CN109486930A - 一种先天性缺牙易感基因的检测方法 - Google Patents
一种先天性缺牙易感基因的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种先天性缺牙易感基因检测芯片及检测方法。本发明的成果不仅将显著提高先天性缺牙遗传学诊断的效率，扩大其候选基因的诊断涵盖面，同时将极大地丰富先天性缺牙的致病突变谱，利于分析基因间的交互作用，使我们对于这种疾病的致病因素有更加深入的认识。这些极富价值的研究成果最终将有利于先天性缺牙的遗传咨询和产前诊断。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片，具体的说是一种先天性缺牙易感基因的检测方法。
背景技术
由于牙胚发育异常造成的先天性牙齿数量减少称为先天性缺牙。近年来，随着在牙齿发育中各种分子，如转移因子、生长因子、受体分子、细胞表面分子、细胞间分子等的定位，及对其在牙齿发育期间调节作用的研究，使对先天性缺牙遗传因素的研究更加深入，但各学者的看法不一致。例如，Vastardis等研究发现MXS1基因位点突变时，小鼠可表现为严重地多数缺牙；人类则表现为第二前磨牙和第三磨牙先天性缺失。此外，还有学者研究发现上皮生长因子(Epideral growth factor,EGF)、上皮生长因子受体(Epideral growthfactor receptor，EGFR)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)在牙齿发育期有重要的作用。因而学者们提出EGF、EGFR、FGF等因子基因位点突变可引起先天性缺牙。而Arte等采用连锁分析法，对7个患有先天性少数牙缺失的芬兰家庭三代人做家系调查，并采取患者外周血，用PCR技术分析其指纹图谱，却排除了EGF、EGFR、FGF-3因子的基因位点是先天性个别缺牙基因突变的位点。Nieminen等在研究切牙-前磨牙先天缺失的患者的基因时却未发现MXS1基因位点异常。
本申请人收集了国内外关于先天性缺牙易感基因的文献和报道，并对文献和报道进行整理，发现了与先天性缺牙相关的基因有大概60个，尚未发现对这些基因进行整体研究的技术或文献，对这些基因进行筛选和功能确认，如果对这些基因进行整体研究，需要对基因进行检测。
目前针对先天缺牙致病基因的检测手段主要包括Sanger测序、外显子测序及全基因组测序。而Sanger测序耗时、耗材且耗费人力；外显子测序及全基因组测序不仅价格昂贵且测序结果数据量庞大、周期长和成本高。Sanger测序、外显子测序及全基因组测序若用于先天性缺牙相关的基因整体研究，则会耗费大量的资源，因此需要一种更加高效的方法减低先天性缺牙致病基因筛选成本并提高筛选效率。
发明内容
本发明提供一种先天性缺牙易感基因的检测方法，该方法能快速检测先天缺牙致病基因，减低致病基因筛选成本并提高筛选效率。
一种先天性缺牙易感基因的检测方法，所述方法包括：(1)对待测序DNA样品进行PCR扩增，制备测序文库片段；
扩增待测序DNA样品的引物序列设计模板来自35个先天性缺牙相关基因：EDA、EDAR、EDARADD、WNT10A、MSX1、PAX9、AXIN2、BMP4、LTBP3、PITX2、SMOC2、PTH1R、GRHL2、GREM2、TRAF6、LHX8、LRP6、Lef1、SP3、BCOR、SLC26A2、Barx1、FGFR2、GJA1、NFKBIA、IKBKG、IRF6、OFD1、TP63、PVRL1、TBX3、TFAP2B、TCOF1、MSX2和SHH；
所述待测序DNA样品提取自人类体液；
(2)将测序文库片段通过PCR扩增过程克隆到离子微球颗粒上；
(3)将PCR扩增后的离子微球颗粒注入到测序芯片上，加入运行测序程序；
(4)结果分析。
所述步骤(1)中PCR扩增方法为：(1a)对待测序DNA样品用自制引物进行PCR扩增，得初步测序文库片段；(1b)将初步测序文库片段进行消化引物、接头序列连接步骤后，用商业引物进行初步测序文库片段的PCR扩增，制备测序文库片段。
所述步骤(1a)中扩增待测序DNA样品的自制引物序列的核酸序列为SEQ NO.1-934。
所述步骤(1)中扩增待测序DNA样品的自制引物分散到引物库1和引物库2，所述自制引物库1种包含的引物序列为SEQ NO.1-474，所述自制引物库2包含的引物序列为SEQNO.475-934。
所述步骤(1a)的PCR扩增程序为酶活化后，99℃变性15秒、60℃退火/延伸17个循环4min，最后10℃静置。
所述自制引物库1包括237个扩增子，所述自制引物库2包括扩增子230个；所述扩增子的平均长度为125-375bp。
所述步骤(1b)中所述的PCR扩增程序为98℃静置2min，98℃15秒/64℃1min循环5次，最后10℃静置。
所述步骤(2)中的PCR扩增为乳浊液PCR扩增。
本发明所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，可以一次性检测35个基因的序列，在步骤(1)中就涉及到467对PCR扩增引物。在PCR扩增DNA片段时，需根据引物的Tm值设置PCR条件，如延长温度等，而由于本发明使用引物数量较多，众多引物的Tm值和理化性质差异比较大，为了让PCR扩增顺利进行，我们在数据系统进行了多次优化模拟，最后确定将自制引物分为2个引物库，并且最终实验数据证明2个引物库的设置能够满足文库构建的需求。
本发明旨在将半导体芯片技术与扩增子测序这种最新的测序技术相结合，建立一种能同时对目前已经确定的十余种先天性缺牙候选基因的外显子及外显子-内含子结合区域进行大样本量检测的；方便、快捷、高效的；可应用于先天性缺牙遗传学诊断的新方法。
本发明的成果不仅将显著提高先天性缺牙遗传学诊断的效率，扩大其候选基因的诊断涵盖面，同时将极大地丰富先天性缺牙的致病突变谱，利于分析基因间的交互作用，使我们对于这种疾病的致病因素有更加深入的认识。这些极富价值的研究成果最终将有利于先天性缺牙的遗传咨询和产前诊断。
附图说明
图1为待测序DNA样品AFK139-149用引物库1制备的测序文库片段用Agilent 2100BioanalyzerTMinstrument分析的结果图。
图2为待测序DNA样品AFK112用引物库2制备的测序文库片段用Agilent 2100BioanalyzerTMinstrument分析的结果图。
图3为测序单元1(待测序DNA样品AFK105-AFK125)的Summary Report对应的图。
实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1待测序DNA样品的获取
1)收集患者、家系成员以及正常对照的唾液样本2mL，收集于Oragene·DNA(OG-500)DNA采集试剂盒(DNA Genoteck，毕匹生物科技有限公司总代理)中的唾液样本采集管内，室温下储存。
2)使用Oragene·DNA(OG-500)DNA采集试剂盒(DNA Genoteck，毕匹生物科技有限公司总代理)对采集到的唾液样本进行人基因组DNA的提取。
3)提取的DNA取1μl上样，1％琼脂糖凝胶电泳检验基因组DNA量，UV-640 Beckman分光光度计进行DNA定量。以适量体积分装，-20℃冻存。
实施例2先天性缺牙基因的筛选
收集已经被报道的可能与先天性缺牙相关的基因，根据基因在牙胚发育过程中表达的重要性、在各文献或报道等出现频次、数据资料等因素，从收集的60多个先天性缺牙候选基因中筛选出35个，并且按照是否曾在人类先天性缺牙患者中检测出突变进行分类，如表1所示：
表1：入选的先天性缺牙基因
本发明所述的先天性缺牙易感基因的检测方法使用的检测样本来自患者、家系成员以及正常对照，可以检测出先天性缺牙患者在表1中35个基因序列中发生的基因突变情况，一方面用临床大数据验证现有的研发成果，另一方面也可以探索这35个基因在先天性缺牙患者基因中的连锁情况，从基因层面确诊先天性缺牙的致病机理，为探索先天性缺牙有效治疗手段提供研究基础。
实施例3
1.检测用试剂
文库构建试剂：
(1)引物库(Life Technologie合成)
(2)Ion AmpliSeqTMLibrary Kits 2.0(Life Technologies)
(3)Ion XpressTMBarcode Adapters(Life Technologies)
(4)XP Reagent(Beckman Coulter)
(5)Agilent High Sensitivity DNA Kit(Agilent)
Ion OneTouchTM试剂：Ion PGMTMHi-QTMOT2Kit(Life Technologies)
Ion Torrent测序试剂：Ion PGMTMHi-QTMSequencing Kit(Life Technologies)
2.实验流程
(1a)使用两组引物库(引物库的序列见实施例7)扩增目标区域全长基因，得初步测序文库片段。扩增体系和PCR扩增条件如下：
表格2：扩增系统
| 成分 | 添加量 |
| AmpliSeq<sup>TM</sup> HiFi Mix(red cap) | 4微升 |
| 自制引物 | 10微升 |
| 待测序DNA样品 | 10ng(x微升) |
| 不含核酸的水 | (6-x)微升 |
| 总体积 | 20微升 |
表格3：扩增条件
(1b)将初步测序文库片段进行消化引物、接头序列连接步骤后，用商业引物进行初步测序文库片段的PCR扩增，纯化，制备得测序文库片段。
消化引物的步骤为：向初步测序文库片段中加入2μl FuPa Reagent，按照如下程序操作：50℃10min，55℃10min，60℃20min，10℃静置1小时以上。
接头序列连接的步骤为：往22μl消化引物的产物中加入4μl Switch solution(yellow cap)和2μl稀释过的条码接头序列混合物，之后每孔中再添加2μl DNA连接酶，按照如下程序操作：22℃30min，72℃10min，10℃静置1小时以上。用XP Kit按照产品说明书操作步骤对产物进行纯化。
PCR扩增的步骤为：向扩增板中每个含有含有纯化产物的孔中分别加入50μlPCR SuperMix High Fidelity和2μl Library Amplification Primer Mix，按照如下程序操作：98℃静置2min，98℃15秒/64℃1min循环5次，10℃静置。
在所述步骤(1a)中，一个待测序DNA样品分为2个文库进行同步扩增，分别得到初步测序文库片段1和初步测序文库片段2，然后初步测序文库片段1和初步测序文库片段2分别经过所述步骤(1b)进行PCR扩增和纯化，分别得到2个测序文库片段。
(2)将多个待测序DNA样品的测序文库片段混合成一个测序单元的样品池，每个样品池的DNA终浓度为1000PM，将待测序DNA样品通过PCR扩增过程克隆到离子微球颗粒上，运行Ion OneTouchTM2进行扩增，使用Ion OneTouchTMES富集扩增后的离子微球颗粒。扩增体系为：
表格4：乳浊液PCR扩增体系
(3)将PCR扩增后的离子微球颗粒注入到测序芯片上，具体步骤为：
I)将Control Ion SphereTMParticles加入到Ion OneTouchTMES富集的离子微球颗粒中，离心去部分上清；
II)加入Ion PITMSequencing Primer；
III)95℃ 2minutes-37℃ for 2minutes；
IV)加入Ploymerase,室温孵育5minutes；
V)将新的318V2芯片安装到PGM上运行Chip Check检测芯片；
VI)Loading芯片；
VII)将芯片安装到ion PGM上；
运行测序程序。加入运行测序程序。
(4)结果分析。
实施例4
待测序DNA样品的信息如下表5所示：
表格5：待测序DNA样品信息
根据实施例3所述的步骤(1)的方法制备得到待测序DNA样品AFK105-AFK159的测序文库片段，使用Agilent 2100 BioanalyzerTMinstrument对测序文库片段进行分析，具体的是使用Agilent High Sensitivity DNA Kit检测测序文库片段质量，测序文库片段符合：测序文库片段的文库浓度大于1000Pm，长度分布范围为200-450bp之间，即测序文库片段为合格。
待测序DNA样品AFK132用引物库1制备的测序文库片段被称为AFK132-1，用引物库2制备的测序文库片段被称为AFK132-2，其他的待测序DNA样品的测序文库片段也按照此规则进行编号。
图1为待测序DNA样品AFK139-149用引物库1制备的测序文库片段AFK139-1到AFK149-1用Agilent 2100 BioanalyzerTMinstrument分析结果，其余样品与这11个样品相似。
图2为待测序DNA样品AFK112用引物库2制备的测序文库片段AFK112-2用Agilent2100 BioanalyzerTMinstrument分析结果，回收片段有效长度116bp-394bp区域样品量为4535.8pmol/L，文库质量符合检测范围，其余样品与待测序DNA样品AFK112相似。
表格6为待测序DNA样品AFK105-AFK159的检测结果。
表格6：待测序DNA样品AFK105-AFK159的文库质量检测结果
使用Agilent 2100BioanalyzerTMinstrument对测序文库片段结果表明，表格6中的待测序DNA样品经过实施例3实验步骤(1)的处理后，所得到的测序文库片段符合文库质量的标准，能够被用于下一步的检测。
实施例5
将实施例4中待测序DNA样品AFK105-AFK159的测序文库片段按照以下表格7分配到3个测序单元相应的样品池。通过2100定量文库浓度，16个待测序DNA样品的测序文库片段合并为一个测序单元的样品池，每个样品池的文库终浓度为1000PM。
表格7：待测序DNA样品AFK105-AFK159的分组
按照实施例3所述的方法进行实验步骤(2)-(4)的操作，3个测序单元的总数据量，reads数，平均读长如下表8所示：
表格8：待测序DNA样品AFK105-AFK159的测序结果
| chip 318 V2 | 测序单元1 | 测序单元2 | 测序单元3 |
| Total Bases | 1.24G | 1.21G | 1.12G |
| Total Reads | 5.07M | 5.19M | 4.9M |
| Mean Read Length | 245bp | 233bp | 229bp |
| Test Fragment | OK | OK | OK |
图3为测序单元1(待测序DNA样品AFK105-AFK125)的Summary Report对应的图，表格9为测序单元1(待测序DNA样品AFK105-AFK125)的Summary Report对应的数据总结表格。
结合图3和表格9的实验结果和数据，可以认为测试单元1是合格的。
表格9：测试单元1的结果
质控品：TF-A，TF-1测序质量大于50％，质控品的实验结果见表格10所示。该结果证明实验质控合格。
表格10：质控品的实验结果
测试单元2和测试单元3的Summary Report情况，与测试单元1的Summary Report情况相似。
结论：实施例4和实施例5的实验结果表明，本发明所述方法包含的各程序和各步骤运行稳定，从本实验方法得出的测序结果可靠。
实施例6
一位被临床确诊为先天性缺牙的患者血清，患者的牙齿诊断表征为：上颌缺牙数8颗、下颌缺牙数8颗，经询问该患者的临床表型和家族史的结果为：(1)牙槽嵴丰满度较差，颌间距离偏低。下前牙锥形。头发正常，眉毛稀疏，汗腺功能低下，有点口干。左腿有黑色斑块，手、右腿、腰处也长过，色素退了留斑；(2)小时候常感冒；(3)亲属中仅她1人有缺牙；(4)否认近亲结婚。
按照本发明所述的的方法，检测该患者的血清，分析结果如下：
芯片初步分析结果
根据PolyPhen-2软件(prediction of functional effects of human nsSNPs，http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)对上述基因突变位点导致的致病性分析，结合患者的表型相关性，初步判断该患者的致病基因是IKBKG。经Sanger测序验证，最终得出结论，该患者的致病基因突变是IKBKG Y376*。
本发明所述的方法与Sanger测序法获得的实验结果相符。证明本发明所述方法具有临床应用的价值。
实施例7
本发明所述的引物库见表格11和表格12。
表格11：引物库1的引物序列
表格12：引物库2的引物序列
表格11和表格12包含了本发明的自制引物的所有序列，其中表格12种引物名称为“WNT10A引物对7”，意思为基因WNT10A的第7对用于PCR扩增的引物对。表格12中与“WNT10A引物对7”位于同一行的序列SEQ NO.933和SEQ NO.934，分别为基因WNT10A的第7对用于PCR扩增的正向引物和反向引物。
表格11和表格12中其他序列和引物名称，都按照序列SEQ NO.933、序列SEQNO.934和“WNT10A引物对7”的形式进行解释。
Claims (8)
1.一种先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述方法包括：步骤(1)对待测序DNA样品进行PCR扩增，制备测序文库片段；
扩增待测序DNA样品的引物序列设计模板来自35个先天性缺牙相关基因：EDA、EDAR、EDARADD、WNT10A、MSX1、PAX9、AXIN2、BMP4、LTBP3、PITX2、SMOC2、PTH1R、GRHL2、GREM2、TRAF6、LHX8、LRP6、Lef1、SP3、BCOR、SLC26A2、Barx1、FGFR2、GJA1、NFKBIA、IKBKG、IRF6、OFD1、TP63、PVRL1、TBX3、TFAP2B、TCOF1、MSX2和SHH；
所述待测序DNA样品提取自人类体液；
步骤(2)将测序文库片段通过PCR扩增过程克隆到离子微球颗粒上；
步骤(3)将PCR扩增后的离子微球颗粒注入到测序芯片上，加入运行测序程序；
步骤(4)结果分析。
2.如权利要求1所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述步骤(1)中PCR扩增方法为：(1a)对待测序DNA样品用自制引物进行PCR扩增，得初步测序文库片段；(1b)将初步测序文库片段进行消化引物、接头序列连接步骤后，用商业引物进行初步测序文库片段的PCR扩增，制备测序文库片段。
3.如权利要求2所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述步骤(1a)中扩增待测序DNA样品的自制引物序列的核酸序列为SEQ NO.1-934。
4.如权利要求3所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述步骤(1a)中扩增待测序DNA样品的自制引物分散到引物库1和引物库2，所述引物库1种包含的引物序列为SEQ NO.1-474，所述引物库2包含的引物序列为SEQ NO.475-934。
5.如权利要求2所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述步骤(1a)的PCR扩增程序为酶活化后，99℃变性15秒；60℃退火和延伸17个循环4min；最后10℃静置。
6.如权利要求4所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述引物库1包括237个扩增子，所述引物库2包括扩增子230个；所述扩增子的平均长度为125-375bp。
7.如权利要求2所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述步骤(1b)中所述的PCR扩增程序为98℃静置2min；98℃处理15秒和64℃处理1min循环5次；最后10℃静置。
8.如权利要求1所述的先天性缺牙易感基因的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中的PCR扩增为乳浊液PCR扩增。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115992215A (zh) * | 2022-09-22 | 2023-04-21 | 中南大学 | 非综合征型先天缺牙基因突变位点及其应用 |
| CN116240268A (zh) * | 2023-02-27 | 2023-06-09 | 北京大学口腔医学院 | 用于检测多个基因重排探针系统 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104561250A (zh) * | 2013-10-22 | 2015-04-29 | 联合基因生物医药有限公司 | 伊马替尼靶向用药基因的检测方法及其引物 |
| CN106047857A (zh) * | 2016-06-01 | 2016-10-26 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种发掘特异性功能抗体的方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104561250A (zh) * | 2013-10-22 | 2015-04-29 | 联合基因生物医药有限公司 | 伊马替尼靶向用药基因的检测方法及其引物 |
| CN106047857A (zh) * | 2016-06-01 | 2016-10-26 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种发掘特异性功能抗体的方法 |
Non-Patent Citations (8)
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115992215A (zh) * | 2022-09-22 | 2023-04-21 | 中南大学 | 非综合征型先天缺牙基因突变位点及其应用 |
| CN116240268A (zh) * | 2023-02-27 | 2023-06-09 | 北京大学口腔医学院 | 用于检测多个基因重排探针系统 |
| CN116240268B (zh) * | 2023-02-27 | 2024-04-26 | 北京大学口腔医学院 | 用于检测多个基因重排探针系统 |
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