JP2001128685A - ヒトｐ５３遺伝子の変異の検出方法 - Google Patents
ヒトｐ５３遺伝子の変異の検出方法Info
- Publication number
- JP2001128685A JP2001128685A JP31567899A JP31567899A JP2001128685A JP 2001128685 A JP2001128685 A JP 2001128685A JP 31567899 A JP31567899 A JP 31567899A JP 31567899 A JP31567899 A JP 31567899A JP 2001128685 A JP2001128685 A JP 2001128685A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer
- human
- gene
- dna
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 迅速且つ正確に、ｐ５３遺伝子変異の有無を
判定することのできる検出方法を提供する。 【解決手段】 ヒトｐ５３タンパク質に特異的に反応す
る抗体を用いて、被検試料を免疫学的に染色する免疫学
的検出工程；前記免疫学的検出工程により得られた染色
結果に基づいて、染色性細胞と非染色性細胞とを分離す
る細胞分離工程；前記細胞分離工程で分離した染色性細
胞から、ゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工
程；ヒトｐ５３遺伝子変異が生じている可能性のある領
域を含むヒトｐ５３遺伝子断片を増幅することのできる
プライマーと、前記ゲノムＤＮＡ抽出工程で得られたゲ
ノムＤＮＡとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ増
幅工程；及び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物
を解析する解析工程をこの順序で実施する。
判定することのできる検出方法を提供する。 【解決手段】 ヒトｐ５３タンパク質に特異的に反応す
る抗体を用いて、被検試料を免疫学的に染色する免疫学
的検出工程；前記免疫学的検出工程により得られた染色
結果に基づいて、染色性細胞と非染色性細胞とを分離す
る細胞分離工程；前記細胞分離工程で分離した染色性細
胞から、ゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工
程；ヒトｐ５３遺伝子変異が生じている可能性のある領
域を含むヒトｐ５３遺伝子断片を増幅することのできる
プライマーと、前記ゲノムＤＮＡ抽出工程で得られたゲ
ノムＤＮＡとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ増
幅工程；及び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物
を解析する解析工程をこの順序で実施する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトｐ５３遺伝子
の変異の検出方法及び新規プライマーに関する。
の変異の検出方法及び新規プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトｐ５３遺伝子は、第１７番染色体短
腕（１７ｐ１３．１）に位置し、約２０ｋｂの遺伝子で
あり、１１個のエクソンを有する。ヒトｐ５３ｍＲＮＡ
は、２．８ｋｂであり、分子量５３ｋＤのタンパク質を
発現する。ｐ５３タンパク質は、四量体を形成してＤＮ
Ａプロモーター領域に結合し、転写制御因子として多く
の標的遺伝子の発現制御を行なっていることが明らかに
なっている。
腕（１７ｐ１３．１）に位置し、約２０ｋｂの遺伝子で
あり、１１個のエクソンを有する。ヒトｐ５３ｍＲＮＡ
は、２．８ｋｂであり、分子量５３ｋＤのタンパク質を
発現する。ｐ５３タンパク質は、四量体を形成してＤＮ
Ａプロモーター領域に結合し、転写制御因子として多く
の標的遺伝子の発現制御を行なっていることが明らかに
なっている。
【０００３】また、ｐ５３タンパク質には、野生型と変
異型とが存在することが明らかにされ、ｐ５３遺伝子の
野生型は癌抑制遺伝子であり、ｐ５３遺伝子の変異型
は、癌遺伝子を有する細胞の増殖を抑制することができ
ないことが明らかになっている。ｐ５３遺伝子変異は一
塩基置換のミスセンス変異であり、この変異型ｐ５３タ
ンパク質の多くは、その半減期が延長することにより細
胞内（特に核）に蓄積する性質をもつことが知られてい
る［蛋白質核酸酵素（増刊号）４２，１５６７−１５７
４（１９９７）］。従って、病理組織標本を用いる組織
検査、又は細胞診（細胞学的検査）において、抗ヒトｐ
５３タンパク質モノクローナル抗体又はポリクローナル
抗体を利用したタンパク質蓄積所見を指標とした免疫組
織化学的解析が、変異検出として行なわれている。
異型とが存在することが明らかにされ、ｐ５３遺伝子の
野生型は癌抑制遺伝子であり、ｐ５３遺伝子の変異型
は、癌遺伝子を有する細胞の増殖を抑制することができ
ないことが明らかになっている。ｐ５３遺伝子変異は一
塩基置換のミスセンス変異であり、この変異型ｐ５３タ
ンパク質の多くは、その半減期が延長することにより細
胞内（特に核）に蓄積する性質をもつことが知られてい
る［蛋白質核酸酵素（増刊号）４２，１５６７−１５７
４（１９９７）］。従って、病理組織標本を用いる組織
検査、又は細胞診（細胞学的検査）において、抗ヒトｐ
５３タンパク質モノクローナル抗体又はポリクローナル
抗体を利用したタンパク質蓄積所見を指標とした免疫組
織化学的解析が、変異検出として行なわれている。
【０００４】更に、培養癌細胞を用いたｐ５３遺伝子解
析の研究により、癌細胞で見つかる変異の特徴として、
変異はかなり広い領域にわたって検出されているが、そ
の中にホットスポット（すなわち、変異が多発する領
域）があることが明らかになっている。また、変異の頻
度を左右する因子として、臓器又は地域による差がある
ことが明らかになっている。従って、癌細胞又は癌組織
からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを分離及び精製した後、
ｐ５３遺伝子変異のホットスポツトが存在するエクソン
５、エクソン６、エクソン７、又はエクソン８の各領域
を、特定のＤＮＡプライマー（センスプライマー及びア
ンチセンスプライマー）を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）法により遺伝子増幅を行ない、続いて、その
ＰＣＲ生成物のＤＮＡ塩基配列に一塩基置換があるかど
うかを、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型［Ｓｉｎｇｌｅ Ｓ
ｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ（ＳＳＣＰ）］法で調べることにより、ｐ
５３遺伝子変異の有無を判定することができる。更に必
要であれば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法で変異が明らかになっ
たＰＣＲ生成物のダイレクトシ−クエンス法によるＤＮ
Ａ塩基配列の解析を行なうことにより、ｐ５３遺伝子変
異の箇所及び種類（すなわち、一塩基置換の状態）を決
定することができる。
析の研究により、癌細胞で見つかる変異の特徴として、
変異はかなり広い領域にわたって検出されているが、そ
の中にホットスポット（すなわち、変異が多発する領
域）があることが明らかになっている。また、変異の頻
度を左右する因子として、臓器又は地域による差がある
ことが明らかになっている。従って、癌細胞又は癌組織
からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを分離及び精製した後、
ｐ５３遺伝子変異のホットスポツトが存在するエクソン
５、エクソン６、エクソン７、又はエクソン８の各領域
を、特定のＤＮＡプライマー（センスプライマー及びア
ンチセンスプライマー）を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）法により遺伝子増幅を行ない、続いて、その
ＰＣＲ生成物のＤＮＡ塩基配列に一塩基置換があるかど
うかを、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型［Ｓｉｎｇｌｅ Ｓ
ｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈｉｓｍ（ＳＳＣＰ）］法で調べることにより、ｐ
５３遺伝子変異の有無を判定することができる。更に必
要であれば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法で変異が明らかになっ
たＰＣＲ生成物のダイレクトシ−クエンス法によるＤＮ
Ａ塩基配列の解析を行なうことにより、ｐ５３遺伝子変
異の箇所及び種類（すなわち、一塩基置換の状態）を決
定することができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＰＣＲ
−ＳＳＣＰ法を用いる前記従来法では、ゲノムＤＮＡ又
はｍＲＮＡを抽出するのに用いる被検試料（例えば、細
胞又は組織）中に、癌細胞又は癌組織以外の正常細胞又
は正常組織も混入してしまうため、正確な結果が得られ
ないことがあった。また、被検試料として、パラフィン
包埋組織切片標本を用いる場合には、ゲノムＤＮＡの抽
出工程において、通常、プロティナーゼＫ処理を１２〜
２４時間実施する必要があるため、ｐ５３遺伝子変異の
有無を判定するのに２日間を要していた。従って、本発
明の課題は、従来技術の前記欠点を解消し、迅速且つ正
確に、ｐ５３遺伝子変異の有無を判定することのできる
検出方法を提供することにある。
−ＳＳＣＰ法を用いる前記従来法では、ゲノムＤＮＡ又
はｍＲＮＡを抽出するのに用いる被検試料（例えば、細
胞又は組織）中に、癌細胞又は癌組織以外の正常細胞又
は正常組織も混入してしまうため、正確な結果が得られ
ないことがあった。また、被検試料として、パラフィン
包埋組織切片標本を用いる場合には、ゲノムＤＮＡの抽
出工程において、通常、プロティナーゼＫ処理を１２〜
２４時間実施する必要があるため、ｐ５３遺伝子変異の
有無を判定するのに２日間を要していた。従って、本発
明の課題は、従来技術の前記欠点を解消し、迅速且つ正
確に、ｐ５３遺伝子変異の有無を判定することのできる
検出方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
る、ヒトｐ５３タンパク質に特異的に反応する抗体を用
いて、被検試料を免疫学的に染色する免疫学的検出工
程；前記免疫学的検出工程により得られた染色結果に基
づいて、染色性細胞と非染色性細胞とを分離する細胞分
離工程；前記細胞分離工程で分離した染色性細胞から、
ゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程；ヒトｐ
５３遺伝子変異が生じている可能性のある領域を含むヒ
トｐ５３遺伝子断片を増幅することのできるプライマー
と、前記ゲノムＤＮＡ抽出工程で得られたゲノムＤＮＡ
とを用いて、ＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ増幅工程；及
び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を解析する
解析工程をこの順序で実施することを特徴とする、ヒト
ｐ５３遺伝子の変異の検出方法により解決することがで
きる。また、本発明は、配列表の配列番号１〜１６で表
される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるプラ
イマーに関する。
る、ヒトｐ５３タンパク質に特異的に反応する抗体を用
いて、被検試料を免疫学的に染色する免疫学的検出工
程；前記免疫学的検出工程により得られた染色結果に基
づいて、染色性細胞と非染色性細胞とを分離する細胞分
離工程；前記細胞分離工程で分離した染色性細胞から、
ゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程；ヒトｐ
５３遺伝子変異が生じている可能性のある領域を含むヒ
トｐ５３遺伝子断片を増幅することのできるプライマー
と、前記ゲノムＤＮＡ抽出工程で得られたゲノムＤＮＡ
とを用いて、ＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ増幅工程；及
び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を解析する
解析工程をこの順序で実施することを特徴とする、ヒト
ｐ５３遺伝子の変異の検出方法により解決することがで
きる。また、本発明は、配列表の配列番号１〜１６で表
される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるプラ
イマーに関する。
【０００７】本明細書における「ｐ５３タンパク質」、
「ｐ５３遺伝子」、及び「ｐ５３ｍＲＮＡ」には、特に
断わらない限り、野生型と変異型との両方が含まれるも
のとする。例えば、「ｐ５３タンパク質」には、野生型
ｐ５３タンパク質と変異型ｐ５３タンパク質とが含ま
れ、「ｐ５３遺伝子」には、野生型ｐ５３遺伝子と変異
型ｐ５３遺伝子とが含まれる。
「ｐ５３遺伝子」、及び「ｐ５３ｍＲＮＡ」には、特に
断わらない限り、野生型と変異型との両方が含まれるも
のとする。例えば、「ｐ５３タンパク質」には、野生型
ｐ５３タンパク質と変異型ｐ５３タンパク質とが含ま
れ、「ｐ５３遺伝子」には、野生型ｐ５３遺伝子と変異
型ｐ５３遺伝子とが含まれる。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の検出方法を適用すること
のできる被検試料としては、ヒトｐ５３遺伝子をゲノム
中に有する細胞を含む可能性のある被検試料である限
り、特に限定されるものではなく、例えば、生体試料
（例えば、組織又は細胞）、又はそれらの標本を挙げる
ことができる。本明細書において、「標本」とは、生体
試料に適当な処理を施すことにより保存可能にしたもの
を意味する。細胞を確認することができる点で、生体試
料の標本であることが好ましい。以下、被検試料とし
て、生体試料の標本、すなわち、被検標本を用いる態様
に基づいて、本発明の検出方法を主に説明するが、被検
試料として生体試料をそのまま用いる場合にも、同様に
して実施することができる。
のできる被検試料としては、ヒトｐ５３遺伝子をゲノム
中に有する細胞を含む可能性のある被検試料である限
り、特に限定されるものではなく、例えば、生体試料
（例えば、組織又は細胞）、又はそれらの標本を挙げる
ことができる。本明細書において、「標本」とは、生体
試料に適当な処理を施すことにより保存可能にしたもの
を意味する。細胞を確認することができる点で、生体試
料の標本であることが好ましい。以下、被検試料とし
て、生体試料の標本、すなわち、被検標本を用いる態様
に基づいて、本発明の検出方法を主に説明するが、被検
試料として生体試料をそのまま用いる場合にも、同様に
して実施することができる。
【０００９】被検標本としては、例えば、組織切片標
本、培養細胞標本、又は細胞診用の細胞標本などを挙げ
ることができる。一般に、標本内のＲＮＡはリボヌクレ
アーゼ（ＲＮａｓｅ）により分解されやすいので、ｍＲ
ＮＡの遺伝子増幅は新鮮な生検材料でないとできない。
本発明は、被検標本の細胞内で比較的安定であるゲノム
ＤＮＡを抽出し、ヒトｐ５３遺伝子の変異を検出する。
光学顕微鏡レベルで免疫染色を行なう場合、染色に用い
る組織切片は、その調製法に基づいて、凍結切片とパラ
フィン切片との２つに大別される。抗原性の保存の点で
は前者が優れており、組織構造保存の点では後者の方が
優れているが、本発明の検出方法では、いずれの組織切
片標本でも用いることができる。
本、培養細胞標本、又は細胞診用の細胞標本などを挙げ
ることができる。一般に、標本内のＲＮＡはリボヌクレ
アーゼ（ＲＮａｓｅ）により分解されやすいので、ｍＲ
ＮＡの遺伝子増幅は新鮮な生検材料でないとできない。
本発明は、被検標本の細胞内で比較的安定であるゲノム
ＤＮＡを抽出し、ヒトｐ５３遺伝子の変異を検出する。
光学顕微鏡レベルで免疫染色を行なう場合、染色に用い
る組織切片は、その調製法に基づいて、凍結切片とパラ
フィン切片との２つに大別される。抗原性の保存の点で
は前者が優れており、組織構造保存の点では後者の方が
優れているが、本発明の検出方法では、いずれの組織切
片標本でも用いることができる。
【００１０】前記被検標本は、従来公知の方法により作
製することができる。例えば、パラフィン包埋組織切片
標本は、例えば、患者等から採取した組織を、ホルマリ
ン固定した後、パラフィン包埋し、ミクロトームで連続
薄切切片（約１０μｍ）を作製し、この切片をスライド
ガラスに貼布後、充分に乾燥させることにより作製する
ことができる。前記固定には、一般的に１０％ホルマリ
ンが使用されることが多い。また、核酸の安定性のため
には、固定液は中性〜弱アルカリ性であることが必要で
あり、緩衝ホルマリンが使用される。前記ホルマリン固
定後、エタノールで脱水し、クロロホルムで置換した
後、融点５６〜５８℃のパラフィンで包埋する。ミクロ
トームによる試料薄切にあたり、ミクロトーム又はピン
セットなどはエタノールで清拭する。
製することができる。例えば、パラフィン包埋組織切片
標本は、例えば、患者等から採取した組織を、ホルマリ
ン固定した後、パラフィン包埋し、ミクロトームで連続
薄切切片（約１０μｍ）を作製し、この切片をスライド
ガラスに貼布後、充分に乾燥させることにより作製する
ことができる。前記固定には、一般的に１０％ホルマリ
ンが使用されることが多い。また、核酸の安定性のため
には、固定液は中性〜弱アルカリ性であることが必要で
あり、緩衝ホルマリンが使用される。前記ホルマリン固
定後、エタノールで脱水し、クロロホルムで置換した
後、融点５６〜５８℃のパラフィンで包埋する。ミクロ
トームによる試料薄切にあたり、ミクロトーム又はピン
セットなどはエタノールで清拭する。
【００１１】また、細胞標本は、例えば、患者から採取
した浮遊細胞（血液、胸水、腹水、胆汁、又は乳汁から
単離した細胞）又は微量組織をスライドガラスに固定す
ることにより、作製することができる。
した浮遊細胞（血液、胸水、腹水、胆汁、又は乳汁から
単離した細胞）又は微量組織をスライドガラスに固定す
ることにより、作製することができる。
【００１２】本発明の検出方法における免疫学的検出工
程で用いることのできる抗体は、ヒトｐ５３タンパク質
（野生型及び変異型の両方を含む）に特異的に反応する
抗体、すなわち、野生型ヒトｐ５３タンパク質及び変異
型ヒトｐ５３タンパク質の両方に特異的に反応する抗体
である限り、特に限定されるものではなく、抗ヒトｐ５
３タンパク質モノクローナル抗体、あるいは、抗ヒトｐ
５３タンパク質ポリクローナル抗体を用いることができ
る。
程で用いることのできる抗体は、ヒトｐ５３タンパク質
（野生型及び変異型の両方を含む）に特異的に反応する
抗体、すなわち、野生型ヒトｐ５３タンパク質及び変異
型ヒトｐ５３タンパク質の両方に特異的に反応する抗体
である限り、特に限定されるものではなく、抗ヒトｐ５
３タンパク質モノクローナル抗体、あるいは、抗ヒトｐ
５３タンパク質ポリクローナル抗体を用いることができ
る。
【００１３】前記抗体としては、例えば、ＤＯ−７モノ
クローナル抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ又はＤａｋｏ）
を挙げることができる。ＤＯ−７モノクローナル抗体の
エピトープは、ヒトｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン
の２０〜２５アミノ酸からなる領域であり、ヒトｐ５３
タンパク質の野生型及び変異型の両方に反応することが
明らかになっている。被検標本としてパラフィン包埋組
織切片標本を用いる場合には、前記抗体として、パラフ
ィン包埋処理したｐ５３タンパク質抗原にも反応する抗
体（例えば、ＤＯ−７モノクローナル抗体）を使用する
ことが好ましい。
クローナル抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ又はＤａｋｏ）
を挙げることができる。ＤＯ−７モノクローナル抗体の
エピトープは、ヒトｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン
の２０〜２５アミノ酸からなる領域であり、ヒトｐ５３
タンパク質の野生型及び変異型の両方に反応することが
明らかになっている。被検標本としてパラフィン包埋組
織切片標本を用いる場合には、前記抗体として、パラフ
ィン包埋処理したｐ５３タンパク質抗原にも反応する抗
体（例えば、ＤＯ−７モノクローナル抗体）を使用する
ことが好ましい。
【００１４】本発明の検出方法における免疫学的検出工
程は、前記の特定抗体を用いること以外は、例えば、従
来公知の免疫染色法に基づいて実施することが可能であ
る。例えば、抗ｐ５３タンパク質モノクローナル抗体
（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）を一次抗体に用い、二次抗体
にウサギＰＯＤ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を含む免疫組織染
色キット（ＳｃｙＴｅｋ社）を用い、ＤＡＢ（３，３’
−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）発色液で染色し
た後、このスライドガラス標本を顕微鏡で観察し、ｐ５
３タンパク質が染まるかどうかを確認する。
程は、前記の特定抗体を用いること以外は、例えば、従
来公知の免疫染色法に基づいて実施することが可能であ
る。例えば、抗ｐ５３タンパク質モノクローナル抗体
（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）を一次抗体に用い、二次抗体
にウサギＰＯＤ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を含む免疫組織染
色キット（ＳｃｙＴｅｋ社）を用い、ＤＡＢ（３，３’
−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）発色液で染色し
た後、このスライドガラス標本を顕微鏡で観察し、ｐ５
３タンパク質が染まるかどうかを確認する。
【００１５】被検標本としてパラフィン包埋組織切片標
本を用いる場合には、脱パラフィン処理を実施した後、
前記免疫学的検出工程を実施することができる。前記脱
パラフィン処理は、例えば、パラフィン包埋組織切片標
本をキシレン槽に浸し（最低でも３回溶媒を交換す
る）、次に、１００％エタノール槽に３回、７０％エタ
ノール槽に３回浸して洗浄した後、精製水で洗浄するこ
とにより、実施することができる。
本を用いる場合には、脱パラフィン処理を実施した後、
前記免疫学的検出工程を実施することができる。前記脱
パラフィン処理は、例えば、パラフィン包埋組織切片標
本をキシレン槽に浸し（最低でも３回溶媒を交換す
る）、次に、１００％エタノール槽に３回、７０％エタ
ノール槽に３回浸して洗浄した後、精製水で洗浄するこ
とにより、実施することができる。
【００１６】本発明の検出方法における細胞分離工程で
は、前記免疫学的検出工程により得られた染色結果（例
えば、染色パターン）に基づいて、染色性細胞と非染色
性細胞とを分離する。すなわち、染色された細胞は癌細
胞であり、染色されなかった細胞は正常細胞であると考
えられるので、本工程では、染色されなかった細胞が混
入しないように、染色された細胞のみを採取する。
は、前記免疫学的検出工程により得られた染色結果（例
えば、染色パターン）に基づいて、染色性細胞と非染色
性細胞とを分離する。すなわち、染色された細胞は癌細
胞であり、染色されなかった細胞は正常細胞であると考
えられるので、本工程では、染色されなかった細胞が混
入しないように、染色された細胞のみを採取する。
【００１７】より具体的には、（１）前記免疫学的検出
工程に用いた被検標本から、染色された細胞のみを分離
するか、あるいは、（２）前記免疫学的検出工程に用い
た被検標本と実質的に同一の別の被検標本から、前記免
疫学的検出工程で染色された細胞に相当する細胞のみを
分離する。なお、本明細書において、或る被検標本と
「実質的に同一の被検標本」とは、或る被検標本を免疫
学的に染色して得られる染色パターンに基づいて、免疫
学的に染色していない別の被検標本から染色性細胞と非
染色性細胞とを分離することができる程度に、標本に含
まれる組織切片及び／又は細胞とが実質的に同一である
被検標本を意味し、例えば、パラフィン包埋組織から連
続的に切り出した或る薄切切片に対し、それに隣接する
薄片切片は実質的に同一の被検標本である。
工程に用いた被検標本から、染色された細胞のみを分離
するか、あるいは、（２）前記免疫学的検出工程に用い
た被検標本と実質的に同一の別の被検標本から、前記免
疫学的検出工程で染色された細胞に相当する細胞のみを
分離する。なお、本明細書において、或る被検標本と
「実質的に同一の被検標本」とは、或る被検標本を免疫
学的に染色して得られる染色パターンに基づいて、免疫
学的に染色していない別の被検標本から染色性細胞と非
染色性細胞とを分離することができる程度に、標本に含
まれる組織切片及び／又は細胞とが実質的に同一である
被検標本を意味し、例えば、パラフィン包埋組織から連
続的に切り出した或る薄切切片に対し、それに隣接する
薄片切片は実質的に同一の被検標本である。
【００１８】例えば、被検試料として細胞標本又は生体
試料を用いる場合には、免疫学的検出工程に用いた被検
標本から、染色された細胞のみを分離する。一方、被検
標本としてパラフィン包埋組織切片標本を用いる場合に
は、免疫学的検出工程に用いた被検標本から、染色され
た細胞のみを分離することもできるが、パラフィン包埋
組織切片標本を作製する際に、パラフィン包埋組織から
連続薄切切片を切り出し、互いに実質的に同一のパラフ
ィン包埋組織切片標本を複数個作製することが一般的で
あるので、以下に示すように、免疫学的検出工程に用い
た被検標本と実質的に同一の別の被検標本から、前記免
疫学的検出工程で染色された細胞に相当する細胞のみを
分離することもできる。
試料を用いる場合には、免疫学的検出工程に用いた被検
標本から、染色された細胞のみを分離する。一方、被検
標本としてパラフィン包埋組織切片標本を用いる場合に
は、免疫学的検出工程に用いた被検標本から、染色され
た細胞のみを分離することもできるが、パラフィン包埋
組織切片標本を作製する際に、パラフィン包埋組織から
連続薄切切片を切り出し、互いに実質的に同一のパラフ
ィン包埋組織切片標本を複数個作製することが一般的で
あるので、以下に示すように、免疫学的検出工程に用い
た被検標本と実質的に同一の別の被検標本から、前記免
疫学的検出工程で染色された細胞に相当する細胞のみを
分離することもできる。
【００１９】すなわち、互いに実質的に同一の複数個の
パラフィン包埋組織切片標本の内、１個のパラフィン包
埋組織切片標本を用いて前記免疫学的検出工程を実施
し、前記パラフィン包埋組織切片標本上で染色された細
胞を確認する。前記免疫学的検出工程に用いたのとは別
のパラフィン包埋組織切片標本を、倒立顕微鏡のステー
ジ台に載せ、マイクロダイセクション装置（例えば、マ
イクロダイセクションシステムＬＭ１００；オリンパス
販売）又はメスを用いて、前記染色パターンに基づい
て、染色された細胞に相当する細胞のみを採取する。な
お、前記細胞採取に先だって、前記染色パターンに基づ
き、更に別のパラフィン包埋組織切片標本上で、目的の
病変部位を確認することができる。
パラフィン包埋組織切片標本の内、１個のパラフィン包
埋組織切片標本を用いて前記免疫学的検出工程を実施
し、前記パラフィン包埋組織切片標本上で染色された細
胞を確認する。前記免疫学的検出工程に用いたのとは別
のパラフィン包埋組織切片標本を、倒立顕微鏡のステー
ジ台に載せ、マイクロダイセクション装置（例えば、マ
イクロダイセクションシステムＬＭ１００；オリンパス
販売）又はメスを用いて、前記染色パターンに基づい
て、染色された細胞に相当する細胞のみを採取する。な
お、前記細胞採取に先だって、前記染色パターンに基づ
き、更に別のパラフィン包埋組織切片標本上で、目的の
病変部位を確認することができる。
【００２０】ゲノムＤＮＡ抽出工程では、前記細胞分離
工程で得られた細胞から、例えば、従来公知の方法、例
えば、プロティナーゼＫ／フェノール抽出法、プロティ
ナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ
溶解法、又はボイリング法［以上、関谷剛男及び藤永恵
編「ＰＣＲ法最前線」共立出版，４７−５０（１９９
７）］を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出することができ
る。例えば、前記細胞分離工程で得られた細胞を、滅菌
したチューブ（例えば、エッペンドルフチューブ）に入
れ、界面活性剤［例えば、Ｔｗｅｅｎ２０又はドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］含有のプロティナーゼＫ反
応液［例えば、２０ｍｍｏｌ／ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ／０．５％
−ＳＤＳ／Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋ（２００μｇ／ｍ
ｌ）］を、採取細胞数１００個当たり５μｌ加え、４２
℃で１２〜２４時間反応させた後、９５℃で１０分間加
熱することによりプロティナーゼＫを失活させ、続い
て、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈
澱によりＤＮＡを調製する方法［実験医学，Ｖｏｌ．１
５，Ｎｏ．７（増刊），２４−２８（１９９７）］を用
いることができる。この場合、高分子キャリアーとし
て、グリコーゲン又はエタ沈メイト（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇ
ｅｎｅ）を用いると収率が向上する。また、メタノー
ル、エタノール、又はホルマリン固定サンプルからも同
様に、ゲノムＤＮＡを調製することができる。
工程で得られた細胞から、例えば、従来公知の方法、例
えば、プロティナーゼＫ／フェノール抽出法、プロティ
ナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ
溶解法、又はボイリング法［以上、関谷剛男及び藤永恵
編「ＰＣＲ法最前線」共立出版，４７−５０（１９９
７）］を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出することができ
る。例えば、前記細胞分離工程で得られた細胞を、滅菌
したチューブ（例えば、エッペンドルフチューブ）に入
れ、界面活性剤［例えば、Ｔｗｅｅｎ２０又はドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］含有のプロティナーゼＫ反
応液［例えば、２０ｍｍｏｌ／ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ／０．５％
−ＳＤＳ／Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋ（２００μｇ／ｍ
ｌ）］を、採取細胞数１００個当たり５μｌ加え、４２
℃で１２〜２４時間反応させた後、９５℃で１０分間加
熱することによりプロティナーゼＫを失活させ、続い
て、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈
澱によりＤＮＡを調製する方法［実験医学，Ｖｏｌ．１
５，Ｎｏ．７（増刊），２４−２８（１９９７）］を用
いることができる。この場合、高分子キャリアーとし
て、グリコーゲン又はエタ沈メイト（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇ
ｅｎｅ）を用いると収率が向上する。また、メタノー
ル、エタノール、又はホルマリン固定サンプルからも同
様に、ゲノムＤＮＡを調製することができる。
【００２１】あるいは、前記細胞分離工程で得られた細
胞を、滅菌したチューブ（例えば、エッペンドルフチュ
ーブ）に入れ、滅菌精製水に懸濁（約１００ｍｇ細胞に
対して滅菌精製水１ｍｌ）した後、チューブの蓋に小さ
な穴を開け、ヒートブロックにより９５〜１００℃の熱
水中で１０〜１５分間加熱し、遠心分離（例えば、１
５，０００ｒｐｍ×１０分間）することにより上清とし
てゲノムＤＮＡを得る方法（以下、煮沸法と称すること
がある）を用いることもできる。
胞を、滅菌したチューブ（例えば、エッペンドルフチュ
ーブ）に入れ、滅菌精製水に懸濁（約１００ｍｇ細胞に
対して滅菌精製水１ｍｌ）した後、チューブの蓋に小さ
な穴を開け、ヒートブロックにより９５〜１００℃の熱
水中で１０〜１５分間加熱し、遠心分離（例えば、１
５，０００ｒｐｍ×１０分間）することにより上清とし
てゲノムＤＮＡを得る方法（以下、煮沸法と称すること
がある）を用いることもできる。
【００２２】なお、被検標本としてパラフィン包埋組織
切片標本を用いる場合であって、前記免疫学的検出工程
の前に脱パラフィン処理を実施していない場合には、前
記ゲノムＤＮＡ抽出工程の前に、脱パラフィン処理を実
施する。前記脱パラフィン処理は、例えば、前記細胞分
離工程で得られた細胞を、滅菌したチューブ（例えば、
エッペンドルフチューブ）に入れ、キシレンを加える
（最低でも３回溶媒を交換する）ことにより実施するこ
とができる。過剰のパラフィン標本からの抽出物は、そ
の中にＤＮＡ以外の産物が残存しやすく、ＰＣＲ反応を
阻害する。
切片標本を用いる場合であって、前記免疫学的検出工程
の前に脱パラフィン処理を実施していない場合には、前
記ゲノムＤＮＡ抽出工程の前に、脱パラフィン処理を実
施する。前記脱パラフィン処理は、例えば、前記細胞分
離工程で得られた細胞を、滅菌したチューブ（例えば、
エッペンドルフチューブ）に入れ、キシレンを加える
（最低でも３回溶媒を交換する）ことにより実施するこ
とができる。過剰のパラフィン標本からの抽出物は、そ
の中にＤＮＡ以外の産物が残存しやすく、ＰＣＲ反応を
阻害する。
【００２３】本発明の検出方法におけるＤＮＡ増幅工程
は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）によ
り実施することができる。本発明の検出方法におけるＤ
ＮＡ増幅工程で用いることのできるプライマーは、ヒト
ｐ５３遺伝子変異が生じている可能性のある領域［好ま
しくはホットスポット（すなわち、変異が多発する領
域）存在領域］を含むヒトｐ５３遺伝子断片を増幅する
ことができるプライマーである限り、特に限定されるも
のではなく、ヒトｐ５３遺伝子の塩基配列［Ｂｕｃｈｍ
ａｎ Ｖ．Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ，７０，２４５−２５２
（１９８８）］に基づいて適宜決定することができる。
は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）によ
り実施することができる。本発明の検出方法におけるＤ
ＮＡ増幅工程で用いることのできるプライマーは、ヒト
ｐ５３遺伝子変異が生じている可能性のある領域［好ま
しくはホットスポット（すなわち、変異が多発する領
域）存在領域］を含むヒトｐ５３遺伝子断片を増幅する
ことができるプライマーである限り、特に限定されるも
のではなく、ヒトｐ５３遺伝子の塩基配列［Ｂｕｃｈｍ
ａｎ Ｖ．Ｌ．ら，Ｇｅｎｅ，７０，２４５−２５２
（１９８８）］に基づいて適宜決定することができる。
【００２４】ヒトｐ５３遺伝子におけるホットスポット
存在領域としては、例えば、エクソン５（ヒトｐ５３遺
伝子の第１３０５５番目〜第１３２３８番目の塩基配
列；塩基数＝１８４ｂｐ）、エクソン６（ヒトｐ５３遺
伝子の第１３３２０番目〜第１３４３２番目の塩基配
列；塩基数＝１１３ｂｐ）、エクソン７（ヒトｐ５３遺
伝子の第１４０００番目〜第１４１０９番目の塩基配
列；塩基数＝１１０ｂｐ）、及びエクソン８（ヒトｐ５
３遺伝子の第１４４５２番目〜第１４５８８番目の塩基
配列；塩基数＝１３７ｂｐ）の各領域が知られている。
従って、前記プライマーとしては、エクソン５、エクソ
ン６、エクソン７、又はエクソン８のいずれか１つの全
領域若しくはその一部の領域又は前記全領域を含む領域
を増幅することのできるプライマーを用いることができ
る。
存在領域としては、例えば、エクソン５（ヒトｐ５３遺
伝子の第１３０５５番目〜第１３２３８番目の塩基配
列；塩基数＝１８４ｂｐ）、エクソン６（ヒトｐ５３遺
伝子の第１３３２０番目〜第１３４３２番目の塩基配
列；塩基数＝１１３ｂｐ）、エクソン７（ヒトｐ５３遺
伝子の第１４０００番目〜第１４１０９番目の塩基配
列；塩基数＝１１０ｂｐ）、及びエクソン８（ヒトｐ５
３遺伝子の第１４４５２番目〜第１４５８８番目の塩基
配列；塩基数＝１３７ｂｐ）の各領域が知られている。
従って、前記プライマーとしては、エクソン５、エクソ
ン６、エクソン７、又はエクソン８のいずれか１つの全
領域若しくはその一部の領域又は前記全領域を含む領域
を増幅することのできるプライマーを用いることができ
る。
【００２５】前記プライマーの塩基数は、通常のＰＣＲ
法に用いられる塩基数であることができ、好ましくは１
５〜２５ｍｅｒのプライマー、より好ましくは１５〜２
０ｍｅｒのプライマーを用いることができる。また、前
記プライマーにより増幅される領域の塩基数は、ＳＳＣ
Ｐ法により一塩基置換を判定することのできる塩基数で
ある限り、特に限定されるものではなく、塩基数が１０
０〜３００ｂｐであることが好ましい。
法に用いられる塩基数であることができ、好ましくは１
５〜２５ｍｅｒのプライマー、より好ましくは１５〜２
０ｍｅｒのプライマーを用いることができる。また、前
記プライマーにより増幅される領域の塩基数は、ＳＳＣ
Ｐ法により一塩基置換を判定することのできる塩基数で
ある限り、特に限定されるものではなく、塩基数が１０
０〜３００ｂｐであることが好ましい。
【００２６】本発明の検出方法におけるＤＮＡ増幅工程
は、前記の特定のプライマーを用いること以外は、通常
のＰＣＲ法の手順に基づいて実施することができる。例
えば、９５℃で熱変性させた後、１サイクルが（１）Ｄ
ＮＡの変性工程（９２℃で１分間）、（２）１本鎖ＤＮ
Ａとプライマーとのアニーリング工程（６０℃で２分
間）、及び（３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
Ａ合成工程（７２℃で３分間）からなる増幅サイクルを
４５回繰り返すことにより、所望の領域を増幅すること
ができる。
は、前記の特定のプライマーを用いること以外は、通常
のＰＣＲ法の手順に基づいて実施することができる。例
えば、９５℃で熱変性させた後、１サイクルが（１）Ｄ
ＮＡの変性工程（９２℃で１分間）、（２）１本鎖ＤＮ
Ａとプライマーとのアニーリング工程（６０℃で２分
間）、及び（３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
Ａ合成工程（７２℃で３分間）からなる増幅サイクルを
４５回繰り返すことにより、所望の領域を増幅すること
ができる。
【００２７】細胞１個当たりのＤＮＡ含有量は約６ｐｇ
であるので、例えば、被検標本から抽出したゲノムＤＮ
Ａ量が少なく、本工程に用いるゲノムＤＮＡ量が少ない
場合には、ホットスタート法、又はネステッド（Ｎｅｓ
ｔｅｄ）ＰＣＲ法若しくはヘミネステッド（Ｈｅｍｉ−
Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法を行なうことにより、非特異的
なＰＣＲ反応を抑制することができる。これらの方法
は、単独で実施することもできるし、組み合わせて実施
することもできる。
であるので、例えば、被検標本から抽出したゲノムＤＮ
Ａ量が少なく、本工程に用いるゲノムＤＮＡ量が少ない
場合には、ホットスタート法、又はネステッド（Ｎｅｓ
ｔｅｄ）ＰＣＲ法若しくはヘミネステッド（Ｈｅｍｉ−
Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法を行なうことにより、非特異的
なＰＣＲ反応を抑制することができる。これらの方法
は、単独で実施することもできるし、組み合わせて実施
することもできる。
【００２８】例えば、本発明者が、パラフィン包埋組織
切片標本から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲを一段階で
行ない、ＰＣＲ生成物の電気泳動を行なったところ、熱
変性、アニーリング、及び伸長反応の各時間を通常より
長めに設定し、サイクル数も通常より多めに（例えば、
３５〜４０回）設定しても、バンドが確認できないか、
あるいは、スメアーになることがあった。この原因は、
標本から抽出できるゲノムＤＮＡ量が少ないこと、ある
いは、プライマー量がゲノムＤＮＡ量に比べて多いこと
によるものと考えられる。このような場合であっても、
ホットスタート法、又はネステッドＰＣＲ法若しくはヘ
ミネステッドＰＣＲ法を行なうことにより、非特異的な
ＰＣＲ反応を抑制することができる。
切片標本から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲを一段階で
行ない、ＰＣＲ生成物の電気泳動を行なったところ、熱
変性、アニーリング、及び伸長反応の各時間を通常より
長めに設定し、サイクル数も通常より多めに（例えば、
３５〜４０回）設定しても、バンドが確認できないか、
あるいは、スメアーになることがあった。この原因は、
標本から抽出できるゲノムＤＮＡ量が少ないこと、ある
いは、プライマー量がゲノムＤＮＡ量に比べて多いこと
によるものと考えられる。このような場合であっても、
ホットスタート法、又はネステッドＰＣＲ法若しくはヘ
ミネステッドＰＣＲ法を行なうことにより、非特異的な
ＰＣＲ反応を抑制することができる。
【００２９】前記ホットスタート法とは、ＰＣＲ法にお
ける最初の熱変性を実施するまで、反応液中における耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼの反応を実質的に完全に抑制す
る方法であり、例えば、（１）熱変性温度に達したとこ
ろで、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応液に添加する方
法、（２）高温で溶解するワックスにより、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを含む上層と、それ以外の成分を含む下
層とに分離しておく方法、あるいは、（３）高温で変性
する抗耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ抗体を、反応液に添加
しておく方法を挙げることができる。
ける最初の熱変性を実施するまで、反応液中における耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼの反応を実質的に完全に抑制す
る方法であり、例えば、（１）熱変性温度に達したとこ
ろで、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応液に添加する方
法、（２）高温で溶解するワックスにより、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを含む上層と、それ以外の成分を含む下
層とに分離しておく方法、あるいは、（３）高温で変性
する抗耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ抗体を、反応液に添加
しておく方法を挙げることができる。
【００３０】一方、ネステッドＰＣＲ法とは、所定の領
域（本工程においては、エクソン５、エクソン６、エク
ソン７、又はエクソン８のいずれか１つの全領域若しく
はその一部の領域又は前記全領域を含む領域）を増幅す
ることのできる一対のプライマーを用いて第１のＰＣＲ
を実施した後、第１のＰＣＲに用いた各プライマーが相
補的に結合する配列よりも内側の配列（好ましくは５〜
２０ｂｐ内側、より好ましくは５〜１０ｂｐ内側）と相
補的に結合する一対のプライマーと、前記の第１のＰＣ
Ｒにより得られたＰＣＲ生成物の一部とを用いて、第２
のＰＣＲを実施する方法である。
域（本工程においては、エクソン５、エクソン６、エク
ソン７、又はエクソン８のいずれか１つの全領域若しく
はその一部の領域又は前記全領域を含む領域）を増幅す
ることのできる一対のプライマーを用いて第１のＰＣＲ
を実施した後、第１のＰＣＲに用いた各プライマーが相
補的に結合する配列よりも内側の配列（好ましくは５〜
２０ｂｐ内側、より好ましくは５〜１０ｂｐ内側）と相
補的に結合する一対のプライマーと、前記の第１のＰＣ
Ｒにより得られたＰＣＲ生成物の一部とを用いて、第２
のＰＣＲを実施する方法である。
【００３１】また、ヘミネステッドＰＣＲ法とは、前記
ネステッドＰＣＲ法の変法であって、第２のＰＣＲ法に
用いる一対のプライマーの一方として、第１のＰＣＲに
用いた一方のプライマーが相補的に結合する配列よりも
内側の配列（好ましくは５〜２０ｂｐ内側、より好まし
くは５〜１０ｂｐ内側）と相補的に結合するプライマー
を用い、第２のＰＣＲ法に用いる一対のプライマーの残
る一方として、第１のＰＣＲに用いた残る一方のプライ
マーを用いる方法である。
ネステッドＰＣＲ法の変法であって、第２のＰＣＲ法に
用いる一対のプライマーの一方として、第１のＰＣＲに
用いた一方のプライマーが相補的に結合する配列よりも
内側の配列（好ましくは５〜２０ｂｐ内側、より好まし
くは５〜１０ｂｐ内側）と相補的に結合するプライマー
を用い、第２のＰＣＲ法に用いる一対のプライマーの残
る一方として、第１のＰＣＲに用いた残る一方のプライ
マーを用いる方法である。
【００３２】第１及び第２のＰＣＲに用いるプライマー
の塩基数は、それぞれ、通常のＰＣＲ法に用いられる塩
基数であることができ、好ましくは１５〜２５ｍｅｒの
プライマー、より好ましくは１５〜２０ｍｅｒのプライ
マーを用いることができる。ＤＮＡ増幅工程においてネ
ステッドＰＣＲ法を用いる場合であって、ヒトｐ５３遺
伝子のエクソン５を増幅する場合には、第１のＰＣＲ用
のプライマーとして、配列表の配列番号１で表される塩
基配列からなるプライマーと配列表の配列番号２で表さ
れる塩基配列からなるプライマーとの組み合わせを用
い、第２のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列
番号９で表される塩基配列からなるプライマーと配列表
の配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマー
との組み合わせを用いることが好ましい。ホットスポッ
トのある遺伝子領域を増幅することができ、しかも、Ｐ
ＣＲ生成物が多いからである。
の塩基数は、それぞれ、通常のＰＣＲ法に用いられる塩
基数であることができ、好ましくは１５〜２５ｍｅｒの
プライマー、より好ましくは１５〜２０ｍｅｒのプライ
マーを用いることができる。ＤＮＡ増幅工程においてネ
ステッドＰＣＲ法を用いる場合であって、ヒトｐ５３遺
伝子のエクソン５を増幅する場合には、第１のＰＣＲ用
のプライマーとして、配列表の配列番号１で表される塩
基配列からなるプライマーと配列表の配列番号２で表さ
れる塩基配列からなるプライマーとの組み合わせを用
い、第２のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列
番号９で表される塩基配列からなるプライマーと配列表
の配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマー
との組み合わせを用いることが好ましい。ホットスポッ
トのある遺伝子領域を増幅することができ、しかも、Ｐ
ＣＲ生成物が多いからである。
【００３３】また、ヘミネステッドＰＣＲ法を用いる場
合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン５を増幅する
場合には、第１のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表
の配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと
配列表の配列番号２で表される塩基配列からなるプライ
マーとの組み合わせを用い、第２のＰＣＲ用のプライマ
ーとして、配列表の配列番号１で表される塩基配列から
なるプライマーと配列表の配列番号１０で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせ、あるいは、配
列表の配列番号９で表される塩基配列からなるプライマ
ーと配列表の配列番号２で表される塩基配列からなるプ
ライマーとの組み合わせを用いることが好ましい。同一
のプライマーを用いて再度ＰＣＲを行なうと、目的のＰ
ＣＲ生成物の重合物ができることがあるが、ＰＣＲ生成
物を増すことができ、しかも、電気泳動後の染色バンド
がスメアになるのを防ぐことができるからである。
合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン５を増幅する
場合には、第１のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表
の配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと
配列表の配列番号２で表される塩基配列からなるプライ
マーとの組み合わせを用い、第２のＰＣＲ用のプライマ
ーとして、配列表の配列番号１で表される塩基配列から
なるプライマーと配列表の配列番号１０で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせ、あるいは、配
列表の配列番号９で表される塩基配列からなるプライマ
ーと配列表の配列番号２で表される塩基配列からなるプ
ライマーとの組み合わせを用いることが好ましい。同一
のプライマーを用いて再度ＰＣＲを行なうと、目的のＰ
ＣＲ生成物の重合物ができることがあるが、ＰＣＲ生成
物を増すことができ、しかも、電気泳動後の染色バンド
がスメアになるのを防ぐことができるからである。
【００３４】同様に、ＤＮＡ増幅工程においてネステッ
ドＰＣＲ法を用いる場合であって、ヒトｐ５３遺伝子の
エクソン６を増幅する場合には、第１のＰＣＲ用のプラ
イマーとして、配列表の配列番号３で表される塩基配列
からなるプライマーと配列表の配列番号４で表される塩
基配列からなるプライマーとの組み合わせを用い、第２
のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列番号１１
で表される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列
番号１２で表される塩基配列からなるプライマーとの組
み合わせを用いることが好ましい。ホットスポットのあ
る遺伝子領域を増幅することができ、しかも、ＰＣＲ生
成物が多いからである。
ドＰＣＲ法を用いる場合であって、ヒトｐ５３遺伝子の
エクソン６を増幅する場合には、第１のＰＣＲ用のプラ
イマーとして、配列表の配列番号３で表される塩基配列
からなるプライマーと配列表の配列番号４で表される塩
基配列からなるプライマーとの組み合わせを用い、第２
のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列番号１１
で表される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列
番号１２で表される塩基配列からなるプライマーとの組
み合わせを用いることが好ましい。ホットスポットのあ
る遺伝子領域を増幅することができ、しかも、ＰＣＲ生
成物が多いからである。
【００３５】また、ヘミネステッドＰＣＲ法を用いる場
合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン６を増幅する
場合には、第１のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表
の配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと
配列表の配列番号４で表される塩基配列からなるプライ
マーとの組み合わせを用い、第２のＰＣＲ用のプライマ
ーとして、配列表の配列番号３で表される塩基配列から
なるプライマーと配列表の配列番号１２で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせ、あるいは、配
列表の配列番号１１で表される塩基配列からなるプライ
マーと配列表の配列番号４で表される塩基配列からなる
プライマーとの組み合わせを用いることが好ましい。同
一のプライマーを用いて再度ＰＣＲを行なうと、目的の
ＰＣＲ生成物の重合物ができることがあるが、ＰＣＲ生
成物を増すことができ、しかも、電気泳動後の染色バン
ドがスメアになるのを防ぐことができるからである。
合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン６を増幅する
場合には、第１のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表
の配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと
配列表の配列番号４で表される塩基配列からなるプライ
マーとの組み合わせを用い、第２のＰＣＲ用のプライマ
ーとして、配列表の配列番号３で表される塩基配列から
なるプライマーと配列表の配列番号１２で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせ、あるいは、配
列表の配列番号１１で表される塩基配列からなるプライ
マーと配列表の配列番号４で表される塩基配列からなる
プライマーとの組み合わせを用いることが好ましい。同
一のプライマーを用いて再度ＰＣＲを行なうと、目的の
ＰＣＲ生成物の重合物ができることがあるが、ＰＣＲ生
成物を増すことができ、しかも、電気泳動後の染色バン
ドがスメアになるのを防ぐことができるからである。
【００３６】また、ＤＮＡ増幅工程においてネステッド
ＰＣＲ法を用いる場合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエ
クソン７を増幅する場合には、第１のＰＣＲ用のプライ
マーとして、配列表の配列番号５で表される塩基配列か
らなるプライマーと配列表の配列番号６で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせを用い、第２の
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列番号１３で
表される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番
号１４で表される塩基配列からなるプライマーとの組み
合わせを用いることが好ましい。ホットスポットのある
遺伝子領域を増幅することができ、しかも、ＰＣＲ生成
物が多いからである。
ＰＣＲ法を用いる場合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエ
クソン７を増幅する場合には、第１のＰＣＲ用のプライ
マーとして、配列表の配列番号５で表される塩基配列か
らなるプライマーと配列表の配列番号６で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせを用い、第２の
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列番号１３で
表される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番
号１４で表される塩基配列からなるプライマーとの組み
合わせを用いることが好ましい。ホットスポットのある
遺伝子領域を増幅することができ、しかも、ＰＣＲ生成
物が多いからである。
【００３７】また、ヘミネステッドＰＣＲ法を用いる場
合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン７を増幅する
場合には、第１のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表
の配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーと
配列表の配列番号６で表される塩基配列からなるプライ
マーとの組み合わせを用い、第２のＰＣＲ用のプライマ
ーとして、配列表の配列番号５で表される塩基配列から
なるプライマーと配列表の配列番号１４で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせ、あるいは、配
列表の配列番号１３で表される塩基配列からなるプライ
マーと配列表の配列番号６で表される塩基配列からなる
プライマーとの組み合わせを用いることが好ましい。同
一のプライマーを用いて再度ＰＣＲを行なうと、目的の
ＰＣＲ生成物の重合物ができることがあるが、ＰＣＲ生
成物を増すことができ、しかも、電気泳動後の染色バン
ドがスメアになるのを防ぐことができるからである。
合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン７を増幅する
場合には、第１のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表
の配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーと
配列表の配列番号６で表される塩基配列からなるプライ
マーとの組み合わせを用い、第２のＰＣＲ用のプライマ
ーとして、配列表の配列番号５で表される塩基配列から
なるプライマーと配列表の配列番号１４で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせ、あるいは、配
列表の配列番号１３で表される塩基配列からなるプライ
マーと配列表の配列番号６で表される塩基配列からなる
プライマーとの組み合わせを用いることが好ましい。同
一のプライマーを用いて再度ＰＣＲを行なうと、目的の
ＰＣＲ生成物の重合物ができることがあるが、ＰＣＲ生
成物を増すことができ、しかも、電気泳動後の染色バン
ドがスメアになるのを防ぐことができるからである。
【００３８】更に、ＤＮＡ増幅工程においてネステッド
ＰＣＲ法を用いる場合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエ
クソン８を増幅する場合には、第１のＰＣＲ用のプライ
マーとして、配列表の配列番号７で表される塩基配列か
らなるプライマーと配列表の配列番号８で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせを用い、第２の
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列番号１５で
表される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番
号１６で表される塩基配列からなるプライマーとの組み
合わせを用いることが好ましい。ホットスポットのある
遺伝子領域を増幅することができ、しかも、ＰＣＲ生成
物が多いからである。
ＰＣＲ法を用いる場合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエ
クソン８を増幅する場合には、第１のＰＣＲ用のプライ
マーとして、配列表の配列番号７で表される塩基配列か
らなるプライマーと配列表の配列番号８で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせを用い、第２の
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列番号１５で
表される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番
号１６で表される塩基配列からなるプライマーとの組み
合わせを用いることが好ましい。ホットスポットのある
遺伝子領域を増幅することができ、しかも、ＰＣＲ生成
物が多いからである。
【００３９】また、ヘミネステッドＰＣＲ法を用いる場
合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン８を増幅する
場合には、第１のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表
の配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーと
配列表の配列番号８で表される塩基配列からなるプライ
マーとの組み合わせを用い、第２のＰＣＲ用のプライマ
ーとして、配列表の配列番号７で表される塩基配列から
なるプライマーと配列表の配列番号１６で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせ、あるいは、配
列表の配列番号１５で表される塩基配列からなるプライ
マーと配列表の配列番号８で表される塩基配列からなる
プライマーとの組み合わせを用いることが好ましい。同
一のプライマーを用いて再度ＰＣＲを行なうと、目的の
ＰＣＲ生成物の重合物ができることがあるが、ＰＣＲ生
成物を増すことができ、しかも、電気泳動後の染色バン
ドがスメアになるのを防ぐことができるからである。
合であって、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン８を増幅する
場合には、第１のＰＣＲ用のプライマーとして、配列表
の配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーと
配列表の配列番号８で表される塩基配列からなるプライ
マーとの組み合わせを用い、第２のＰＣＲ用のプライマ
ーとして、配列表の配列番号７で表される塩基配列から
なるプライマーと配列表の配列番号１６で表される塩基
配列からなるプライマーとの組み合わせ、あるいは、配
列表の配列番号１５で表される塩基配列からなるプライ
マーと配列表の配列番号８で表される塩基配列からなる
プライマーとの組み合わせを用いることが好ましい。同
一のプライマーを用いて再度ＰＣＲを行なうと、目的の
ＰＣＲ生成物の重合物ができることがあるが、ＰＣＲ生
成物を増すことができ、しかも、電気泳動後の染色バン
ドがスメアになるのを防ぐことができるからである。
【００４０】本発明の検出方法における解析工程は、前
記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物におけるヒトｐ
５３遺伝子変異を判定することのできる公知の判定方法
を用いることにより、実施することができる。このよう
な判定方法としては、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳ
ＣＰ）法又はダイレクトシークエンス法を挙げることが
できる。
記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物におけるヒトｐ
５３遺伝子変異を判定することのできる公知の判定方法
を用いることにより、実施することができる。このよう
な判定方法としては、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳ
ＣＰ）法又はダイレクトシークエンス法を挙げることが
できる。
【００４１】ＳＳＣＰ法を用いる解析工程は、例えば、
以下に示す手順により実施することができる。すなわ
ち、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、ＳＳ
ＣＰ変性溶液に加え、９５〜１００℃のヒーティングブ
ロック又は熱水中で２〜３分間加熱し、氷中で冷却した
後、低温（通常、１０〜２５℃）下で電気泳動を実施す
ることのできるコールドＳＳＣＰ装置で、２０％ポリア
クリルアミドＴＢＥゲル又は４〜２０％グラジェントポ
リアクリルアミドＴＢＥゲルにアプライし、電気泳動を
行なう。電気泳動終了後、ゲルカセットからポリアクリ
ルアミドゲルを取り出し、エチジウムブロマイド溶液又
はサイバーグリーンII溶液［ＣＹＢＲ ＧｒｅｅｎII
（ジメチルスルホキシド溶液）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅ社：使用時に、ＴＢＥ（８９ｍｍｏｌ／ｌ−
Ｔｒｉｓ，８９ｍｍｏｌ／ｌホウ酸，２ｍｍｏｌ／ｌ−
ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で１０，０００倍に希釈］を用
いて室温で１５分間染色することにより、バンドを検出
する。
以下に示す手順により実施することができる。すなわ
ち、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、ＳＳ
ＣＰ変性溶液に加え、９５〜１００℃のヒーティングブ
ロック又は熱水中で２〜３分間加熱し、氷中で冷却した
後、低温（通常、１０〜２５℃）下で電気泳動を実施す
ることのできるコールドＳＳＣＰ装置で、２０％ポリア
クリルアミドＴＢＥゲル又は４〜２０％グラジェントポ
リアクリルアミドＴＢＥゲルにアプライし、電気泳動を
行なう。電気泳動終了後、ゲルカセットからポリアクリ
ルアミドゲルを取り出し、エチジウムブロマイド溶液又
はサイバーグリーンII溶液［ＣＹＢＲ ＧｒｅｅｎII
（ジメチルスルホキシド溶液）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅ社：使用時に、ＴＢＥ（８９ｍｍｏｌ／ｌ−
Ｔｒｉｓ，８９ｍｍｏｌ／ｌホウ酸，２ｍｍｏｌ／ｌ−
ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で１０，０００倍に希釈］を用
いて室温で１５分間染色することにより、バンドを検出
する。
【００４２】本発明の検出方法においては、相同染色体
上に存在する２個のヒトｐ５３遺伝子のどちらにも変異
（例えば、一塩基置換）が起こっていない場合（すなわ
ち、野生型ヒトｐ５３遺伝子である場合）には、解析工
程により得られるバンドは、野生型プラス鎖に由来する
バンド及び野生型マイナス鎖に由来するバンドの２本で
ある。一方、ヒトｐ５３遺伝子のいずれか一方に変異
（例えば、一塩基置換）が起こっている場合には、野生
型ヒトｐ５３遺伝子と変異型ヒトｐ５３遺伝子とを含む
ので、解析工程により得られるバンドは３本である。こ
の理由は、変異型ヒトｐ５３遺伝子では、通常、プラス
鎖にのみ変異が生じており、マイナス鎖には変異が生じ
ていないので、変異型プラス鎖及び野生型マイナス鎖か
らなるからである。
上に存在する２個のヒトｐ５３遺伝子のどちらにも変異
（例えば、一塩基置換）が起こっていない場合（すなわ
ち、野生型ヒトｐ５３遺伝子である場合）には、解析工
程により得られるバンドは、野生型プラス鎖に由来する
バンド及び野生型マイナス鎖に由来するバンドの２本で
ある。一方、ヒトｐ５３遺伝子のいずれか一方に変異
（例えば、一塩基置換）が起こっている場合には、野生
型ヒトｐ５３遺伝子と変異型ヒトｐ５３遺伝子とを含む
ので、解析工程により得られるバンドは３本である。こ
の理由は、変異型ヒトｐ５３遺伝子では、通常、プラス
鎖にのみ変異が生じており、マイナス鎖には変異が生じ
ていないので、変異型プラス鎖及び野生型マイナス鎖か
らなるからである。
【００４３】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【実施例１】《抗ヒトｐ５３タンパク質モノクローナル
抗体を用いた組織染色》常法に従って、以下に示す手順
で、被検材料を固定し、パラフィン包埋した。前記被検
材料としては、大腸癌、乳癌、及び胃癌の生検組織を用
いた。前記被検材料を、緩衝ホルマリン［組成：１０％
ホルマリン原液，リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）］で
固定した後、エタノールで脱水し、続いて、クロロホル
ムで置換した後、融点５６〜５８℃のパラフィンを用い
て包埋した。
抗体を用いた組織染色》常法に従って、以下に示す手順
で、被検材料を固定し、パラフィン包埋した。前記被検
材料としては、大腸癌、乳癌、及び胃癌の生検組織を用
いた。前記被検材料を、緩衝ホルマリン［組成：１０％
ホルマリン原液，リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）］で
固定した後、エタノールで脱水し、続いて、クロロホル
ムで置換した後、融点５６〜５８℃のパラフィンを用い
て包埋した。
【００４４】得られたパラフィン包埋標本から、ミクロ
トームを用いて、連続薄切切片（約１０μｍ）を作製
し、この切片をスライドガラスに貼布し、充分に乾燥さ
せた。なお、前記ミクロトームは、試料薄切前に予めエ
タノールで清拭した。次に、得られたスライドグラスの
内、５枚を、キシレン槽に浸し、脱パラフィン操作を行
なった。この際、１００％エタノール槽に３分間ずつ、
３回浸した後、７０％エタノール槽に３分間浸した後、
精製水で洗浄した。
トームを用いて、連続薄切切片（約１０μｍ）を作製
し、この切片をスライドガラスに貼布し、充分に乾燥さ
せた。なお、前記ミクロトームは、試料薄切前に予めエ
タノールで清拭した。次に、得られたスライドグラスの
内、５枚を、キシレン槽に浸し、脱パラフィン操作を行
なった。この際、１００％エタノール槽に３分間ずつ、
３回浸した後、７０％エタノール槽に３分間浸した後、
精製水で洗浄した。
【００４５】抗ヒトｐ５３タンパク質モノクローナル抗
体を用いた染色後の鏡検によるｐ５３タンパク質の確認
は、免疫組織染色キット（ＳｃｙＴｅｋ社製造，ダイア
ヤトロン販売）を用いて以下に示す手順で行なった。す
なわち、脱パラフィン操作を実施した前記スライドグラ
ス標本に、スーパーブロック液（バイアル＃１）４滴を
滴下して、室温で５分間ブロッキングし、リン酸緩衝液
で１回洗浄した後、一次抗体として抗ヒトｐ５３タンパ
ク質特異モノクローナル抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）
溶液１００μｌを滴下し、室温で２０分間反応させた。
次に、リン酸緩衝液で４回洗浄した後、二次抗体として
ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液４滴を滴下し、室
温で１０分間反応させた後、リン酸緩衝液で４回洗浄し
た。更に、ストレプトアビジン・ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒ
ａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を滴下し、室温で
１０分反応させた後、リン酸緩衝液で４回洗浄した。続
いて、ＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄ
ｉｎｅ）発色液（ＤＡＢ基質液にＤＡＢクロモーゲン４
滴を加え、混和することにより調製したもの）を４滴滴
下し、染色した。
体を用いた染色後の鏡検によるｐ５３タンパク質の確認
は、免疫組織染色キット（ＳｃｙＴｅｋ社製造，ダイア
ヤトロン販売）を用いて以下に示す手順で行なった。す
なわち、脱パラフィン操作を実施した前記スライドグラ
ス標本に、スーパーブロック液（バイアル＃１）４滴を
滴下して、室温で５分間ブロッキングし、リン酸緩衝液
で１回洗浄した後、一次抗体として抗ヒトｐ５３タンパ
ク質特異モノクローナル抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）
溶液１００μｌを滴下し、室温で２０分間反応させた。
次に、リン酸緩衝液で４回洗浄した後、二次抗体として
ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液４滴を滴下し、室
温で１０分間反応させた後、リン酸緩衝液で４回洗浄し
た。更に、ストレプトアビジン・ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒ
ａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を滴下し、室温で
１０分反応させた後、リン酸緩衝液で４回洗浄した。続
いて、ＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄ
ｉｎｅ）発色液（ＤＡＢ基質液にＤＡＢクロモーゲン４
滴を加え、混和することにより調製したもの）を４滴滴
下し、染色した。
【００４６】更に、ヘマトキシリン・エオジン液を用い
て、核染色を行ない、リン酸緩衝液で洗浄した。このス
ライドガラス標本を顕微鏡で観察し、ヒトｐ５３タンパ
ク質の染色の有無を確認したところ、核に、ヒトｐ５３
タンパク質の染色が認められた。すなわち、正常細胞の
核は青色に染まるのに対して、ｐ５３タンパク質が局在
している癌細胞の核は、茶褐色に染まった。
て、核染色を行ない、リン酸緩衝液で洗浄した。このス
ライドガラス標本を顕微鏡で観察し、ヒトｐ５３タンパ
ク質の染色の有無を確認したところ、核に、ヒトｐ５３
タンパク質の染色が認められた。すなわち、正常細胞の
核は青色に染まるのに対して、ｐ５３タンパク質が局在
している癌細胞の核は、茶褐色に染まった。
【００４７】
【実施例２】《ゲノムＤＮＡの抽出》前記の抗ヒトｐ５
３タンパク質モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色
を行なった切片の癌細胞を確認し、その染色パターンに
基づいて、免疫組織染色を実施しなかった別のスライド
グラス上の連続切片にカバーグラスをかけ目的の病変部
位を顕微鏡観察下、確認した。この切片に存在する癌細
胞の部分をメスで削り取り集めた。これを滅菌したエッ
ペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）に入れ、滅菌精製水
１ｍｌに懸濁した。チューブの蓋に小さな穴を開け、ヒ
ートブロック中で１５分間沸騰し、遠心分離（１５，０
００ｒｐｍ×１０分間）することにより上清を得た。こ
の上清をゲノムＤＮＡ試料として以下の工程に用いた。
３タンパク質モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色
を行なった切片の癌細胞を確認し、その染色パターンに
基づいて、免疫組織染色を実施しなかった別のスライド
グラス上の連続切片にカバーグラスをかけ目的の病変部
位を顕微鏡観察下、確認した。この切片に存在する癌細
胞の部分をメスで削り取り集めた。これを滅菌したエッ
ペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）に入れ、滅菌精製水
１ｍｌに懸濁した。チューブの蓋に小さな穴を開け、ヒ
ートブロック中で１５分間沸騰し、遠心分離（１５，０
００ｒｐｍ×１０分間）することにより上清を得た。こ
の上清をゲノムＤＮＡ試料として以下の工程に用いた。
【００４８】
【実施例３】《ｐ５３のエクソン５、エクソン６、エク
ソン７、及びエクソン８遺伝子の増幅》 （１）プライマーの合成 ３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステ
ムズ社）を用いて、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン５の全
領域を含む領域を増幅することのできる４種類のプライ
マー、すなわち、第１のＰＣＲに用いる配列：５’−TT
CCTCTTCCTGCAGTACTCC−３’（配列表の配列番号１で表
される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ５ｓｅ１及び配列：５’−
GCCCCAGCTGCTCACCATCG−３’（配列表の配列番号２で表
される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ５ａｓ１、並びに第
２のＰＣＲに用いる配列：５’−TGCAGTACTCCCCTGCCCTC
−３’（配列表の配列番号９で表される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ５ｓｅ２及び配列：５’−
CTCACCATCGCTATCTGAGC−３’（配列表の配列番号１０で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ５ａｓ２をそれぞれ
合成した。各プライマーとそれらが認識するヒトｐ５３
遺伝子の塩基配列との関係を表１に示す。
ソン７、及びエクソン８遺伝子の増幅》 （１）プライマーの合成 ３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステ
ムズ社）を用いて、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン５の全
領域を含む領域を増幅することのできる４種類のプライ
マー、すなわち、第１のＰＣＲに用いる配列：５’−TT
CCTCTTCCTGCAGTACTCC−３’（配列表の配列番号１で表
される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ５ｓｅ１及び配列：５’−
GCCCCAGCTGCTCACCATCG−３’（配列表の配列番号２で表
される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ５ａｓ１、並びに第
２のＰＣＲに用いる配列：５’−TGCAGTACTCCCCTGCCCTC
−３’（配列表の配列番号９で表される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ５ｓｅ２及び配列：５’−
CTCACCATCGCTATCTGAGC−３’（配列表の配列番号１０で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ５ａｓ２をそれぞれ
合成した。各プライマーとそれらが認識するヒトｐ５３
遺伝子の塩基配列との関係を表１に示す。
【００４９】同様に、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン６の
全領域を含む領域を増幅することのできる４種類のプラ
イマー、すなわち、第１のＰＣＲに用いる配列：５’−
CACTGATTGCTCTTAGGTCTG−３’（配列表の配列番号３で
表される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ６ｓｅ１及び配列：５’−
AGTTGCAAACCAGACCTCAGG−３’（配列表の配列番号４で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ６ａｓ１、並びに第
２のＰＣＲに用いる配列：５’−TGCTCTTAGGTCTGGCCCCT
−３’（配列表の配列番号１１で表される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ６ｓｅ２及び配列：５’−
ACCAGACCTCAGGCGGCTCA−３’（配列表の配列番号１２で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ６ａｓ２をそれぞれ
合成した。各プライマーとそれらが認識するヒトｐ５３
遺伝子の塩基配列との関係を表１に示す。
全領域を含む領域を増幅することのできる４種類のプラ
イマー、すなわち、第１のＰＣＲに用いる配列：５’−
CACTGATTGCTCTTAGGTCTG−３’（配列表の配列番号３で
表される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ６ｓｅ１及び配列：５’−
AGTTGCAAACCAGACCTCAGG−３’（配列表の配列番号４で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ６ａｓ１、並びに第
２のＰＣＲに用いる配列：５’−TGCTCTTAGGTCTGGCCCCT
−３’（配列表の配列番号１１で表される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ６ｓｅ２及び配列：５’−
ACCAGACCTCAGGCGGCTCA−３’（配列表の配列番号１２で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ６ａｓ２をそれぞれ
合成した。各プライマーとそれらが認識するヒトｐ５３
遺伝子の塩基配列との関係を表１に示す。
【００５０】また、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン７の全
領域を含む領域を増幅することのできる４種類のプライ
マー、すなわち、第１のＰＣＲに用いる配列：５’−GT
GTTGTCTCCTAGGTTGGC−３’（配列表の配列番号５で表さ
れる塩基配列） からなるセンスプライマーＥ７ｓｅ１及び配列：５’−
CAAGTGGCTCCTGACCTGGAG−３’（配列表の配列番号６で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ７ａｓ１、並びに第
２のＰＣＲに用いる配列：５’−CTAGGTTGGCTCTGACTGTA
−３’（配列表の配列番号１３で表される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ７ｓｅ２及び配列：５’−
CTGACCTGGAGTCTTCCAGT−３’（配列表の配列番号１４で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ７ａｓ２をそれぞれ
合成した。各プライマーとそれらが認識するヒトｐ５３
遺伝子の塩基配列との関係を表１に示す。
領域を含む領域を増幅することのできる４種類のプライ
マー、すなわち、第１のＰＣＲに用いる配列：５’−GT
GTTGTCTCCTAGGTTGGC−３’（配列表の配列番号５で表さ
れる塩基配列） からなるセンスプライマーＥ７ｓｅ１及び配列：５’−
CAAGTGGCTCCTGACCTGGAG−３’（配列表の配列番号６で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ７ａｓ１、並びに第
２のＰＣＲに用いる配列：５’−CTAGGTTGGCTCTGACTGTA
−３’（配列表の配列番号１３で表される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ７ｓｅ２及び配列：５’−
CTGACCTGGAGTCTTCCAGT−３’（配列表の配列番号１４で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ７ａｓ２をそれぞれ
合成した。各プライマーとそれらが認識するヒトｐ５３
遺伝子の塩基配列との関係を表１に示す。
【００５１】更に、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン８の全
領域を含む領域を増幅することのできる４種類のプライ
マー、すなわち、第１のＰＣＲに用いる配列：５’−CC
TATCCTGAGTAGTGGTAAT−３’（配列表の配列番号７で表
される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ８ｓｅ１及び配列：５’−
GTCCTGCTTGCTTACCTCGC−３’（配列表の配列番号８で表
される塩基配列）からなるアンチセンスプライマーＥ８
ａｓ１、並びに第２のＰＣＲに用いる配列：５’−GTAG
TGGTAATCTACTGGGA−３’（配列表の配列番号１５で表さ
れる塩基配列） からなるセンスプライマーＥ８ｓｅ２及び配列：５’−
CTTACCTCGCTTAGTGCTCC−３’（配列表の配列番号１６で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ８ａｓ２をそれぞれ
合成した。各プライマーとそれらが認識するヒトｐ５３
遺伝子の塩基配列との関係を表１に示す。なお、表１に
示すヒトｐ５３遺伝子の塩基配列番号は、米国ＮＣＢＩ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＡｃ
ｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ９４７８８「Ｈｕｍａｎ ｐ
５３」の塩基配列番号である。
領域を含む領域を増幅することのできる４種類のプライ
マー、すなわち、第１のＰＣＲに用いる配列：５’−CC
TATCCTGAGTAGTGGTAAT−３’（配列表の配列番号７で表
される塩基配列） からなるセンスプライマーＥ８ｓｅ１及び配列：５’−
GTCCTGCTTGCTTACCTCGC−３’（配列表の配列番号８で表
される塩基配列）からなるアンチセンスプライマーＥ８
ａｓ１、並びに第２のＰＣＲに用いる配列：５’−GTAG
TGGTAATCTACTGGGA−３’（配列表の配列番号１５で表さ
れる塩基配列） からなるセンスプライマーＥ８ｓｅ２及び配列：５’−
CTTACCTCGCTTAGTGCTCC−３’（配列表の配列番号１６で
表される塩基配列） からなるアンチセンスプライマーＥ８ａｓ２をそれぞれ
合成した。各プライマーとそれらが認識するヒトｐ５３
遺伝子の塩基配列との関係を表１に示す。なお、表１に
示すヒトｐ５３遺伝子の塩基配列番号は、米国ＮＣＢＩ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＡｃ
ｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ９４７８８「Ｈｕｍａｎ ｐ
５３」の塩基配列番号である。
【００５２】 《表１》 プライマー 増幅対象の プライマーが認識するヒト エクソン ｐ５３遺伝子の塩基配列 Ｅ５ｓｅ１ ５ 第１３０４０番目〜第１３０６０番目 Ｅ５ａｓ１ ５ 第１３２３４番目〜第１３２５３番目 Ｅ５ｓｅ２ ５ 第１３０５０番目〜第１３０６９番目 Ｅ５ａｓ２ ５ 第１３２２４番目〜第１３２４３番目 Ｅ６ｓｅ１ ６ 第１３３０４番目〜第１３３２４番目 Ｅ６ａｓ１ ６ 第１３４２７番目〜第１３４４７番目 Ｅ６ｓｅ２ ６ 第１３３１１番目〜第１３３３０番目 Ｅ６ａｓ２ ６ 第１３４２０番目〜第１３４３９番目 Ｅ７ｓｅ１ ７ 第１３９８６番目〜第１４００５番目 Ｅ７ａｓ１ ７ 第１４１０４番目〜第１４１２４番目 Ｅ７ｓｅ２ ７ 第１３９９６番目〜第１４０１５番目 Ｅ７ａｓ２ ７ 第１４０９５番目〜第１４１１４番目 Ｅ８ｓｅ１ ８ 第１４４３８番目〜第１４４５８番目 Ｅ８ａｓ１ ８ 第１４５８４番目〜第１４６０３番目 Ｅ８ｓｅ２ ８ 第１４４４８番目〜第１４４６７番目Ｅ８ａｓ２ ８ 第１４５７４番目〜第１４５９３番目
【００５３】（２）エクソン５、エクソン６、エクソン
７、及びエクソン８遺伝子の第１のＰＣＲによる増幅 前記実施例２で得られたＤＮＡ３０μｌ及びマスターＴ
ａｑキット試薬（エッペンドルフ）を用いて、反応容量
５０μｌで４５サイクル行なった。ＰＣＲ反応溶液に
は、Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）０．２μｌ、１
０ｘバッファー［１００ｍｍｏｌ／ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３）／５００ｍｍｏｌ／ｌ−ＫＣｌ／１５
ｍｍｏｌ／ｌ−ＭｇＣｌ2］５μｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ
−ｄＮＴＰ１μｌ、５ｘエンハンサー１０μｌ、プライ
マー各０．５μｌ、及び滅菌精製水２．８μｌが含まれ
る。
７、及びエクソン８遺伝子の第１のＰＣＲによる増幅 前記実施例２で得られたＤＮＡ３０μｌ及びマスターＴ
ａｑキット試薬（エッペンドルフ）を用いて、反応容量
５０μｌで４５サイクル行なった。ＰＣＲ反応溶液に
は、Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）０．２μｌ、１
０ｘバッファー［１００ｍｍｏｌ／ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３）／５００ｍｍｏｌ／ｌ−ＫＣｌ／１５
ｍｍｏｌ／ｌ−ＭｇＣｌ2］５μｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ
−ｄＮＴＰ１μｌ、５ｘエンハンサー１０μｌ、プライ
マー各０．５μｌ、及び滅菌精製水２．８μｌが含まれ
る。
【００５４】ヒトｐ５３遺伝子のエクソン５の第１のＰ
ＣＲによる増幅には、前記実施例３（１）で合成したプ
ライマーＥ５ｓｅ１及びプライマーＥ５ａｓ１を用い
た。まず、ゲノムＤＮＡを９５℃で１０分間熱変性させ
た後、１サイクルが（１）ＤＮＡの変性工程（９２℃で
１分間）、（２）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニー
リング工程（６０℃で２分間）、及び（３）ＤＮＡポリ
メラーゼによるＤＮＡ合成工程（７２℃で３分間）から
なるＰＣＲサイクルを４５回繰り返し、更に、７２℃で
１０分間のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行なっ
た。
ＣＲによる増幅には、前記実施例３（１）で合成したプ
ライマーＥ５ｓｅ１及びプライマーＥ５ａｓ１を用い
た。まず、ゲノムＤＮＡを９５℃で１０分間熱変性させ
た後、１サイクルが（１）ＤＮＡの変性工程（９２℃で
１分間）、（２）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニー
リング工程（６０℃で２分間）、及び（３）ＤＮＡポリ
メラーゼによるＤＮＡ合成工程（７２℃で３分間）から
なるＰＣＲサイクルを４５回繰り返し、更に、７２℃で
１０分間のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行なっ
た。
【００５５】同様に、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン６の
第１のＰＣＲによる増幅には、前記実施例３（１）で合
成したプライマーＥ６ｓｅ１及びプライマーＥ６ａｓ１
を用い、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン７の第１のＰＣＲ
による増幅には、前記実施例３（１）で合成したプライ
マーＥ７ｓｅ１及びプライマーＥ７ａｓ１を用い、ヒト
ｐ５３遺伝子のエクソン８の第１のＰＣＲによる増幅に
は、前記実施例３（１）で合成したプライマーＥ８ｓｅ
１及びプライマーＥ８ａｓ１を用い、それぞれ第１のＰ
ＣＲによる増幅を行なった。
第１のＰＣＲによる増幅には、前記実施例３（１）で合
成したプライマーＥ６ｓｅ１及びプライマーＥ６ａｓ１
を用い、ヒトｐ５３遺伝子のエクソン７の第１のＰＣＲ
による増幅には、前記実施例３（１）で合成したプライ
マーＥ７ｓｅ１及びプライマーＥ７ａｓ１を用い、ヒト
ｐ５３遺伝子のエクソン８の第１のＰＣＲによる増幅に
は、前記実施例３（１）で合成したプライマーＥ８ｓｅ
１及びプライマーＥ８ａｓ１を用い、それぞれ第１のＰ
ＣＲによる増幅を行なった。
【００５６】（３）エクソン５、エクソン６、エクソン
７、及びエクソン８遺伝子の第２のＰＣＲによる増幅 前記実施例３（２）で得られたエクソン５のＰＣＲ生成
物１μｌを鋳型ＤＮＡとして用い、前記実施例３（１）
で合成したプライマーＥ５ｓｅ２及びプライマーＥ５ａ
ｓ２を用いて、以下に示す手順により、反応容量５０μ
ｌで第２のＰＣＲによる増幅を行なった。まず、９５℃
で１０分間熱変性させた後、１サイクルが（１）ＤＮＡ
の変性工程（９２℃で１分間）、（２）１本鎖ＤＮＡと
プライマーとのアニーリング工程（６０℃で２分間）、
及び（３）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程
（７２℃で３分間）からなるＰＣＲサイクルを３０回繰
り返し、更に、７２℃で１０分間のＤＮＡポリメラーゼ
による伸長反応を行なった。
７、及びエクソン８遺伝子の第２のＰＣＲによる増幅 前記実施例３（２）で得られたエクソン５のＰＣＲ生成
物１μｌを鋳型ＤＮＡとして用い、前記実施例３（１）
で合成したプライマーＥ５ｓｅ２及びプライマーＥ５ａ
ｓ２を用いて、以下に示す手順により、反応容量５０μ
ｌで第２のＰＣＲによる増幅を行なった。まず、９５℃
で１０分間熱変性させた後、１サイクルが（１）ＤＮＡ
の変性工程（９２℃で１分間）、（２）１本鎖ＤＮＡと
プライマーとのアニーリング工程（６０℃で２分間）、
及び（３）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程
（７２℃で３分間）からなるＰＣＲサイクルを３０回繰
り返し、更に、７２℃で１０分間のＤＮＡポリメラーゼ
による伸長反応を行なった。
【００５７】同様に、前記実施例３（２）で得られたエ
クソン６、エクソン７、及びエクソン８の各ＰＣＲ生成
物についても、前記実施例３（１）で合成したプライマ
ーＥ６ｓｅ２及びプライマーＥ６ａｓ２、プライマーＥ
７ｓｅ２及びプライマーＥ７ａｓ２、並びにプライマー
Ｅ８ｓｅ２及びプライマーＥ８ａｓ２をそれぞれ用い、
第２のＰＣＲによる増幅を行なった。
クソン６、エクソン７、及びエクソン８の各ＰＣＲ生成
物についても、前記実施例３（１）で合成したプライマ
ーＥ６ｓｅ２及びプライマーＥ６ａｓ２、プライマーＥ
７ｓｅ２及びプライマーＥ７ａｓ２、並びにプライマー
Ｅ８ｓｅ２及びプライマーＥ８ａｓ２をそれぞれ用い、
第２のＰＣＲによる増幅を行なった。
【００５８】（４）ＰＣＲ生成物の確認 ２０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）
に、前記実施例３（３）で得られた各ＰＣＲ生成物及び
ＤＮＡマーカーＩＸ（ロシュダイアグノスティクス）を
アプライし、電気泳動（２００Ｖ，５０分間）を行なっ
た。このゲルを０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド
溶液を用いて室温で１５分間染色し、エクソン５、エク
ソン６、エクソン７、及びエクソン８に相応するバンド
の有無を確認した。結果を図１に示す。図１において、
レーン１はＤＮＡマーカーＩＸの結果であり、レーン２
〜レーン５は、それぞれ、エクソン５、エクソン６、エ
クソン７、及びエクソン８を増幅した各ＰＣＲ生成物の
結果である。レーン１に示すバンドは、それぞれ、下か
ら７２ｂｐ、１１８ｂｐ、１９４ｂｐ、２３４ｂｐ、２
８１ｂｐ、３１０ｂｐ、６０３ｂｐ、８７２ｂｐ、及び
１３５３ｂｐである。
に、前記実施例３（３）で得られた各ＰＣＲ生成物及び
ＤＮＡマーカーＩＸ（ロシュダイアグノスティクス）を
アプライし、電気泳動（２００Ｖ，５０分間）を行なっ
た。このゲルを０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド
溶液を用いて室温で１５分間染色し、エクソン５、エク
ソン６、エクソン７、及びエクソン８に相応するバンド
の有無を確認した。結果を図１に示す。図１において、
レーン１はＤＮＡマーカーＩＸの結果であり、レーン２
〜レーン５は、それぞれ、エクソン５、エクソン６、エ
クソン７、及びエクソン８を増幅した各ＰＣＲ生成物の
結果である。レーン１に示すバンドは、それぞれ、下か
ら７２ｂｐ、１１８ｂｐ、１９４ｂｐ、２３４ｂｐ、２
８１ｂｐ、３１０ｂｐ、６０３ｂｐ、８７２ｂｐ、及び
１３５３ｂｐである。
【００５９】（５）ｐ５３遺伝子変異の有無の確認 前記実施例３（３）で得られた各ＰＣＲ生成物５μｌを
ＳＳＣＰ変性溶液（グリセロール１０μｌ／フォルムア
ミド１７０μｌ／０．０２％キシレンシアノール及び
０．０２％ブロムフェノールブルー２０μｌ）１０μｌ
に加え、９５℃のヒートブロックで、１０分間加熱し、
氷中で冷却した後、バッファー温度が１０℃になるよう
に設定したコールドＳＳＣＰ装置（Ｎｏｖｅｘ）で、２
０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル又は４〜２０％グラ
ジェントポリアクリルアミドＴＢＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）
にアプライし、電気泳動を行なった。この際、２０％Ｔ
ＢＥゲルの場合には、１００Ｖで３０分間泳動した後、
更に、３００Ｖで１３０分間泳動し、一方、４〜２０％
ＴＢＥゲルの場合には、１００Ｖで３０分間泳動した
後、更に、３００Ｖで５０分間泳動した。なお、ＤＮＡ
マーカーとしては、ＩＸ（ロシュダイアグノスティク
ス）を用いた。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲ
ルを０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液を用い
て室温で１５分間染色し、コントロール（正常細胞のヒ
トｐ５３遺伝子）と比較し、異なる位置にバンドがある
かどうかを確認した。
ＳＳＣＰ変性溶液（グリセロール１０μｌ／フォルムア
ミド１７０μｌ／０．０２％キシレンシアノール及び
０．０２％ブロムフェノールブルー２０μｌ）１０μｌ
に加え、９５℃のヒートブロックで、１０分間加熱し、
氷中で冷却した後、バッファー温度が１０℃になるよう
に設定したコールドＳＳＣＰ装置（Ｎｏｖｅｘ）で、２
０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル又は４〜２０％グラ
ジェントポリアクリルアミドＴＢＥゲル（Ｎｏｖｅｘ）
にアプライし、電気泳動を行なった。この際、２０％Ｔ
ＢＥゲルの場合には、１００Ｖで３０分間泳動した後、
更に、３００Ｖで１３０分間泳動し、一方、４〜２０％
ＴＢＥゲルの場合には、１００Ｖで３０分間泳動した
後、更に、３００Ｖで５０分間泳動した。なお、ＤＮＡ
マーカーとしては、ＩＸ（ロシュダイアグノスティク
ス）を用いた。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲ
ルを０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液を用い
て室温で１５分間染色し、コントロール（正常細胞のヒ
トｐ５３遺伝子）と比較し、異なる位置にバンドがある
かどうかを確認した。
【００６０】得られたエクソン５、エクソン６、エクソ
ン７、及びエクソン８に関する結果の内、２０％ポリア
クリルアミドＴＢＥゲルで電気泳動を実施したエクソン
７に関する結果のみを図２に示す。図２において、レー
ン１はＤＮＡマーカーの結果であり、レーン２は正常細
胞の結果であり、レーン３〜レーン７は、それぞれ、標
本でｐ５３タンパク質を確認した大腸癌、乳癌、大腸
癌、胃癌、及び乳癌の患者の結果である。
ン７、及びエクソン８に関する結果の内、２０％ポリア
クリルアミドＴＢＥゲルで電気泳動を実施したエクソン
７に関する結果のみを図２に示す。図２において、レー
ン１はＤＮＡマーカーの結果であり、レーン２は正常細
胞の結果であり、レーン３〜レーン７は、それぞれ、標
本でｐ５３タンパク質を確認した大腸癌、乳癌、大腸
癌、胃癌、及び乳癌の患者の結果である。
【００６１】
【発明の効果】本発明によれば、正常細胞又は正常組織
の混入を回避し、正確に、ｐ５３遺伝子変異の有無を判
定することができる。また、本発明方法におけるゲノム
ＤＮＡ抽出工程において煮沸法を用いると、正確に、ｐ
５３遺伝子変異の有無を判定することができるだけでな
く、迅速且つ簡易に判定することができる。
の混入を回避し、正確に、ｐ５３遺伝子変異の有無を判
定することができる。また、本発明方法におけるゲノム
ＤＮＡ抽出工程において煮沸法を用いると、正確に、ｐ
５３遺伝子変異の有無を判定することができるだけでな
く、迅速且つ簡易に判定することができる。
【００６２】
【配列表】 <110> Iatron Labortories, Inc. <120> Method for Detection of Human p53 Gene Mutations <130> IAT99019P <160> 16 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttcctcttcc tgcagtactc c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gccccagctg ctcaccatcg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cactgattgc tcttaggtct g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agttgcaaac cagacctcag g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gtgttgtctc ctaggttggc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 caagtggctc ctgacctgga g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cctatcctga gtagtggtaa t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gtcctgcttg cttacctcgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tgcagtactc ccctgccctc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ctcaccatcg ctatctgagc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tgctcttagg tctggcccct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 accagacctc aggcggctca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ctaggttggc tctgactgta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ctgacctgga gtcttccagt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gtagtggtaa tctactggga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 cttacctcgc ttagtgctcc 20
【図１】エクソン５、エクソン６、エクソン７、及びエ
クソン８を増幅した各ＰＣＲ生成物の電気泳動の結果を
示す、図面に代わる写真である。
クソン８を増幅した各ＰＣＲ生成物の電気泳動の結果を
示す、図面に代わる写真である。
【図２】エクソン７を増幅した各ＰＣＲ生成物のコール
ドＳＳＣＰ電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真で
ある。
ドＳＳＣＰ電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長村 義之 東京都世田谷区桜丘３−28−13 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA80 CA03 CA09 HA14 4B063 QA01 QA13 QA17 QQ08 QQ48 QR08 QR32 QR42 QR48 QR66 QS16 QS25 QX02
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒトｐ５３タンパク質に特異的に反応す
る抗体を用いて、被検試料を免疫学的に染色する免疫学
的検出工程；前記免疫学的検出工程により得られた染色
結果に基づいて、染色性細胞と非染色性細胞とを分離す
る細胞分離工程；前記細胞分離工程で分離した染色性細
胞から、ゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工
程；ヒトｐ５３遺伝子変異が生じている可能性のある領
域を含むヒトｐ５３遺伝子断片を増幅することのできる
プライマーと、前記ゲノムＤＮＡ抽出工程で得られたゲ
ノムＤＮＡとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅するＤＮＡ増
幅工程；及び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物
を解析する解析工程をこの順序で実施することを特徴と
する、ヒトｐ５３遺伝子の変異の検出方法。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１〜１６で表される塩
基配列のいずれか１つの塩基配列からなるプライマー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31567899A JP2001128685A (ja) | 1999-11-05 | 1999-11-05 | ヒトｐ５３遺伝子の変異の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31567899A JP2001128685A (ja) | 1999-11-05 | 1999-11-05 | ヒトｐ５３遺伝子の変異の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001128685A true JP2001128685A (ja) | 2001-05-15 |
| JP2001128685A5 JP2001128685A5 (ja) | 2006-05-18 |
Family
ID=18068256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31567899A Pending JP2001128685A (ja) | 1999-11-05 | 1999-11-05 | ヒトｐ５３遺伝子の変異の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001128685A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004079004A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-09-16 | Istituto Oncologico Romagnolo Cooperativa Sociale A R.L. | Method for the identification of colorectal tumors |
| CN111334582A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-06-26 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 用于同步检测p53基因4个外显子基因突变的方法 |
-
1999
- 1999-11-05 JP JP31567899A patent/JP2001128685A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004079004A1 (en) * | 2003-03-07 | 2004-09-16 | Istituto Oncologico Romagnolo Cooperativa Sociale A R.L. | Method for the identification of colorectal tumors |
| US8343722B2 (en) | 2003-03-07 | 2013-01-01 | Istituto Oncologico Romagnolo Cooperativa Sociale a.r.l. | Method for the identification of colorectal tumors |
| CN111334582A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-06-26 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 用于同步检测p53基因4个外显子基因突变的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lanza et al. | Immunohistochemical pattern of MLH1/MSH2 expression is related to clinical and pathological features in colorectal adenocarcinomas with microsatellite instability | |
| Debiec‐Rychter et al. | Gastrointestinal stromal tumours (GISTs) negative for KIT (CD117 antigen) immunoreactivity | |
| US8093001B2 (en) | Detection and diagnosis of smoking related cancers | |
| WO2009146545A1 (en) | Compositions and methods for classifying lung cancer and prognosing lung cancer survival | |
| JP2005503158A (ja) | 色素生産性インサイチューハイブリダイゼーション方法、キットおよび組成物 | |
| US20200199687A1 (en) | Materials and methods for assessing progression of prostate cancer | |
| EP3543359A1 (en) | Molecular marker, kit and application for use in early diagnosis and prediction of sepsis as complication of acute kidney injury | |
| US6503706B1 (en) | Method for identifying human and animal cells having an unlimited proliferation of tumor-formation potential | |
| JP2016512032A (ja) | 結腸直腸腺腫を評価するための材料および方法 | |
| JP2008283985A (ja) | 癌の診断および予後のための方法 | |
| Merkelbach-Bruse et al. | Current diagnostic methods of HER-2/neu detection in breast cancer with special regard to real-time PCR | |
| Zhang et al. | Automated brightfield dual-color in situ hybridization for detection of mouse double minute 2 gene amplification in sarcomas | |
| JP7150018B2 (ja) | 新規なｃｉｐ２ａバリアント及びその使用 | |
| WO2012115493A9 (ko) | 암에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 암 진단 | |
| JP2005519606A (ja) | ヒトカリクレイン−２及びカリクレイン−３のバリアント並びにそれらの使用 | |
| US20060292591A1 (en) | Genes from the 20q13 amplicon and their uses | |
| JP2001128685A (ja) | ヒトｐ５３遺伝子の変異の検出方法 | |
| Palmieri et al. | Genetic instability markers in cancer | |
| WO2015194524A1 (ja) | Ｂ前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病新規キメラ遺伝子 | |
| AU2009216723B2 (en) | BRCA1 mRNA expression predicts survival in patients with bladder cancer treated with neoadjuvant cisplatin-based chemotherapy | |
| JP2009535033A5 (ja) | ||
| US7537905B2 (en) | Amplified and overexpressed gene in colorectal cancers | |
| CN111269982B (zh) | Snep1蛋白在诊断结直肠癌中的应用 | |
| JP2006520912A (ja) | 癌の予後の検知方法 | |
| CN111235276B (zh) | 去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估标志物LncRNA ZNF518A及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20051027 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060313 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060313 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090106 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090428 |