CN110343745A - 一种egfr/l858r突变超敏检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒及其应用，所述的一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒，其特征在于，包含L858R突变上游发泡富集引物和EGFR基因下游引物，qPCR反应体系试剂，突变型与野生型EGFR基因的阳性质粒。本发明可用于肺癌EGFR/L858R突变血清游离DNA的定性检测，试剂盒的实验检测下限为0.1%。该试剂盒检测方法只涉及到染料法qPCR，不涉及探针的合成与修饰，检测费用低，有利于节省广大患者的基因检测费用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒。
背景技术
L858R突变导致EGFR中第858位的亮氨酸（L）被精氨酸（R）取代，该突变发生在含激酶结构域的第21外显子上。L858R突变在肺肿瘤中以约43％的频率发生，与多种EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）药物疗效高度相关。在肺癌转移过程中，EGFR突变可被用于患者对TKIs药物敏感性的预测，包括一代药物Gefitinib (Iressa)和erlotinib (Tarceva)及第二代药物Afatinib (Gilotrif)。与EGFR野生型肿瘤相比，EGFR突变肿瘤患者具有更好的预后。EGFR突变肿瘤患者TKI治疗的无进展生存期比接受化疗的患者更长，TKI治疗的转移性EGFR突变肿瘤患者的中位生存期约为两年。
在临床应用中，原发性肿瘤切除的肺癌患者因无法获取肿瘤组织而未进行L858R突变分子检测的可能性较大。一些前瞻性研究表明，与肿瘤组织相比，血液循环肿瘤DNA（ctDNA）中EGFR突变检测同样具有较高的特异性，但是敏感度有待提高。基于此，我们开发了一种新的L858R突变液体活检试剂盒，实验检测下限(LOD)为0.1%，该试剂盒可在EGFR-TKIs治疗过程中连续监测L858R ctDNA，利于患者尽可能从TKI的治疗中受益。
发明内容
本发明的目的：提供一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒，实验检测下限(LOD)为0.1%，该试剂盒检测方法只涉及到染料法qPCR，不涉及探针的合成与修饰，检测费用低，有利于节省广大患者的基因检测费用。
本发明提供的EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的引物包括：
L858R突变上游发泡富集引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；
EGFR基因下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
优选的技术方案是：EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的发泡富集引物末端核苷酸经过调整，其中3’端第二位碱基与EGFR序列没有互补，3’端第一位碱基与突变型互补，但与野生型不互补。此外，发泡富集引物与EGFR配对时，两侧配对，但中间有一“发泡”位置，该序列与EGFR并不配对，跨越基因7个bp。由于发泡富集引物3’端连续两个碱基都与野生型模板不匹配，野生型EGFR不能够产生荧光信号，但发泡富集引物5’端“泡”前位置与EGFR配对可增强发泡引物与靶序列的识别，其扩增L858R突变的能力得到增强，可以特异扩增含L858R突变的EGFR 核酸片段。
上述试剂盒中还包括EGFR基因L858R突变型和野生型的基因组片段阳性对照质粒（L和R质粒）。
本发明提供了一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
步骤1：针对突变位点设计L858R突变上游发泡富集引物和EGFR基因下游引物；
步骤2：血液DNA的提取；
步骤3：qPCR扩增方法。
在所述的步骤1中，EGFR的突变点为rs121434568（NCBI SNP数据库），两侧序列为：CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC[G/T]GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAG，其中野生型为T，突变型为G，突变后氨基酸L [Leu] 转变为R [Arg]，形成错意突变。以该突变位置附近前后250bp为模板序列，设计L858R突变上游发泡富集引物，EGFR基因下游引物。
在所述的步骤2中，取1 ml全血，2000 rpm离心 10 min，将上清移至新的离心管中；重复离心，将剩余上清转入离心管后，加入介孔纳米磁珠50 μl；用NaCl调节 Na+ 浓度至0.4 mol / L，漩涡震荡1 min；室温吸附 10 min ；将离心管轻微漩涡震荡5 sec，立即置于磁力吸附架上，静置5 sec，吸弃液体；用洗涤液 300 μl（0.4 mol / L NaCl）重复上述步骤2次；开盖干燥 10 min，加入去离子水 100 μl，漩涡震荡混匀，65℃ 水浴10 min；将离心管漩涡震荡10 sec，立即置于磁力吸附架上，静置5 sec，吸取液体备用。
在所述的步骤3中，qPCR扩增反应体系包括：
PCR反应体系：1μl L858R突变上游发泡富集引物（浓度5-10 μM ），1 μl EGFR基因下游引物（浓度5-10 μM ）；12.5 μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 2-5 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl，在退火阶段采集荧光信号（使用FAM荧光通道）。qPCR 程序设置为：94℃ 2 min；94℃ 50 sec，58℃ 30 sec, 72℃ 10 sec, 35-50cycles；72℃ 1min；4℃恒温。
本发明相对于现有技术具有如下的优点与效果：
EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的发泡富集引物末端核苷酸经过调整，其中3’端第二位碱基与EGFR序列没有互补，3’端第一位碱基与突变型互补，但与野生型不互补，避免野生型EGFR被扩增出；发泡富集引物与EGFR配对时，其5’端配对区的退火温度较普通PCR温度更高，使得发泡富集引物更容易和L858R突变基因序列配对，提升总体PCR效率；由于不涉及探针的使用，试剂盒操作简单，检测价廉，可以大规模推广；试剂盒检测速度快，检测过程只需要3小时完成。
附图说明
图1是本发明EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的引物设计策略。
图2是本试剂盒对L858R突变型质粒的qPCR灵敏度检测。
具体实施方式
实施例1用于EGFR基因 L858R突变检测的发泡富集引物设计及其特异性和敏感性验证。
引物设计：EGFR的突变点为rs121434568（NCBI SNP数据库），两侧序列为：CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC[G/T]GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAG，其中野生型为T，突变型为G，突变后氨基酸L [Leu] 转变为R [Arg]，形成错意突变。以该突变位置附近前后250bp为模板序列，设计L858R突变上游发泡富集引物，EGFR基因下游引物（图1）。
血液DNA提取：取1 ml全血，2000 rpm离心 10 min，将上清移至新的离心管中；重复离心，将剩余上清转入离心管后，加入介孔纳米磁珠 50 μl；用NaCl调节 Na+ 浓度至0.4mol / L，漩涡震荡1 min；室温吸附 10 min ；将离心管轻微漩涡震荡5 sec，立即置于磁力吸附架上，静置 5 sec，吸弃液体；用洗涤液 300 μl（0.4 mol / L NaCl）重复上述步骤2次；开盖干燥10 min，加入去离子水 100 μl，漩涡震荡混匀，65℃ 水浴 10 min；将离心管漩涡震荡10 sec，立即置于磁力吸附架上，静置 5 sec，吸取液体备用。
qPCR扩增反应体系与扩增参数：PCR反应体系：1μl L858R突变上游发泡富集引物（浓度10 μM ），1 μl EGFR基因下游引物（浓度10 μM ）；12.5 μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl23 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl，在退火阶段采集荧光信号（使用FAM荧光通道）。
以20%R, 5%R，1%R, 0.1%R, 0.01%R的质粒为模板的灵敏度试验中（L858R突变型的质粒浓度为25 copy/20 μl,L质粒浓度依照百分比增加），发现用L858R突变上游发泡富集引物能检出0.1%的R型质粒（图2），所扩增产物由测序验证。
实施例2用于EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒对临床样本的检测。
1、临床样本准备，取20例经组织切片分子检测确认肺癌L858R突变样本中，取全血1ml备用，另取正常人全血样本作为对照。
2、血液DNA提取，取1 ml全血，2000 rpm离心 10 min，将上清移至新的离心管中；重复离心，将剩余上清转入离心管后，加入介孔纳米磁珠 50 μl；用NaCl调节 Na+ 浓度至0. 4 mol / L，漩涡震荡1 min；室温吸附 10 min ；将离心管轻微漩涡震荡5 sec，立即置于磁力吸附架上，静置 5 sec，吸弃液体；用洗涤液 300 μl（0. 4 mol / L NaCl）重复上述步骤2次；开盖干燥 10 min，加入去离子水 100 μl，漩涡震荡混匀，65℃ 水浴 10 min；将离心管漩涡震荡10 sec，立即置于磁力吸附架上，静置 5 sec，吸取液体备用。
3、qPCR扩增反应体系与扩增参数：PCR反应体系：1μl L858R突变上游发泡富集引物（浓度10 μM ），1 μl EGFR基因下游引物（浓度10 μM ）；12.5 μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)；dNTP 0.5 mM；MgCl2 3 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl，在退火阶段采集荧光信号（使用FAM荧光通道）。
4、qPCR 程序设置为：94℃ 2 min； 94℃ 50 sec，62℃ 30 sec, 72℃ 10 sec,50 cycles；72℃ 1min；4℃∞。
在20个接受检测的样本中，在使用L858R突变上游发泡富集引物的PCR扩增过程中，18个样本均为阳性，但在以去掉发泡区域及其5’侧翼序列的上游引物作为PCR引物时，只有7个样本为阳性信号（表一）。
考虑到在不同患者虽然患上相同类型的癌症，但他们身上的ctDNA水平可能相差较大。即使是在转移性癌症患者中，也有很大一部分患者血浆中ctDNA的比例异常的少。据估算，1毫升血浆中含有大约1500个基因组当量（GE）的DNA片段，通常一次1毫升抽血可以从血样中获得0.4毫升血浆，意味着能够获得600 GE的DNA片段。假设ctDNA的突变等位基因频率（VAF）为0.1%的情况下，只有0.6个DNA分子携带着想要检测到的基因突变，但考虑到20个接受检测的样本为肺癌组织阳性L858R突变样本，本实验的18个阳性结果是可信的。在以去掉发泡区域及其5’侧翼序列的上游引物（TCAAGATCACAGATTTTGGGAG）作为PCR引物时，只有7个样本为阳性信号（阳性对照质粒为阴性），表明上游引物的位置受到突变点的影响，引物扩增效率、特异性都不可能高于发泡富集引物。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法与其核心思想，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<120> 一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
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tgaaaacacc gcagcatgta gatcgatgca tcaatcaaga tcacagattt tgggag 56
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
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Claims (6)
1.一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒，其特征在于，包含L858R突变上游发泡富集引物和EGFR基因下游引物，qPCR反应体系试剂，突变型与野生型EGFR基因的阳性质粒。
2.本发明提供了一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的制备与使用方法，其特征在于，具体步骤包括：
步骤1：针对突变位点设计L858R突变上游发泡富集引物和EGFR基因下游引物；
步骤2：血液DNA的提取；
步骤3：qPCR扩增方法。
3.根据权利要求2所述的一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的制备与使用方法，其特征在于：在所述的步骤1中，EGFR的突变点为rs121434568（NCBI SNP数据库），其中野生型为T，突变型为G，突变后氨基酸L [Leu] 转变为R [Arg]，形成错意突变，以该突变位置附近前后250bp为模板序列，设计L858R突变上游发泡富集引物，EGFR基因下游引物。
4.根据权利要求2所述的一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的制备与使用方法，其特征在于：在所述的步骤2中，取1 ml全血，2000 rpm离心 10 min，将上清移至新的离心管中；重复离心，将剩余上清转入离心管后，加入介孔纳米磁珠50 μl；用NaCl调节 Na+ 浓度至0.4 mol / L，漩涡震荡1 min；室温吸附 10 min ；将离心管轻微漩涡震荡5 sec，立即置于磁力吸附架上，静置5 sec，吸弃液体；用洗涤液 300 μl（0.4 mol / L NaCl）重复上述步骤2次；开盖干燥 10 min，加入去离子水 100 μl，漩涡震荡混匀，65℃ 水浴10 min；将离心管漩涡震荡10 sec，立即置于磁力吸附架上，静置5 sec，吸取液体备用。
5.根据权利要求2所述的一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的制备与使用方法，其特征在于：在所述的步骤3中，qPCR扩增反应体系包括：
PCR反应体系：1μl L858R突变上游发泡富集引物（浓度5-10 μM ），1 μl EGFR基因下游引物（浓度5-10 μM ）；12.5 μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 2-5 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl，在退火阶段采集荧光信号（使用FAM荧光通道）。
6. 根据权利要求2所述的一种EGFR/L858R突变超敏检测试剂盒的制备与使用方法，其特征在于：在所述的步骤3中，qPCR 程序设置为：94℃ 2 min；94℃ 50 sec，58℃ 30 sec,72℃ 10 sec, 35-50 cycles；72℃ 1min；4℃恒温。
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