CN108676852B

CN108676852B - 在外周血游离dna中检测p53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒

Info

Publication number: CN108676852B
Application number: CN201810536403.6A
Authority: CN
Inventors: 朱运峰; 石焕焕; 操清兰; 刘纯希
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108676852A

Abstract

本发明公开一种在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒。本发明首先公开了在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成。本发明进一步公开了包含上述引物对组的试剂盒。本发明在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒，该检测具有高敏感性和特异性，对肿瘤风险预测以及疗效评估具有重要的价值。

Description

在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒。

背景技术

在肿瘤预防与治疗的临床需求中，液体活检已成为肿瘤风险预测、靶向药物用药指导以及疗效评估的重要手段，其中肿瘤的早期风险评估是肿瘤预防的最重要的环节。血液因其含有大量肿瘤相关信息无疑是液体检测的最佳样本，其中外周血游离DNA是目前液体活检关注的热点，该游离DNA存在于血浆或血清中，它既可能来自于正常细胞死亡的释放物，也可能来自于肿瘤或癌前病变细胞的死亡释放物，同时无论正常细胞还是肿瘤细胞均可主动释放。

肿瘤的发生发展过程中，不仅涉及基因结构的改变(突变、缺失、转位等)，而且更多的还表现在表观遗传学修饰的变化，尽管关键基因的结构改变在其过程中起着非常重要的作用，但结构性改变发生的位点与频率在很多肿瘤中差异很大，并具有随机性，同时这些改变在疾病的进程中是一个不断积累的过程，特别是在肿瘤的早期，来自于肿瘤结构性改变的DNA在外周血中的丰度都很低，对检测的敏感度要求很高，从而给检测带来了极大的挑战。尽管目前二代测序可以通过增加测序的深度来增加其敏感性，但一方面成本显著的增高，同时另一方面并不是基因所有结构性改变都与肿瘤有关，即有些突变并没有发现其与肿瘤的相关性。

相对于基因突变的低丰度，基因的表观遗传学修饰变化则更为普遍，这样靶向基因修饰差异性的检测则具有更高的敏感性。表观遗传学研究发现，基因的修饰与其表达能力密切相关，这些修饰主要表现在DNA的甲基化和组蛋白的各种修饰上。近来研究发现，表观遗传学修饰既可发生在基因的启动子区域，也可发生在基因体(Gene Body，包含外显子、内含子以及两端的非翻译区)中。已知基因启动子的甲基化与基因表达呈负相关(影响转录因子以及RNA聚合酶的结合)，但对基因体中表观遗传学修饰的功能仍不清楚，当前的研究主要集中在对基因启动子区域的表观遗传学修饰上，而对基因体中各种表观遗传学修饰的变化则关注很少。

由于肿瘤的发生的根本原因是基因组调控异常，P53基因已被证明在肿瘤的发生与发展过程中具有极其重要的作用，特别是在肿瘤的早期阶段，大量报道显示P53基因出现调控异常。因此，建立一种对P53基因表观遗传修饰差异的检测方法，将可实现对肿瘤的风险评估、疗效评价以及预后预测，对肿瘤预防以及治疗均具有重大的指导意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一组用于在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组。

本发明的另一个目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、特异性强的在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

发明人研究发现，在高的变性温度(94℃)下，表观遗传学修饰对DNA的解链没有明显的影响，表现为完全解链，高温条件下定量PCR扩增的Ct值标记为Ct_HT；但在低温变性条件(实验条件需要摸索)下，表观遗传学修饰则对DNA的解链有较大的影响，表现为解链程度的不同，进而影响PCR扩增的效率，低温条件下定量PCR扩增的Ct值标记为Ct_LT，△Ct＝|Ct_HT–Ct_LT|。在定量PCR扩增过程中，发明人发现在来自于正常人和肿瘤患者的外周血游离DNA中，P53外显子中的某些区域DNA片段，在低温变性条件下其扩增效率显著不同，而启动子区域则没有发现有显著性差异(结果没有给出)。即在低温变性条件下，相对于正常人，肿瘤患者的P53基因中的某些片段更难以解链，表现为扩增效率降低，这样针对P53基因的待测区域进行检测，可以鉴别外周血游离DNA的正常来源以及肿瘤来源。为进一步证明这种差异来自于表观遗传学修饰的不同，发明人以稀释后的PCR产物为模板进行再次扩增(该PCR产物为没有任何修饰的裸露DNA)，发现其ΔCt值显著小于正常人来源以及肿瘤来源的DNA样本，以上结果表明：无论正常人来源还是肿瘤来源的外周血游离DNA均存在不同程度的表观遗传学修饰，该修饰影响DNA的解链并进一步影响PCR的扩增效率，并且这种修饰在正常人与肿瘤患者中显著的不同。

这样可根据正常人与肿瘤患者P53基因待测区域ΔCt值的不同，评估正常人与肿瘤患者该基因表观遗传学修饰的差异。研究发现，在正常人与肿瘤患者外周血来源的游离DNA中，单个区域修饰差异的变异较大，进一步对P53基因的不同区域进行了综合分析，其中不同区域xn的ΔCt标记为△Ct_xn，并采用SPSS软件对不同区域的ΔCt_xn值进行了加权计算，得到ΔCt_加权值。

发明人通过大量的筛选实验，获得了用于检测P53基因不同区域片段表观遗传学修饰差异的引物对组，得到了对应的△Ct值，对这些不同区域片段△Ct进行加权分析后，得到ΔCt_加权值以及检测阈值(Cut Off值)，并根据该阈值在肿瘤与正常样本中进行了敏感性与特异性分析。

基于以上研究，本发明首先提供了一组在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成；

其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为140bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为204bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为153bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为180bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针。

进一步，本发明提供了一种在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的试剂盒，所述试剂盒包括由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成的引物对组。

进一步，所述试剂盒还包括质控对照DNA样品；所述质控对照DNA样品为裸露的DNA，例如可以为不存在表观遗传学修饰的PCR产物；为更好的模拟游离DNA的浓度，PCR产物需要高度稀释使其与样本浓度相当，再作为模板重新扩增；

其中，所述质控对照DNA样品包括P53基因外显子3区域片段长度为140bp裸露DNA、P53基因外显子3区域片段长度为204bp裸露DNA、P53基因外显子4区域片段长度为153bp裸露DNA和P53基因外显子4区域片段长度为180bp裸露DNA。

进一步，所述试剂盒还包括PCR反应液和ddH₂O。

本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)抽提外周血游离DNA；

2)使用由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成的引物对组，分别对外周血游离DNA及质控对照DNA样品在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，得到P53基因待测区域片段xn的△Ct_xn＝|Ct_xn-HT–Ct_xn-LT|及质控对照DNA样品xn'的△Ct_xn'＝|Ct_xn'_-HT–Ct_xn'_-LT|；

其中，Ct_xn-LT表示P53基因待测区域片段xn在低温变性条件下扩增的Ct值；Ct_xn-HT表示P53基因待测区域片段xn在高温变性条件下扩增的Ct值；；例如在本发明中△Ct_xn可以为△Ct_x1、△Ct_x2、△Ct_x3、△Ct_x4；△Ct_x1代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp的△Ct值，△Ct_x2代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp的△Ct值，△Ct_x3代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp的△Ct值，△Ct_x4代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp的△Ct值；

Ct_xn'_-LT表示质控对照DNA样品xn'在低温变性条件下扩增的Ct值；Ct_xn'_-HT表示质控对照DNA样品xn'在高温变性条件下扩增的Ct值；例如在本发明中△Ct_xn'可以为△C_x1'、△Ct_x2'、△Ct_x3'、△Ct_x4'；△Ct_x1'代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp裸露DNA的△Ct值，△Ct_x2'代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp裸露DNA的△Ct值，△Ct_x3'代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp裸露DNA的△Ct值，△Ct_x4'代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp裸露DNA的△Ct值；

比较△Ct_xn与△Ct_xn'的差异判定外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn是否存在表观遗传学修饰：当△Ct_xn＝△Ct_xn'±[标准误]时，说明外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn不存在表观遗传学修饰；否则说明外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn存在表观遗传学修饰。

在本发明中所述高温变性条件为可以使得DNA完全解链的温度，优选的为94℃；所述低温变性条件为可以使得DNA部分解链的温度，需要根据实验进行确定(采用变性温度梯度PCR进行实验)，原则上是DNA可以被检测到扩增的最低变性温度。

进一步，所述结果判定包括对P53基因不同待测区域片段的△Ct_xn进行加权计算，具体公式为：

△Ct_加权值＝a*△Ct_x1+b*△Ct_x2+c*△Ct_x3+d*△Ct_x4；

其中，a,b,c,d为回归分析对P53基因不同待测区域片段对应的△Ct值给出的加权系数；

△Ct_x1代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp的△Ct值，△Ct_x2代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp的△Ct值，△Ct_x3代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp的△Ct值，△Ct_x4代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp的△Ct值。

由于P53基因单个区域片段在肿瘤与正常人中表观遗传学修饰的差异范围较大，需要进一步对这些不同区域片段进行加权计算，求出△Ct_加权值，并据此得出阈值(Cut Off值)。这样，本发明基于肿瘤患者以及正常人的外周血游离DNA样本，通过P53基因不同区域片段的△Ct值检测，并进一步经统计学回归分析得到△Ct_加权值，并用得到的阈值对正常人与肿瘤患者进行阴阳性鉴别。

在本发明具体的实施方式中，基于32例肿瘤患者以及32例正常人的外周血游离DNA样本，对P53基因不同待测区域片段的△Ct_xn进行了检测，并通过对这些待测区域片段的△Ct_xn的加权计算(SPSS软件分析)，得出如下公式：

△Ct_加权值＝0.117*△Ct_x1+0.215*△Ct_x2+0.461*△Ct_x3+1.051*△Ct_x4；

其中，△Ct_x1代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp的△Ct值，△Ct_x2代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp的△Ct值，△Ct_x3代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp的△Ct值，△Ct_x4代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp的△Ct值。

进一步，根据由△Ct_加权值得出的阈值(Cut Off值)进行结果判定。本发明在外周血游离DNA中检测P53基因的引物对组及试剂盒具有较高的敏感性与特异性(ROC曲线的覆盖面积>90％)，特别是敏感性显著优于目前临床上使用的经典肿瘤标志物。

本发明的有益效果如下：

1、高敏感性：在外周血游离DNA中，采用对P53基因多个存在表观遗传学修饰的区域进行联合检测及加权分析，可用于对正常人与肿瘤来源游离DNA的高敏感性鉴别。

2、特异性：由于P53基因在所有肿瘤细胞中出现广谱性异常调控，对其进行检测具有肿瘤的特异性。

3、直接性：常规的蛋白肿瘤标志物通常是检测代谢指标的异常，是间接指标，而外周血游离DNA是直接来自于细胞本身，是直接性指标，更加真实可信。

4、实时性：同时由于外周血游离DNA在体内的代谢很快(半衰期在15分钟左右)，这样可以对治疗效果进行实时的评价。

5、稳定性：相对于蛋白质标志物而言，DNA的稳定性较好，对样本的储存运输等条件要求相对较低。

6、预警性：由于肿瘤的发生的根本原因是基因组调控异常，P53基因已被证明在肿瘤的发生与发展过程中具有极其重要的作用，特别是在肿瘤的早期阶段，大量报道显示P53基因出现调控异常，而此时其基因结构的改变(突变)则比例很低。所以该检测对肿瘤风险预测具有重大的意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出不同来源DNA在低温变性条件下解链程度与扩增效率的关系(示意图)。

图2示出正常人与肿瘤患者中△Ct_加权值分布范围。

图3示出检测敏感性与特异性的ROC曲线分析，其中AUC为曲线下面积。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

发明人研究发现，在高的变性温度(94℃)下，表观遗传学修饰对DNA的解链没有明显的影响，表现为完全解链，高温条件下定量PCR扩增的Ct值标记为Ct_HT；但在低温变性条件(实验条件需要摸索)下，表观遗传学修饰则对DNA的解链有较大的影响，表现为解链程度的不同，进而影响PCR扩增的效率，低温条件下定量PCR扩增的Ct值标记为Ct_LT，△Ct＝|Ct_HT–Ct_LT|。在定量PCR扩增过程中，发明人发现来自于正常人和肿瘤患者，P53外显子中的某些区域DNA片段，在低温变性条件下其扩增效率显著不同，而启动子区域则没有发现有显著性差异(结果没有给出)。这样针对P53基因的靶区进行检测，即可区分外周血游离DNA的正常来源以及肿瘤来源。即如图1所示在低温变性条件下，相对于正常人，肿瘤患者的P53基因中的某些区域片段更难以解链，表现为扩增效率降低；为进一步证明这种差异来自于表观遗传学修饰的不同，发明人以稀释后的PCR产物为模板进行再次扩增(该PCR产物为没有任何修饰的裸露DNA)，发现其ΔCt值显著小于正常人以及肿瘤来源的DNA样本，以上结果表明：无论正常人来源还是肿瘤来源的外周血游离DNA均存在影响DNA解链的修饰，而且这种修饰在正常人与肿瘤患者中显著的不同。这样可根据正常人与肿瘤患者P53基因待测区域ΔCt值的不同，评估正常人与肿瘤患者该基因表观遗传学修饰的差异。研究发现，在正常人与肿瘤患者外周血来源的游离DNA中，单个区域修饰差异的变异较大，需进一步对P53基因的不同区域进行了综合分析。发明人通过大量的筛选实验，获得了用于检测P53基因不同区域片段表观遗传学修饰差异的引物对组，以及对应的△Ct值，并进一步对这些△Ct进行加权分析得到ΔCt_加权值以及检测阈值(Cut Off值)，随后基于该阈值进行检测的敏感性与特异性分析。

实施例1在外周血游离DNA的检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组

针对P53基因不同区段的序列，设计PCR引物进行了大量的筛选实验，最终得到了一组特异性强、灵敏度高的在外周血游离DNA的检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成；

其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为140bp(P53-E3-140)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为204bp(P53-E3-204)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为153bp(P53-E4-153)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.10和SEQID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为180bp(P53-E4-180)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；具体序列如下：

P53-E3-140(x1)扩增引物与探针

上游引物(P53-E3-140-U)

5'-CTCCCAGAATGCCAGAGGCTG-3' (SEQ ID NO.1)

下游引物(P53-E3-140-D)

5'-GAAACCGTAGCTGCCCTGGTAG-3' (SEQ ID NO.2)

探针序列(P53-E3-140-Taqman)

5'-FAM-CCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.3)

P53-E3-204(x2)扩增引物与探针

上游引物(P53-E3-204-U)：

5'-GTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATG-3' (SEQ ID NO.4)

下游引物(P53-E3-204-D)：

5'-GACTTGGCTGTCCCAGAATGCAAG-3' (SEQ ID NO.5)

探针序列(P53-E3-204-Taqman)：

5'-FAM-CTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCC–BHQ1-3' (SEQ ID NO.6)

P53-E4-153(x3)扩增引物与探针

上游引物(P53-E4-153-U)

5'-CTCCTTCCTCTTCCTACAG-3' (SEQ ID NO.7)

下游引物(P53-E4-180/153-D)：

5'-GTCATGTGCTGTGACTGCTTG-3' (SEQ ID NO.8)

探针序列(P53-E4-180/153-Taqman)：

5'-FAM-GATGGCCATGGCGCGGACGCGGGTG–BHQ1-3' (SEQ ID NO.9)

P53-E4-180(x4)扩增引物与探针

上游引物(P53-E4-180-U)：

5'-CACTTGTGCCCTGACTTTCAAC-3' (SEQ ID NO.10)

下游引物(P53-E4-180/153-D)：

5'-GTCATGTGCTGTGACTGCTTG-3' (SEQ ID NO.8)

探针序列(P53-E4-180/153-Taqman)：

5'-FAM-GATGGCCATGGCGCGGACGCGGGTG–BHQ1-3' (SEQ ID NO.9)。

实施例2在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的试剂盒

在外周血游离DNA中，检测P53基因表观遗传学修饰差异的试剂盒包括实施例1中由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成的引物对组、PCR反应液(Premix Ex Taq^TM)、质控对照DNA样品和ddH₂O；

所述质控对照DNA样品为裸露的DNA，例如可以为不存在表观遗传学修饰的PCR产物；进一步为更好的模拟游离DNA的浓度，PCR产物需要高度稀释使其与样本浓度相当，再作为模板重新扩增；其中，所述质控对照DNA样品包括P53基因外显子3区域片段长度为140bp裸露DNA、P53基因外显子3区域片段长度为204bp裸露DNA、P53基因外显子4区域片段长度为153bp裸露DNA和P53基因外显子4区域片段长度为180bp裸露DNA。

实施例3检测方法与流程

1)抽提外周血游离DNA；

2)使用由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成的引物对组，分别对外周血游离DNA及质控对照DNA样品在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，

所述反应体各引物组的qPCR反应体系见表1-4：

表1.x1序列qPCR反应体系

表2.x2序列qPCR反应体系

表3.x3序列qPCR反应体系

表4.x4序列qPCR反应体系

反应条件为：

高温变性(High Temperature,HT)：预变性95℃5min；94℃5s，60℃(x1,x3)/58℃(x2,x4)15秒，72℃30s，50个循环；

低温变性(Low Temperature,LT)：

预变性95℃5min；88℃15s，60℃(x1,x3)/58℃(x2,x4)15秒，72℃30s，50个循环。

P53基因待测区域片段xn的△Ct_xn及质控对照DNA样品xn'的△Ct_xn'；

其中，△Ct_xn＝|Ct_xn-HT–Ct_xn-LT|，Ct_xn-LT表示P53基因待测区域片段xn在低温变性条件下扩增的Ct值；Ct_xn-HT表示P53基因待测区域片段xn在高温变性条件下扩增的Ct值；在本发明中△Ct_xn为△Ct_x1、△Ct_x2、△Ct_x3、△Ct_x4；△Ct_x1代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp的△Ct值，△Ct_x2代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp的△Ct值，△Ct_x3代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp的△Ct值，△Ct_x4代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp的△Ct值；

△Ct_xn'＝|Ct_xn'_-HT–Ct_xn'_-LT|，Ct_xn'_-LT表示质控对照DNA样品xn'在低温变性条件下扩增的Ct值；Ct_xn'_-HT表示质控对照DNA样品xn'在高温变性条件下扩增的Ct值；

在本发明中△Ct_xn'为△C_x1'、△Ct_x2'、△Ct_x3'、△Ct_x4'；△Ct_x1'代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp裸露DNA的△Ct值，△Ct_x2'代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp裸露DNA的△Ct值，△Ct_x3'代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp裸露DNA的△Ct值，△Ct_x4'代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp裸露DNA的△Ct值；

3)比较△Ct_xn与△Ct_xn'的差异判定外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn是否存在表观遗传学修饰：当△Ct_xn＝△Ct_xn'±[标准误]时，说明外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn不存在表观遗传学修饰；否则说明外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn存在表观遗传学修饰，结果判定需进一步对P53基因不同待测区域片段的△Ct_xn进行加权计算，具体公式为：

△Ct_加权值＝a*△Ct_x1+b*△Ct_x2+c*△Ct_x3+d*△Ct_x4；

基于来自于32例正常人(表6)以及32例肿瘤患者(表7)的P53基因不同待测区域片段的△Ct_xn值的差异分析，并对这些区域片段的△Ct_xn进行加权计算(SPSS软件分析)，得出如下公式：

根据统计分析，阈值(Cut off值)为5.919。

实施例4

根据实施例3所述的检测方法对质控对照P53基因(不同区域片段PCR产物)进行3个梯度的稀释，并以此为模板进行再次扩增，计算△Ct_xn'值及△Ct_加权值'，结果如表5所示。

表5 P53质控对照DNA扩增的△Ct_xn'值及△Ct_加权值'*

*：表中的数值为6次独立实验结果的平均值。

实施例5

按照实施例3所述的检测方法对正常人组(32例正常人由北京交通大学校医院提供)和肿瘤组(32例肿瘤患者由解放军总医院肿瘤中心实验室提供)进行检测，并计算△Ct_加权值，肿瘤患者与正常人的分布情况如图2所示，其中，正常人组的△Ct_加权值见表6，肿瘤组的△Ct_加权值见表7。

表6正常人组的△Ct_加权值

注：加粗为高于阈值的样本

表7肿瘤组的△Ct_加权值

注：加粗为低于阈值的样本

当阈值(Cut off值)为5.919，如表8所示，在32例正常人中有7例高于Cut off值；在32例肿瘤患者中有5例低于Cut off值，该肿瘤患者分别为：1例肝癌患者，1例为舌癌患者，其余3例均为胃癌术后患者。表9的统计学分析显示正常人和肿瘤患者具有极其显著性的差异。本发明检测方法的敏感性为84.4％，特异性为78.1％，符合率为81.3％。图3所示本检测方法具有较高的敏感性和特异性，ROC曲线下的覆盖面积>90％，

以上结果表明，P53基因在正常与肿瘤来源的DNA中具有显著的表观遗传学修饰差异。该检测在的肿瘤疗效评估中具有重要的参考价值。

表8检测结果分析

表9正常人和肿瘤患者检测结果的统计学分析

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 朱运峰

<120> 在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒

<130> JLC18I0377E

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcccagaat gccagaggct g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaaccgtag ctgccctggt ag 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccccccgtgg cccctgcacc agc 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttcactgaa gacccaggtc cagatg 26

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacttggctg tcccagaatg caag 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcccagaat gccagaggct gctcc 25

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccttcctc ttcctacag 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcatgtgct gtgactgctt g 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatggccatg gcgcggacgc gggtg 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacttgtgcc ctgactttca ac 22

Claims

1.一种在外周血游离DNA中检测P53基因表观遗传学修饰差异的非诊断目的的方法，其特征在于，包括以下步骤：

抽提外周血游离DNA；

使用由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成的引物对和探针，分别对外周血游离DNA及质控对照DNA样品在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，得到P53基因待测区域片段xn的△Ct_xn及质控对照DNA样品xn'的△Ct_xn'；

其中，△Ct_xn=|Ct_xn-HT–Ct_xn-LT|，Ct _xn-LT表示P53基因待测区域片段xn在低温变性条件下扩增的Ct值；Ct_xn-HT表示P53基因待测区域片段xn在高温变性条件下扩增的Ct值；

△Ct_xn'= |Ct_xn'_-HT–Ct _xn'_-LT|，Ct_xn'_-LT表示质控对照DNA样品xn'在低温变性条件下扩增的Ct值；Ct_xn'_-HT表示质控对照DNA样品xn'在高温变性条件下扩增的Ct值；

比较△Ct_xn与△Ct_xn'的差异判定外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn是否存在表观遗传学修饰：当△Ct _{xn =}△Ct _xn'±[标准误]时，说明外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn不存在表观遗传学修饰；否则说明外周血游离DNA中P53基因待测区域片段xn存在表观遗传学修饰；

对P53基因不同待测区域片段的△Ct_xn进行加权计算，具体公式为：

△Ct_加权值= a*△Ct_x1+ b*△Ct_x2+ c*△Ct_x3+d*△Ct_x4；

其中，a,b,c,d为回归分析对P53基因不同待测区域片段对应的△Ct值给出的加权系数；△Ct_x1代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp的△Ct值，△Ct_x2代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp的△Ct值，△Ct_x3代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp的△Ct值，△Ct_x4代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp的△Ct值；

根据由△Ct_加权值得到的阈值进行结果判定。