CN106520979A

CN106520979A - 用于检测人类adrb1基因 g1165c多态性的核酸、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN106520979A
Application number: CN201611082241.0A
Authority: CN
Inventors: 李惠; 邹芳; 杨惠娟; 段卫涛; 赵平锋
Original assignee: WUHAN HYGIEA BIOSCIENCE CO Ltd
Current assignee: WUHAN HYGIEA BIOSCIENCE CO Ltd
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-03-22

Abstract

本发明公开了用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测人类ADRB1基因G1165C多态性的检测方法。本发明设计的人类ADRB1基因G1165C多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。本发明提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

Description

用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。流行病学统计数据显示，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居全球各类死因之首。高血压是心脑血管疾病的重要病因和危险因素，长期高血压能影响心、脑、肾等器官的结构和功能，最终导致这些器官功能衰竭，是心脑血管病患者死亡的主要原因之一。心力衰竭是一种因心脏泵血不足而导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足的复杂临床综合征，合并有神经内分泌系统的异常改变，是包括高血压、冠心病、心肌病在内的大多数心血管疾病的终末阶段。

肾上腺素能受体是一类介导儿茶酚胺作用的G-蛋白耦联型组织受体，根据其对去甲肾上腺素的不同反应情况分为α和β两类。其中，α受体分为α1和α2两个亚型，β受体分为β1、β2和β3三个亚型。

ADRB1是β1肾上腺素能受体基因，其编码的功能蛋白由477个氨基酸残基组成，在心肌细胞中大量表达，也是目前临床上治疗多种心脑血管疾病的β受体拮抗药物的主要作用靶点。ADRB1基因最常见的单核苷酸多态性(SNP)为G1165C(rs1801253)位点，对应的第389位氨基酸由甘氨酸变成精氨酸(Gly389Arg)。

到目前为止，已有众多研究结果表明，β肾上腺素能受体的基因多态性会影响β受体阻滞剂的治疗效果，进而影响心衰患者的愈后。2003年发表的多篇相关临床试验文献报道显示，高血压患者在服用美托洛尔后，389Arg纯合基因型患者的血压下降值，比同等条件下其他基因型患者明显提高，并且389Arg纯合基因型的健康人群，在口服阿替洛尔后的血压下降值，也明显高于其他基因型人群。2006年，有研究者发现，389Arg纯合基因型的心衰患者，在使用布新洛尔治疗后心功能有了明显改善，其死亡率显著低于其他基因型患者。

综上所述，ADRB1的基因多态性，虽然在高血压和心衰的发生中不起主要作用，但能修饰β受体阻滞剂相关的临床表型，如β受体阻滞剂对高血压患者血压的降低效果，对心衰患者短期心功能的改善和长期生存率的提高，对临床指导个体化医疗和治疗效果评估有重要指导意义。

目前市面上用于检测ADRB1基因多态性(G1165C)的方法主要有直接测序法、基因芯片和液相芯片法。直接测序的方法虽然结果测序结果较为准确，但其检测灵敏度低，易出现假阴性，操作流程较复杂，样品易污染，耗时较长，且检测成本较高。基因芯片法和液相芯片法同样操作过程复杂，检测成本高，检测周期长，且结果准确性不高，容易发生样品污染。以上缺点限制了这三种方法在实际临床工作中的发展和应用，无法满足快速指导临床评估的需求。因此，一种快速、准确且低成本的新型检测方法成为了迫切需求。

发明内容

为克服以上现有检测人类ADRB1基因多态性方法的不足，本发明的目的是提供一组用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸。本发明的另一个目的是提供一种用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸，该核酸包括检测针对ADRB1基因G1165C的野生型下游引物、突变型下游引物、公用上游引物和公用检测探针，其中，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突变型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

如上所述的核酸，优选的，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

如上所述的核酸，优选的，所述核酸还包括野生型阳性对照物、突变型阳性对照物和质控阳性对照物，其中，所述野生型阳性对照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述突变型阳性对照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，和/或所述质控阳性对照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

一种用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒，该试剂盒用于实时荧光PCR检测人类ADRB1基因G1165C的野生型和突变型，所述试剂盒包括如上所述的核酸，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，和/或质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。

如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、矿物油、阴性对照物：超纯水。

如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

一种检测人类ADRB1基因G1165C多态性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA，同时进行野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其中，所述野生型体系中野生型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反突变型体系中突变型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品的所述野生型反应体系和所述突变型反应体系的荧光信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值△Ct值来确定样本DNA的基因型。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述野生型体系和所述突变型体系还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在各自的所述野生型体系和所述突变型体系中，各条引物和探针的终浓度为100-1000n mol/L；所述荧光基团为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

如上所述的方法，优选地，步骤(2)中，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：

第一阶段：95℃4min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段：95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

信号收集：第三阶段72℃时收集荧光信号。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在各自所述野生型体系和所述突变型体系中，所述野生型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述突变型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述公用检测探针的终浓度为200nmol/L，所述内部质控的引物对的终浓度均为150nmol/L，所述质控探针的终浓度为100nmol/L；所述公用检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，所述质控探针的5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1；

所述确定样本DNA的基因型，如下：

△Ct＝|野生型Ct值-突变型Ct值|≤2.5为杂合型样本；

△Ct＝野生型Ct值-突变型Ct值>2.5为突变型样本；

△Ct＝突变型Ct值-野生型Ct值>2.5为野生型样本。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；所述阴性对照为以水为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；

在步骤(4)中，所述阳性对照的野生型体系和突变型体系的FAM均有明显的扩增曲线，且FAM信号的Ct值≤20，和/或JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值≤25，符合要求，检测结果可靠；所述阴性对照的野生型体系和突变型体系的FAM都没有明显的扩增曲线，符合要求，检测结果可靠，否则应重新配置检测体系，重新进行检测。

本发明提供了一组用于检测人类ADRB1基因G1165C位点多态性的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测人类ADRB1基因G1165C位点多态性的检测方法。

本发明提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

本发明提供的检测试剂盒及方法，用于检测人类ADRB1基因G1165C位点多态性时，为了避免漏检、及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，设有内部质控，为了判断检测体系是否正常，还设有阴性对照和检测引物的阳性对照；为了避免假阴性及漏检，设有阳性对照，其阳性对照检测呈阳性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检；为了避免假阳性及漏检，设有阴性对照，其阴性对照检测呈阴性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阳性结果及漏检；检测试剂盒及方法设计严谨，有效避免漏检、错检的可能。

与现有技术相比，本发明运用ARMS引物分野生型和突变型基因，还有如下有优点：

(1)本发明采用了特异性突变引物和Taqman探针技术，可以特异性的检测人类ADRB1基因多态性G1165C位点的基因型；

(2)本方法灵敏度高，可实现10拷贝突变型和野生型基因的稳定检出；特异性好，可实现高至200ng上样量基因组DNA的准确分型，且不会出现非特异性扩增，检测结果准确度高。

(3)成本低，ARMS引物分型法相对于Taqman探针分型法，不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性，而且还能节约成本，ARMS引物合成快速简单，合成成本低，扩增效果更佳。

(4)应用Fast premix预混在反应体系中，减少了酶与样本混合的步骤，减少了样本的污染，操作更简单，一步加样，避免了气溶胶污染引起的假阳性。

(5)检测速度快，整个检测过程只需要90分钟。

(6)安全：整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。

本发明设计的人类ADRB1基因G1165C位点多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。

附图说明

图1为本发明优选的试剂盒检测内部质控的扩增曲线。

图2为本发明优选的试剂盒检测阴性对照的扩增曲线。

图3为本发明优选的试剂盒检测阳性对照的扩增曲线。

图4为本发明优选的试剂盒检测突变型灵敏度的扩增曲线。

图5为本发明优选的试剂盒检测野生型灵敏度的扩增曲线。

图6为本发明优选的试剂盒检测突变型精密度的扩增曲线。

图7为本发明优选的试剂盒检测野生型精密度的扩增曲线。

图8为本发明优选的试剂盒检测突变型和野生型特异性的扩增曲线。

图9为本发明优选的试剂盒检测野生纯合型样本的扩增曲线。

图10为本发明优选的试剂盒检测突变杂合型样本的扩增曲线。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1引物、探针、验证模板设计

本发明是针对人类ADRB1基因G1165C SNP位点设计。引物及探针使用的具体原理是：针对突变位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman探针，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血细胞或口腔拭子等组织中提取的基因组DNA进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型。并通过对突变型ARMS引物和Taqman探针的筛选和突变检测体系的优化，建立了实时荧光PCR突变检测体系，实现对ADRB1基因多态性(G1165C)的高灵敏度和高特异性检测。通过无数次试验、优化、最后获得野生型下游引物(ADRB1RW)、突变型下游引物(ADRB1RM)、公用上游引物(ADRB1F)和公用检测探针(ADRB1P)的序列，其核苷酸序列如下：

ADRB1RW(SEQ ID No.1)：5’-CGCGCATCAGTGCAGTCC-3’；

ADRB1RM(SEQ ID No.2)：5’-CGCGGATCAGAGCAGTCG-3’；

ADRB1F(SEQ ID No.3)：5’-CTGGGCTACGCCAACTCG-3’；

ADRB1P(SEQ ID No.4)：5’-CCTTGCGGAAGTCG-3’

其中，野生型引物扩增产物长度为90bp，突变型引物扩增片段长度为90bp。扩增产物可作为阳性对照，即野生型阳性对照物含SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、突变型阳性对照物含SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，具体如下：

SEQ ID No.8:

5’-CTGGGCTACGCCAACTCGGCCTTCAACCCCATCATCTACTGCCGCAGCCCCGACTTCCGCAAGGCCTTCCAGGGACTGCTCTGCTGCGCG-3’

SEQ ID No.9:

5’-CTGGGCTACGCCAACTCGGCCTTCAACCCCATCATCTACTGCCGCAGCCCCGACTTCCGCAAGGCCTTCCAGCGACTGCTCTGCTGCGCG-3’

进一步，为了对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控，同时检测样本的质量，避免漏检，本发明选用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内参基因，该酶基因为管家(house keeping)基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中该基因的含量一般是恒定的，可作为荧光定量PCR的内参基因，针对该基因设计的内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系(NTC)不起线，样本起线正常。最后确定选用的碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NC_000012.12(6534405..6538375)第3381到3545位。GAPDH基因作为人类基因组的保守基因，不仅可以作为试剂盒内部的质控，还可作为样本DNA的质控。通过内部质控的质控引物对、质控探针的筛选和体系优化，建立了实时荧光PCR内部质控检测体系，其中，质控引物对(GAP F、GAP R)、质控探针(GAP P)最后确定的核苷酸序列如下：

GAP F(SEQ ID No.5)：5’-GTGTCCCCACTGCCAACG-3’；

GAP R(SEQ ID No.6)：5’-CGCTGTTGAAGTCAGAGGAGAC-3’；

GAP P(SEQ ID No.7)：5’-CCTCAAGGGCATCCT-3’。

作为内部质控的质控引物对进行PCR扩增时，其扩增序列的大小为165bp，将扩增序列作为内部质控阳性对照物，即包含如SEQ ID No.10所示序列，作为验证是否漏检的阳性对照。

SEQ ID No.10：

5’-GTGTCCCCACTGCCAACGTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCCAAATATGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’

实施例2采用实时荧光PCR检测人类ADRB1基因G1165C多态性的方法将实施例1筛选设计的野生型下游引物、突变型下游引物、公用上游引物和公用检测探针进行合成，在检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，其中，荧光基团可为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，淬灭基团可为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

实时荧光PCR检测人类ADRB1基因G1165C多态性的方法如下：

(1)从样品中提取DNA或获取样品DNA；

(2)对提取的样品DNA进行进行人类ADRB1基因G1165C位点多态性的实时荧光PCR扩增检测，采用野生型反应体系和突变型反应体系，其中，所述野生型体系中野生型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反突变型体系中突变型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，均用40μL反应体系，PCR反应液组分如下：

PCR缓冲液(10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus))：2～8μL

dNTP：0.2～0.8mmol

各条引物：0.1～1.0μmol

各条探针：0.1～1.0μmol

DNA聚合酶采用Fast master premix：6～10μL

样品DNA模板：10μL

其余用水补足总体积：40μL。

实时荧光PCR扩增反应条件优选为：

第一阶段：95℃4min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段:95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

第三阶段:35个循环中，72℃时收集荧光信号；

将ADRB1基因G1165C的野生型阳性对照物和突变型阳性对照物进行上述实时荧光PCR扩增反应，结果显示，所设计的检测引物及反应体系可有效扩增出ADRB1基因G1165C位点的野生型和突变型，对EDTA抗凝血和口腔拭子提取的基因组DNA以及全血细胞去红细胞后的白细胞都具有检测能力。

对样品进行检测时，为避免漏检，如避免有的反应孔中未加检测样本的情况出现，在每个反应孔中设置有内部质控，其质控引物对和质控探针如实施例1中所述。应当注意的是公用检测探针与质控探针荧光基团标记为不同检测模式的荧光基团。具体的实时荧光PCR扩增反应体系组成按上述PCR反应液组分配置。对于人血液样品或咽拭子样品的DNA检测时，质控探针的信号应有明显的扩增曲线。

在探针合成时，探针与荧光和淬灭基团相连，公用检测探针的荧光-淬灭基团为优选为FAM-MGB，质控探针的荧光-淬灭基团优选为JOE-BHQ1，当然，其它荧光-淬灭基团组合也同样适用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，经实验验证，均可检测人类ADRB1基因G1165C位点的基因型。

为了避免假阴性及漏检，检测方法中还设有野生型反应体系、突变性反应体系和内部质控的阳性对照(STD)，以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其阳性对照检测呈阳性结果，检测荧光信号均有明显的扩增曲线(均起线)，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检。

为了避免假阳性及漏检，设有检测引物和内部质控的阴性对照(NTC)，以水为模板，分别进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其阴性对照检测呈阴性结果，检测荧光信号均无明显的扩增曲线(均不起线)，说明检测体系没有问题，不会出现假阳性结果及漏检；否则，应重新进行反应体系的配置及检测。阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准。

上述实时荧光PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

实施例3用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒

用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的实时荧光PCR试剂盒包括以下成分：

野生型下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

突变型下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

公用上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

公用检测探针：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

为了避免漏检，错检，还包括：作为内部质控的质控引物对、质控探针和质控阳性对照物，

其中，质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团，质控阳性对照物含有如SEQ IDNo.10所示的核苷酸序列；荧光基团为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

为了防止反应体系在PCR扩增过程中挥发，影响检测效果，试剂盒还包括有矿物油。

为了便于反应体系的配置，试剂盒还包括10×PCR缓冲液；DNA聚合酶，阴性对照物：超纯水。其中DNA聚合酶可用Fast Advanced Master Mix，采用ABI(美国应用生物系统公司)；10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，也可应用市场上其他公司的PCR缓冲液与DNA聚合酶。

实施例4快速检测试剂盒的制备

本实施例的试剂盒是在实施例3的基础上，制备成可以直接加入检测样品后，进行检测的试剂盒。该试剂盒有检测ADRB1的8联PCR反应条以及验证试剂盒性能分析时所需的野生型质粒、突变型质粒、内控质粒，也就是ADRB1G1165C野生型、突变型阳性对照物及质控阳性对照物组成，各成分如表1所示，具体反应体系的配置见表2。每条ADRB1 8联PCR反应条的奇数管(1/3/5/7或A/C/E/G)对应检测体系为野生型反应体系A1反应液，检测ADRB1G1165C野生型；偶数管(2/4/6/8或B/D/F/H)对应的检测体系为突变型反应体系A2反应液，检测ADRB1G1165C突变型。每管主要成分为特异性引物、荧光探针和PCR反应液等，其中公共检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，则检测样品信号类型为FAM信号；内部质控的质控探针5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1，内部质控信号类型为JOE信号(内控作为对试剂盒、DNA质量以及操作本身的质控)；检测引物、探针和阳性对照物委托上海英俊生物技术有限公司合成。

表1试剂盒组成

表2反应体系的配置

其中，AB premix的全称 Fast Advanced Master Mix，购自ABI(美国应用生物系统公司)；10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，经过大量试验、验证该试剂盒为一种高灵敏、高特异性、高效的检测ADRB1基因多态性的检测试剂盒。

实施例5：对实施例4中制备的试剂盒进行性能分析实验

以现有基因工程技术如上海英俊生物技术有限公司合成的ADRB1基因G1165C多态性位点含有SEQ ID NO:8所示序列为野生型质粒，含有SEQ ID NO:9所示序列为突变型质粒，含有SEQ ID NO:10所示序列为内控质粒。各质粒干粉用TE(10mmol/L，PH8.0)复溶，定量后稀释。

在每次检测具体样品时，为了保证数据真实、可靠、避免漏检、错检，需同时进行阴性对照(非模板对照，即NTC)实验和阳性对照(STD)实验。采用实施例4制备的试剂盒，运用实施例2所用的检测方法，经多次试验验证，图1为内控质粒(IC)检测结果，JOE信号，Ct_内控≤25，符合要求；图2为NTC检测结果，反应体系1～2FAM均不起线，符合要求；图3为STD检测结果，反应体系1～2FAM信号均起线且Ct≤20，符合要求。

并对实施例4制备的试剂盒进行如下的性能分析实验：

(1)灵敏度实验

取2×10¹copies/μL的野生型质粒和内控质粒1：1混合，配置成终浓度为10copies/μL的W-1参考品；取2×10¹copies/μL的突变型质粒和内控质粒1：1混合，配置成终浓度为10copies/μL的M-1参考品；取2×10¹copies/μL的野生型质粒、突变型质粒、内控质粒1:1:2体积比混合，配置成终浓度为10copies/μL的WM-1杂合参考品，以这三种参考品为模板，在实施例4中制备野生型反应体系A1(ADW)和突变型反应体系A2(ADM)体系中分别进行实时荧光PCR扩增反应。扩增反应的程序采用实施例2中方法，具体结果见图4和图5。由图4和图5可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高，10copies/μL浓度的DNA在两种体系中均可检出三种基因型。

(2)精密度

取6×10³copies/μL的野生型质粒、突变型质粒、内控质粒1:1:2体积比混合，配置成终浓度为3×10³copies/μL的杂合参考品WM-2，以此参考品为模板，做10个平行样，在A1和A2体系中分别进行如上实时荧光PCR扩增反应，结果见图6和图7。结果表明本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(10次重复实验结果稳定，CV<5％)。

(3)特异性

选取三例从临床血液样本中提取的基因组DNA，其ADRB1基因型分别为阴性纯合、阳性纯合和阳性杂合。以此基因组DNA作为模版，在上样量分别为200ng、100ng、10ng的条件下，在A1和A2体系中分别进行如上实时荧光PCR扩增反应，实验结果表明，即使基因组DNA的上样量高至200ng，本发明的荧光PCR方法依然能对样品进行准确分型，且不会出现非特异性扩增。此处以阴性纯合样本为例，检测结果见图8。

实施例6：临床样本DNA的检测

一、EDTA抗凝血样品

本实施例是从武汉大学人民医院收集到的84个临床样本为EDTA抗凝血样品中提取基因组DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用Qiagen公司的血液基因组DNA提取试剂盒，具体操作见该DNA提取试剂盒说明书，最后，将提取的EDTA抗凝血样品DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。

采用实施例4制备的试剂盒对上述提取的DNA样品，进行实时荧光PCR扩增。

检测方法如下：

1)每次PCR反应中，同时进行非模板对照(No Template Control；NTC，本实施例用超纯水)、阳性对照和待测样本的检测。

2)将阳性对照物取出解冻后震荡混匀，并离心30s。

3)将8联PCR反应条取出解冻后离心30s，防止反应液在开盖时溅出。

4)将超纯水(NTC)、上述提取的DNA样本、阳性对照物分别加入A1反应液和A2反应液中，每孔10μL。

5)将以上8联PCR反应条盖好管盖于离心机上离心30S，确保管壁上不沾有液滴。

6)将8联PCR反应条放于实时荧光PCR仪器中。

反应条件的设置：

第一阶段：95℃4min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第二阶段：95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

信号收集：第三阶段72℃时收集FAM和JOE信号。

利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果；其中，JOE是内控信号，用于检测体系是否正常，样本是否漏加及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值(CT值小于25)；FAM是检测信号，用于检测样本的基因多态性；在内控信号达到要求后，以G1165C位点的突变型和野生型FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值的差值作为判断标准。

具体按如下判断：

△Ct＝|野生型CT值-突变型CT值|≤2.5为杂合型样本，△Ct＝野生型CT值-突变型CT值>2.5为突变型样本，△Ct＝突变型CT值-野生型CT值>2.5为野生型样本，样本结果判定具体见表3。

表3 ADRB1基因多态性检测结果判定

对EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本84个，进行实时荧光PCR的检测结果，经过计算，有9个野生纯合GG、50个突变纯合CC和25个突变杂合GC样本，其中三种类型结果的扩增曲线仅列出野生纯合GG和突变杂合GC样本各一例，扩增曲线对应见附图9和10所示，突变纯合CC样本扩增曲线可参考附图8，基因多态性结果见表4。

表4样本检测结果

样本	个数	本发明试剂盒检测结果	sanger测序结果
				野生纯合	9	GG	GG
突变纯合	50	CC	CC
				突变杂合	25	GC	GC

将EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本84个，同时进行了sanger测序法检测，sanger测序由武汉艾康健生物科技有限公司进行，检测结果与本发明的检测结果相同。由此说明，本发明制备的试剂盒用于检测的ADRB1基因G1165C多态性结果准确度高。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉海吉力生物科技有限公司

<120> 用于检测人类ADRB1基因 G1165C多态性的核酸、试剂盒及方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cgcgcatcag tgcagtcc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgcggatcag agcagtcg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctgggctacg ccaactcg 18

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccttgcggaa gtcg 14

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtgtccccac tgccaacg 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cgctgttgaa gtcagaggag ac 22

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cctcaagggc atcct 15

<210> 8

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ctgggctacg ccaactcggc cttcaacccc atcatctact gccgcagccc cgacttccgc 60

aaggccttcc agggactgct ctgctgcgcg 90

<210> 9

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ctgggctacg ccaactcggc cttcaacccc atcatctact gccgcagccc cgacttccgc 60

aaggccttcc agcgactgct ctgctgcgcg 90

<210> 10

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gtgtccccac tgccaacgtg tcagtggtgg acctgacctg ccgtctagaa aaacctgcca 60

aatatgatga catcaagaag gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc aagggcatcc 120

tgggctacac tgagcaccag gtggtctcct ctgacttcaa cagcg 165

Claims

1.一组用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的核酸，其特征在于，该核酸包括检测针对G1165C的野生型下游引物、突变型下游引物、公用上游引物和公用检测探针，其中，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突变型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包括野生型阳性对照物、突变型阳性对照物和质控阳性对照物，其中，所述野生型阳性对照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述突变型阳性对照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，和/或所述质控阳性对照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

4.一种用于检测人类ADRB1基因G1165C多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于实时荧光PCR检测人类ADRB1基因G1165C的野生型和突变型，所述试剂盒包括如权利要求1-3中任一所述的核酸，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，和/或质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、矿物油、阴性对照物：超纯水；所述荧光基团为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

6.一种检测人类ADRB1基因G1165C多态性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取DNA；

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述野生型体系和所述突变型体系还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在各自的所述野生型体系和所述突变型体系中，各条引物和探针的终浓度为100-1000n mol/L；所述荧光基团为FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种；

步骤(2)中，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：

第一阶段：95℃4min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段：95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

信号收集：第三阶段72℃时收集荧光信号。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在各自所述野生型体系和所述突变型体系中，所述野生型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述突变型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述公用检测探针的终浓度为200nmol/L，所述内部质控的引物对的终浓度均为150nmol/L，所述质控探针的终浓度为150nmol/L；所述公用检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，所述质控探针的5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1；

所述确定样本DNA的基因型，如下：

△Ct＝|野生型Ct值-突变型Ct值|≤2.5为杂合型样本；

△Ct＝野生型Ct值-突变型Ct值>2.5为突变型样本；

△Ct＝突变型Ct值-野生型Ct值>2.5为野生型样本。

10.如权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；所述阴性对照为以水为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；