CN201501881U - 高血压个体化药物治疗基因型检测芯片和配套试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种高血压个体化药物治疗基因型检测芯片产品及其配套试剂盒。所述高血压个体化药物治疗基因型检测芯片由基片(1)和在基片(1)表面上的反应区(2)中固定的基因型检测探针(4)组成。配套试剂盒由容器和装于容器中的DNA抽提试剂，待测基因突变位点的PCR引物，DNA聚合酶，PCR反应液，含有待测基因突变位点序列的质粒，杂交液，洗涤液所组成。本实用新型针对高血压药物治疗中的药物反应个体差异现象，提供一种较完善的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片产品，其检测结果可作为高血压临床用药方案的参考。
Description
技术领域
本实用新型涉及生物芯片领域，具体地涉及一种基因型检测基因芯片产品及其配套试剂盒。
背景技术
高血压是一种严重损害人类身心健康的疾病，据估计，我国的高血压患者人数已超过了1.6亿，并且其发病率还在逐年上升；用于治疗高血压及其引发的并发症所需的经济支出是全球第3大医疗费用负担。采用药物控制和降低血压是相当长的时间内治疗高血压及其并发症的主要方法。但因为药物反应(疗效和不良反应)的个体间差异，约有20％～50％接受药物治疗的患者其血压未达到良好的控制水平。
对于药物反应的个体差异在临床极其普遍，产生这种差异的原因有多种：性别、年龄、体重、遗传、疾病状况等多种因素都可导致不同个体对同一药物的反应出现量和质的差别。近20多年来遗传药理学和临床药理学的研究表明：所有这些因素中，绝大多数情况下最主要的因素是遗传因素，即药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的基因多态性导致了其编码蛋白的功能改变，导致其对药物的转化、运输能力及反应能力发生改变，进一步使靶点的药物浓度和药物敏感性发生改变，从而导致了对药物反应的个体差异。
目前临床常用的抗高血压药物有(见表1)：
表1临床常用的抗高血压药物
| 类别 | 代表药物 |
| 钙拮抗剂 | 氨氯地平、左旋氨氯地平、硝苯地平、非洛地平、尼莫地平 |
| 血管紧张素转换酶抑制剂 | 贝那普利、福辛普利、培哚普利、西拉普利、依那普利、卡托普利 |
| β-受体阻滞剂 | 美托洛尔、卡维地洛、比索洛尔、艾司洛尔 |
| 血管紧张素II受体拮抗剂 | 氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦 |
| 利尿降压药 | 氢氯噻嗪、呋塞米、布美他尼、螺内酯 |
| 其他 | 特拉唑嗪、多沙唑嗪、北京降压0号 |
经过国内外长期研究，目前已发现多个基因的突变位点与抗高血压药物的反应性密切相关，其中主要有下列位点(表2)：
表2与抗高血压药物反应性相关的基因突变位点
| 突变名称 | 基因突变的意义 | 相关药物 |
| CYP2C9*3 | 代谢酶功能显著降低 | 血管紧张素II受体拮抗剂 |
| CYP2C9*13 | 代谢酶功能显著降低 | 血管紧张素II受体拮抗剂 |
| CYP2C19*2 | 代谢酶功能显著降低 | β-受体阻滞剂 |
| CYP2C19*3 | 代谢酶功能显著降低 | β-受体阻滞剂 |
| AGTR1(A1166C) | 受体敏感性下降 | 血管紧张素II受体拮抗剂 |
| CYP2D6*10 | 代谢酶功能显著降低 | β-受体阻滞剂 |
| ADRB1(A145G) | 受体敏感性增强 | β-受体阻滞剂 |
| ADRB1(C1165G) | 受体敏感性增强 | β-受体阻滞剂 |
| ACE(I/D) | 作用靶点的敏感性改变 | 血管紧张素转换酶抑制剂 |
| CYP3A5*3 | 代谢酶功能显著降低 | 钙拮抗剂 |
| GNB3(C825T) | 含T等位基因者药物敏感性降低 | 钙拮抗剂 |
| TSC(C1784T) | 药物敏感性降低 | 利尿剂 |
| ADRB3(T727C) | 药物敏感性降低 | 利尿剂 |
| SCNN1G_rs5729 | 药物敏感性增强 | 利尿剂 |
| SCNN1G_rs5723 | 药物敏感性增强 | 利尿剂 |
| ENOSA_rs1799983 | 药物敏感性降低 | 利尿剂 |
这些基因突变位点均与抗高血压药物在人体内的反应性密切相关，这里所说的反应性包括了药物的疗效和安全性两个方面，即：同种同剂量的药物作用于不同基因型的患者，有的人恰好有效，有的人根本无效，还有的人会出现药物的毒副反应，因此利用基因突变检测技术对高血压患者的上述遗传编码进行解读，根据检测的结果调整患者的用药种类与剂量，可以使药物发挥更好的疗效，并防止毒副反应发生，这就是基因导向性的个体化用药新模式。目前该种用药模式已被越来越多的科研人员、临床医生及患者所接受，2006年在我国举行的第15届“国际遗传药理学大会”(IUPHAR会议)上，来自27个国家的数百名代表共同探讨了基因导向个体化用药目前的发展现状和在各国的推广情况，预测了“个体化用药”时代的到来。
目前对基因突变进行检测的方法有很多，常用的有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP法)、序列特异性PCR、手工或自动测序等方法，这些方法不仅操作繁琐、检测周期长、无法做到高通量，而且影响检测结果的因素众多，检测的质量难以控制，不能满足临床实际检测的要求，目前一般只用于科学研究。
基因芯片(gene chip)，又称基因微阵列或寡核苷酸芯片，其基本原理是将基因探针固定在固相支持物上形成阵列，通过与实际样本或扩增产物进行杂交反应和对荧光等杂交信号的检测，一次性地获得大量待检基因的信息。基因芯片的原理基本相同，但其具体实现却多种多样，同时，基因芯片因其固定的探针种类的不同，其能够完成的功能也不相同。目前，尚缺乏较完善的针对高血压治疗药物反应性相关基因多态性的基因芯片产品。
发明内容
本实用新型的目的在于针对目前高血压药物治疗过程中普遍存在的药物反应个体差异现象，提供一种高血压个体化药物治疗基因型检测芯片产品及其配套试剂盒，用于检测抗高血压药物反应性相关基因的基因型，其检测结果可供提示高血压药物临床疗效和调整用药方案。
在本实用新型的第一方面，提供了一种高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，该基因芯片包括基片和基片表面上的反应区。反应区的数目可以是一个或两个以上。反应区由底部的固相支持物和固定在固相支持物上的CYP2C9*3，CYP2C9*13，CYP2C19*2，CYP2C19*3，AGTR1(A1166C)，CYP2D6*10，ADRB1(A145G)，ADRB1(C1165G)，ACE(I/D)，CYP3A5*3，GNB3(C825T)，TSC(C1784T)，ADRB3(T727C)，SCNN1G_rs5729，SCNN1G_rs5723，ENOSA_rs1799983基因型检测探针和阳性参照探针及阴性参照探针构成。应该明确，上述寡核苷酸探针和阳性参照探针及阴性参照探针组合可以有多种方式，该基因芯片上既可以只固定任一个寡核苷酸探针，也可以固定任选的几个寡核苷酸探针。这些寡核苷酸探针既可以与阳性参照探针和阴性参照探针组合使用，也可以不与阳性参照探针或阴性参照探针组合使用。
所述的固相支持物可采用基因芯片领域常用的各种材料，如但不限于表面经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片、各种纤维膜、尼龙膜等，用于修饰的活性基团如但不限于醛基、氨基、巯基、羧基等。经活性基团修饰后，固相支持物表面形成一层覆膜。基片的材质可以与固相支持物相同，也可以不同。固相支持物可以是基片本身的一部分，也可以不是。
所述基片上还可设置标签区，标签区的基片表面可以磨砂处理或用颜料覆盖，标签区可书写或印上标记，也可粘贴标签。
所述基片上的反应区之间可用格栅分隔，格栅为防水的材料制成，如但不限于塑料、橡胶、防水胶、玻璃、金属。格栅上留有空格，空格的尺寸大于等于反应区的尺寸。格栅与基片之间可通过粘结剂连接，如但不限于不干胶。
所述的用于检测每一个待测基因位点的基因型检测探针由2条或2条以上的寡核苷酸序列片段所组成，分别对应未发生突变(野生型)和发生了突变(突变型)的基因型。该寡核苷酸序列片段长度为10～30个碱基，其序列与待测基因型的核酸序列一致或互补。所述的阳性参照探针的寡核苷酸序列与扩增上述某一任选基因位点的荧光引物的寡核苷酸序列互补。所述的阴性参照探针的寡核苷酸序列与待测基因的序列不同源。所述的阴性参照探针也可不含寡核苷酸片段。在具体应用中，针对不同的固相支持物和修饰的活性基团，在上述寡核苷酸序列片段的末端可连接其他分子或基团来改善空间结构、附着能力和稳定性，这些分子包括但不限于聚胸腺苷酸、聚四乙二醇、氨基。
在一优选例中，所述固相支持物为尼龙膜，该尼龙膜未修饰。
在另一优选例中，所述固相支持物为未修饰的玻片、塑料片、硝酸纤维膜。
在另一优选例中，所述固相支持物为经醛基修饰的玻片、硅片。
在另一优选例中，所述固相支持物为经氨基修饰的玻片。
在另一优选例中，所述固相支持物为
在另一优选例中，所述反应区上的探针为CYP2C19*3基因型检测探针，该探针的寡核苷酸序列与CYP2C19*3突变型的核酸序列互补。
在另一优选例中，所述反应区上的探针为ACE(I/D)，GNB3(C825T)，TSC(C1784T)基因型检测探针、阳性参照探针和阴性参照探针。
在另一优选例中，所述反应区上的探针为CYP2C9*3基因型检测探针、AGTR1(A1166C)基因型检测探针、ACE(I/D)基因型检测探针。
在另一优选例中，所述探针与固相支持物之间通过共价键连接。
在另一优选例中，所述阴性参照探针不含寡核苷酸片段。
在另一优选例中，所述探针的寡核苷酸序列末端连接氨基。
在另一优选例中，所述基片上还有标签区。
在另一优选例中，所述基片上的标签区贴有标签。
在另一优选例中，所述基片上还有格栅。
在另一优选例中，所述格栅的材料为塑料。
在另一优选例中，所述格栅的材料为防水胶。
在另一优选例中，所述格栅的材料为橡胶。
在另一优选例中，所述格栅与基片之间通过不干胶连接。
在本实用新型的第二方面，提供了一种高血压个体化药物治疗基因型检测芯片配套试剂盒。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括待测基因突变位点的PCR引物。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括DNA抽提试剂。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括DNA聚合酶。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括PCR反应液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括含待测基因突变位点序列的寡核苷酸片段。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括杂交液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括洗涤液。
所述待测基因突变位点的PCR引物采用本领域技术人员熟知的方法设计与合成。为便于进行结果检测，上述引物在合成时可进行标记或修饰，所述标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等，所采用的标记方法以及各标记物的检测方法为本领域的常用技术。
所述含待测基因突变位点序列的寡核苷酸片段为含有待测基因突变位点序列的质粒或DNA提取物或采用本领域技术人员常用的方法合成获得。
在另一优选例中，所述标记基团为Cy5。
附图说明
图1是高血压个体化药物治疗基因型检测芯片的一种实施方式的结构的平面示意图。图中还包括反应区2的点样示意图。
图2是高血压个体化药物治疗基因型检测芯片的另一种实施方式的结构的平面示意图。图中还包括反应区2的点样示意图。
图3是高血压个体化药物治疗基因型检测芯片的另一种实施方式的结构的纵剖示意图。
图4是高血压个体化药物治疗基因型检测芯片的另一种实施方式的结构的纵剖示意图。
附图中的标记1是表示基片，2是表示反应区，3是表示标签区，4是表示基因型检测探针，5是表示阳性参照探针，6是表示阴性参照探针，7是表示标签区，8是表示格栅，9是固相支持物。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本实用新型作进一步阐述。这些实施例仅用于说明本实用新型的可实现性而不用于限制本实用新型的适用范围。下列实施例中所未注明的实验方法和反应液成分，为按照常规条件，如：分子克隆(Molecular Cloning)-冷泉港实验室出版(Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
高血压个体化药物治疗基因型检测芯片的制备
如图1所示，取基片1，在基片1上有反应区2和标签区3。在反应区2的底部固定有CYP2C9*3，CYP2C9*13，CYP2C19*2，CYP2C19*3，AGTR1(A1166C)，CYP2D6*10，ADRB1(A145G)，ADRB1(C1165G)，ACE(I/D)，CYP3A5*3，GNB3(C825T)，TSC(C1784T)，ADRB3(T727C)，SCNN1G_rs5729，SCNN1G_rs5723，ENOSA_rs1799983的基因型检测探针4和阳性参照探针5。如图2、图3和图4所示，在基片上还可有标签区7，标签区7上固定有标签3；基片上还可有格栅8，多个反应区2之间被格栅8分开；反应区2上还可固定有阴性参照探针；基片1表面上还可覆盖固相支持物9，该固相支持物9位于反应区2的底部。
实施例2
高血压个体化药物治疗基因型检测芯片配套试剂盒的制备
制备包含以下组件的试剂盒：
容器z和装于所述容器z中的：容器a和装于容器a中的DNA抽提试剂，容器b和装于容器b中的待测基因突变位点的PCR引物，容器c和装于容器c中的DNA聚合酶，容器d和装于容器d中的PCR反应液，容器e和装于容器e中的含有待测基因突变位点序列的质粒，容器f和装于容器f中的杂交液，容器g和装于容器g中的洗涤液。
实施例3
高血压个体化药物治疗相关基因变异的检测
按下述方法对待测个体的基因型进行检测：
1、采集待检测个体的外周静脉血2ml，用高血压个体化药物治疗基因型检测芯片配套试剂盒中的DNA抽提试剂提取DNA。
2、将高血压个体化药物治疗基因型检测芯片配套试剂盒中的PCR引物、DNA聚合酶、PCR反应液与上一步得到的DNA进行PCR扩增和标记。
3、将12μlPCR产物加到高血压个体化药物治疗基因型检测芯片上的反应区，然后将芯片置于43℃保温保湿反应1小时。
4、用高血压个体化药物治疗基因型检测芯片配套试剂盒中的洗涤液漂洗3次，每次30秒，置避光处晾干。
5、将晾干的芯片用荧光扫描仪检测。
结果判定：
根据各位点的判定阀值，对比实际检测值，确定各位点的基因型。通过各位点基因型与高血压药物反应性的关系，可预测该个体对相关药物的反应性，并可作为选择药物与调整用药剂量的参考。
同时，该检测结果可与常规方法(PCR-RFLP和测序)的检测结果对照，经研究表明，本实用新型高血压个体化药物治疗基因型检测芯片的检测结果准确可靠。
Claims (19)
1.一种高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于，它由基片(1)和在基片(1)表面上的反应区(2)的底部固定的基因型检测探针(4)组成。
2.按照权利要求1所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述反应区(2)的底部固定的基因型检测探针(4)由CYP2C9*3，CYP2C9*13，CYP2C19*2，CYP2C19*3，AGTR1(A1166C)，CYP2D6*10，ADRB1(A145G)，ADRB1(C1165G)，ACE(I/D)，CYP3A5*3，GNB3(C825T)，TSC(C1784T)，ADRB3(T727C)，SCNN1G_rs5729，SCNN1G_rs5723，ENOSA_rs1799983基因型检测探针中的一个或多个基因型检测探针组成。
3.按照权利要求2所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述反应区(2)的底部还固定有阳性参照探针(5)。
4.按照权利要求2或3所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述反应区(2)的底部还固定有阴性参照探针(6)。
5.按照权利要求1、2或3所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)上还有标签区(7)。
6.按照权利要求4所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)上还有标签区(7)。
7.按照权利要求5所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述标签区(7)上还有标签(3)。
8.按照权利要求6所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述标签区(7)上还有标签(3)。
9.按照权利要求1、2、3、6、7或8所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)上还有格栅(8)。
10.按照权利要求4所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)上还有格栅(8)。
11.按照权利要求5所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)上还有格栅(8)。
12.按照权利要求9所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述格栅(8)上留有空格，空格的尺寸大于等于反应区(2)的尺寸。
13.按照权利要求10或11所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述格栅(8)上留有空格，空格的尺寸大于等于反应区(2)的尺寸。
14.按照权利要求1、2、3、6、7、8、10、11或12所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)表面上还覆盖有固相支持物(9)，该固相支持物(9)位于反应区(2)的底部。
15.按照权利要求4所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)表面上还覆盖有固相支持物(9)，该固相支持物(9)位于反应区(2)的底部。
16.按照权利要求5所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)表面上还覆盖有固相支持物(9)，该固相支持物(9)位于反应区(2)的底部。
17.按照权利要求9所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)表面上还覆盖有固相支持物(9)，该固相支持物(9)位于反应区(2)的底部。
18.按照权利要求13所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片，其特征在于所述基片(1)表面上还覆盖有固相支持物(9)，该固相支持物(9)位于反应区(2)的底部。
19.一种按照权利要求1所述的高血压个体化药物治疗基因型检测芯片的配套试剂盒，其特征在于，所述配套试剂盒由容器z和装于容器z中的：容器a和装于容器a中的DNA抽提试剂，容器b和装于容器b中的待测基因突变位点的PCR引物，容器c和装于容器c中的DNA聚合酶，容器d和装于容器d中的PCR反应液，容器e和装于容器e中的含有待测基因突变位点序列的质粒，容器f和装于容器f中的杂交液，容器g和装于容器g中的洗涤液所组成。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Zhao Zhenyu Document name: Notification to Pay the Fees |
|
| CX01 | Expiry of patent term | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20100609 |