CN113151434A - Snp标志物、应用及引物、探针、肺移植物排斥风险试剂盒 - Google Patents
Snp标志物、应用及引物、探针、肺移植物排斥风险试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了SNP标志物、应用及引物、探针、肺移植物排斥风险试剂盒，具体提供了32个SNP位点在评估肺移植术后移植物排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的32个特定SNP位点进行检测，获得GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比快速而准确地判断移植排斥的程度，无需任何侵入式的检测，准确性和灵敏度高，为临床检测器官移植术后移植物排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及SNP标志物、应用及引物、探针、肺移植物排斥风险试剂盒。
背景技术
目前肺器官移植术后移植物的健康监测常采用抽血进行肺功能检查，或穿刺针采集组织进行病理学检查。
对于常规抽血功能检查，其各项指标如肌酐、ALT、AST、胆红素等等灵敏度和特异性均不高，无法准确的反应移植物的健康状况。
对于目前金标准的组织活检，其虽可直接的反应移植物的健康状况。但存在以下重大缺点：
1)侵入式检测，对病人造成较大痛苦，同时对移植物造成损伤；
2)检出异常时，移植物实质性损伤已经发生，并且损伤往往已经较为严重，这时对于临床医生来说拯救移植物往往已经太晚；
3)若穿刺针未采集到移植物的病灶组织部分，会对结果准确性造成较大影响，因此准确性和灵敏度不高。
发明内容
有鉴于此，本申请提SNP标志物、应用及引物、探针、肺移植物排斥风险试剂盒，通过对移植后受体总游离DNA的32个特定SNP位点进行检测，最终获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比快速而准确地判断移植排斥的程度，使得该试剂盒能够灵敏、特异、准确的评估肺移植物的排斥风险，无需进行创伤检测。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种评估肺移植术后移植物排斥风险的SNP标记物为SNP位点rs2074533、rs1700189、rs977624、rs2075152、 rs2075755、rs572846、rs2075910、rs691057、rs1860263、rs2271715、rs2271730、 rs894039、rs303815、rs1460355、rs2271971、rs748384、rs260502、rs1039322、rs820094、 rs1049437、rs2281913、rs1893061、rs881803、rs1805794、rs943199、rs599437、rs948119、 rs678209、rs704329、rs2282772、rs1603022、rs1845430的组合。
本发明还提供了SNP位点在制备评估肺移植术后移植物排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点为：rs2074533、rs1700189、rs977624、rs2075152、rs2075755、 rs572846、rs2075910、rs691057、rs1860263、rs2271715、rs2271730、rs894039、rs303815、rs1460355、rs2271971、rs748384、rs260502、rs1039322、rs820094、rs1049437、rs2281913、rs1893061、rs881803、rs1805794、rs943199、rs599437、rs948119、rs678209、rs704329、rs2282772、rs1603022、rs1845430。
优选的，所述产品通过检测待测样品中的受体游离DNA中供体游离DNA含量来评估肺移植术后移植物排斥风险。
优选的，所述待测样品为血液，所述产品通过检测待测样品中的受体游离DNA 中供体游离DNA含量，计算GcfDNA供受比来评估肺移植术后移植物排斥风险， GcfDNA供受比≤8.2％，表示受者肺移植物排斥风险低；GcfDNA供受比＞8.2％，表示受者肺移植物排斥风险高；或
所述待测样品为尿液，所述产品通过检测待测样品中的受体游离DNA中供体游离DNA含量，计算GcfDNA供受比来评估肺移植术后移植物排斥风险，GcfDNA 供受比≤3.3％，表示受者肺移植物排斥风险低；GcfDNA供受比＞3.3％，表示受者肺移植物排斥风险高。
本发明还提供了一种用于评估肺移植术后移植物排斥风险的引物和探针，
所述引物为：
用于检测rs2074533的引物，其序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
用于检测rs1700189的引物，其序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
用于检测rs977624的引物，其序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于检测rs2075152的引物，其序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于检测rs2075755的引物，其序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于检测rs572846的引物，其序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
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用于检测rs678209的引物，其序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
用于检测rs704329的引物，其序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；
用于检测rs2282772的引物，其序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；
用于检测rs1603022的引物，其序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
用于检测rs1845430。的引物，其序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；
所述探针为：
用于检测rs2074533的探针，其序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；
用于检测rs1700189的探针，其序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
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用于检测rs1603022的探针，其序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；
用于检测rs1845430。的探针，其序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128。
本发明还提供了上述引物和探针在制备评估肺移植术后移植物排斥风险的产品中的应用。
本发明还提了一种用于评估肺移植术后移植物排斥风险的试剂盒，包括上述序列如SEQ ID No.1～64所示的引物和序列如SEQ ID No.65～128所示的探针。
优选的，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
优选的，所述探针的5’端分别连接FAM荧光基团或VIC荧光基团，所述探针的3’端标记NFQ和MGB。
优选的，所述试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
优选的，所述试剂盒还包括：ddPCRTMProbeSupermix和超纯水。
本发明还提供了一种检测受体游离DNA中供体游离DNA含量的方法，包括如下步骤：步骤1：以待测样品的总游离DNA为模板，加入序列SEQ ID No.1～64 所示的引物和序列SEQ ID No.65～128所示的探针，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
步骤2：反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA 的比值，即GcfDNA供受比，其中，SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2±0.4)，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在 SNPNo#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
优选的，所述待测样品为血液、尿液。
优选的，所述数字PCR反应的反应体系为：
优选的，所述数字PCR反应的反应程序为：95℃、10min预变性；95℃、15s， 57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明提供了SNP位点在评估肺移植术后移植物排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的32个特定SNP位点进行检测，结合数字PCR技术以及特定的计算方法，最终获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA供受比，根据GcfDNA供受比判断移植排斥的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
无创，采用血液和尿液作物生物样品，少量静脉采血即可进行检测；其中采用尿液作为生物样品，尿液收集低廉、快速且非侵入性，尿液收集便捷可以实现频繁监测，相对于采用血液作为生物样品，监测效果更好。
灵敏，采用本发明引物、探针、试剂盒，检测灵敏度高；且选择现有PCR技术中精准度最高的数字PCR设备作为检测平台；
(3)早期，选用核酸分子作为检测靶点，这些靶点的变化发生在器官病变或损伤的最早期；
(4)特异，用本发明引物、探针、试剂盒，检测特异性高，可特异性的反映出肺移植物的健康状况；
(5)方便，相比该领域其它技术或检测，例如测序、DSA检测等需要移植受者和移植供者双方的样本相比，该方法无需移植供者样本，仅需受者血液或尿液样本即可完成；本发明采用的是数字PCR进行检测，样本需求量低。
附图说明
图1为实施例4中的按照实施例2收集血液得到的ROC曲线图；
图2为实施例4中的按照实施例3收集尿液得到的ROC曲线图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种评估肺移植术后移植物排斥风险的SNP标记物为SNP位点rs2074533、rs1700189、rs977624、rs2075152、rs2075755、rs572846、rs2075910、rs691057、rs1860263、rs2271715、rs2271730、rs894039、rs303815、rs1460355、rs2271971、rs748384、rs260502、rs1039322、rs820094、rs1049437、rs2281913、rs1893061、rs881803、rs1805794、rs943199、rs599437、rs948119、rs678209、rs704329、rs2282772、rs1603022、rs1845430的组合。
SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2±0.4)，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在 SNPNo#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
GcfDNA供受比：供者游离DNA/受者游离DNA的比值。
筛出有效靶点：是指对单个样本而言，筛选出至少2个满足上述SNP位点的分析方法步骤3)的条件(位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9)的SNP位点，并通过这两个位点可以计算出GcfDNA供受比。
筛出有效靶点效率：是指对多个样本而言，通过该方法或该位点组合，可以计算出筛出有效靶点的样本比率，即检出率。
上述32个SNP位点的筛选方法：
1、根据NCBI数据库，在每对常染色体中选择20个MAF>0.45的SNP位点不同的SNP位点之间符合连锁平衡的条件；
2、收集400例肺移植受者血浆样本，使用440个(22对常染色体*20)备选 SNP位点进行靶点筛选，经DNA提取、PCR扩增后，采用SNP位点的分析方法分析每个SNP位点，计算GcfDNA供受比；
3、对440个备选SNP位点依据筛出有效靶点效率进行排名，选择排名前32 个筛出有效靶点效率最高(评估为有效靶点的次数最多)的靶点
对于400例肺移植受者中的每例肺移植受者，使用该32个靶点进行检测，均能检测出GcfDNA供受比的数值。
该SNP位点组合(SNP标记物)筛出有效靶点的效率＝100％，SNP组合含有较高的多态性。
一种用于评估肺移植术后移植物排斥风险的试剂盒，包括表1中序列如SEQ IDNo.1～64所示的引物和序列如SEQ ID No.65～128所示的探针，ddPCRTM ProbeSupermix和超纯水；
所述探针的5’端分别连接FAM荧光基团，所述探针的3’端标记NFQ和MGB。
表1
实施例2
采用本发明提供的试剂盒评估肺移植术后移植物排斥风险
1、血液中总游离DNA提取
1.1、使用Streck无创采血管静脉采集一名肺移植术后10周受者血液10ml；
2、将Streck无创采血管采集的血液转移至15ml离心管中，低温4℃2000g离心10min；取上层血浆约4～6ml于新的15ml离心管中，继续低温4℃4000g离心 10min；取上层血浆4～6ml于新的15ml离心管中；
3、取4ml血浆，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行总游离DNA的提取，调整DNA浓度为10～40ng/ul。
2、制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应
2.1、配置数字PCR反应体系，制备数字PCR反应微滴，进行PCR反应；32 个SNP位点的检测体系，共计32管，反应配制如下：
表2
其中，用于检测SNP位点的引物包含上、下游引物，各0.125μL，共0.25μL；探针为两条，各0.125μL，共0.25μl；表2中本发明引物和探针如表1所示。
2.2、将配置好的反应体系加入到微滴发生卡DG8TM Cartridges的样品槽中，同时在发生油槽中加入60ul微滴发生油Droplet Generation Oil for Probes，最后用封膜DG8TM Gaskets封好，置于微滴发生仪上，进行反应微滴的制备。
2.3、将制备好的反应微滴缓慢转移至96孔板中，然后用铝制封膜配合封膜机器热封好后进行PCR反应，反应程序设置如下：
表3
3、反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比
3.1PCR反应结束后，将96孔板转移至QX200TM数字PCR读取仪中，读取结果，见表4。
表4 32个SNP位点的原始数据
3.2按照以下方法对表4的数据进行分析：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNP No#1和SNP No#2为例，SNP No#1的碱基比约等于SNP No#2 的两倍(2±0.4)，则判定SNP No#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNP No#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，采用碱基低含量 /总含量，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
评价标准：GcfDNA供受比≤8.2％，表示受者肺移植物排斥风险低；GcfDNA 供受比＞8.2％，表示受者肺移植物排斥风险高。
根据表4的数据计算得到GcfDNA供受比(供者游离DNA/受者游离DNA)为 5.7％，表示受者肺移植物排斥风险低。
实施例3
本实施例和实施例2的区别仅在于：
采集一名肺移植术后8周受者尿液10ml，将尿液按3000rpm离心5min。
取4ml离心后尿液上清液，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic AcidKit进行总游离DNA的提取，调整DNA浓度为10～30ng/ul。
3、反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比
3.1 PCR反应结束后，将96孔板转移至QX200TM数字PCR读取仪中，读取结果，见表5。
表5 32个SNP位点的原始数据
3.2按照以下方法对表5的数据进行分析：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNP No#1和SNP No#2为例，SNP No#1的碱基比约等于SNP No#2 的两倍(2±0.4)，则判定SNP No#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNP No#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，采用碱基低含量 /总含量，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
评价标准：GcfDNA供受比≤3.3％，表示受者肺移植物排斥风险低；GcfDNA 供受比＞3.3％，表示受者肺移植物排斥风险高。
根据表5的数据计算得到GcfDNA供受比(供者游离DNA/受者游离DNA)为 2％，表示受者肺移植物排斥风险低。
实施例4
纳入470例诊断出移植排斥的肺移植受者，以及250例诊断为移植物正常的肺移植受者，220例诊断出移植排斥的肺移植受者。
(1)按照实施例2收集他们的血液，提取血液中总游离DNA，制备数字PCR 反应微滴，进行数字PCR反应，反应结束后，分析每个SNP位点，计算GcfDNA 供受比，设定8.2％为参考值区分移植排斥(GcfDNA供受比＞8.2％)和移植物正常组(GcfDNA供受比≤8.2％)病人。
使用MedCalc软件进行分析，得到检测对照的ROC曲线(图1)，AUC＝0.88，灵敏度＝83.8％，特异度＝79.3％。
(2)按照实施例3收集他们的尿液，提取尿液中总游离DNA，制备数字PCR 反应微滴，进行数字PCR反应，反应结束后，分析每个SNP位点，计算GcfDNA 供受比，设定3.3％为参考值区分移植排斥(GcfDNA供受比＞3.3％)和移植物正常组(GcfDNA供受比≤3.3％)病人。
使用MedCalc软件进行分析，得到检测对照的ROC曲线(图2)，AUC＝0.81，灵敏度＝53％，特异度＝92.8％。
本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反映肺移植物的健康状况，评估肺移植术后移植物排斥风险。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> SNP 标志物、应用及引物、探针、肺移植物排斥风险试剂盒
<160> 128
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcctttccc tggattcctc aggcagcccc ctgagcact 39
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccactggac agggactcac tgggccgcca gcttaatgaa 40
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actctgaggt gacttccaag ctgaagagct atgaattcc 39
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctcgggaac caaaggggtc gcggtagctc tcgatgaacc 40
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacacgtgct ttttctctat gcccttatct ggatgtgt 38
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcagggtct aagtcacaga actgtctgtg gaactccctc 40
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcttaggag catagcatgt agaggaagta cctggcttc 39
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctccaaaac ccaattgcct taccgttaac tggggat 37
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctcccgagt agctgggatt ataagtgtgc accaccac 38
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatatcaaaa ttcccctctt cccttctcct gggatttg 38
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtgggcccc tcgctttctg ctcttttcct agtccctg 38
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaatggggtg cagggaagca ggggctgtgc cccagcccag 40
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agttcaacgt cctgaagcag gtcaaccacc cacatgtc 38
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cacacccaca cacgcatgct gggaagcccc tgagca 36
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agtgctgacc accttcgacc ataccctgga ccatgagtc 39
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtccacctgg ccctacctcc aagagttccc aaagaagga 39
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agaggaaact ggagatgaaa aaggagtcag catgtcccta 40
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtaatgttta atgtaaggaa caccgagcac accaggg 37
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taccccctaa ggttctagca ttgactgagg acccccagc 39
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagggtacct ctttgcaaat taggaaaagg cactcct 37
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagctcctcc tccatgttcc gacaggtaga tgttctctgg 40
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtcagcctct gagactaaaa ctgggctcct caggcctt 38
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tccagaaacc tctgtctccc cttggctctg ccaaggaca 39
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggggtgcgcg cgcctgactg ctgtcctctc atctcagct 39
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgccttaat ccctgttctt ctgctgtcct attcagatc 39
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaaatcctga gctaaaaaca aaggcaggta tctcttta 38
<210> 27
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaacctcaac cccatctgag gactaattag gaattaca 38
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcttctgctt cctgcaggta gcacttgcta atcagag 37
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acagcggact cctcaggtcc tcagccctca cctggcccg 39
<210> 30
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggccacaggg aataattctg caatttccat cacacgc 37
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctcagtgatt acactcttga gagagagaag acagactt 38
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aataacattt aactgcactt tgtcattaac ttcctttct 39
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acctcaggcg ctgtccttca ctgggcgatc cagcatgga 39
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcgcagggga cgaccctggt ggtcactctc atcacact 38
<210> 35
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgcatctaga ttttaatgcc aacggtttct tggcttcct 39
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agtatctacc tttgttagat aataacaagt gattaag 37
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cgccagtggg gtctgacctc caggtctctt tcagatgctt 40
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
caaatcataa gcattcaaca gataactgat actgtatga 39
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgcgccgagc tctactgcct cgcgggaagg cggaagggt 39
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgaggagaag gcggcggccg cggcgtaggc gcacgtc 37
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtaaggttag cagggaagag gggtcagtag tttgtaaca 39
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggcctataac caaccccacc ccattccact cacccgtga 39
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccaggcaaga aatgctatgg aagtgtttat atataacc 38
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tgtgatgtat tctaaaaccg tgtgtgtgtg tgtgtg 36
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gatatctttg tgcaaagctt tcattgaaac caagatca 38
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ttgtgatctc tgacttgtga cccagaccag ccaact 36
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
actaacaaaa aaccttccat taataatacc gaactata 38
<210> 48
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gatgtaaaca gcctctttgt agtttataac ttaaaact 38
<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
aatgctagtg gtatggtacc tgcaggaagg catatata 38
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acctgaggag gtgtggcagg ggcctgtagt tgctttac 38
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ccatcctgat atcccttctg aaatacacat tagcctcca 39
<210> 52
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gataacatga tcctgatgct gatgttcttt atcttcag 38
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gcaaatttaa gtgcattcag acgtgggaga gggagatt 38
<210> 54
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ttgctattct tcataatagc agggatgcta atgagtg 37
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cggatcattg cagctctccc caccagcctt atcaatgtg 39
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gatgaaagat aacactaggc cattgatggc tacactgg 38
<210> 57
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tcgacttcgc catcagcgcc aaacctctca cccgctaca 39
<210> 58
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tgaagctgcc tcccattgcc atctcaggtc ttgggagc 38
<210> 59
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctcagctgct tattgcaggg acacagagcc cggcatgg 38
<210> 60
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gtgttctaat acagctctaa gaactgagta tttaatga 38
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
agcccgctgt gagcataggt gattatagta aagagat 37
<210> 62
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ggaatctacg tatgacttcc ttggtgatag aaattatgg 39
<210> 63
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
agatcattgg gtattttctg aaagcttaca taatggctg 39
<210> 64
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
atggcatcac gcagagtaag gtagagggtg cttgaagat 39
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ggtatgggag gcaga 15
<210> 66
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtgtgggag gcaga 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ggtatggagg tgggt 15
<210> 68
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggtgtggagg tgggt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttactcagtg caaag 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcatggcttt gtgtg 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaattgaac tcttc 15
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tcgcgggtcc ggggc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgtgggtcc ggggc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccatggggc aggga 15
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cccgtggggc aggga 15
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gaacccagaa ttgtc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaatccagaa ttgtc 15
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taaattttct cacct 15
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taatttttct cacct 15
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tggcacagtg acctg 15
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tggtacagtg acctg 15
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agccgcctgg cccta 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcaatttgag cttgc 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcagtttgag cttgc 15
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aatgggtttc tgtgg 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
accatacttt aaatc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
accgtacttt aaatc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cccaccggca ggggt 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccgccggca ggggt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttaaaaaat atcca 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ttttaaaaat atcca 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
atcaagcagg cccat 15
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atcgagcagg cccat 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctagctaac catct 15
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<211> 15
<212> DNA
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tctggctaac catct 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagaaatact gaaga 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taggaatact gaaga 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
tcgaggtcgg tgccg 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tcgcggtcgg tgccg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttaaagaaa gacac 15
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttaagaaag acac 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acaataacgt ttatg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
acagtaacgt ttatg 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
cataccaaaa gccac 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgccaaaa gccac 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actcaactgc tttca 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actgaactgc tttca 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctgcagaaa aagaa 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcttcagaaa aagaa 15
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtaacccgg gtagc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtgacccgg gtagc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgatgtgat gaggt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggtgtgat gaggt 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccaactgag cccca 15
<210> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcatttgaa agcct 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
tgcgtttgaa agcct 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agaattcagg tgact 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
agagttcagg tgact 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
cacacctgtt agaag 15
<210> 128
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
cacgcctgtt agaag 15
Claims (10)
1.一种评估肺移植术后移植物排斥风险的SNP标记物，其特征在于，所述SNP标记物为SNP位点rs2074533、rs1700189、rs977624、rs2075152、rs2075755、rs572846、rs2075910、rs691057、rs1860263、rs2271715、rs2271730、rs894039、rs303815、rs1460355、rs2271971、rs748384、rs260502、rs1039322、rs820094、rs1049437、rs2281913、rs1893061、rs881803、rs1805794、rs943199、rs599437、rs948119、rs678209、rs704329、rs2282772、rs1603022、rs1845430的组合。
2.SNP位点在制备评估肺移植术后移植物排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点为：rs2074533、rs1700189、rs977624、rs2075152、rs2075755、rs572846、rs2075910、rs691057、rs1860263、rs2271715、rs2271730、rs894039、rs303815、rs1460355、rs2271971、rs748384、rs260502、rs1039322、rs820094、rs1049437、rs2281913、rs1893061、rs881803、rs1805794、rs943199、rs599437、rs948119、rs678209、rs704329、rs2282772、rs1603022、rs1845430。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述产品通过检测待测样品中的受体游离DNA中供体游离DNA含量来评估肺移植术后移植物排斥风险。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述待测样品为血液，所述产品通过检测待测样品中的受体游离DNA中供体游离DNA含量，计算GcfDNA供受比来评估肺移植术后移植物排斥风险，GcfDNA供受比≤8.2％，表示受者肺移植物排斥风险低；GcfDNA供受比＞8.2％，表示受者肺移植物排斥风险高；或
所述待测样品为尿液，所述产品通过检测待测样品中的受体游离DNA中供体游离DNA含量，计算GcfDNA供受比来评估肺移植术后移植物排斥风险，GcfDNA供受比≤3.3％，表示受者肺移植物排斥风险低；GcfDNA供受比＞3.3％，表示受者肺移植物排斥风险高。
5.一种用于评估肺移植术后移植物排斥风险的引物和探针，其特征在于，
所述引物为：
用于检测rs2074533的引物，其序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
用于检测rs1700189的引物，其序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
用于检测rs977624的引物，其序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于检测rs2075152的引物，其序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于检测rs2075755的引物，其序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于检测rs572846的引物，其序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
用于检测rs2075910的引物，其序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
用于检测rs691057的引物，其序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；
用于检测rs1860263的引物，其序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；
用于检测rs2271715的引物，其序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
用于检测rs2271730的引物，其序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；
用于检测rs894039的引物，其序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；
用于检测rs303815的引物，其序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
用于检测rs1460355的引物，其序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；
用于检测rs2271971的引物，其序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；
用于检测rs748384的引物，其序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
用于检测rs260502的引物，其序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；
用于检测rs1039322的引物，其序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；
用于检测rs820094的引物，其序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
用于检测rs1049437的引物，其序列为SEQ ID No：39和SEQ ID No：40；
用于检测rs2281913的引物，其序列为SEQ ID No：41和SEQ ID No：42；
用于检测rs1893061的引物，其序列为SEQ ID No：43和SEQ ID No：44；
用于检测rs881803的引物，其序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；
用于检测rs1805794的引物，其序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；
用于检测rs943199的引物，其序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
用于检测rs599437的引物，其序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；
用于检测rs948119的引物，其序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；
用于检测rs678209的引物，其序列为SEQ ID No：55和SEQ ID No：56；
用于检测rs704329的引物，其序列为SEQ ID No：57和SEQ ID No：58；
用于检测rs2282772的引物，其序列为SEQ ID No：59和SEQ ID No：60；
用于检测rs1603022的引物，其序列为SEQ ID No：61和SEQ ID No：62；
用于检测rs1845430。的引物，其序列为SEQ ID No：63和SEQ ID No：64；
所述探针为：
用于检测rs2074533的探针，其序列为SEQ ID No：65和SEQ ID No：66；
用于检测rs1700189的探针，其序列为SEQ ID No：67和SEQ ID No：68；
用于检测rs977624的探针，其序列为SEQ ID No：69和SEQ ID No：70；
用于检测rs2075152的探针，其序列为SEQ ID No：71和SEQ ID No：72；
用于检测rs2075755的探针，其序列为SEQ ID No：73和SEQ ID No：74；
用于检测rs572846的探针，其序列为SEQ ID No：75和SEQ ID No：76；
用于检测rs2075910的探针，其序列为SEQ ID No：77和SEQ ID No：78；
用于检测rs691057的探针，其序列为SEQ ID No：79和SEQ ID No：80；
用于检测rs1860263的探针，其序列为SEQ ID No：81和SEQ ID No：82；
用于检测rs2271715的探针，其序列为SEQ ID No：83和SEQ ID No：84；
用于检测rs2271730的探针，其序列为SEQ ID No：85和SEQ ID No：86；
用于检测rs894039的探针，其序列为SEQ ID No：87和SEQ ID No：88；
用于检测rs303815的探针，其序列为SEQ ID No：89和SEQ ID No：90；
用于检测rs1460355的探针，其序列为SEQ ID No：91和SEQ ID No：92；
用于检测rs2271971的探针，其序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；
用于检测rs748384的探针，其序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96；
用于检测rs260502的探针，其序列为SEQ ID No：97和SEQ ID No：98；
用于检测rs1039322的探针，其序列为SEQ ID No：99和SEQ ID No：100；
用于检测rs820094的探针，其序列为SEQ ID No：101和SEQ ID No：102；
用于检测rs1049437的探针，其序列为SEQ ID No：103和SEQ ID No：104；
用于检测rs2281913的探针，其序列为SEQ ID No：105和SEQ ID No：106；
用于检测rs1893061的探针，其序列为SEQ ID No：107和SEQ ID No：108；
用于检测rs881803的探针，其序列为SEQ ID No：109和SEQ ID No：110；
用于检测rs1805794的探针，其序列为SEQ ID No：111和SEQ ID No：112；
用于检测rs943199的探针，其序列为SEQ ID No：113和SEQ ID No：114；
用于检测rs599437的探针，其序列为SEQ ID No：115和SEQ ID No：116；
用于检测rs948119的探针，其序列为SEQ ID No：117和SEQ ID No：118；
用于检测rs678209的探针，其序列为SEQ ID No：119和SEQ ID No：120；
用于检测rs704329的探针，其序列为SEQ ID No：121和SEQ ID No：122；
用于检测rs2282772的探针，其序列为SEQ ID No：123和SEQ ID No：124；
用于检测rs1603022的探针，其序列为SEQ ID No：125和SEQ ID No：126；
用于检测rs1845430。的探针，其序列为SEQ ID No：127和SEQ ID No：128。
6.权利要求5所述引物和探针在制备评估肺移植术后移植物排斥风险的产品中的应用。
7.一种用于评估肺移植术后移植物排斥风险的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述序列如SEQ ID No.1～64所示的引物和序列如SEQ ID No.65～128所示的探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端分别连接FAM荧光基团或VIC荧光基团，所述探针的3’端标记NFQ和MGB。
10.一种检测受体游离DNA中供体游离DNA含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：以待测样品的总游离DNA为模板，加入序列SEQ ID No.1～64所示的引物和序列SEQ IDNo.65～128所示的探针，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
步骤2：反应结束后，分析每个SNP位点，计算供者游离DNA/受者游离DNA的比值，即GcfDNA供受比，其中，SNP位点的分析方法如下：
1)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0.9～1，视该位点数据为无效数据；
2)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0，即仅有一种碱基阳性，视该位点数据为无效数据；
3)该位点两种碱基比(低含量/高含量)＝0～0.9，视该位点数据为有效数据；在有效数据中，以SNPNo#1和SNPNo#2为例，SNPNo#1的碱基比约等于SNPNo#2的两倍(2±0.4)，则判定SNPNo#1中，移植受者和移植供者在中均为纯合子；在SNPNo#2中，移植受者为纯合子，移植供者为杂合子；
4)选择判定移植受者和移植供者均为纯合子的SNP位点数据，计算平均值，即为GcfDNA供受比。
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