CN114395641A

CN114395641A - 一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对、试剂盒及其应用和检测方法

Info

Publication number: CN114395641A
Application number: CN202210058020.9A
Authority: CN
Inventors: 房文文; 郭涛; 姜艳芳; 王海凤; 张士永; 薛芳; 张焕霞
Original assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-01-19
Filing date: 2022-01-19
Publication date: 2022-04-26

Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对、试剂盒及其应用和检测方法。本发明提供了一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对，所述引物对包括PigmR‑F和PigmR‑R；所述PigmR‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PigmR‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对具有结果准确稳定、操作简便、检测周期短、易于实现高通量检测的优势，对于促进PigmR基因改良稻瘟病抗性具有重要意义。

Description

一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对、试剂盒及其应用和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对、试剂盒及其应用和检测方法。

背景技术

稻瘟病是世界各水稻生产区内广泛发生、且危害极大的一种真菌性病害。培育和选种抗病品种是防控稻瘟病最经济有效的措施。分子标记辅助选择是加速育种进程的有效办法。

水稻中鉴定了100多个稻瘟病抗性基因，成功克隆了35个抗性基因或等位基因。Pigm是广谱抗瘟基因，与叶瘟抗性相关，来源于谷梅4号。其中PigmR和PigmS是2个功能蛋白，通过竞争形成异源二聚体，减缓了病原菌对PigmR的致病力进化，达到持久抗病。该基因位于Pi2/Pi9位点，与Pi2、Pi9、Piz、Pizt、Pi50为复等位基因。目前检测PigmR基因的方法存在周期长、检测结果不准确等缺点，难以实现批量化检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对、试剂盒及其应用和检测方法。本发明提供的引物对具有结果准确稳定、操作简便、检测周期短、易于实现高通量检测的优势，对于促进PigmR基因改良稻瘟病抗性具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对，所述引物对包括PigmR-F和PigmR-R；所述PigmR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PigmR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物对。

优选的，所述试剂盒为荧光PCR-HRM检测试剂盒。

本发明提供了上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂盒在检测稻瘟病抗瘟基因PigmR中的应用。

本发明提供了一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的方法，包括以下步骤：

以待测样品的DNA为模板DNA，与上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂盒中的引物对混合后进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行溶解曲线分析，得到待测样品熔解温度；

当所述待测样品的熔解温度为＜82.0℃时，则所述待测样品为含有PigmR基因的样品；当所述待测样品的温度为≥82.0℃时，则所述待测样品为不含有PigmR基因的样品。

优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。

优选的，所述PCR扩增反应的反应体系以10μL计，包括以下组分：模板DNA 3μL、10×Taq buffer 1μL、dNTP 0.2μL、20×Evagreen 0.125μL、Taq DNA Polymerase 0.1μL、所述引物对中的PigmR-F、PigmR-R各0.2μL和余量的ddH2O。

优选的，所述模板DNA的浓度为10～50ng/μL；所述10×buffer含有Mg²⁺，所述10×buffer中Mg²⁺的浓度为20mM；所述dNTP的浓度为2.5mM；所述Taq DNA Polymerase的活力为0.5U；所述引物对中的PigmR-F和PigmR-F的浓度分别为0.1mM。

优选的，所述熔解曲线分析的程序为：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，进行熔解曲线分析。

本发明提供了上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂盒在抗稻瘟病基因PigmR育种或辅助育种中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对，所述引物对包括PigmR-F和PigmR-R；所述PigmR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PigmR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述引物对是根据PigmR基因序列与其等位基因及感病品种的碱基差异开发SNP标记进行设计的，因此，该引物对可高通量检测水稻品种中PigmR基因，同时还具有结果准确稳定、操作简便、检测周期短、易于实现高通量检测的优势，对抗稻瘟病基因PigmR辅助育种有指导作用。

另外，本发明首次公开了用于PCR-HRM检测PigmR的引物对和方法，该方法可以实现一板96个样品同时检测；此方法扩增完不需要任何处理，如酶切、点样、跑胶等，可以直接上机，准确性高；检测流程中不需要酶切、电泳及测序步骤，简化检测流程，检测效率高，可实现高通量检测品种资源和杂交后代群体，加快抗稻瘟病育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为PigmR-F1R2引物对溶解曲线结果；

图2为PigmR-F2R1溶解曲线结果；

图3为PigmR-F3R1溶解曲线结果；

图4为PigmR-F3R2溶解曲线结果；

图5为水稻抗稻瘟病基因PigmR基因熔解曲线结果，其中蓝色曲线的熔解温度为＜82.0℃(位点为T)，红色曲线的熔解温度为≥82.0℃(位点为C)；

图6为利用王芳权等人开发的PigmR功能标记GMRA进行HRM验证图，其中蓝色曲线为含有PigmR的样品；

图7为利用本发明所述引物对对33份材料进行检测结果，其中蓝色曲线的熔解温度为＜82.0℃(位点为T)，红色曲线的熔解温度为≥82.0℃(位点为C)。

具体实施方式

本发明提供了一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对，所述引物对包括PigmR-F和PigmR-R；所述PigmR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：CGAACTAATAACTCCAAACGTA；所述PigmR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：GGAGGTGCTAGAGTTTGTCGCC。

本发明提供了一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物对。在本发明中，所述试剂盒还包括10×Taq buffer、dNTP、20×Evagreen、Taq DNA Polymerase和ddH₂O。在本发明中，所述试剂盒优选为荧光PCR-HRM检测试剂盒。本发明所述试剂盒基于PCR-HRM方法设置，使其具有操作简单，结果准确稳定，易于实现高通量检测的优势。

本发明所述引物对是根据Pigm基因序列与其等位基因及感病品种的碱基差异开发SNP标记进行设计的，因此，该引物对可高通量检测水稻品种中PigmR基因，同时还具有结果准确稳定、操作简便、检测周期短、易于实现高通量检测的优势。因此，本发明所述引物对或含有该引物对的试剂盒能够用于检测稻瘟病抗瘟基因PigmR。

本发明提供了上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂盒在检测稻瘟病抗瘟基因PigmR中的应用。利用本发明所述引物对或试剂盒对12种已知是否含有基因PigmR的品种进行检测，结果显示：与现有技术中检测结果是一致的，证明本发明所述引物对或试剂盒能够准确检测出样品中是否含有基因PigmR。

以待测样品的DNA为模板DNA，与上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂盒中的引物对混合后进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行溶解曲线分析，得到待区分稻瘟病菌熔解温度；

当所述待测样品的熔解温度为＜82.0℃时，则所述待测样品为含有PigmR基因的样品；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度≥82.0℃时，则所述待测样品为不含有PigmR基因的样品。

本发明以待测样品的DNA为模板DNA，与上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述试剂盒中的引物对混合后进行PCR扩增；将PCR扩增产物进行溶解曲线分析，得到待区分稻瘟病菌熔解温度。在本发明中，所述待测样品优选包括水稻，更优选包括水稻的叶片，最优选包括水稻的新鲜叶片。

本发明对提取待待测样品的DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，采用CTAB法提取待区分稻瘟病菌的基因组DNA。

在本发明中，所述PCR扩增优选为荧光PCR扩增。在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选包括：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；所述PCR扩增反应的反应体系以10μL计，优选包括以下组分：模板DNA 3μL、10×Taq buffer 1μL、dNTP 0.2μL、20×Evagreen 0.125μL、Taq DNA Polymerase 0.1μL、所述引物对中的PigmR-F、PigmR-R各0.2μL和余量的ddH₂O。在本发明中，所述模板DNA的浓度优选为10～50ng/μL，进一步优选为20～40ng/μL，更优选为25～35ng/μL；所述10×Taq buffer优选含有Mg²⁺，所述10×Taqbuffer中Mg²⁺的浓度优选为20mM；所述dNTP的浓度优选为2.5mM；所述Taq DNAPolymerase的活力优选为0.5U；所述引物对中的PigmR-F和PigmR-F的浓度分别优选为0.1mM；所述dNTP的浓度优选为250μmol/L。

在本发明中，所述熔解曲线分析的程序优选为：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，进行熔解曲线分析。在本发明中，所述熔解曲线分析采用的软件优选的包括LightCycler96。

在本发明中，当所述待测样品的熔解温度为＜82.0℃时，则所述待测样品为含有PigmR基因的样品；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为≥82.0℃时，则所述待测样品为不含有PigmR基因的样品，优选的，当所述待测样品的熔解温度的范围为81.5≥且＜82.0℃时，则所述待测样品为含有PigmR基因的样品；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度的范围为82.0≥且＜82.5℃时，则所述待测样品为不含有PigmR基因的样品。在本发明中，所述溶解温度优选为利用等位基因序列差异(T/C)获得。在本发明中，当扩增位点为T时，溶解温度为81.5～82.0℃时，所述待测样品为含有PigmR基因的样品，当扩增位点为C时，溶解温度为82.0～82.5℃时，待测样品为不含有PigmR基因的样品。

本发明所述引物对可高通量检测水稻品种中PigmR基因，同时还具有结果准确稳定、操作简便、检测周期短、易于实现高通量检测的优势；因此，该引物对对抗稻瘟病基因PigmR辅助育种有指导作用。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对、试剂盒及其应用和检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

引物设计

根据参考文献(Deng Y,Zhai K,Xie Z,et al.Epigenetic regulation ofantagonistic receptors confers rice blast resistance with yield balance[J].Science,2017)，谷梅4号PigmR基因序列登录号为KU904633，采用NCBI网站进行核酸序列分析。利用Pigm与其等位基因及感病品种日本晴中的序列差异，根据差异的SNP(基于PARMS技术的抗稻瘟病基因Pigm分子标记的开发_卿冬进[J])设计引物对，该引物对如下：

PigmR-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5’-AAATGCTACCACAAACGAACTA-3’；

PigmR-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-CGAACTAATAACTCCAAACGTA-3’；

PigmR-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：5’-CTCCAAACGTAAAGTGGAGGAAC-3’；

PigmR-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-GGAGGTGCTAGAGTTTGTCGCC-3’；

PigmR-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：5’-TAGAGTTTGTCGCCACTCGAGTC-3’。

将上述引物进行组合，分为PigmR-F1R1(PigmR-F1和PigmR-R1)、PigmR-F1R2(PigmR-F1和PigmR-R2)、PigmR-F2R1(PigmR-F2和PigmR-R1)、PigmR-F2R2(PigmR-F2和PigmR-R2)、PigmR-F3R1(PigmR-F3和PigmR-R1)和PigmR-F3R2(PigmR-F3和PigmR-R2)6组引物对。

对上述6组引物对进行检测，检测方法同实施例2。这6对引物对分别采用了5个水稻品种(谷梅4号、金香玉1号、日本晴、宁香粳9号和75-1-127(Pi9))进行实验，发现谷梅4号和金香玉1号为含有PigmR样品；日本晴、宁香粳9号和75-1-127(Pi9)为不含有PigmR样品。

利用组合PigmR-F1R1，PigmR-F2R2两个小组对样品进行扩增没有扩增出来。，PigmR-F1R2，PigmR-F2R1，PigmR-F3R1，PigmR-F3R2四个小组，扩增结果如图1～4所示：根据熔解曲线的平滑程度及对样品的多态性区分，对图2～图4进行了淘汰，图1线比较平滑，说明扩增好；而且图1这个组合引物PigmR-F2R1能够对两种类别的样品进行多态性区分，最终选择的PigmR-F2R1组合(记为PigmR-F和PigmR-R)作为本发明后续试验采用的引物对。

实施例2

1、引物

PigmR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；PigmR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、供试水稻DNA提取

1)供试水稻叶片收集：剪取3段供试的水稻叶片(大小为2mm×2mm)于2mL离心管中。

2)供试水稻DNA提取：采用CTAB法提取供试水稻的DNA，具体步骤如下：

(1)将各供试水稻的叶片加600μL 65℃预热的2×CTAB，然后65℃温浴30min；

(2)冷却后加600μL氯仿异戊醇溶液(氯仿和异戊醇体积比为1:1)混匀，12000rpm离心10min，吸200μL上清液，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀-20℃条件下沉淀30min；

(3)12000rpm、4℃条件下离心15min，弃上清液，加入600μL体积百分含量为70％的乙醇洗涤沉淀1～2次，放入通风橱内吹干；

(4)加入100μL TE(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH 8.0)溶解DNA，使用核酸定量仪测量DNA浓度，并将浓度调整为约10ng/μL，-20℃保存备用，待测样品的DNA。

3、PCR-HRM检测

以上述待测样品的DNA为模板DNA，与上述引物对混合后进行荧光PCR扩增；将PCR扩增产物进行溶解曲线分析；

荧光PCR反应体系为：10×Taq buffer(含20mM的Mg²⁺)1μL，250μmol/L dNTP 0.2μL，0.5U Taq DNA Polymerase 0.1μL，20×Evagreen 0.125μL，10ng/μL的DNA模板3μL，0.1mM引物(PigmR-F和PigmR-F)各0.2μL，用ddH₂O定容至10μL。

荧光PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。

熔解曲线(HRM)分析程序：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10reading/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，采用软件Light Cycler 96 software进行熔解曲线分析。

当所述待测样品的熔解温度范围为81.5≥且＜82.0℃(等位基因序列差异位点为T)时，则所述待测样品为含有PigmR基因的样品；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度范围为82.0≥且＜82.5℃(等位基因序列差异位点为C)时，则所述待测样品为不含有PigmR基因的样品。

4、基因分型

水稻抗稻瘟病基因Pigm基因熔解曲线结果如图5所示，熔解温度范围为81.5≥且＜82.0℃时，谷梅4号、金香玉1号、空育131(Pigm)出峰，即上述样品等位基因序列差异位点为T，为含有PigmR的水稻品种；熔解温度范围为82.0≥且＜82.5℃时，日本晴、宁香粳9号和75-1-127(Pi9)出峰，即上述样品等位基因序列差异位点为C，为不含有PigmR的水稻品种。

同时本实施例利用王芳权等人(王芳权等，水稻广谱抗稻瘟病基因PigmR功能标记的开发及应用，中国农业科学2019,52(6):955-967)开发的PigmR功能标记GMRA进行了HRM验证，结果如图6所示，发现谷梅4号、金香玉1号、空育131(Pigm)在熔解温度为81.5℃左右时，能出峰，即能够扩增出98bp产物，携带PigmR；日本晴、宁香粳9号、75-1-127(Pi9)在熔解温度为81.5℃左右时，没有出现峰，即不能扩增出98bp产物，不携带PigmR，这与图1中结果是一致的。

由此可见，采用本发明提供的引物对能够准确验证样品中是否含有携带PigmR，并且通过熔解曲线峰型以及Tm值差异可以完全区分开水稻中是否含有基因PigmR。

实施例3

为检测本发明中引物对的特异性和实用性，利用本发明引物对对33份材料进行检测，检测方法同实施例2，检测结果如表1和图7所示。

表1 SNP标记鉴定部分水稻材料

由表1和图7记载的可知，利用本发明所述引物对共检测到1个品种含有PigmR基因，为金香玉1号，其他32个品种中均不含有PigmR基因。可见，本发明所述引物对可用来检测PigmR基因位点为抗性位点，用于鉴定水稻品种中是否含有PigmR基因。

综上所述，本发明所述引物对是根据PigmR基因序列与其等位基因及感病品种的碱基差异开发SNP标记进行设计的，因此，该引物对可高通量检测水稻品种中PigmR基因，同时还具有结果准确稳定、操作简便、检测周期短、易于实现高通量检测的优势，对抗稻瘟病基因PigmR辅助育种有指导作用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 山东省农业科学院

<120> 一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对、试剂盒及其应用和检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgaactaata actccaaacg ta 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaggtgcta gagtttgtcg cc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaatgctacc acaaacgaac ta 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctccaaacgt aaagtggagg aac 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tagagtttgt cgccactcga gtc 23

Claims

1.一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的引物对，其特征在于，所述引物对包括PigmR-F和PigmR-R；所述PigmR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PigmR-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

2.一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为荧光PCR-HRM检测试剂盒。

4.权利要求1所述引物对或权利要求2或3所述试剂盒在检测稻瘟病抗瘟基因PigmR中的应用。

5.一种检测稻瘟病抗瘟基因PigmR的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测样品的DNA为模板DNA，与权利要求1所述引物对或权利要求2或3所述试剂盒中的引物对混合后进行荧光PCR扩增；将PCR扩增产物进行熔解曲线分析，得到待测样品熔解温度；

当所述待测样品的熔解温度＜82.0℃时，则所述待测样品为含有PigmR基因的样品；当所述待测样品熔解温度为≥82.0℃时，则所述待测样品为不含有PigmR基因的样品。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应体系以10μL计，包括以下组分：模板DNA 3μL、10×Taqbuffer 1μL、dNTP 0.2μL、20×Evagreen 0.125μL、TaqDNAPolymerase 0.1μL、所述引物对中的PigmR-F、PigmR-R各0.2μL和余量的ddH₂O。

8.根权利要求7所述的方法，其特征在于，所述模板DNA的浓度为10～50ng/μL；所述10×buffer含有Mg²⁺，所述10×buffer中Mg²⁺的浓度为20mM；所述dNTP的浓度为2.5mM；所述Taq DNAPolymerase的活力为0.5U；所述引物对中的PigmR-F和PigmR-F的浓度分别为0.1mM。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述熔解曲线分析的程序为：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，进行熔解曲线分析。

10.权利要求1所述引物对或权利要求2或3所述试剂盒在抗稻瘟病基因PigmR育种或辅助育种中的应用。