JPH07505777A

JPH07505777A - 一般的な生産の染色体異数体の検出用プローブ

Info

Publication number: JPH07505777A
Application number: JP5518495A
Authority: JP
Inventors: クリンガー，キャサリン・ダブリュー; ダコウスキー，ウィリアム・アール; ランデス，グレッグ
Original assignee: アイジー・ラボラトリーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-04-09
Filing date: 1993-04-08
Publication date: 1995-06-29
Also published as: CA2117783A1; AU4027293A; WO1993021342A1; AU680412B2; EP0635067A1; US5693783A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】一般的な生産の染色体異数体の検出用プローブ発明の背景インントゥハイブリダイゼーションは、分子遺伝学者にとって、染色体、細胞または組織中に存在する特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を視覚化するための主要な研究手段であった。ハイブリダイゼーションにおいて最初に行われたＦＩＳＨは、迅速に選択法となりつつある。というのは、ＦＩＳＨは一層速やかに行うことができ、複数のシグナルを一時に検出することができ、しかもハイブリダイゼーションングナルを一層正確に位置付けることができるからである。しかしながら、一般に、同位体を用いない方法は感度に欠けるという欠点を有する。加えて、複数の蛍光団を同時に使用することが理論上は提唱されているが、実際は１または２の発色ＦＩＳＨのみが現在一般的である。

染色体異常の通常の出生前細胞遺伝学的分析には１〜３週間を要するので、ＦＩＳＨを出生前診断に応用することに大きな関心がもたれている。これまでの研究では、蛍光インノトウハイブリダイゼーションによって間期にある核の染色体異常を一般に検出できることが示されてイる［フレマー（Ｃｒｅｍｅｒ、　Ｔ　、　）ら、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、６０　：　４６〜５６　（１９８２）；ジュリアン（Ｊ　ｕｌｉｅｎ、　Ｃ，）ら、↓Ａしかしながら、これら研究に使用するプローブでは、ある面ではプローブ組成の制約により、並びに試料調製物およびハイブリダイゼーション検出における変動のために限られたハイブリダイゼーション効率しか達成できない。実際、このことは、多くの染色体はハイブリダイズせず、またハイブリダイズした核の中でも多くは期待するほどノゾブリダイゼーションシグナルが多くないことを意味している。たとえば、一つの完全な染色体ライブラリーからの挿入物からなる複合３８−９１４２　（１９８８）；リヒターら、Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、８０　：　２２４〜２３１４５〜１５０　（１９９０）に記載されたちの］では、非常に大きな分散シグナルが得られるため、シグナルの縁を輪郭付けることが困難であり、ハイブリダイゼーション領域の重複が一般的である。

一方、染色体の動原体周辺に位置する繰り返し配列にハイブリダイズするアルファサテライト繰り返しプローブ（たとえば、ライラード（Ｗｉｌｌａｒｄ、　Ｈ，Ｆ、）およびウェイ（Ｊ、Ｓ、Ｗａｙｅ）　、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、３　：１９２〜１９８　（１９８７）に記載されたもの）は、際立ったハイブリダイゼーションシグナルを生成するが、臨床に利用するには幾つかの問題点を有する。一般に、該繰り返しプローブの染色体特異性はハイブリダイゼーション条件に対して非常に感受性であり、／グナルサイズは動原体周辺の異形に対して非常に感受性である。加えて、第２１染色体および第１３染色体上に存在するアルファサテライト繰り返し要素は同じであり、それゆえアルファサテライト繰り返しプローブを用いて識別することはできない。さらに、該プローブの動原体での位置からはダウン症候群のすべての表示を同定することができない（すなわち、ロバートソン転座（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｉａｎ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ）　）。

単一のコピーサブクローンからなる混成プローブセット（すなわち、プラスミドプール）［たとえば、リヒターら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　＋　８５　：９６６４〜９６６８　（１９８８）に記載のもの］は、良好なシグナル解像力および特異性を有するが、シグナルはしばしば多くの小さなシグナルからなっており、このため定量が複雑になる［リヒターら、「第２１染色体特異的ＤＮＡプローブを用いたインシトウハイブリダイゼーションによるダウン症候群の検出」、バダーリン（Ｄ、　ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　２１　ａｎｄＤｏｗｎ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）　、ウィリー−リス、ニューヨーク（１９９０）コ。

新生児における最も一般的な染色体異常は、発病率１／８００の２１トリソミ− （ダウン症候群）、発病率１／８０００の１８トリソミー（エドワーズ症候群）、発病率１／２０．０００の１３トリソミー（パトー症候群）、発病率１／１０゜０００のＸモノソミー（ターナ−症候群）、および総発病率１／１０００のクラインフェルター症候群（ＸＸＹ）などの他の性染包体異数体である［トンプソン（Ｔ　ｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｊ　、　Ｓ　、　）およびトンプソン（Ｍ、　Ｗ、　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）編、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅダブリュー・ビー・ソーンダーズ、フィラデルフィア、ベンンルベニア（１９８６）］。これら５つの染色体の異数体（子供の先天的欠損症を伴う）を合わせると、生産の染色体異常の９５％を占める［ホワイトマン（Ｗｈｉｔｅｍａｎ。

Ｄ、　Ａ、　Ｈ，）およびクリンガ−（Ｋ、　Ｋｌｉｎｇｅｒ）　％　Ｉ　ｎｔｌ、　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　Ｈｕｔ　Ｇｅｎｅｔ（印刷中）コ。

重要な胎児の異数体の迅速かつ正確な検出が可能な方法は、将来親となるであろう人や医療従事者に試験結果を考慮し思慮ある行為の発現を促す意味で価値がある。

発明の要約本発明は、ヒトの第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体の部分に特異的にハイブリダイズすることのできる一本鎖核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する。第１３染色体に特異的な核酸分子は、ヒト染色体遺伝子座１３ｑ１３　（Ｄ１３Ｓ６）の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることのできる隣接（ｃｏｎｔｉｇ）コスミドからなる。第１８染色体に特異的な核酸分子は、ヒト染色体遺伝子座１８ｑ２２−ｑｔｅｒの６５〜１１０ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることのできる隣接コスミドからなる。第２１染色体に特異的な核酸分子は、ヒト染色体遺伝子座２１ｑ２２．３　（Ｄ２１Ｓ７１）の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにノゾブリダイズすることのできる隣接コスミドからなる。Ｘ染色体にハイブリダイズすることのできる分子は、動原体周辺にハイブリダイズすることのできる繰り返し配列を含有する単一のコスミドであり、ＹプローブはｐＤＰ９７、繰り返しクローンである。

本発明はまた、検出可能なマーカーて標識した核酸プローブにも関し、該プローブは上記分子またはその断片から調製することができる。上記５つの各プローブは、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体上の独特の遺伝子座に特異的にハイブリダイズすることができるため、高いシグナル／ノイズ比が得られ、高ハイブリダイゼーション／検出効率を示す。それゆえ、これらプローブは診断に有用である。

本発明はさらに、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体を検出するため、および染色体異数体を診断するため、上記プローブおよび該プローブを包含するキットをそれぞれ単独または組み合わせて使用する方法にも関する。たとえば、該プローブを出生前分析に用いることができる。第２１染色体に特異的なプローブは、ロバートソン転座にょる２１トリソミーを含む２１トリソミー（ダウン症候群）を診断するのに用いることができ、第１８染色体に特異的なプローブは、１８トリソミー（エドヮーズ症候群）を診断するのに用いることができ、第１３染色体に特異的なプローブは、１３トリンミー（バトー症候群）を診断するのに用いることができ、ＸおよびＹプローブはＸモノソミー（ターナ−症候群）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）および他の性染包体異数体を診断するのに用いることができる。

本発明のプローブは、ヒトの第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体にハイブリダイズしたときに、空間的に充分に分離された、明るく容易に検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを生成する。加えて、本発明のプローブは、−貫して約９５％のハイブリダイゼーション効率を示した。

さらに、同じノゾブリダイゼ＝ノヨン条件では５つのすべてのプローブについて等価な性能特性を生成するため、これらプローブを同時に用いることが可能である。

本明細書に開示するプローブをハイブリダイゼーションアッセイに用いると正確な結果が得られ、細胞遺伝学的分析を行う際に要する時間（すなわち、約７日間：所要時間が２週間以上であることは普通である）よりも短い時間（すなわち、２４時間未満）で行うことができる。それゆえ、本明細書に開示するプローブを用いたインノトゥ分析は、将来親となるであろう人や医療従事者に試験結果を考慮し思慮ある行為の発現を促す。

本発明は、ヒトの第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体および）′染色体の部分に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸分子を開発したことに基づく。これら分子またはその断片は標識してプローブとすることができ、ついでインントゥでハイブリダイズさせて各ヒト染色体の特異的な下領域を検出することができる。本発明はプローブとしてＤＮＡ分子に関連して特に記載しであるが、当業者であればリボ核酸（ＲＮＡ）分子もハイブリダイゼーションブローブとして用いることができることを理解するであろう。そのようなＲＮＡ分子の調製法は当該技術分野で知られている。

第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体にハイブリダイズするＤＮＡ分子は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９２年３月１９日に寄託してあり、それぞれ、６８９３６．６８９３４．６８９３５．６８９３２および６８９３３のＡＴＣＣ受託番号を付与されている。

第１３染色体、第１８染色体および第２１染色体に特異的なりＮＡ分子は、それぞれヒト染色体遺伝子座１３ｑ１３　（Ｄ１３Ｓ６）、１８ｑ２２−Ｑｔｅｒ　（ミニリン塩基性タンパク質、ＭＢＰ）および２１ｑ２２．３　（Ｄ２１Ｓ７１、ダウン症候群で示される領域）にマツピングされる単一コピークローンでヒト染色体ライブラリーをスクリーニングすることにより生成させ、コスミド（すなわち、３３〜５２ｋｂの挿入物を有するクローン）を同定した。ついで、これら第一コスミドを染色体歩行に用いて、挿入物が第一コスミドの挿入物と最小の重複を有するコスミドを得た。一連のコスミド内の隣接する染色体断片（すなわち、隣接コスミド）の合計が１００ｋｂを越えるまで、該第二コスミドから一方向へ数回の染色体歩行を行った。これら隣接コスミドを厳格に特徴付けして本発明の分子を得た。第２１染色体、第１３染色体および第１８染色体に特異的なりＮＡ分子は３つの各コスミドのプールを構成するが、Ｘ染色体に特異的なりＮＡ分子は一つのコスミドである。

検出可能なマーカーで標識したデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブは、クローン化ＤＮＡ分子またはその断片から当該技術分野でよく知られた方法に従ってｒＡ製することができる。そのような技術としては、放射能標識の導入、蛍光色素または酵素の直接結合、および免疫化学的にまたは他のアフィニティー反応によって検出可能とできるような核酸断片の種々の化学的修飾が挙げられる。好ましい標識法は、ハプテン化（ｈａｐｔｅｎａｔｅｄ）ヌクレオノド三リン酸（たとえば、ビオチン標識ｄＵＴＰ）を用いたニックトランスレーンヨンによるか、またはｄＴＴＰをＢ　ｉ　ｏ−１１−ｄＵＴＰで置換する［ランガー（Ｌａｎｇｅｒ、　Ｐ、　Ｒ，）ら、Ｐ　ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａヱ８　：　６６３３〜３７　（１９８１）；ブリガティ（Ｂｒｉｇａｔｉ、　Ｄ、　Ｊ　、　）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、工λ６　：　３２〜５０　（１９８３）］ランダムプライマー伸長［ファインバーブ（Ｆ　ｅｉｎｂｅｒｇ）　＆フォーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）　、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、よ旦ユ　２６６〜２６７．１９８４］　（たとえば、マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマーンヤム））によるものである。標識されたら、標準イン／トゥハイブリダイゼーション法を用いて本発明のプローブを染色体に適用することができる。

臨床的有用性を最大とするため、本発明のプローブが染色体特性的であること、および本発明のプローブがノブナル／ノイズ比およびハイブリダイゼーションシグナルの空間的分離の両方を最大とする複雑さくｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）を有することが重要である。本発明の第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体プローブを、実施例１に詳細に記載するように、それぞれ短期血液培養液および非培養羊水試料を用い、ハイブリダイゼーション効率および中期の広がり（ｓｐｒｅａｄｓ）および開期の核の両方に対する特異性について試験した。

本明細書に記載する遺伝子座特異的プローブは、第２１染色体、ヒト第１８染色体、ヒト第１３染色体、ヒトＸ染色体およびヒトＹ染色体のヒト中期の広がりに抑制条件下でハイブリダイズしたときに、空間的に充分に分離した、明るく容易に検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを生成する。実施例１に開示する方法に従って該プローブが開期の広がりにハイブリダイズしたときの推定ハイブリダイゼーション効率は、約９５％である。これらプローブおよび非培養洋膜細胞に対して最適化した試料処理プロトコールを用い、５００以上の臨床羊水試料を分析した。これらプローブを用いて試験した核の９５％以上が評価可能であると認められ、核試料の９０％以上が正確な数のハイブリダイゼーションノグナルを示した。

別々に使用する場合に加えて、２以上の異数体を同時に検出するために組み合わせて用いることができるような仕方で上記５つの各プローブを別個に標識することができる。緑色（フルオレセイン）、赤色（ローダミンまたはテキサスレッド）および青色（ＡＭＣＡまたはカスカードブルー）を放射する３つの識別できる蛍光団が一般的にＦＩＳＨに用いられる。それゆえ、標準法を用いることにより、少なくとも３つのプローブを組み合わせて用いて３つの染色体異数体を同時に検出することができる。加えて、実施例１に開示する方法により、５つのすべてのプローブを同時に視覚化することができる。

インントゥハイプリダイゼーションを行う方法は当該技術分野でよ（知られてイる。一般に、細胞試料をスライド上に置き、ハイブリダイゼーションできるようにし、プローブと接触させ、ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの検出は、試料中の該プローブに相補的な配列の存在を示す。本発明のプローブは、異数体に関与する第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体の領域にノゾブリダイズする。それゆえ、本発明のプローブは、たとえば、とりわけ子宮から採った羊水から単離した細胞、絨毛膜絨毛組織がら単離した細胞、母体血液から単離した（たとえばフローソーティングにより）胎児細胞または頚部分泌物から単離した細胞のスクリーニングにおいて診断に用いることができる。

第２１染色体に特異的なプローブは２１トリソミー（ダウン症候群）の診断に用いることができる。該プローブが動原体に局在化しないことにより、ロバートソン転座による２１トリソミーを検出することも可能となる。第１８染色体に特異的なプローブは１８トリソミー（エドヮーズ症候群）を診断するのに有用であり、第１３染色体に特異的なプローブセットは１３トリソミー（バトー症候群）の診断に有用であり、ＸプローブおよびＹプローブのセットはＸモノソミー（ターナ−症候群）およびタラインフェルター症候群（ＸＸＹ）などの他の性染包体異数体の診断に有用である。同じハイブリダイゼーション条件では５つのすべてのプローブについて等価な性能特性が得られるので、多色蛍光と組み合わせて用いれば多色分析に用いることができる。

第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体を検出し染色体の異数体を診断するのに用いることのできる本発明のプローブを包含するキットを製造することができる。該キットには、たとえば、必要な成分を保持するための容器、核をスライドに固定するための溶液、プローブ、ハイブリダイズしたプローブを染色するための溶液、およびスライド（核を一層良（保持するためにンラン処理してよい）が含まれる。好ましい態様において、本発明のプローブは、競合ＤＮＡ　（ハイブリダイゼーションを抑制するための）からなる混合物を含む。

細胞遺伝学的分析（一般に中期染色体を細胞遺伝学的にバンド形成させる（ｂａｎｄｉｎｇ）ことからなる）は、現在、染色体異常のある子供を生む危険性のある婦人（最も一般的な兆候は、母親の年齢がいっていること、異常な母親の血清アルファフェトプロティン（ＭＳＡＦＰ）　、ＭＳＡＦＰＳｂＨＣＧおよびエストリオールの異常な総レベル、または家族歴である）に日常的に提供されている。現在使用されている細胞遺伝学的アッセイは、正確で、がっしばしば極めて微妙な再配列を検出する。しかしながら、培養法および染色技術の進歩が分析を行うのに要する時間を短縮したとはいえ、最適の環境下で試験を完了するのに約７日間を要し、２週間以上の所要時間はご（一般的である。本明細書に開示するプローブは染色体をイン／トウで迅速に分析するのに用いることができ、トリソーム染色体構成を有意に短い時間で同定することができる。

つぎに、本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１．第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体に対するプローブを用いた、非培養羊膜細胞から得た開期の核および短期の血液培養液から調製した中期の広がりにおける異数体の迅速な検出核の調製第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体に対するプローブを、それぞれ、短期の血液培養液および非培養羊水を用いイ、中期の広がりおよび開期の核に対しＦＩＳＨにより評価した。中期の広がりを短期の血液培養液から調製し、標準的細胞遺伝学的プロトコールを用いてスライドに固定した。

羊水から単離した胎児細胞の試料を固定するには特別の技術が必要である。というのは、そのような試料は一般に、情報を与える細胞に加えて多くの死細胞または死につつある細胞を含んでいるからである。

以下の溶液をＸ１ｌｌ製した。

Ｂ５ＮａＣ１（３２ｇ）　、ＫＣＩ　（０，８ｇ）およびＮ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４７Ｈ２０（８６８ｇ）。蒸留Ｈ２０を用いて４リツトルとし、ｐＨは７５カーノイ固定液（Ｃａｒｎｏｙ’ｓ　Ｆｉｘａｔｉｖｅ）　：メタノール（７５ｍｌ）氷酢酸（２５ｍｌ）０．０７５ＭＫＣｌ蒸留Ｈ２０（１リツトル）にＫＣＩ　（５，５９ｇ）を溶解する。０．２ミクロンフィルターフラスコを用いて滅菌濾過する。

０．０７５ＭＫＣｌ中の３０％固定液：カーノイ固定液（３ｍｌ）ＫＣＩ　（７ｍｌ）３−アミノプロピルトリエトキン／ランの２％溶液。

３−アミノプロピルトリエトキン／ラン（５ｍｌ）アセトン（２４５ｍ　ｌ　）透明なガラス製の顕微鏡スライドをスライドラックに置き、上記２％溶液中に２分間浸漬する。これらスライドを２分間の＆漬の後に該溶液から取り、蒸留水を２回変えて濯いだ。これらスライドの水を切り、空気乾燥させた。調製したスライドを塵のない箱の中で室温にて貯蔵した。

羊水試料を遠心管中、２１０ＯＲＰＭ　（１０２９Ｇ）にて室温で７分間回転させた。上澄み液を吸引により取った。最初の羊水容量１ｍｌ当たり５０μｌのＰＢＳ中にベレットを再呼濁した。ＰＢＳ中に再竪濁したベレットを（２５μｍ）をンラン処理したガラス製の顕微鏡スライド上に置いた。羊水中に実質量の血液が存在する場合は、７０％０．０７５ＭＫＣｌ中の３０％３．１メタノール。

氷酢酸固定液（カーノイ固定液）（１滴）を加えた。

スライドを湿潤チャンバ中に水平にして３７℃の温度で１５分間装いた。このインキュベーション期間により、情報を与える細胞はンラン処理したスライド表面に邪魔されることなく沈殿し、一方、死細胞や膜に障害を有する他の細胞は緩衝液中に浮遊したままであった。１５分後、０．０７５　ＫＣＩ低張溶液（前以て２７℃に温めである）（５０μｌ）を上記再懸濁した細胞ベレットを含有する緩衝溶液に穏やかに加え、ついで加熱した湿潤チャンバ中でさらに１５分間インキュベートした。この低張溶液は生きた細胞を膨潤させ、以下の工程で細胞質および細胞膜を除去するのを容易にする。

ＫＣＩ中で３７℃にて１５分間インキュベートした後、流体を各スライドから穏やかに傾けて除いた（縦方向ではな（横側に）。この段階ではスライドを乾燥させなかった。各スライドを傾けて流体を除いた後、紙タオルの上に平らに置き、７０％０．０７５ＭＫＣｌ中の３０％カーノイ固定液（１００μｍ）を穏やかに加えた。これらスライドを５分間、この状態で放置した。この３０％固定／ＫＣ１は膨潤した細胞膜を破砕し、細胞を固定化した。

５分間インキュベートした後、各スライドを傾けて流体を除いた。スライドを乾燥させなかった。胎児細胞を含有するスライドの領域に、５〜６滴の新たな非希釈カーノイ固定液を直ちに滴下した。スライドを約５分間インキュベートし、ついで６０℃のスライド保温器に移し、乾燥させた。この固定液処理により残留する膜はすべて破砕され、核をスライドに固定化する間に残留する破砕物は濯ぎ除かれた。

この固定化工程の後、過剰の流体をスライドを傾けて除き、スライドをスライド保温器に置いて乾燥させた。スライドを乾燥させたら、ハイブリダイゼーションする前に一連のエタノールで処理した。コブリン（ｃｏｐｌｉｎ）広口瓶中、スライドを７０％、８０％、９０％および１００％エタノールとそれぞれ１分間、順番に接触させた。ついで、スライドを室温にて乾燥させた。

プローブの標識５つの染色体特異的プローブのセットを以下のようにしてニックトランスレーノコンにより標識した：第２１染色体プローブはＤＮＰ−ｄＵＴＰを用い、第１８染色体プローブはビオチン−ｄＵＴＰを用い、第１３染色体プローブはジゴキンゲニンーｄＵＴＰを用い、Ｘ染色体プローブはビオチン−ｄＵＴＰおよびジゴキンゲニンーｄＵＴＰを用い、Ｙ−プローブ（ｐＤＰ９７）はジゴキシゲニンーｄＵＴＰおよびＤＮＰ−ｄＬｌＴＰの両方を用いた。

ハイブリダイゼーション基本的にリヒター（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　Ｐ、）らの記載に従い［フレマーら、Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、８０：２３５〜２４６　（１９８８）：リヒターら、Ｈｕｔ　Ｇｅｎｅｔ、８０　：　２２４〜２３４　（１９８８）］　、ハハイブリダイゼーンヨを抑制条件下、スライド上で行った。使用したプローブの濃度は、各常染包体隣接コスミド、Ｘ染色体特異的コスミドおよび）′染色体繰り返しについて、それぞれ５．２．５および１μｇ／ｍｌであった。ハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣ］および０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、１０％（Ｗ／Ｖ）硫酸デキストラン、５０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、超音波処理したヒトＤＮＡ（Ｙ染色体繰り返しを除＜）（１００μｇ／ｍｌ）および超音波処理したサケＤＮＡ　（９００μｇ／ｍｌ）を含有するハイブリダイゼーションカクテル（１０μｍ）中で行った。少数の試料については、全ヒトＤＮＡの代わりにヒトＣ０Ｔｌ　ＤＮＡ　（２００μｇ／ｍｌ　；ギブコＢＲＬ、ライ７−テクツロジーズ、ガイセルスバーグ、メリーランド州）を用いた。プローブおよび標的ＤＮＡを、密封したカバーグラス下、８０℃にて８分間、同時に変性させた。３７℃で一夜ハイブリダイゼーションさせた後、スライドを４２℃にて５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ！および０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）中で各５分間、３回洗浄し、ついで６０℃にて０．ｌＸ５ＳＣ中で各５分間、３回洗浄した。スライドを湿潤チャンバ中、３７℃にて４ＸＳＳＣ／１％Ｂ５Ａ１０．１％ツイーン２０中のアビジン−ＦＩＴＣ（５μｇ／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートした。ついで、スライドを４２℃にて４ｘＳＳＣ１０，１％ツイーン２０で５分間、３回洗浄した。

暫検出は、リヒターらの記載に従って行った【フレマーら、Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、８０：２３５〜２４６　（１９８８）；リヒターら、Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、８０　：　２２４〜２３４　（１９８８）］。ビオチン化プローブは、アビジン −ＦＩＴＣかまたはアビジン−テキサスレッド（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンゲーム、カリフォルニア州）のいずれかで検出した。ジゴキシゲニンー標識プローブは抗ジゴキシゲニンーＦＩＴＣ（バーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）で検出した。これら研究ではシグナル増幅は用いなかった。プローブの性能を比較するすべての研究を、アビジン−ＦＩＴＣで検出するビオチン化プローブを用いて単一のプローブハイブリダイゼーションとして行った。幾つかの実験においては、Ｘプローブ（ジゴキシゲニン／抗ジゴキンゲニンーＦＩＴＣ）およびＹ（ビオチン／アビジンテキサスレッド）プローブの同時ハイブリダイゼーションおよび検出を行った。

分析に先立ってスライドを１００ｍＭトリス（ｐＨ８，０）　、９０％（Ｖ／Ｖ）グリセロリン中の２．３３％ＤＡＢＣＯアンチフェード（ａｎｔｉｆａｄｅ）　（Ｄ　２５２２、シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ州）中に積載し、場合により４゜６−ジアミツー２−フェニルインドール（ＤＡＰｒ）またはプロビンウムヨーダイドで対比染色した。別の場合に、一層厳格でない抑制条件を用いて繰り返しＤＮＡをハイブリダイズさせ、対比染色することなく核の可視化ができるようにした。結果の視覚化はすべてツァイスアキシオブランエビフルオレッセンス（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｌａｎ　ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡を用いて行った。ＦＩＴＣおよびテキサスレッドを同時に可視化するには、デュアルバンドパスフィルター（オメガ・オプティカル（０＋＊ｅｇａ　０ｐｔｉｃａｌ　Ｉ　ｎｃ、）、ブラントルボロ、ヴアージン諸島）を用いた。３５ｍｍカメラおよびコグツクゴールド４００フイルムを用い、結果を顕微鏡から直接写真に撮った。

ブを用いて得られた結果と標準細胞遺伝学的分析によって得られた結果との比較間期の細胞遺伝学を通常の細胞遺伝学と比較するため、共同研究している臨床研究所から羊水試料（一般に１５〜５ｍ１）を得、患者の身元番号のみで同定した。標準細胞遺伝学的分析は、共同研究している研究所によって各試料について行った。試料の受領後、内部ＩＤ番号を付与することによりさらに符号化した。

内部ＩＤ番号は本研究者のみが利用できる同定であった。それゆえ、プローブの評価は盲検により行った。インノトゥハイプリダイゼーンヨンの前に細胞培養は行わなかった。プローブ当たり最小５０のハイブリダイズした核（５０〜１２９６）が各試料についてカウントされ、１．２．３または４のハイブリダイゼーションシグナルを示す核の数を記録した。重複または凝集した細胞はカウントしなかった。可視化したシグナルは、たとえばそれらがＧ２核の特徴である空間的に密接に位！したシグナルベアの部分である場合でも、統計的分析のため各シグナルを一つのシグナルとしてカウントした。ついで、試料を復号し、種型分析により決定されるように正常と異常とに分類した。

非培養羊水試料のハイブリダイゼーション分析が完了したら、データを以下のようにして分析した。まず、１．２．３または４のシグナルを示したカウントされた余積のパーセントを計算した。核型に基づいて試料を正常または異常に分類した。これらの結果を開期の細胞遺伝学によって得られた結果と比較したところ、各京染包体プローブのセットはほぼ等価な性能特性を有し、効率的なハイブリダイゼーション／検出を達成できることが明らかとなった。９１５の分析からの結果をプールした場合、京染包体プローブセットの一つを用いて分析したときに所定の二染包体性試料において平均して約９０％のハイブリダイズした核が２つのシグナルを示した。１１の試料のみが７０％未満の２シグナル核を示し、すべての二染包体性試料において少なくとも５０％のハイブリダイズした核が２つのシグナルを示した。間期の細胞遺伝学は、これら京染包体についてすべての試料を二染色体性として正確に同定した。わずかな二染色体性の核は３つのハイブリダイゼーションシグナルを示した（Ｘ２１＝４％、Ｘ　１８＝３％、×３％）。性染色体についても同様の結果が得られ、ＸｘおよびＸＹの遺伝子型が区別された。

異常な核型の２１の試料を研究の過程で分析した。２１の試料のうち１４で２１トリソミーが示された。１８トリソミーおよび１３トリソミーについてそれぞれ２ケース、および３つの性染包体異数体（ＩＸＸ／ＸＸＸ、２ＸＸＹ）が認められた。トリソミー試料は正常試料と明らかに識別された。３つのハイブリダイゼーションシグナルを示すトリソミー細胞の頻度は４５〜８８％の範囲であったが、例外として一つの試料が母体血液の存在のために実質的な母体汚染を受けていた。このデータセットにおいて、正常試料における３シグナル核のパーセントとトリソミー試料における３シグナル核のパーセントとの間には重複は認められなかった。すべての試料について正常または異常の核型を正確に割り当てることができた。これには、２１：２１０バートソン転座によって引き起こされた２１トリソミーの一つのケースが含まれていた（ハイブリダイズした核の８８？６か３つのシグナルを示した）。

この研究において、すべてのトリソミー試料のハイブリダイゼーションパターンは正常細胞でみられるハイブリダイゼーションパターンから明らかに区別され、間期の細胞遺伝学の感度および特異性を示していた。しかしながら、細胞遺伝学においてみられる染色体異常の発生率を反映して、これら系列に存在する異数体試料の数は小さかった（ｎ＝２１）。臨床系列において殆どの試料が正常であるとすると、正常試料と異数体試料とを識別する上記データセットの検出力（ｐｏｓｅｒ）は、これら結果からのプロトコールを一般化して遺伝子型の予期された割り当てを行うために傾注される。統計的分析によれば、これらデータセットは、２３％未満の核が３つのハイブリダイゼーションシグナルを示す試料は所定の染色体について二染色体性であると予測され、４２％またはそれ以上の核が３つのシグナルを示す試料はトリソミーであると予測され、２３〜４２％の３シグナル核を生成するハイブリダイゼーションパターンは決定できないとするようなカットオフ値の割り当てを支持していることを示した。これら基準を用い、９５％かまたは９９％レベルで正常または異常状態を予測できる信頼区間において重複が存在しなかった。得られたシグナルが重複なく分布することは、この技術がトリソミー細胞の存在のインディケータ−として直接臨床に応用できることを示唆している。

国際調査報告、　、　＋１１＋　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３３５０フロントページの続き（７２）発明者　ダコウスキー、ウィリアム・アールアメリカ合衆国０１７４８マサチユーセツツ、ホブキントン、ヴアレンタイン・ロード４番（７２）発明者　ランデス、ブレツブアメリカ合衆国０１５３２マサチューセッツ、ノースボロー、インディアン・メドウ・ドライブ１９番

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒト染色体遺伝子座１３ｑ１３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子。
２．ＡＴＣＣ６８９３６である請求項１に記載の核酸分子。
３．ヒト染色体遺伝子座１８ｑ２２−ｑｔｅｒの６５〜１１０ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子。
４．ＡＴＣＣ６８９３４である請求項３に記載の核酸分子。
５．ヒト染色体遺伝子座２１ｑ２２．３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子。
６．ＡＴＣＣ６８９３５である請求項５に記載の核酸分子。
７．Ｘ染色体の動原体の周辺にハイブリダイズすることができる核酸分子。
８．ＡＴＣＣ６８９３２である請求項７に記載の核酸分子。
９．（ａ）細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）ヒト染色体遺伝子座１３ｑ１３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに咳試料核酸を接触させ、（ｃ）核プローブを該試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）第１３染色体の存在を指示するものとしてハイブリダイゼーションシグナルを検出することを特徴とする、細胞試料中の第１３染色体の存在の検出方法。
１０．（ａ）胎児細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）ヒト染色体遺伝子座１３ｑ１３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブを該試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）トリソミー１３を指示するものとして３つのハイブリダイゼーションシグナルを検出することを特徴とする、胎児細胞を含有する試料におけるトリソミー１３の診断方法。
１１．（ａ）細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）ヒト染色体遺伝子座１８ｑ２２−ｑｔｅｒの６５〜１１０ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブを該試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）第１８染色体の存在を指示するものとしてハイブリダイゼーションシグナルを検出することを特徴とする、胎児細胞を含有する試料における第１８染色体の存在の検出方法。
１２．（ａ）胎児細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）ヒト染色体遺伝子座１８ｑ２２−ｑｔｅｒの６５〜１１０ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブを該試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）トリソミー１８を指示するものとして３つのハイブリダイゼーションシグナルを検出することを特徴とする、胎児細胞を含有する試料におけるトリソミー１８の診断方法。
１３．（ａ）細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）ヒト染色体遺伝子座２１ｑ２２．３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブを該試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）第２１染色体の存在を指示するものとしてハイブリダイゼーションシグナルを検出することを特徴とする、胎児細胞を含有する試料における第２１染色体の存在の検出方法。
１４．（ａ）胎児細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）ヒト染色体遺伝子座２１ｑ２２．３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブを咳試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）トリソミー２１を指示するものとして３つのハイブリダイゼーションシグナルを検出することを特徴とする、胎児細胞を含有する試料におけるトリソミー２１の診断方法。
１５．（ａ）胎児細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）ヒト染色体遺伝子座２１ｑ２２．３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブを該試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）ロバートソン転座を指示するものとして３つのハイブリダイゼーションシグナルを検出することを特徴とする、胎児細胞を含有する試料におけるロバートソン転座の診断方法。
１６．（ａ）細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）Ｘ染色体の動原体の周辺にハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブを該試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）第２１染色体の存在を指示するものとしてハイブリダイゼーシヨンシグナルを検出することを特徴とする、胎児細胞を含有する試料におけるＸ染色体の存在の検出方法。
１７．（ａ）胎児細胞試料中に存在する核酸をハイブリダイゼーションに利用できるようにし、（ｂ）Ｘ染色体の動原体の周辺にハイブリダイズすることができハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブを該試料核酸とハイブリダイズさせてシグナルを生成させ、ついで（ｄ）ターナー症候群を指示するものとして１つのハイブリダイゼーションシグナルを検出することを特徴とする、胎児細胞を含有する試料におけるターナー症候群の診断方法。
１８．（ａ）固定化溶液、（ｂ）ＡＴＣＣ６８９３６、ＡＴＣＣ６８９３４、ＡＴＣＣ６８９３５およびＡＴＣＣ６８９３３でありハイブリダイゼーションによりシグナルを生成することができる標識核酸分子からなるプローブ、（ｃ）染色溶液、および（ｄ）スライドからなることを特徴とする、第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体の検出用キット。
１９．（ａ）細胞試料中に存在する核酸をインジトウハイブリダイゼーシヨン用に調製し、（ｂ）それぞれ識別し得る標識を含みヒト第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体の一つに特異的にハイブリダイズすることができる５つの染色体特異的プローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）該プローブおよび核試料核酸をハイブリダイズさせ、ついで（ｄ）単一細胞中のハイブリダイズしたプローブの数を定量し、その際、いずれか一つのプローブが奇数のコピー数で存在することは該プローブにハイブリダイズした染色体が異数体であることを示すことを特徴とする、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体における異数体の存在について細胞試料をスクリーニングする方法。
２０．該細胞試料が胎児細胞を含む請求項１９に記載の方法。
２１．５つの染色体特異的プローブが、（ｉ）ヒト染色体遺伝子座１３ｑ１３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（ｉｉ）ヒト染色体連伝子座１８ｑ２２−ｑｔｅｒの６５〜１１０ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子；（ｉｉｉ）ヒト染色体遺伝子座２１ｑ２２．３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子；（ｉｖ）Ｘ染色体の動原体の周辺にハイブリダイズすることができる核酸分子および（ｖ）ｐＤＰ９７からなる、請求項１９に記載の方法。
２２．５つの染色体特異的プローブが、（ｉ）ＡＴＣＣ６８９３６；（ｉｉ）ＡＴＣＣ６８９３４；（ｉｉｉ）ＡＴＣＣ６８９３５；（ｉｖ）ＡＴＣＣ６８９３２および（ｖ）ＡＴＣＣ６８９３３からなる、請求項２１に記載の方法。
２３．（ａ）細胞試料中に存在する核酸をインジトウハイブリダイゼーシヨン用に調製し、（ｂ）それぞれ異なる蛍光団または蛍光団の組み合わせで区別して標識されヒト第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体の一つに特異的にハイブリダイズすることができる５つの染色体特異的プローブに該試料核酸を接触させ、（ｃ）咳プローブおよび該試料核酸をハイブリダイズさせ、ついで（ｄ）単一細胞中のハイブリダイズしたプローブの数を定量し、その際、いずれか一つのプローブが奇数のコピー数で存在することは染色体が異数体であることを示すことを特徴とする、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体における異数体の存在について細胞試料をスクリーニングする方法。
２４．該細胞試料が胎児細胞を含む請求項２３に記載の方法。
２５．５つの染色体特異的プローブが、（ｉ）ヒト染色体遺伝子座１３ｑ１３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（ｉｉ）ヒト染色体遺伝子座１８ｑ２２−ｑｔｅｒの６５〜１１０ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子；（ｉｉｉ）ヒト染色体遺伝子座２１ｑ２２．３の６５〜１００ｋｂの非重複ＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子；（ｉｖ）Ｘ染色体の動原体の周辺にハイブリダイズすることができる核酸分子および（ｖ）ｐＤＰ９７からなる、請求項２３に記載の方法。
２６．５つの染色体特異的プローブが、（ｉ）ＡＴＣＣ６８９３６；（ｉｉ）ＡＴＣＣ６８９３４；（ｉｉｉ）ＡＴＣＣ６８９３５；（ｉｖ）ＡＴＣＣ６８９３２および（ｖ）ＡＴＣＣ６８９３３からなる、請求項２５に記載の方法。