CN115992215A - 非综合征型先天缺牙基因突变位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了非综合征型先天缺牙基因突变位点及其应用，其为位于PAX9基因上的c.296C>A。基于该基因突变位点的检测引物可制成试剂盒，用于非综合征型先天缺牙机制研究、筛查、辅助诊断或辅助治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种先天缺牙致病基因，具体涉及一种非综合征型先天缺牙基因突变位点及其应用。属于基因技术领域。
背景技术
先天缺牙是指在牙胚形成过程中未能发育和形成的牙，属于牙齿发育异常中的数目异常。临床诊断以“临床检查牙齿部分或全部缺失，结合X线片证实没有恒牙胚，确认既往没有拔牙史”为标准。对于先天缺牙病例，在临床上一般根据缺失牙齿数目分为个别牙缺失(缺牙＜6个)、多数牙缺失(缺牙数≥6个)和先天性无牙。按是否有伴发症状，先天缺牙可分为非综合征型(单纯性)先天缺牙(指仅有牙齿的先天缺失，没有任何其他先天性发育畸形)和综合征型先天缺牙(指先天缺牙同时伴有其他器官的发育异常)。先天缺牙可同时伴随几种牙齿异常情况，如过小牙、锥形牙；且牙齿异位萌出，牙间隙扩大及乳牙滞留等牙齿异常也与先天缺牙有关。先天缺牙既影响患者的咀嚼，又影响其容貌、发音甚至心理健康。因此其病因的寻找成为现今众多口腔临床医生及基础研究学者关注的热点。
至今为止，超过150种综合征和80个基因与先天缺牙有关。但在先天缺牙患者中针对已知致病基因的突变检出率往往很低，国内外仍有许多病例未找到与之临床表现对应的基因突变类型。提示先天缺牙存在明显遗传异质性，可能存在新的致病基因或者已知基因的未知突变未被发现。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供非综合征型先天缺牙基因突变位点及其应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、非综合征型先天缺牙基因突变位点，其为位于PAX9基因上的c.296C>A。
2、检测基因突变位点的引物在制备非综合征型先天缺牙机制研究、筛查、辅助诊断或辅助治疗试剂盒中的应用，所述的基因突变位点为位于PAX9基因上的c.296C>A。
优选的，所述引物包括上游引物和下游引物，它们的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
上游引物：aggagtgttcgtgaacggga，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：agggctggggtacgagtaga，如SEQ ID NO.2所示。
3、一种用于非综合征型先天缺牙机制研究、筛查、辅助诊断或辅助治疗的试剂盒，其包含检测基因突变位点的引物，所述的基因突变位点为位于PAX9基因上的c.296C>A。
4、一种非综合征型先天缺牙基因突变位点的筛选方法，具体步骤如下：
(1)收集有家族遗传史的非综合征型先天缺牙家系，通过家系调查及临床资料收集，确定该家系中的非综合征型先天缺牙患者，进而确定先证者；
(2)提取基因组DNA，对先证者进行全外显子组测序；
(3)对全外显子组测序原始数据按照表1的筛选策略进行数据筛选；
表1.全外显子测序原始数据筛选策略
(4)在筛选出的候选基因中，根据Provean和SIFT、Mutation Taster和Polyphen-2网站进行与非综合征型先天缺牙的相关性预测，经分析确定PAX9基因c.296C>A突变是导致非综合征型先天缺牙的突变位点。
本发明的有益效果：
申请人前期通过全外显子组测序以及家系共分离找到了一个从未报道与非综合征先天缺牙有关的新突变(PAX9基因上的c.296C>A)，该突变与先天缺牙之间的关系尚不明确，也未见相关的功能研究。申请人通过一系列的体外功能实验证实了该突变是导致先天缺牙的重要原因，扩大了该疾病的致病基因谱，为非综合征先天缺牙的遗传咨询、预防和基因治疗提供了依据，同时也为大范围先天缺牙人群筛查提供了理论基础。
附图说明
图1是非综合征型先天缺牙显性遗传家系图谱；
图2是家系中患者的全景片A.IV-1先证者全景片B.II-1全景片C.III-2全景片D.IV-2全景片(白色五角星代表先天缺牙位置，蓝色五角星代表因外伤史或拔除史缺牙位置)；
图3是Sanger测序结果(箭头代表突变的碱基位置)；
图4是PAX9-空载质粒图谱；
图5是PAX9-MUT质粒图谱；
图6是pGL3-Basic-BMP4P质粒图谱；
图7是细胞定位实验荧光图(实验重复3次)；
图8是放线菌酮示踪实验蛋白降解速率(实验重复3次)；A.Western Blot条带图B.数据统计折线图(*：P<0.05)；
图9是双荧光素酶报告实验结果(实验重复3次)；(MOCK为空载组；WT为正常PAX9；MUT为突变PAX9；*：P<0.05)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
1.家系调查及临床资料收集
对就诊中南大学湘雅口腔医院儿童口腔科患儿进行口腔检查，收集有家族遗传史的非综合征型先天缺牙家系，签署知情同意书。
(1)填写相关调查问卷。
(2)问诊：采集基本资料，询问是否有外伤史或拔牙史等。
(3)专科检查及全身体格检查：记录缺失牙齿的数量、具体位置及形状异常的牙齿；判断是否伴有其他组织或器官(如毛发、皮肤粘膜、骨骼和指甲等)发育异常。
(4)全景片X线检查：判断继承恒牙胚有无缺失。
(5)对先证者及其他缺牙患者进行图片信息的采集：拍摄面相、四肢照片和口内相。
综合以上信息后确定此家系的临床表型特征(所有第三磨牙的缺失均不纳入缺牙记录)。
结果：该家系有四代人，家系成员一共12人。通过家系调查及临床资料收集，确定在该家系中有4名非综合型先天缺牙患者：分别为先证者(IV-1)(12、15、16、17、21、22、25、26、27、33、37、47牙未见)、先证者的外公(II-1)(12、15、21、32、41牙未见，21、41牙有外伤史)、先证者的母亲(III-2)(17、26、27牙未见，26牙有拔牙史)和先证者的妹妹(IV-2)(17、16、13、12、27、37、47牙)，家系图见图1，全景片见图2。
2.家系致病基因的筛查和确定
2.1提取基因组DNA
(1)取4ml外周血加入40ml 1×红细胞裂解液，混匀。
(2)4℃，3000rpm，离心10min，弃上清液。加3ml 1×细胞核裂解液、25μlproteinase K(蛋白酶K)、300μl质量浓度20％SDS(十二烷基硫酸钠)水溶液，振荡混匀。37℃消化过夜。
(3)将消化液加6ml饱和酚，混匀，4℃，3000rpm，离心10min，取上清，加入氯仿和饱和酚(各3ml)，颠倒混匀，4℃，3000rpm，离心10min，取上清，加6ml氯仿，颠倒混匀，4℃，3000rpm，离心10min，取上清，加入10ml无水乙醇，颠倒混匀，可见白色絮状物。用平头、大直径的大Tip头将白色絮状物吸出，收集至1.5ml EP管，部分保存至-20℃冰箱，部分继续进行DNA的溶解。
(4)13000rpm，常温下离心20min，去上清，加入400μl体积分数75％的乙醇，缓慢上下颠倒混匀，13000rpm离心5min。
(5)去上清，加入200μl体积分数75％的乙醇，上下颠倒混匀，4℃，3000rpm，离心10min。
(6)取上清，室温下开盖干燥5min，可见白色絮状物变透明，即获得了DNA。
(7)加入30μl EB，室温下溶解过夜。
(8)用移液枪吹打混匀后点离，紫外测OD值，检测DNA质量及浓度(A260/A280比值在1.8～2.0之间)。
2.2全外显子组测序
对先证者IV-1进行全外显子测序，由The Berry Genomics Co.,Ltd.(北京，中国)进行。步骤包括对DNA样品进行检测；建库捕获；库检；上机测序。
2.3生物信息学分析
对于WES原始结果进行下一步的筛选，数据过滤策略如下(表1)：
表1.全外显子组原始数据筛选策略
在筛选出的候选基因中，根据Provean和SIFT、Mutation Taster和Polyphen-2网站进行与非综合征型先天缺牙的相关性预测，经分析获得其中PAX9基因c.296C>A突变是有可能在此家系中导致非综合征型先天缺牙的一个重要突变位点。
2.4Sanger测序
针对筛选出的候选基因设计特异性引物，PCR扩增所有家系成员的DNA，再进行Sanger测序，最后进行家系共分离，以确认该家系的突变基因及突变位点。PAX9的核苷酸序列和编号来自GenBank(登录号:NC_000014.9，核苷酸编号:NM_006194)。采用PrimerPremier 5.0设计候选基因引物，扩增出编码区，并用Primer BLAST对引物进行验证(引物序列见表2)。
表2.突变所在位点测序引物序列
PCR扩增条件：预变：95℃，3min；变性：95℃，15s；复性：60℃，15s；延伸：72℃，30s；修复延伸：72℃，5min；反应终止：4℃，hold。
PCR扩增后，将PCR产物通过质量浓度1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的PCR条带切胶回收；测序产物进行纯化，上机电泳，将对应的PCR产物送至上海Biosune公司进行Sanger测序，用sequence analysis分析结果，基因分型结果，如图3所示，非综合征型先天缺牙患者均为杂合突变，而正常对照在该位点未发现突变。由此根据本发明的设计方案，可以在此实施例中成功证实通过全基因组外显子测序所检测到的该PAX9基因第三外显子上的c.296C>A突变可能为非综合征型先天缺牙新致病位点，且杂合即可致病，可见，本发明所提供的PAX9突变基因可以用于非综合征型先天缺牙机制研究、筛查、辅助诊断和/或治疗。
3.致病基因突变位点的功能研究
3.1构建PAX9-空载、PAX9-WT、pGL3-BMP4、pRL-TK质粒
(1)PAX9-WT/MUT/空载质粒的构建
委托OBIO TECHNOLO(SHANGHAI)公司合成PAX9(NM_006194.3)的cDNA序列全长，克隆到PAX9-空载质粒(图4)，获得PAX9-WT质粒。使用Primer Star(Vazyme)试剂盒进行定点诱变，获得突变型PAX9-MUT质粒(图5)，定点诱变引物序列如表3：
表3定点诱变引物序列
(2)双荧光素酶报告实验相关质粒的构建
委托HonorGene(CHANGSHA)公司合成pGL3-Basic(产品货号：HG-VQP0121)和内参pRL-TK质粒(产品货号：HG-VQP0126)，再将BMP4启动子序列(NM_001202)(约2kb)克隆到pGL3-Basic上获得BMP4相关启动子报告质粒pGL3-Basic-BMP4p。选取BMP4启动子更为有效的序列(约400bp)重新构造了BMP4相关启动子报告质粒(记为pGL3-Basic-BMP400)。pGL3-Basic-BMP4P质粒图谱见图6。
3.2真核表达质粒的表达
选取COS-7细胞(4代)进行第一次细胞传代，再进行常规细胞传代，细胞冻存，细胞复苏，使用Lipo-3000和质粒混合，室温下孵育，培养。
3.3突变蛋白细胞定位实验
本实验分为三组——WT组、MUT组和对照组，将PAX9-MUT、PAX9-WT和PAX9-空载三组质粒分别转染至COS-7细胞中，转染48h后，DAPI染色，通过Leica荧光显微镜观察蛋白与细胞核的相对位置。结果表明PAX9-WT和PAX9-MUT蛋白均定位于胞核中，PAX9-MUT在细胞中的定位并未改变(图7)。
3.4放线菌酮示踪实验
进一步通过放线菌酮示踪实验来对比PAX9-MUT蛋白和PAX9-WT蛋白在细胞中的稳定性，将两组质粒PAX9-MUT和PAX9-WT分别转染至COS-7细胞，转染24h后加入放线菌酮(Cycloheximide，CHX)试剂(工作浓度20mg/ml)，然后分别在0h，2h，4h，8h，12h和24h共6个时间点提取蛋白，结果表明抑制蛋白合成后PAX9-MUT蛋白在第4h开始出现明显降解，且整体降解速度较PAX9-WT组明显加快，在第9个小时左右蛋白已降解至50％；PAX9-WT蛋白在CHX处理后第12h开始出现明显降解(p<0.05)，处理后24h蛋白也未降解至原有的50％(图8)。
3.5双荧光素酶报告实验
本实验旨在探讨PAX9基因对下游靶基因BMP4启动子激活作用的影响，选取了BMP4上游400bp左右的启动子区域，并成功构建了PAX9报告质粒(pGL3-Basic-BMP400)。
本实验的步骤如下：
(1)取生长状况良好的COS-7细胞(购自BNCC生物公司)，接种；
(2)实验分为三组，分别是WT组、MUT组和对照组(MOCK组)，每组共转染三种质粒，每孔质粒的总量为1μg；
(3)转染前1h换成DMEM培养液，用Lip-2000转染试剂进行转染，6h后换成10％完全培养基；
(4)24h后，将24孔板放置在冰上，弃培养基，用预冷过的PBS液洗3次，每孔加入1xPBL(24孔板每孔加入100μl)，放在摇床上室温摇5min；
(5)用枪尖头将裂解的细胞充分吹打后收集到1.5ml EP管，常温12000rpm离心5min，将上清液转移到一个新的印管中；
(6)设置单管式化学发光分度计参数，选择“DUALMEAS”模式，“Delay time”2s，“Measurement”10s。
(7)按照说明书配制LARII(配置后冻存于-80℃)和Stop&Glo工作液(保存至-20℃，需新鲜配置)。在1个新的1.5ml EP管中加入50μl LARII(购自Promega公司，荧光素酶检测试剂。)，再加入10μl细胞裂解液(尽量取上清)，混合后读取萤火虫荧光值；继续快速加入50μl Stop&Glo，读取海参荧光值。每个孔的最终荧光值为萤火虫荧光/海参荧光值。
结果表明PAX9突变后，PAX9对BMP4启动子激活能力下降，BMP4转录的活性降低，结果具有统计学差异(p＜0.05)(图9)。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (5)
1.非综合征型先天缺牙基因突变位点，其特征在于，其为位于PAX9基因上的c.296C>A。
2.检测基因突变位点的引物在制备非综合征型先天缺牙机制研究、筛查、辅助诊断或辅助治疗试剂盒中的应用，其特征在于，所述的基因突变位点为位于PAX9基因上的c.296C>A。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
上游引物：aggagtgttcgtgaacggga，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：agggctggggtacgagtaga，如SEQ ID NO.2所示。
4.一种用于非综合征型先天缺牙机制研究、筛查、辅助诊断或辅助治疗的试剂盒，其特征在于，其包含检测基因突变位点的引物，所述的基因突变位点为位于PAX9基因上的c.296C>A。
5.一种非综合征型先天缺牙基因突变位点的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)收集有家族遗传史的非综合征型先天缺牙家系，通过家系调查及临床资料收集，确定该家系中的非综合征型先天缺牙患者，进而确定先证者；
(2)提取基因组DNA，对先证者进行全外显子测序；
(3)对全外显子测序原始数据按照表1的筛选策略进行数据筛选；
表1.全外显子测序原始数据筛选策略
(4)在筛选出的候选基因中，根据Provean和SIFT、Mutation Taster和Polyphen-2网站进行与非综合征型先天缺牙的相关性预测，经分析确定PAX9基因c.296C>A突变是导致非综合征型先天缺牙的突变位点。
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