CN111334582A - 用于同步检测p53基因4个外显子基因突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同步检测P53基因4个外显子基因突变的引物对及检测方法，有益于检测通量的提高。本发明提供用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的引物对，包含一对引物，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示。使用该引物对进行PCR扩增反应时，P53基因5‑8号外显子基因同时进行扩增，即同时扩增包含5‑8号外显子的基因片段。本发明通过一次反应可以对P53基因4个外显子基因突变进行检测。如此，可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的引物对及检测方法。
背景技术
P53基因位于人类第17号染色体的短臂上，全长16-20kb，含有11个外显子和10个内含子。野生型P53是一种抑癌基因，其主要生物学功能是经过一系列信号传导作用调控细胞周期和诱导细胞凋亡，维持基因组和细胞稳定，抑制肿瘤生长，在细胞周期起着“分子警察”作用。突变型P53基因则起着原癌基因的作用，可促进肿瘤的发生、发展。研究发现，人类50％的肿瘤中均发现P53基因有缺失或突变。目前发现的有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等。约70％的结直肠癌、50％的肺癌、40％的乳腺癌都有P53的突变。P53基因是迄今发现与人类恶性肿瘤相关性最高的基因，也是肿瘤细胞中基因变异频率最高的靶基因，而且P53基因突变在肿瘤发生中是早期事件，可应用于肿瘤的早期诊断。
P53基因中有5个高度保守区，其中4个位于外显子5～8，是突变热点，分别编码132～143、174～179、236～248和272～281号氨基酸。约86.0％的P53基因突变集中在这部分区域；有报道部分突变点发生在4号外显子上。在大多数人类肿瘤中，确定P53基因的状态对肿瘤治疗的疗效和患者的预后更有决定性意义。
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。目前，可针对P53基因的第5、6、7、8号外显子分别设计PCR检测试验，以进行基因突变情况的检测。由于每个PCR反应只针对一个外显子，故检测通量较低。
发明内容
为了解决上述缺陷，本发明的技术目的是提供同时同步检测P53基因第5、6、7、8号外显子基因突变的引物对及PCR检测方法，有益于检测通量的提高。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
首先提供一种用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的引物对，包含一对引物，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示。本发明的引物对尤其是针对P53基因5-8号外显子的特异性扩增所特别设计的，可以同时同步、高效率、高特异性、准确地扩增出P53基因5-8号外显子的特异性基因片段，再通过测序，检测其基因突变情况。使用该引物对进行PCR扩增反应时，P53基因的5、6、7、8号外显子同时进行扩增，即同时扩增包含其中热点突变位点的4个外显子。可以最大程度地提高检测通量。
经过多次试验证明，本发明提供的引物对具有较好的特异性和扩增准确性，可以应用于制备同步检测P53基因4个外显子基因突变的试剂盒，通过制备成成品试剂盒，可以在采集了样品试验后，快速准确地得出P53基因4个外显子基因突变的结果。
所述试剂盒，主要是包括本发明提供的引物对，其中引物的终浓度优选为20-300nM。其他PCR试剂可以根据常规技术选择，例如优选的技术方案是，还包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)的混合物和超纯水。其中DNA聚合酶的用量为0.5-5U，每种dNTP的终浓度均为50-500μM。
DNA聚合酶可以选用Taq、KOD FX等DNA聚合酶，如此，PCR缓冲液即为与所选用DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液，具体浓缩程度可选用2×、5×或10×。
举例来说，选用KOD FX这一DNA聚合酶，且选用2×的浓缩缓冲液时，为配置上述PCR反应体系，体系中各个组分的用量可以为：DNA聚合酶0.5～2μl、PCR缓冲液18～30μl、各种dNTP的混合物1～10μl、上下游引物各1-5μl、DNA 5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl。以及可以为按照相同比例配置的其他体积大小。
在制作成品试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配置用于提取样品DNA的试剂或者专业的DNA提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待检测样品的DNA，增强本发明的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样品可以为任何含有DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子样本。
在本发明提供的引物对的基础上，本发明进一步提供一种用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的检测方法，采用所述的引物对进行PCR检测。
根据一种优选的实施方式，所述检测方法的具体步骤是：
(1)从待测样品中提取DNA，作为扩增模板；
(2)配置包含所述引物对和所述扩增模板的PCR反应体系；
(3)对所述PCR反应体系进行PCR扩增反应，得到PCR产物；
(4)根据所述PCR产物，测定P53基因4个外显子基因突变。
其中PCR扩增反应的最优选的反应条件为：94℃：1～10min；98℃：5～20s，58～68℃：10～60s，68～72℃：10s～5min，共25～40个循环；68～72℃：0～30min。
在上述方法和条件的基础上，本发明的检测方法可以快速、有效、方便地同时同步得到待检测样品的P53基因4个外显子基因突变，可用于非诊断目的。通常情况下，利用上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2来扩增P53基因的5、6、7、8号外显子时，相应扩增产物的片段长度为1731bp。进而对该DNA片段进行切胶回收，并进行序列的测定。
根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(4)测定P53基因4个外显子基因突变，包括：电泳检测所述PCR产物，以验证所述PCR产物的扩增片段大小；验证正确后对所述PCR产物进行序列测定，以获得所述待测样本的P53基因5～8号外显子的基因突变情况。详细地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳检测PCR扩增的片段。
同现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：(1)提高检测通量：一般每个PCR反应只针对一个外显子，而本发明可以同时检测4个外显子，通过一次反应可以对P53基因的5、6、7、8号外显子的热点突变位点进行检测。如此，可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。(2)降低成本：本发明可以将PCR反应体系由4个体系/程序缩减至1个体系/程序，故减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。
附图说明
图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对一突变位点的部分；
图3是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对另一突变位点的部分；
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明。非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
设计并合成引物对，包括以下步骤：
步骤1.1：基于P53基因5～8号外显子及上下游序列，设计特异性扩增基因突变位点区域的上下游引物。
对于设计引物，采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在5～8号外显子的两端设计引物。
本实施例所提供的引物对覆盖了P53基因5、6、7、8号外显子的热点突变位点。由于小的序列变化会导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，故分别针对不同位点/外显子分别设计PCR引物对，并在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点/外显子包含情况，选取了如下述表1所示的扩增效果最佳的引物对。
表1
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| SEQ ID NO.1 | GGTGTAGACGCCAACTCTCTCT |
| SEQ ID NO.2 | GCATAACTGCACCCTTGGTCTC |
步骤1.2：合成1.1中设计好的引物对。
实施例2
从待测样本中提取DNA，包括如下步骤：
步骤2.1：用口腔拭子收集口腔脱落细胞或用采血管收集新鲜外周血样本。
本实施例中，样本来源为正常人体。
步骤2.2：采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)，或，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，从样本中提取DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，保存DNA。
实施例3
同步检测P53基因4个外显子基因突变的PCR检测方法，包括以下步骤：
步骤3.1：以步骤2.2中所得的DNA为扩增模板，并采用步骤1.2中合成的引物对，来配置PCR反应体系。
本实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101)中DNA聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制PCR扩增体系，这一反应体系的具体组成如下述表3所示。当然，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
表3
引物浓度是10微摩尔；DNA模板量可调整，本实施例中DNA可采用30ng。
步骤3.2：按照下述表4所示的PCR反应条件，设置PCR仪器的程序。
表4
步骤3.3：利用程序设好的PCR仪器，对步骤3.1中配置的PCR反应体系，进行PCR扩增反应，得到PCR产物。
实施例4
电泳检测，包括以下步骤：
步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.3中得到的PCR产物，以验证PCR产物片段的大小。
检测结果如图1所示，图1中所示出的532、537、626、628、683、3301、4901等主要用于区分不同的待测样本，图1的最左侧列展示了标尺条，最右侧列展示了空白对照组的PCR产物的电泳结果，中间各列展示了不同样本的PCR产物的电泳结果。
根据各个产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出产物亮带所对应的是否是目标扩增产物。
请参考图1，根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，存在的条带为对应的PCR扩增产物，条带大小与理论保持一致；条带清晰无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明利用步骤1.1中设计的PCR扩增引物对进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物对设计合理。
步骤4.2：验证PCR产物片段的大小正确后，可针对PCR产物进行序列测定。
实施例5
序列测定，包括以下步骤：
步骤5.1：步骤4.2中验证PCR产物片段的大小正确后，将步骤3.3中得到的PCR产物送至测序公司进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。
步骤5.2：通过Chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得P53基因5～8号外显子的热点突变位点的基因突变情况。
部分测序结果如图2-3所示。
请参考图2，图2示出了P53基因突变位点c.524G＞A处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知在第524位处并未由G突变为A，即在该基因突变位点处未发生基因突变。这一基因突变情况与样本来源为正常人体这一前提保持一致。
请参考图3，图3示出了P.53基因突变位点c.701A＞G处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图2中的框线部分，可知在第701位处并未由A突变为G，即在该基因突变位点处未发生基因突变。这一基因突变情况与样本来源为正常人体这一前提保持一致。
实施例6：试剂盒的配置
根据上述实验结果，本实施例提供一种优选的用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的试剂盒，所述试剂盒中包含以下试剂：
1、PCR引物对：F上游引物(10μM)，R下游引物(10μM)；
2、KOD FX(1U/μl)；
3、2×PCR buffer for FX；
4、dNTP(2mM)；
5、样品DNA提取试剂；
6、样品采集收纳盒(如包含口腔拭子和拭子收纳盒/管)；
7、超纯水。
所述试剂在试剂盒中合理安放，再放入试剂盒的使用说明(可选择性再配置PCR试管或孔板或移液枪)，所述使用说明包括待测样品的采集步骤，采集后放入收纳盒/管中，再进行DNA提取步骤，最后按照上述的检测方法进行PCR扩增过程。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司
<120> 用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的方法
<130> ss191-213
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggtgtagacg ccaactctct ct 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gcataactgc acccttggtc tc 22
Claims (10)
1.一种用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的引物对，其特征在于，所述引物对包含一对引物，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述P53基因4个外显子是5-8号外显子。
3.权利要求1或2所述的引物对在制备用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的试剂盒中的应用。
4.一种用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP的混合物和超纯水。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶的用量为0.5-5U，每种dNTP的终浓度均为50-500μM，引物的终浓度为20-300nM。
7.根据权利要求4-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包含待测样品DNA提取试剂或DNA提取试剂盒。
8.一种用于同步检测P53基因4个外显子基因突变的检测方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的引物对对待测样品进行PCR检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括步骤：
(1)从待测样品中提取DNA，作为扩增模板；
(2)配制包含所述引物对和所述扩增模板的PCR反应体系；
(3)对所述PCR反应体系进行PCR扩增反应，得到PCR产物；
(4)根据所述PCR产物，测定P53基因4个外显子基因突变。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃：1～10min；98℃：5～20s，58～68℃：10～60s，68～72℃：10s～5min，共25～40个循环；68～72℃：0～30min。
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