎的细胞的应用

根据以上材料和方法部分所述，对人类胚胎使用G-尾标记的探针。对于可以使用G-尾标记的ODN探针靶向的至少另外6个人类染色体(染色体Y)，确定染色体特异性DNA重复基序。这些探针的应用在用于PGD的多色杂交研究中得到验证。

实施例5：多色探针混合物的制备

通过混合等量的染色体2、4和Y染色体ODN探针混合物，制备多色探针试剂盒。根据如上述的杂交试验所确定的各种染色体2、4和Y染色体探针的相对特异性，以及每种混合物的ODN探针的最佳数量，选择在多色探针试剂盒中包含的染色体2、4和Y染色体探针混合物。用不同的荧光团标记每种不同的探针。例如，用Alexa 488(492nm处有最大激发，520nm处有最大发射)标记染色体2ODN探针；用Alexa546(555nm处有最大激发，570nm处有最大发射)标记染色体4ODN探针；以及用Alexa 594(588nm处有最大激发，615nm处有最大发射)标记Y染色体ODN探针。

使用多色染色体2、4和Y染色体探针混合物，通过在1分钟到2小时的不同时间使多色混合物与5个染色体正常样本杂交，测定最短杂交时间。对于这些研究，计算每个个人的30个分裂间期细胞核的信号强度和测试的杂交时间。最佳杂交时间是导致信/噪比≥商业探针的最短时间。

实施例6：G-尾标记的寡核苷酸探针在检测细胞核仁中的前体核糖体 RNA中的应用

合成与新生rRNA的区域互补的寡核苷酸，使之包含G-尾，然后使用Alexa 568或Alexa 488试剂标记ULS。使用Alexa 568标记的探针和Alexa 488标记的探针进行原位杂交都导致新生核糖体RNA的特异性检测。杂交信号限于核仁。信号模式与非G-尾标记的对照ODN探针无法区分。

实施例7：G-尾标记的寡核苷酸探针在mRNA检测中的应用

使用60个G-尾ODN探针(通过ULS方法用生物素标记)检测SUPT-1细胞中的Ki-67mRNA。可靠地检测到Ki-67mRNA，即使在没有完全优化的原位杂交实验中。

通过ULS方法，用生物素标记60个Ki-67mRNA特异性的G-尾ODN探针。用含有皂苷的多聚甲醛固定SUPT-1细胞，并与G-尾生物素标记的ODN探针杂交16小时，其中只使用标记的ODN探针或向标记探针中添加100倍过量的非标记探针。杂交后，使用来自MolecularProbes(Eugene，OR)TSA试剂盒的AlexaFluor 546酪胺酰胺和其它试剂进行酪胺酰胺信号放大。可靠地检测到Ki-67mRNA，即使在没有完全优化的原位杂交实验中。在IPLab(Fairfax，VA)成像软件的帮助下计算通过CCD照相机测量的单细胞荧光。A和B中的细胞平均值分别是1014和314。因此，该测量的信/噪比是1014/314＝3.22。

实施例8：使用5′末端标记的寡核苷酸探针检测膀胱癌

按照Meiers等人在2007年描述的尿道上皮细胞玻片制备技术，可以使用寡聚FISH探针对这些细胞在记录时间内进行FISH来检测非整倍性(Meiers等人，″Improved filter method for urine sediment detection ofurothelial carcinoma by fluorescence in situ hybridization，″Arch PatholLabMed.131(10)：1574-7(2007))。使用寡核苷酸而不是在质粒或BAC中克隆的基因组DNA探针允许在仅2小时内检测尿道上皮癌。

1.玻片制备

用乙醇保存尿液样本，并吸入具有Luer lock尖端的60mL注射器中。将安装在13mm过滤器固定器中的8μ过滤器(Millipore，Billerica，MA)连接到注射器尖端。然后轻轻地推送尿液样本通过过滤器直至过滤器饱和。然后将膜放置在带正电的玻璃玻片上，并用Kimwipe轻推，以将上皮细胞转移到玻璃表面上。玻片立即用新鲜制备的3∶1的甲醇∶乙酸固定5分钟。风干玻片，并在65℃老化15分钟。

2.载玻片预处理

为了改善探针对细胞DNA的接近性，在RNAse溶液中处理玻片30分钟，随后在蛋白酶中处理15分钟。最后，在1％的甲醛中固定玻片10分钟。

3.细胞DNA变性

在应用探针之前，通过在72℃、在70％甲酰胺、2xSSC中孵育玻片5分钟使细胞DNA变性。然后，在冷乙醇中使这些玻片脱水。

4.寡聚FISH探针杂交

在载玻片上应用用于检测染色体3、7、9和17的寡聚FISH探针的组合，并在37℃孵育5分钟。然后在室温下在2xSSC中收集载玻片，直至容易地从载玻片上分离盖玻片。搅拌下，在50℃下，在0.2xSSC和0.1％SDS浴中清洗玻片2分钟。室温下，在0.2xSSC浴中再次收集载玻片，并用含有DAPI作为复染剂的抗衰减溶液封固。

5.载玻片分析和解释

在配备有对应于探针氟荧光剂的滤光片的表面荧光显微镜下观察玻片。非整倍性细胞定义为对于特定染色体显示不同于2的信号数的细胞。如果观察到最少4个具有同样的非整倍性的细胞，则考虑该样本为尿道上皮癌阳性。

可以理解，本文所述的实施例和实施方案只是示例性的，根据它们的各种修改或改变是本领域的技术人员清楚的，并且包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、GenBank登记号、专利和专利申请都为了所有目的在此完整引入作为参考。

序列表

<110>Cellay，LLC

Aurich-Costa，Joan

Bradley，Sean P.

Moen，Phillip T.

<120>高度可见的染色体特异性探针及相关方法

<130>019168-000910PC

<150>US 60/962,258

<151>2007-07-26

<160>19

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

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<223>合成的Y1

<400>1

ccagtcgaat ccat tegagt acatacc 27

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ccttttgaat ccattccatt ggagtcc 27

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attcattgca ttccgtttea tgaaattcga 30

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ctgcatacaa tttcactcca ttcgttccca 30

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ttgatcctat tttattaaat tgcattctat 30

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gtgcgccctc aactaacagt gttgaagctt 30

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gaaacgggat tgtcttcata taaactctag 30

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gtatcttcca ataaaagcta gatagaagca 30

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<213>人工的

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<223>合成的2.6.1

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atgtcagaaa ctttttcatg atgtatctac 30

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<223>合成的2.7.3

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tatgtgtgat gtgcgccctc aactaagagt 30

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<212>DNA

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tctcagaagc ttcattggga tgtttcaatt 30

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<223>合成的2.10.1

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ggaatacggt gataaaggaa atatcttcca 30

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<223>合成的4.3.2

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tctttgtgtt gtgtgtactc atgtaacagt 30

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tttctgccct acctggaagc ggacatttcg 30

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<223>合成的4.7.5

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ggttatcttc atataaaatc cagacaggag 30

<210>17

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<213>人工的

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<223>合成的4.10.2

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cggcactacc tggaagtgga tatttcgagc 30

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<223>合成的4.18.7

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tctgcactac ctggaagagg ccatttcgag 30

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<223>合成的4.22.10

<400>19

cctacgggga gaaaggaaat atcttcaaat 30

Claims

1.合成寡核苷酸，包括：

由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，其中，所述染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述重复序列选自着丝粒重复序列、近着丝粒重复序列、异染色质重复序列和端粒重复序列。

3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述共有重复序列选自α随体、β随体、γ随体、随体1、随体2和随体3重复序列。

4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述染色体特异性序列与人类基因组内的所有其它连续核酸序列不到84％相同。

5.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述染色体特异性序列对于选自Y染色体、染色体2和染色体4的染色体的α单体重复序列是特异性的。

6.如权利要求5所述的寡核苷酸，其中，所述染色体特异性序列选自：

CCAGTCGAATCCATTCGAGTACATACC(SEQ ID NO：1)；

CCTTTTGAATCCATTCCATTGGAGTCC(SEQ ID NO：2)；

ATTCATTGCATTCCGTTTCATGAAATTCGA(SEQ ID NO：3)；

CTGCATACAATTTCACTCCATTCGTTCCCA(SEQ ID NO：4)；

TCCATTGGAGTCAATTCCTTTCGACACCCA(SEQ ID NO：5)；

TTGATCCTATTTTATTAAATTGCATTCTAT(SEQ ID NO：6)；

GTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTGAAGCTT(SEQ ID NO：7)；

GAAACGGGATTGTCTTCATATAAACTCTAG(SEQ ID NO：8)；

GTATCTTCCAATAAAAGCTAGATAGAAGCA(SEQ ID NO：9)；

ATGTCAGAAACTTTTTCATGATGTATCTAC(SEQ ID NO：10)；

TATGTGTGATGTGCGCCCTCAACTAAGAGT(SEQ ID NO：11)；

TCTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTCAATT(SEQ ID NO：12)；

GGAATACGGTGATAAAGGAAATATCTTCCA(SEQ ID NO：13)；

TCTTTGTGTTGTGTGTACTCATGTAACAGT(SEQ ID NO：14)；

TTTCTGCCCTACCTGGAAGCGGACATTTCG(SEQ ID NO：15)；

GGTTATCTTCATATAAAATCCAGACAGGAG(SEQ ID NO：16)；

CGGCACTACCTGGAAGTGGATATTTCGAGC(SEQ ID NO：17)；

TCTGCACTACCTGGAAGAGGCCATTTCGAG(SEQ ID NO：18)；和

CCTACGGGGAGAAAGGAAAATTCTTCAAAT(SEQ ID NO：19)

7.如权利要求1所述的寡核苷酸，进一步包括可检测标记。

8.如权利要求7所述的寡核苷酸，其中，所述可检测标记包括荧光团。

9.如权利要求7所述的寡核苷酸，其中，所述荧光团选自荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568和Alexa 594。

10.如权利要求1所述的寡核苷酸，进一步包括形成包括茎区和环区的发夹结构的寡核苷酸，其中，所述发夹结构中的多个核苷酸具有连接的可检测标记。

11.如权利要求10所述的寡核苷酸，其中，所述茎区具有16-40个核苷酸。

12.如权利要求10所述的寡核苷酸，其中，至少2个具有连接的可检测标记的核苷酸是相邻的。

13.如权利要求10所述的寡核苷酸，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔至少2个核苷酸。

14.如权利要求10所述的寡核苷酸，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔3个核苷酸。

15.一种包含多个如权利要求7所述的寡核苷酸的组合物。

16.如权利要求15所述的组合物，其中，每个寡核苷酸的可检测标记是具有光谱可区别的发射波长的荧光团。

17.标记探针，包括：

由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，其中，所述染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同；和

可检测标记。

18.如权利要求17所述的探针，其中，所述可检测标记是直接标记。

19.如权利要求18所述的探针，其中，所述直接标记包括荧光团。

20.如权利要求19所述的探针，其中，所述荧光团选自荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa568和Alexa 594。

21.如权利要求17所述的探针，其中，所述标记是间接标记。

22.如权利要求21所述的探针，其中，所述间接标记包括荧光团。

23.如权利要求22所述的探针，其中，所述荧光团选自荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa568和Alexa 594。

24.如权利要求17所述的探针，进一步包括形成包括茎区和环区的发夹结构的寡核苷酸，其中，所述发夹结构中的多个核苷酸具有连接的可检测标记。

25.如权利要求24所述的探针，其中，所述茎区具有16-40个核苷酸。

26.如权利要求24所述的探针，其中，至少2个具有连接的可检测标记的核苷酸是相邻的。

27.如权利要求24所述的探针，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔至少2个核苷酸。

28.如权利要求24所述的探针，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔3个核苷酸。

29.一种探针混合组合物，包括：

多种不同的标记探针，每种不同的标记探针包含由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，其中，所述染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同，且具有

(a)不同的染色体特异性寡核苷酸；和

(b)可与每种其它可检测标记区别的不同的可检测标记。

30.如权利要求29所述的组合物，其中，每种可检测标记是具有光谱可区别的发射波长的荧光团。

31.如权利要求29所述的组合物，其中，每个探针进一步包括形成包括茎区和环区的发夹结构的寡核苷酸，其中，所述发夹结构中的多个核苷酸具有连接的可检测标记。

32.一种确定染色体特异性探针序列的方法，所述方法包括：

(a)比较特定人类染色体的重复序列与所有人类染色体的共有重复序列；和

(b)将由特定人类染色体的重复序列内的25-35个连续核苷酸组成并且与共有重复序列具有低于84％的同一性的核酸序列确定为潜在的染色体特异性探针序列。

33.如权利要求32所述的方法，进一步包括

(d)将与人类基因组中的所有其它连续核苷酸序列具有超过16％的错配的核酸序列确定为潜在的染色体特异性探针序列。

34.如权利要求33所述的方法，进一步包括

(e)化学合成并用可检测标记标记染色体特异性探针序列；

(f)使用(e)的标记探针序列，在人的分裂中期或分裂间期进行原位杂交；

(g)检测与标记相关的信号，其中，选择杂交时产生至少2倍于背景的信号的染色体特异性探针序列作为染色体特异性探针。

35.如权利要求32所述的方法，其中，所述重复序列选自着丝粒重复序列、近着丝粒重复序列、异染色质重复序列和端粒重复序列。

36.如权利要求32所述的方法，其中，所述重复序列选自α随体、β随体、γ随体、随体1、随体2和随体3重复序列。

37.如权利要求32所述的方法，其中，所述共有重复序列选自着丝粒重复序列、近着丝粒重复序列、异染色质重复序列和端粒重复序列。

38.如权利要求32所述的方法，其中，所述共有重复序列选自α随体、β随体、γ随体、随体1、随体2和随体3重复序列。

39.如权利要求32所述的方法，其中，所述特定人类染色体选自Y染色体、染色体2和染色体4。

40.一种检测特定人类染色体的方法，所述方法包括：

(a)将人类染色体制品与标记的寡核苷酸接触，该标记的寡核苷酸包含由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，其中，所述染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同；

(b)在足以允许寡核苷酸与可能存在的具有与探针的染色体特异性序列完全互补的重复序列的特定人类染色体杂交的条件下，孵育所述染色体制品和寡核苷酸；和

(c)检测所述标记以检测可能存在的特定人类染色体。

41.如权利要求40所述的方法，其中，所述标记包括荧光团。

42.如权利要求41所述的方法，其中，所述荧光团选自荧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa568和Alexa 594。

43.如权利要求40所述的方法，其中，所述标记连接到形成包括茎区和环区的发夹结构的寡核苷酸的发夹部分上。

44.如权利要求43所述的方法，其中，所述发夹结构中的多个核苷酸具有连接的标记。

45.如权利要求43所述的方法，其中，所述茎区具有16-40个核苷酸。

46.如权利要求43所述的方法，其中，至少2个具有连接的标记的核苷酸是相邻的。

47.如权利要求43所述的方法，其中，所述具有连接的标记的核苷酸间隔至少2个核苷酸。

48.如权利要求43所述的方法，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔3个核苷酸。

49.如权利要求40所述的方法，其中，所述人类染色体的检测确定染色体异常。

50.如权利要求40所述的方法，其中，所述染色体制品包含人类细胞，且杂交步骤在细胞内的染色体上原位进行。

51.一种检测特定人类染色体的方法，所述方法包括：

(a)将人类染色体制品与包含多个不同的标记寡核苷酸的探针混合组合物接触，所述标记寡核苷酸具有由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，其中，所述染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同，其中，每种不同的寡核苷酸具有不同的染色体特异性序列和不同的可与每种其它可检测标记区别的可检测标记；

(b)在足以允许寡核苷酸与可能存在的具有与寡核苷酸的染色体特异性序列完全互补的重复序列的特定人类染色体杂交的条件下，孵育染色体制品和探针混合组合物；和

(c)检测所述标记以检测可能存在的特定人类染色体。

52.一种选择染色体特异性探针序列的方法，所述方法包括：

(a)比较特定人类染色体的着丝粒重复序列与所有人类染色体的着丝粒重复序列的共有α-单体重复序列；和

(b)确定由特定着丝粒重复序列中的25-35个连续核苷酸组成且与共有α-单体重复序列有低于84％的同一性的核酸序列，从而选择染色体特异性探针序列。

53.如权利要求52所述的方法，进一步包括制备包含染色体特异性核酸序列的寡核苷酸探针，所述序列由(b)中选择的染色体特异性序列组成。

54.如权利要求52所述的方法，包括在(b)中确定多种核酸序列，从而选择多种染色体特异性探针序列。

55.如权利要求54所述的方法，进一步包括

制备多种标记的寡核苷酸探针，每种探针包含可检测标记和不同的染色体特异性核酸序列，每种不同的序列是(b)中选择的染色体特异性序列之一；

在人类的分裂中期或人类的分裂间期，单独地用每种不同的寡核苷酸探针进行原位杂交；

检测与每种杂交探针的标记相关的信号；和

根据检测信号的程度，选择一种或多种寡核苷酸探针。

56.如权利要求54所述的方法，进一步包括

(c)比较在(b)中确定的核酸序列与人类基因组中的所有其它连续核苷酸序列；和

(d)舍弃与人类基因组中的另一种连续核苷酸序列具有超过84％的同一性的任何核酸序列。

57.如权利要求33所述的方法，包括在(b)和(d)中确定多种核酸序列，从而确定多种潜在的染色体特异性探针序列。

58.如权利要求57所述的方法，进一步包括

制备多种标记的寡核苷酸探针，每种探针包含可检测标记和不同的染色体特异性核酸序列，每种不同的序列是(d)中确定的染色体特异性序列之一；

在人类的分裂中期和人类的分裂间期，单独地用每种不同的寡核苷酸探针进行原位杂交；

检测与每种杂交探针的标记相关的信号；和

根据检测信号的程度，选择一种或多种寡核苷酸探针。

59.一种制备标记探针的方法，所述方法包括：

使形成包括茎区和环区的发夹结构的寡核苷酸连接到由25-35个与特定人类染色体上的着丝粒重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列上，其中所述发夹结构中的多个核苷酸具有连接的可检测标记，其中所述染色体特异性序列与所有人类染色体的端粒重复序列的共有α-单体重复序列不到84％相同。

60.如权利要求59所述的方法，其中，所述茎区具有16-40个核苷酸。

61.如权利要求59所述的方法，其中，至少2个具有连接的可检测标记的核苷酸是相邻的。

62.如权利要求59所述的方法，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔至少2个核苷酸。

63.如权利要求59所述的方法，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔3个核苷酸。

64.一种检测特定人类染色体的方法，所述方法包括：

将人类染色体制品与标记探针接触，该标记的探针包含由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，其中，所述染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同；

在足以允许所述探针与可能存在的具有与探针的染色体特异性序列完全互补的着丝粒重复序列的特定人类染色体杂交的条件下，孵育所述染色体制品和所述探针；和

检测所述标记以检测可能存在的特定人类染色体。

65.如权利要求64所述的方法，包括使人类染色体制品与多种不同的标记探针接触，每种不同的标记探针具有不同的染色体特异性序列和不同的可与其它可检测标记中的每一种区分开的可检测标记。

66.如权利要求65所述的方法，其中，每种可检测标记是具有光谱可区别的发射波长的荧光团。

67.如权利要求64所述的方法，它是一种用于确定染色体异常的方法。

68.如权利要求64所述的方法，其中，检测标记包括显微成像。

69.如权利要求64所述的方法，其中，检测标记包括图像扫描显微镜术。

70.如权利要求64所述的方法，其中，所述染色体制品包括人类细胞，且杂交步骤在细胞内的染色体上原位进行。

71.一种用于检测细胞中的特定人类染色体的试剂盒，所述试剂盒包括：

标记的寡核苷酸，其包含由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，其中，所述染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同。

72.如权利要求71所述的试剂盒，其中，所述标记通过连接体连接到染色体特异性序列上。

73.如权利要求71所述的试剂盒，其中，所述标记的寡核苷酸进一步包括形成包括茎区和环区的发夹结构的序列，其中，所述发夹结构中的多个核苷酸具有连接的可检测标记。

74.如权利要求73所述的试剂盒，其中，所述茎区具有16-40个核苷酸。

75.如权利要求73所述的试剂盒，其中，至少2个具有连接的可检测标记的核苷酸是相邻的。

76.如权利要求73所述的试剂盒，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔至少2个核苷酸。

77.如权利要求73所述的试剂盒，其中，所述具有连接的可检测标记的核苷酸间隔3个核苷酸。

78.一种用于检测细胞中的特定人类染色体的试剂盒，所述试剂盒包括：

多种不同的标记探针，每种不同的标记探针包括由25-35个与特定人类染色体上的重复序列完全互补的连续核苷酸组成的染色体特异性序列，其中，所述染色体特异性序列与所有人类染色体的共有重复序列不到84％相同；且具有

(a)不同的染色体特异性序列；和

(b)可与其它可检测标记中的每一种区别开的不同的可检测标记。

79.如权利要求78所述的试剂盒，其中，所述每种可检测标记是具有光谱可区别的发射波长的荧光团。