CN116964223A - 用于检测多个器官的移植受体中的供体源性游离dna的方法 - Google Patents
用于检测多个器官的移植受体中的供体源性游离dna的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116964223A CN116964223A CN202280019708.4A CN202280019708A CN116964223A CN 116964223 A CN116964223 A CN 116964223A CN 202280019708 A CN202280019708 A CN 202280019708A CN 116964223 A CN116964223 A CN 116964223A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- transplant
- dna
- free dna
- donor
- cfdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 231
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 109
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 109
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 77
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 77
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 57
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 55
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 32
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 claims description 16
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 15
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 15
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000011176 pooling Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 180
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 85
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 59
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 46
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 40
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 34
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 19
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 15
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 15
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 13
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 12
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 12
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 12
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 11
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 11
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 10
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 10
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 10
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 8
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 8
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 8
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000007854 ligation-mediated PCR Methods 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 208000034841 Thrombotic Microangiopathies Diseases 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 2
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- CJYDNDLQIIGSTH-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5,7-trinitro-1,3,5,7-tetrazocan-1-yl)ethanone Chemical compound CC(=O)N1CN([N+]([O-])=O)CN([N+]([O-])=O)CN([N+]([O-])=O)C1 CJYDNDLQIIGSTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000003918 Acute Kidney Tubular Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101100284398 Bos taurus BoLA-DQB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102220481335 G-protein coupled receptor family C group 5 member D_A18D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 1
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000034706 Graft dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 241000691979 Halcyon Species 0.000 description 1
- 101000779641 Homo sapiens ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 1
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 1
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 1
- 206010038540 Renal tubular necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001610 euglycemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- -1 insertions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011862 kidney biopsy Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 102200006539 rs121913529 Human genes 0.000 description 1
- 102200006538 rs121913530 Human genes 0.000 description 1
- 102200007373 rs17851045 Human genes 0.000 description 1
- 102200007376 rs770248150 Human genes 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012176 true single molecule sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本公开提供了对DNA进行扩增和测序的方法,所述方法包括:从已接受一个或多个器官的移植的移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA,所述移植包括多个器官的同时移植或顺序移植,其中经提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;使用200个至50,000个引物对在单个反应体积中的200个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;通过高通量测序对扩增产物进行测序以获得测序读段,并基于所述测序读段对供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量进行定量;以及确定所述供体源性游离DNA的量或其函数是否超过指示移植排斥或移植物损伤的临界阈值。
Description
背景技术
快速检测移植物损伤和/或排斥对于多个器官的移植受体来说仍然是一个挑战,无论是同时多器官移植还是顺序移植。传统的基于活检的测试是侵入性的且成本高昂,并且可能导致移植损伤和/或排斥的晚期诊断。因此,需要一种针对多个器官的移植受体的非侵入性移植排斥测试,其比传统的基于活检的测试更灵敏、更特异。
发明内容
本发明涉及对DNA进行扩增和测序的方法,该方法包括:从已接受一个或多个器官的移植的移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA,该移植包括多个器官的同时移植或顺序移植,其中经提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;使用200个至50,000个引物对在单个反应体积中的200个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中该靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;通过高通量测序对扩增产物进行测序以获得测序读段,并基于该测序读段对供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量进行定量;以及确定该供体源性游离DNA的量或其函数是否超过指示移植排斥或移植物损伤的临界阈值。
具体实施方式
Sigdel等人,“通过大规模多重PCR评估供体源性游离DNA来优化肾移植损伤的检测(Optimizing Detection of Kidney Transplant Injury by Assessment of Donor-Derived Cell-Free DNA via Massively Multiplex PCR)”,《临床医学杂志(J.Clin.杂志》)》8(1):19(2019),通过全文引用的方式并入本文。
于2019年7月3日作为PCT/US2019/040603提交的名称为“供体源性游离DNA的检测方法(Methods for Detection of Donor-Derived Cell-Free DNA)”的WO2020/010255通过全文引用的方式并入本文。
美国临时申请号63/031,879,名称为“供体源性游离DNA的改进的检测方法(Improved Methods for Detection of Donor Derived Cell-Free DNA)”于2020年5月29日通过全文引用的方式并入本文。
本发明涉及对从已接受一个或多个器官移植(包括多个器官的同时移植或顺序移植)的移植受体的生物样品中提取的游离DNA进行扩增和测序的方法,其可用于确定移植排斥或移植物损伤。在一些实施例中,该方法包括:(a)从移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA,其中经提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;(b)使用200个至50,000个引物对在单个反应体积中的200个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中该靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;(c)通过高通量测序对扩增产物进行测序以获得测序读段,并基于测序读段对供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量进行定量;以及(d)确定该供体源性游离DNA的量或其函数是否超过指示移植排斥或移植物损伤的临界阈值。
在一些实施例中,移植供体是人受试者。在一些实施例中,移植供体是非人哺乳动物受试者(例如,猪)。在一些实施例中,所述移植受体是人受试者。
在一些实施例中,移植受体已接受一个或多个移植器官,包括但不限于胰腺、肾、肝、心脏、肠、胸腺、造血细胞和子宫。
在一些实施例中,多个器官来自同一移植供体。在一些实施例中,多个器官来自不同的移植供体。
在一些实施例中,移植受体已接受多个器官的同时移植。在一些实施例中,移植受体已接受多个器官的顺序移植。
在一些实施例中,移植受体已接受肾和胰腺的同时移植(SPK)。在一些实施例中,移植受体已接受肾和胰腺的顺序移植(PAK)。
在一些实施例中,移植受体已接受肾和肝的同时移植。在一些实施例中,移植受体已接受肾和心脏的同时移植。在一些实施例中,移植受体已接受肾和肺的同时移植。在一些实施例中,移植受体已接受胰腺和肝的同时移植。在一些实施例中,移植受体已接受心脏和肺的同时移植。
在一些实施例中,移植受体已接受肾和肝的顺序移植。在一些实施例中,移植受体已接受肾和心脏的顺序移植。在一些实施例中,移植受体已接受肾和肺的顺序移植。在一些实施例中,移植受体已接受胰腺和肝的顺序移植。在一些实施例中,移植受体已接受心脏和肺的顺序移植。
在一些实施例中,临界阈值是供体源性游离DNA占总游离DNA的量的百分比,诸如0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、或0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、或2.0%。在一些实施例中,根据移植器官的类型调整临界阈值。在一些实施例中,根据移植器官的数量调整临界阈值。
在一些实施例中,已接受肾移植的移植受体的临界阈值是占总游离DNA的量的1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、或2.0%的供体源性游离DNA的量。
在一些实施例中,已接受心脏移植的移植受体的临界阈值是占总游离DNA的量的0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、或0.5%的供体源性游离DNA的量。
在一些实施例中,临界阈值是供体源性游离DNA的量或其函数。在一些实施例中,临界阈值表示为dd-cfDNA的相对量或绝对量。在一些实施例中,临界阈值表示为每体积单位血液样品中dd-cfDNA的相对量或绝对量。在一些实施例中,临界阈值表示为每体积单位血液样品中dd-cfDNA的相对量或绝对量乘以或除以移植受体的体重、BMI或血液体积。
在一些实施例中,应用结合了dd-cfDNA(%)和dd-cfDNA绝对量(拷贝数/mL)两者的双阈值算法,其目的是提高测试灵敏度,特别是通过在cfDNA水平高的情况下改进检测。在一些实施例中,在新的双阈值算法中,dd-cfDNA分数临界值为0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、或0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、或2.0%,并且dd-cfDNA量临界值为10cp/mL、或15cp/mL、或20cp/mL、或25cp/mL、或30cp/mL、或35cp/mL、或40cp/mL、或45cp/mL、或50cp/mL、或60cp/mL、或70cp/mL、或80cp/mL、或90cp/mL、或100cp/mL、或110cp/mL、或120cp/mL、或130cp/mL、或140cp/mL、或150cp/mL。在一些实施例中,超过任一阈值的样品被视为AR或移植物损伤风险较高。在一些实施例中,超过两个阈值的样品被视为AR或移植物损伤风险较高。
在一些实施例中,靶向扩增包括PCR,并且引物对包括200对至50,000对、500对至20,000对、或1,000对至10,000对、或200对至500对、或500对至1,000对、或1,000对至2,000对、或2,000对至5,000对、或5,000对至10,000对、或10,000对至20,000对、或20,000对至50,000对正向和反向PCR引物。在一些实施例中,靶向扩增包括使用500个至20,000个、或1,000个至10,000个、或200个至500个、或500个至1,000个、或1,000个至2,000个、或2,000个至5,000个、或5,000个至10,000个、或10,000个至20,000、或20,000个至50,000个引物对在单个反应体积中的500个至20,000个、或1,000个至10,000个、或200个至500个、或500个至1,000个、或1,000个至2,000个、或2,000个至5,000个、或5,000个至10,000个、或10,000个至20,000个、或20,000个至50,000个引物对在单个反应体积中的靶基因座处进行靶向扩增以获得扩增产物。
在一些实施例中,靶基因座包含单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施例中,该方法进一步包括在进行高通量测序之前将标签附着至扩增产物,其中标签包含测序兼容的衔接子。
在一些实施例中,该方法进一步包括在进行靶向扩增之前将标签附着至经提取的游离DNA,其中标签包含用于扩增的衔接子。
在一些实施例中,标签包含样品特异性条形码,并且其中该方法进一步包括在高通量测序之前汇集来自多个样品的扩增产物,并在高通量测序期间在单次运行中对扩增产物池一起进行测序。
在一些实施例中,该方法进一步包括对同一移植受体纵向重复步骤(a)至(d),以及确定移植受体中的供体源性游离DNA的量或其函数的纵向变化。
在一些实施例中,该方法进一步包括基于移植受体中的供体源性游离DNA的量或其函数的纵向变化来调节免疫抑制疗法。在一些实施例中,该方法进一步包括鉴于移植受体中的供体源性游离DNA的量或其函数增加而增加免疫抑制疗法。在一些实施例中,该方法进一步包括鉴于移植受体中的供体源性游离DNA的量或其函数减少而减少免疫抑制疗法。
在一些实施例中,在不预先了解供体基因型的情况下进行所述方法。在一些实施例中,该方法不包括对移植供体进行基因分型。
本文描述的方法非常精确地评估所有类型的移植排斥或移植物损伤。从单次抽血(可包括两管或更多管血)中,本文描述的方法的某些实施例测量患者血液中来自多个移植的器官的供体cfDNA的量。使用大量单核苷酸多态性(SNP)(例如,超过13,000个SNP)和高级生物信息学,这些实施例可以区分供体和受体cfDNA,以提供诸如移植受体的血液中dd-cfDNA百分比或供体源性游离DNA的量或其函数的结果。
在一些实施例中,例如,示踪剂DNA或内部校准DNA,是指以下一种或多种已知的DNA的组成:长度、序列、核苷酸组成、量或生物来源。示踪剂DNA可以添加到源自人受试者的生物样品中,以帮助估计所述样品中的总cfDNA的量。其也可以添加到除生物样品本身以外的反应混合物中。
在一些实施例中,例如,单核苷酸多态性(SNP)是指同一物种的两个成员的基因组之间可能存在差异的单核苷酸。所述术语的使用并不意味着对每个变体出现的频率有任何限制。
在一些实施例中,例如,序列是指DNA序列或RNA序列或遗传序列。序列可以指个体中DNA或RNA分子或链的基本物理结构。序列可以指在DNA或RNA分子中发现的核苷酸序列,或DNA或RNA分子的互补链。序列可以指DNA或RNA分子中所包含的信息,作为其生物信息学表示。
在一些实施例中,例如,基因座是指个体DNA或RNA上的特定所关注区域,包含但不限于一个或多个SNP、可能插入或缺失的位点、或一些其他相关基因变异的位点。疾病相关SNP也可以指疾病相关基因座。
在一些实施例中,例如,多态性等位基因,也称为“多态性基因座”是指等位基因或基因座,其中基因型在给定物种的个体之间存在差异。多态性等位基因的一些实例包含单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复、缺失、重复和倒位。
在一些实施例中,例如,等位基因是指占据特定基因座的核苷酸或核苷酸序列。
在一些实施例中,例如,遗传数据,也称为“基因型数据”,是指描述一个或多个个体基因组方面的数据。其可以指一个或一组基因座,部分或整个序列,部分或整个染色体,或整个基因组。其可以指一个或多个核苷酸的同一性;其可以指一组序列核苷酸,或来自基因组中不同位置的核苷酸,或其组合。基因型数据通常为生物信息学,然而也可以将序列中的物理核苷酸视为化学编码的遗传数据。基因型数据可以说是在个体“上”、个体“的”、“在”个体处、“来自”个体或在个体“上”。基因型数据可以指来自基因分型平台的输出测量,这些测量是在遗传材料上进行的。
在一些实施例中,例如,遗传材料,也称为“遗传样品”,是指来自一个或多个包括核酸(例如,包括DNA或RNA)的个体的物理物质,诸如组织或血液。
在一些实施例中,例如,等位基因数据是指一组关于一组一个或多个等位基因的基因型数据。其可以指阶段性、单倍型数据。其可能指SNP身份,也可以指核酸的序列数据,包含插入、缺失、重复和突变。
在一些实施例中,等位基因状态是指一组一个或多个等位基因中基因的实际状态。其可以指由等位基因数据描述的基因的实际状态。
在一些实施例中,等位基因比率(allelic ratio)或等位基因比率(alleleratio)是指样品或个体中存在的基因座处的每个等位基因的量之间的比率。当通过测序测量样品时,等位基因比率可以指映射到基因座处的每个等位基因的序列读段的比率。当用基于强度的测量方法测量样品时,等位基因比率可以指通过测量方法估计的该基因座处存在的每个等位基因的量的比率。
在一些实施例中,例如,等位基因计数是指映射到特定基因座的序列数量,如果该基因座是多态性的,则指映射到等位基因中的每个等位基因的序列数量。如果以二进制方式计数每个等位基因,则等位基因计数将为整数。如果对等位基因进行概率计数,则等位基因计数可以是分数。
在一些实施例中,例如,引物,也称为“PCR探针”是指单个DNA分子(DNA寡聚物)或DNA分子(DNA低聚物)的集合,其中DNA分子相同或近似相同,并且其中引物含有设计用于与靶向的多态性基因座杂交的区域,并且含有设计用于允许PCR扩增等扩增的引发序列。引物也可以含有分子条形码。引物可以含有每个单独的分子不同的随机区域。
在一些实施例中,例如,杂交捕获探针是指通过PCR或直接合成等各种方法生成的任何核酸序列(可能经过修饰),旨在与样品中特定靶DNA或RNA序列的一条链互补。外源性杂交捕获探针可以添加到制备的样品中,并且通过变性再退火过程进行杂交,以形成外源性内源性片段的双链体。然后,可以通过各种方式将这些双链体与样品物理分离。
在一些实施例中,例如,序列读段是指表示核苷酸碱基序列的数据,该碱基序列是使用克隆测序方法测量的。克隆测序可以产生表示单个原始DNA或RNA分子,或其克隆或簇的序列数据。序列读段也可以在序列的每个碱基位置处有相关联的质量评分,表明核苷酸被正确判定的概率。
在一些实施例中,例如,映射序列读段是确定序列读段在特定生物体基因组序列中的来源位置的过程。序列读段的来源位置基于读段与基因组序列的核苷酸序列相似性。
在一些实施例中,例如,供体源性DNA或RNA是指最初是细胞的一部分的DNA或RNA,该细胞的基因型与移植供体的基因型基本相同。供体可以是人或非人哺乳动物(例如,猪)。
在一些实施例中,例如,受体源性DNA或RNA是指最初是细胞的一部分的DNA或RNA,该细胞的基因型与移植受体的基因型基本相同。
在一些实施例中,例如,移植受体血浆是指来自已接受同种异体移植或异种移植的女性患者(例如,器官移植受体)的血液的血浆部分。
在一些实施例中,例如,对应于基因座的DNA或RNA的优选富集、或基因座处的DNA或RNA的优选富集是指任何使得富集后DNA或RNA混合物中对应于基因座的DNA或RNA分子的百分比高于富集前DNA或RNA混合物中对应于基因座的DNA或RNA分子的百分比的技术。该技术可以涉及选择性扩增对应于基因座的DNA或RNA分子。该技术可以涉及去除不与基因座对应的DNA或RNA分子。所述技术可以涉及方法的组合。富集程度被定义为富集后混合物中对应于基因座的DNA或RNA分子的百分比除以富集前混合物中对应于基因座的DNA或RNA分子的百分比。优先富集可以在多个基因座上进行。在本公开的一些实施例中,富集程度大于20。在本公开的一些实施例中,富集程度大于200。在本公开的一些实施例中,富集程度大于2,000。当在多个基因座上进行优先富集时,富集程度可以指所述基因座组中所有基因座的平均富集程度。
在一些实施例中,例如,扩增是指增加DNA或RNA分子拷贝数量的技术。
在一些实施例中,例如,选择性扩增可以指增加特定DNA或RNA分子或对应于特定DNA或RNA区域的DNA或RNA分子的拷贝数量的技术。选择性扩增也可以指一种技术,该技术增加特定靶向DNA或RNA分子或靶向DNA或RNA区域的拷贝数量多于增加非靶向DNA或RNA分子或区域的拷贝数量。选择性扩增可以是优先富集的方法。
在一些实施例中,例如,通用引发序列是指可以附加到靶DNA分子群体中的DNA序列,例如通过连接、PCR或连接介导的PCR。一旦添加到靶分子群体中,可以使用通用引发序列特异性引物,使用单对扩增引物来扩增靶群体。通用引物序列不需要与靶序列相关。
在一些实施例中,例如,通用衔接子或“连接衔接子”或“文库标签”是含有通用引发序列的DNA分子,可与靶双链DNA分子群体的5-主要末端和3-主要末端共价连接。衔接子的添加为靶群体的5-主要末端和3-主要末端提供了通用引物序列,可以从中进行PCR扩增,使用单对扩增引物扩增靶群体的所有分子。
在一些实施例中,例如,靶向是指用于选择性地扩增或以其他方式优选富集那些对应于DNA或RNA混合物中的基因座组的DNA或RNA分子的方法。
分析供体源性游离DNA以监测移植排斥或移植物损伤
一方面,本发明涉及一种对移植受体的血液样品中的供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的量进行定量的方法,该方法包括:从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中的500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中该靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座,并且其中每个引物对被设计成扩增不超过100bp;以及定量扩增产物中该供体源性游离DNA的量。
另一方面,本发明涉及一种对移植受体的血液样品中供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的量进行定量的方法,该方法包括:从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA,并且其中提取步骤包括大小选择以富集供体源性游离DNA并减少从破裂的白细胞中安置的受体源性游离DNA的量;使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中的500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中该靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;以及定量扩增产物中该供体源性游离DNA的量。
另一方面,本发明涉及一种检测移植受体的血液样品中的供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的方法,该方法包括:从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中的500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中该靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;通过高通量测序对扩增产物进行测序;以及定量该供体源性游离DNA的量。
在一些实施例中,该方法进一步包括对提取的DNA进行通用扩增。在一些实施例中,通用扩增优选地扩增供体源性游离DNA,而不是从破裂的白细胞中安置的受体源性游离DNA。
在一些实施例中,移植供体是人受试者。在一些实施例中,移植供体是非人哺乳动物受试者(例如,猪)。在一些实施例中,移植受体是哺乳动物。在一些实施例中,移植受体是人。
在一些实施例中,移植受体已接受选自器官移植、组织移植、细胞移植和流体移植的移植。在一些实施例中,移植受体已接受选自肾移植、肝移植、胰腺移植、肠移植、心脏移植、肺移植、心脏/肺移植、胃移植、睾丸移植、阴茎移植、卵巢移植、子宫移植、胸腺移植、面部移植、手移植、腿移植、骨移植、骨髓移植、角膜移植、皮肤移植、胰岛细胞移植、心脏瓣膜移植、血管移植、造血细胞和输血的移植。在一些实施例中,移植受体已接受SPK移植。
在一些实施例中,所述定量步骤包括确定所述血液样品中供体源性游离DNA占供体源性游离DNA和受体源性游离DNA总量的百分比。在一些实施例中,定量步骤包括确定每体积单位血液样品中供体源性游离DNA的量。
在一些实施例中,该方法进一步包括使用供体源性游离DNA的所定量的量检测主动移植排斥发生或可能发生。在一些实施例中,在不预先了解供体基因型的情况下进行所述方法。
在一些实施例中,每个引物对被设计成扩增约50bp至100bp的靶序列。在一些实施例中,每个引物对被设计成扩增不超过75bp的靶序列。在一些实施例中,每个引物对被设计成扩增约60bp至75bp的靶序列。在一些实施例中,每个引物对被设计成扩增约65bp的靶序列。
在一些实施例中,靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少1,000个多态性基因座。在一些实施例中,靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少2,000个多态性基因座。在一些实施例中,靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少5,000个多态性基因座。在一些实施例中,靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少10,000个多态性基因座。
在一些实施例中,该方法进一步包括测量作为多态性基因座的靶基因座处的一个或多个等位基因的量。在一些实施例中,多态性基因座和非多态性基因座在单个反应中扩增。
在一些实施例中,定量步骤包括使用微阵列检测所扩增的靶基因座。在一些实施例中,定量步骤不包括使用微阵列。
在一些实施例中,靶向扩增包括使用(i)至少500个至50,000个不同的引物对、或(ii)至少500个至50,000个靶特异性引物和通用或标签特异性引物500个至50,000个引物对同时扩增单个反应体积中的500个至50,000个靶基因座。
在另外的方面,本发明涉及确定移植受体体内发生移植排斥或移植物损伤的可能性的方法,该方法包括:从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;对经提取的DNA进行通用扩增;使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中的500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中该靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;通过高通量测序对扩增产物进行测序;以及定量该血液样品中供体源性游离DNA的量,其中dd-cfDNA的量越多表示发生移植排斥或移植物损伤的可能性越大。
在另外的方面,本发明涉及一种诊断移植受体体内的移植是否正在发生急性排斥的方法,该方法包括:从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;对经提取的DNA进行通用扩增;使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中的500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中该靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;通过高通量测序对扩增产物进行测序;以及定量该血液样品中供体源性游离DNA的量,其中dd-cfDNA的量大于1%(或1.1%、或1.2%、或1.3%、或1.4%、或1.5%、或1.6%、或1.7%、或1.8%、或1.9%、或2.0%)表示移植正在发生急性排斥。
在一些实施例中,移植排斥是抗体介导的移植排斥。在一些实施例中,移植排斥是T细胞介导的移植排斥。
在一些实施例中,dd-cfDNA的量小于1%(或0.9%、或0.8%、或0.7%、或0.6%、或0.5%)表示移植正在发生边缘排斥、正在发生其他损伤、或稳定。
在另外的方面,本发明涉及监测受试者的免疫抑制疗法的方法,该方法包括:从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;对经提取的DNA进行通用扩增;使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中的500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中该靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;通过高通量测序对扩增产物进行测序;以及定量该血液样品中供体源性游离DNA的量,其中dd-cfDNA水平在一段时间间隔内的变化表示移植状态。
在一些实施例中,该方法进一步包括基于一段时间间隔内的dd-cfDNA水平调节免疫抑制疗法。
在一些实施例中,dd-cfDNA水平的增加表明移植排斥和需要调节免疫抑制疗法。在一些实施例中,dd-cfDNA水平没有变化或降低表示移植耐受性或稳定性,并且需要调节免疫抑制疗法。
在一些实施例中,dd-cfDNA的量大于1%(或1.1%、或1.2%、或1.3%、或1.4%、或1.5%、或1.6%、或1.7%、或1.8%、或1.9%、或2.0%)表示移植正在发生急性排斥。在一些实施例中,移植排斥是抗体介导的移植排斥。在一些实施例中,移植排斥是T细胞介导的移植排斥。
在一些实施例中,dd-cfDNA的量小于1%(或0.9%、或0.8%、或0.7%、或0.6%、或0.5%)表示移植正在发生边缘排斥、正在发生其他损伤、或稳定。
在一些实施例中,该方法不包括对移植供体和/或移植受体进行基因分型。
在一些实施例中,该方法进一步包括测量作为多态性基因座的靶基因座处的一个或多个等位基因的量。
在一些实施例中,靶基因座包括至少1,000个多态性基因座、或至少2,000个多态性基因座、或至少5,000个多态性基因座、或至少10,000个多态性基因座。
在一些实施例中,在长度为约50bp至100bp、或长度为约50bp至90bp、或长度为约60bp至80bp、或长度为约60bp至75bp、或长度为约65bp的扩增子中扩增靶基因座。
在一些实施例中,移植受体是人。在一些实施例中,移植受体已接受选自肾移植、肝移植、胰腺移植、胰岛细胞移植、肠移植、心脏移植、肺移植、骨髓移植、心脏瓣膜移植或皮肤移植的移植。在一些实施例中,移植受体已接受SPK移植。
在一些实施例中,提取步骤包括大小选择以富集供体源性游离DNA并减少从破裂的白细胞中安置的受体源性游离DNA的量。
在一些实施例中,通用扩增步骤优选地扩增供体源性游离DNA,而不是从破裂的白细胞中处置的受体源性游离DNA。
在一些实施例中,该方法包括在移植后从移植受体纵向收集多个血液样品,并对收集的每个血液样品重复步骤(a)至(e)。在一些实施例中,该方法包括在约三个月、或约六个月、或约十二个月、或约十八个月、或约二十四个月等的时间段内收集和分析来自移植受体的血液样品。在一些实施例中,该方法包括以约一周、或约两周、或约三周、或约一个月、或约两个月、或约三个月等的间隔从移植受体收集血液样品。
在一些实施例中,该方法在识别急性排斥(AR)方面相较于非AR具有至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的灵敏度,其中临界阈值为1%dd-cfDNA,置信区间为95%。
在一些实施例中,该方法在识别AR方面相较于非AR具有至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%的特异性,其中临界阈值为1%dd-cfDNA,置信区间为95%。
在一些实施例中,该方法在识别AR方面相较于非AR具有至少0.8、或0.85、或至少0.9、或至少0.95的曲线下面积(AUC),其中临界阈值为1%dd-cfDNA,置信区间为95%。
在一些实施例中,该方法在识别AR方面相较于正常、稳定的同种异体移植(STA)具有至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的灵敏度,其中临界阈值为1%dd—cfDNA,置信区间为95%。
在一些实施例中,该方法在识别AR方面相较于STA具有至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的特异性,其中临界阈值为1%dd-cfDNA,置信区间为95%。
在一些实施例中,该方法在识别AR方面相较于STA具有至少0.8、或0.85、或至少0.9、或至少0.95、或至少0.98、或至少0.99的AUC,其中临界阈值为1%dd-cfDNA,置信区间为95%。
在一些实施例中,该方法具有由0.5%或更小的空白限(LoB)和0.5%或更小的检测限(LoD)确定的灵敏度。在一些实施例中,LoB为0.23%或更小,并且LoD为0.29%或更小。在一些实施例中,灵敏度进一步由定量限(LoQ)确定。在一些实施例中,LoQ比LoD大10倍;LoQ可能比LoD大5倍;LoQ可能比LoD大1.5倍;LoQ可能比LoD大1.2倍;LoQ可能比LoD大1.1倍;或者LoQ可以等于或大于LoD。在一些实施例中,LoB等于或小于0.04%,LoD等于或小于0.05%,并且/或者LoQ等于LoD。
在一些实施例中,该方法具有通过评估从测量的供体分数的线性回归分析获得的线性值作为对应的尝试尖峰水平的函数而确定的准确度,其中线性值是R2值,其中R2值为约0.98至约1.0。在一些实施例中,R2值为0.999。在一些实施例中,该方法具有通过使用测量的供体分数的线性回归作为对应的尝试尖峰水平的函数来计算斜率值和截距值而确定的准确度,其中斜率值为约0.9至约1.2,并且截距值为约-0.0001至约0.01。在一些实施例中,斜率值大约为1,并且截距值大约为0。
在一些实施例中,该方法具有通过计算变异系数(CV)确定的精度,其中CV小于约10.0%。CV小于约6%。在一些实施例中,CV小于约4%。在一些实施例中,CV小于约2%。在一些实施例中,CV小于约1%。
在一些实施例中,AR是抗体介导的排斥(ABMR)。在一些实施例中,AR是T细胞介导的排斥(TCMR)。在一些实施例中,AR是急性细胞排斥(ACR)。
本文进一步公开了用于检测来自移植受体的样品中的移植供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的方法。在一些实施例中,在本文所公开的方法中,移植受体是哺乳动物。在一些实施例中,移植受体是人。在一些实施例中,移植受体已接受选自肾移植、肝移植、胰腺移植、胰岛细胞移植、肠移植、心脏移植、肺移植、骨髓移植、心脏瓣膜移植或皮肤移植的移植。在一些实施例中,移植受体已接受SPK移植。在一些实施例中,该方法可以在移植手术当天或之后对移植受体进行,直至移植手术后一年。
在一些实施例中,本文公开了一种从移植受体的血液样品中扩增供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的靶基因座的方法,该方法包括:a)从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括源自移植细胞和移植受体两者的游离DNA;b)在靶基因座处富集所提取的DNA,其中该靶基因座包括50个至5000个包括多态性基因座和非多态性基因座的靶基因座;以及c)扩增该靶基因座。
在一些实施例中,本文公开了一种检测来自移植受体的血液样品中的供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的方法,该方法包括:a)从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括源自移植细胞和移植受体两者的游离DNA;b)在靶基因座处富集所提取的DNA,其中该靶基因座包括50个至5000个包括多态性基因座和非多态性基因座的靶基因座;c)扩增该靶基因座;d)将所扩增的靶基因座与和靶基因座特异性杂交的探针接触;以及e)检测该靶基因座与该探针的结合,从而检测该血液样品中的dd-cfDNA。在一些实施例中,探针用可检测标记物标记。
在一些实施例中,本文公开了一种确定移植受体体内发生移植排斥的可能性的方法,该方法包括:a)从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括源自移植细胞和移植受体两者的游离DNA;b)在靶基因座处富集所提取的DNA,其中该靶基因座包括50个至5000个包括多态性基因座和非多态性基因座的靶基因座;c)扩增该靶基因座;以及d)测量该受体血液样品中移植DNA的量和受体DNA的量,其中dd-cfDNA的量越大表示发生移植排斥的可能性越大。
在一些实施例中,本文公开了一种诊断移植受体体内的移植是否正在发生急性排斥的方法,该方法包括:a)从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括源自移植细胞和移植受体两者的游离DNA;b)在靶基因座处富集所提取的DNA,其中该靶基因座包括50个至5000个包括多态性基因座和非多态性基因座的靶基因座;c)扩增该靶基因座;以及d)测量该受体血液样品中移植DNA的量和受体DNA的量;其中dd-cfDNA的量大于1%(或1.1%、或1.2%、或1.3%、或1.4%、或1.5%、或1.6%、或1.7%、或1.8%、或1.9%、或2.0%)表示移植正在发生急性排斥。
在一些实施例中,在本文所公开的方法中,移植排斥是抗体介导的移植排斥。在一些实施例中,移植排斥是T细胞介导的移植排斥。在一些实施例中,dd-cfDNA的量小于1%(或0.9%、或0.8%、或0.7%、或0.6%、或0.5%)表示移植正在发生边缘排斥、正在发生其他损伤、或稳定。
在一些实施例中,本文公开了一种监测受试者的免疫抑制疗法的方法,该方法包括:a)从移植受体的血液样品中提取DNA,其中该DNA包括源自移植细胞和移植受体两者的游离DNA;b)在靶基因座处富集所提取的DNA,其中该靶基因座包括50个至5000个包括多态性基因座和非多态性基因座的靶基因座;c)扩增该靶基因座;以及d)测量该受体血液样品中移植DNA的量和受体DNA的量,其中dd-cfDNA的水平在一段时间间隔内的变化表示移植状态。在一些实施例中,所述方法进一步包括基于时间间隔内的dd-cfDNA水平调节免疫抑制疗法。在一些实施例中,dd-cfDNA水平的增加表明移植排斥和需要调节免疫抑制疗法。在一些实施例中,dd-cfDNA水平变化或降低表示移植耐受性或稳定性,并且需要调节免疫抑制疗法。
在一些实施例中,在本文所公开的方法中,靶基因座在长度为约50bp至100bp、或长度为约60bp至80bp的扩增子中扩增。在一些实施例中,扩增子的长度为约65bp。
在一些实施例中,本文所公开的方法进一步包括测量受体血液样品中移植DNA的量和受体DNA的量。
在一些实施例中,本文所公开的方法不包括对移植供体和移植受体进行基因分型。
在一些实施例中,本文所公开的方法进一步包括使用微阵列检测所扩增的靶基因座。
在一些实施例中,在本文所公开的方法中,多态性基因座和非多态性基因座在单个反应中扩增。
在一些实施例中,在本文所公开的方法中,DNA在靶基因座处优选富集。
在一些实施例中,在多个多态性基因座处优选富集样品中的DNA包括:获得多个预环化探针,其中每个探针靶向多态性基因座中的一个多态性基因座,并且其中探针的3′末端和5′末端设计成与DNA区域杂交,该区域与基因座的多态性基因座由少量碱基分开,其中该少量为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个至25个、26个至30个、31个至60个或它们的组合;将预环化探针与来自样品的DNA杂交;使用DNA聚合酶填充杂交探针末端之间的间隙;环化预环化探针;以及扩增环化探针。
在一些实施例中,在多个多态性基因座处优选富集DNA包括:获得多个连接介导的PCR探针,其中每个PCR探针靶向多态性基因座中的一个多态性基因座,并且其中上游和下游PCR探针设计成与一条DNA链上的DNA区域杂交,该区域与基因座的多态性基因座由少量碱基分开,其中该少量为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个至25个、26个至30个、31个至60个或它们的组合;将连接介导的PCR探针与来自第一样品的DNA杂交;使用DNA聚合酶填充连接介导的PCR探针末端之间的间隙;连接该连接介导的PCR探针;以及扩增该连接的连接介导的PCR探针。
在一些实施例中,在多个多态性基因座处优选富集DNA包括:获得靶向多态性基因座的多个杂交捕获探针;将杂交捕获探针与样品中的DNA杂交;以及从第一DNA样品中物理地去除部分或全部未杂交的DNA。
在一些实施例中,杂交捕获探针设计成与位于多态性基因座侧翼但不与其重叠的区域杂交。在一些实施例中,杂交捕获探针设计成与位于多态性基因座侧翼但不与其重叠的区域杂交,并且其中侧翼捕获探针的长度可以选自由以下项组成的组:少于约120个碱基、少于约110个碱基、少于约100个碱基、少于约90个碱基、少于约80个碱基、少于约70个碱基、少于约60个碱基、少于约50个碱基、少于约40个碱基、少于约30个碱基和少于约25个碱基。在一些实施例中,杂交捕获探针设计成与和多态性基因座重叠的区域杂交,并且其中多个杂交捕获探针包括针对每个多态性基因座的至少两个杂交捕获探针,并且其中每个杂交捕获探针设计成与该多态性基因座处的不同等位基因互补。
在一些实施例中,在多个多态性基因座处优选富集DNA包括:获得多个内部正向引物,其中每个引物靶向多态性基因座中的一个多态性基因座,并且其中内部正向引物的3′末端设计成与位于多态性基因座上游的DNA区域杂交并且与多态性基因座由少量碱基分开,其中该少量选自由以下项组成的组:1个、2个、3个、4个、5个、6个至10个、11个至15个、16个至20个、21个至25个、26个至30个、或31个至60个碱基对;任选地获得多个内部反向引物,其中每个引物靶向多态性基因座中的一个多态性基因座,并且其中内部反向引物的3′末端设计成与DNA区域杂交,该区域位于多态性基因座的上游并且与多态性基因座由少量碱基分开,其中该少量选自由以下项组成的组:1个、2个、3个、4个、5个、6个至10个、11个至15个、16个至20个、21个至25个、26个至30个、或31个至60个碱基对;将内部引物与DNA杂交;以及使用聚合酶链式反应扩增DNA以形成扩增子。
在一些实施例中,该方法还包括:获得多个外部正向引物,其中每个引物靶向多态性基因座中的一个多态性基因座,并且其中外部正向引物设计成与位于内部正向引物上游的DNA区域杂交;任选地获得多个外部反向引物,其中每个引物靶向多态性基因座中的一个多态性基因座,并且其中外部反向引物设计成与位于内部反向引物直接下游的DNA区域杂交;将第一引物与DNA杂交;以及使用聚合酶链式反应扩增DNA。
在一些实施例中,该方法还包括:获得多个外部反向引物,其中每个引物靶向多态性基因座中的一个多态性基因座,并且其中外部反向引物设计成与位于内部反向引物直接下游的DNA区域杂交;任选地获得多个外部正向引物,其中每个引物靶向多态性基因座中的一个多态性基因座,并且其中外部正向引物设计成与位于内部正向引物上游的DNA区域杂交;将第一引物与DNA杂交;以及使用聚合酶链式反应扩增DNA。
在一些实施例中,制备第一样品进一步包括将通用接头附加至第一样品中的DNA,以及使用聚合酶链式反应扩增第一样品中的DNA。在一些实施例中,被扩增的扩增子的至少一部分小于100bp、小于90bp、小于80bp、小于70bp、小于65bp、小于60bp、小于55bp、小于50bp、或小于45bp,并且其中分数为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%。
在一些实施例中,扩增DNA在一个或多个单独的反应体积中进行,并且其中每个单独的反应体积含有超过100个不同的正向和反向引物对、超过200个不同的正向和反向引物对、超过500个不同的正向和反向引物对、超过1,000个不同的正向和反向引物对、超过2,000个不同的正向和反向引物对、超过5,000个不同的正向和反向引物对、超过10,000个不同的正向和反向引物对、超过20,000个不同的正向和反向引物对、超过50,000个不同的正向和反向引物对、或超过100,000个不同的正向和反向引物对。
在一些实施例中,制备样品进一步包括将样品分成多个部分,并且其中每个部分中的DNA优选富集在多个多态性基因座的子集处。在一些实施例中,通过鉴定可能形成不期望的引物双链体的引物对并从多个引物中去除鉴定为可能形成不期望的引物双链体的引物对中的至少一个引物对来选择内部引物。在一些实施例中,内部引物含有设计成与靶向多态性基因座的上游或下游杂交的区域,并且任选地含有设计成允许PCR扩增的通用引发序列。在一些实施例中,至少一些引物还含有对于每个单独的引物分子而言不同的随机区域。在一些实施例中,至少一些引物还含有分子条形码。
在一些实施例中,该方法包括:(a)使用(i)至少1,000个不同的引物对、或(ii)单个反应体积中的至少1,000个靶特异性引物和通用或标签特异性引物对包含靶基因座的核酸样品进行多重聚合酶链反应(PCR)以同时扩增至少1,000个不同的靶基因座,从而产生包含靶扩增子的扩增产物;以及(b)对扩增产物进行测序。在一些实施例中,该方法不包括使用微阵列。
在一些实施例中,该方法包括:(a)使用(i)至少1,000个不同的引物对、或(ii)单个反应体积中的至少1,000个靶特异性引物和通用或标签特异性引物对包含靶基因座的游离DNA样品进行多重聚合酶链反应(PCR)以同时扩增至少1,000个不同的靶基因座,从而产生包含靶扩增子的扩增产物;以及b)对扩增产物进行测序。在一些实施例中,该方法不包括使用微阵列。
在一些实施例中,该方法还包括从移植供体和移植受体中的一者或两者获得基因型数据。在一些实施例中,从移植供体和移植受体中的一者或两者获得基因型数据包括从供体和受体制备DNA,其中该制备包括在多个多态性基因座处优选富集DNA以得到制备的DNA;任选地扩增制备的DNA;以及测量制备的样品中在多个多态性基因座处的DNA。
在一些实施例中,使用从移植供体和移植受体中的一者或两者获得的遗传数据来建立染色体上多个多态性基因座的预期等位基因计数概率的联合分布模型。在一些实施例中,第一样品已从移植受体血浆中分离,并且其中从移植受体获得基因型数据是通过根据对制备的样品进行的DNA测量估计受体基因型数据来完成的。
在一些实施例中,优选富集使得制备的样品与第一样品之间的等位基因偏倚的平均程度具有选自由以下项组成的组的因子:不超过2的因子、不超过1.5的因子、不超过1.2的因子、不超过1.1的因子、不超过1.05的因子、不超过1.02的因子、不超过1.01的因子、不超过1.005的因子、不超过1.002的因子、不超过1.001的因子和不超过1.0001的因子。在一些实施例中,多个多态性基因座是SNP。在一些实施例中,通过测序来测量制备的样品中的DNA。
在一些实施例中,公开了一种用于帮助确定移植受体的移植状态的诊断盒,其中该诊断盒能够执行所公开的方法的准备和测量步骤。
在一些实施例中,等位基因计数是概率性的而不是二进制的。在一些实施例中,在多个多态性基因座处对制备的样品中的DNA进行测量旨在确定移植物是否遗传了一种或多种连锁的单倍型。
在一些实施例中,通过使用关于染色体在染色体中的不同位置处交叉的概率的数据来建立等位基因计数概率的联合分布模型,以对染色体上的多态性等位基因之间的依赖性进行建模。在一些实施例中,建立等位基因计数的联合分布模型以及确定每个假设的相对概率的步骤是使用不需要使用参考染色体的方法来完成的。
在一些实施例中,确定每个假设的相对概率利用制备的样品中供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的估计分数。在一些实施例中,用于计算等位基因计数概率和确定每个假设的相对概率的来自制备的样品的DNA测量值包括初级遗传数据。在一些实施例中,使用最大似然估计或最大后验估计来执行以最大概率选择对应于假设的移植状态。
在一些实施例中,判定移植状态还包括将使用联合分布模型和等位基因计数概率确定的状态假设中的每个状态假设的相对概率与使用取自由以下项组成的组的统计技术计算的状态假设中的每个状态假设的相对概率组合:读取计数分析、比较杂合率、仅在使用供体遗传信息时可用的统计数据、某些供体/受体背景的标准化基因型信号的概率、使用第一样品或制备的样品的估计移植分数计算的统计数据以及它们的组合。
在一些实施例中,计算所判定的移植状态的置信估计。在一些实施例中,该方法还包括基于所判定的移植状态采取临床措施。
在一些实施例中,使用该方法生成显示所确定的移植状态的报告。在一些实施例中,公开了一种用于确定移植状态的试剂盒,该试剂盒设计成与本文所公开的方法一起使用,该试剂盒包括多个内部正向引物和任选地多个内部反向引物以及任选地附加的染色体,其中引物中的每个引物设计成与位于靶染色体上的多态性基因座中的一个多态性基因座直接上游和/或下游的DNA区域杂交,其中杂交区域与多态性基因座由少量碱基分开,其中该少量选自由以下项组成的组:1个、2个、3个、4个、5个、6个至10个、11个至15个、16个至20个、21个至25个、26个至30个、31个至60个以及它们的组合。
在一些实施例中,本文公开的方法包括选择较短cfDNA的选择步骤。
在一些实施例中,本文公开的方法包括富集cfDNA的通用应用步骤。
在一些实施例中,dd-cfDNA的量高于临界阈值的确定指示移植的急性排斥。机器学习可以用于解决排斥与非排斥的问题。
在一些实施例中,临界阈值表示为血液样品的dd-cfDNA的百分比(dd-cfDNA%)。
在一些实施例中,临界阈值表示为每体积单位血液样品中dd-cfDNA的量。
在一些实施例中,临界阈值表示为每体积单位血液样品中dd-cfDNA的量乘以移植受体的体重或血液体积。
在一些实施例中,临界阈值考虑了患者的体重或血液体积。
在一些实施例中,临界阈值考虑了以下一项或多项:供体基因组拷贝/血浆体积、游离DNA产率/血浆体积、供体身高、供体体重、供体年龄、供体性别、供体种族、供体器官质量、供体器官、存活供体与死亡供体、有亲属关系与无亲属关系的供体、受体身高、受体体重、受体年龄、受体性别、受体种族、肌酐、eGFR(估计的肾小球滤过率)、cfDNA甲基化、DSA(供体特异性抗体)、KDPI(肾脏供体特性指数)、药物(免疫抑制剂、类固醇、血液稀释剂等)、感染(BKV、EBV、CMV、UTI、TTV)、受体和/或供体HLA等位基因或表位错配、肾同种异体移植病理的Banff分类、以及原因与监测或方案活检。
在一些实施例中,根据所述血液样品中的总cfDNA的量来缩放所述临界阈值。
在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80%的灵敏度。
在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少70%的特异性。
在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80%的灵敏度。在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少85%的灵敏度。在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少90%的灵敏度。在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少95%的灵敏度。
在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少70%的特异性。在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少75%的特异性。在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少85%的特异性。在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少90%的特异性。在一些实施例中,当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放的临界阈值时,该方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少95%的特异性。
多重扩增
在一些实施例中,所述方法包括在确定选择性富集的DNA的序列之前进行多重扩增反应,以在一个反应混合物中扩增多个多态性基因座。
在某些说明性的实施例中,核酸序列数据是通过对使用多重扩增反应生成的一系列扩增子的多个拷贝进行高通量DNA测序生成的,其中所述系列扩增子的每个扩增子跨越了多态性基因座组中的至少一个多态性基因座,并且其中所述组的多态性基因座中的每个都被扩增。例如,在这些实施例中,可以进行多重PCR,以扩增跨越至少100个;200个;500个;1,000个;2,000个;5,000个;10,000个;20,000个;50,000个;或100,000个多态性基因座(例如,SNP基因座)的扩增子。此多重反应可以设置为单一反应,也可以设置为不同子集多重反应的池。本文提供的多重反应方法,如本文公开的大规模多重PCR提供了进行扩增反应的示例性过程,以帮助达到改进的多重化,从而达到灵敏度水平。
在一些实施例中,使用直接多重PCR、连续PCR、嵌套PCR、双重嵌套PCR、一侧和半侧嵌套PCR、完全嵌套PCR、一侧完全嵌套PCR、一侧嵌套PCR、半嵌套PCR、半嵌套PCR、三重半嵌套PCR、半嵌套PCR、单侧半嵌套PCR、反向半嵌套PCR方法或单侧PCR进行扩增,其在于2012年11月21日提交的美国申请第13/683,604号,美国公开第2013/0123120号,于2011年11月18日提交的美国申请第13/300,235号,美国公开第2012/0270212号和于2014年5月16日提交的美国序列号61/994,791中进行了描述,所有这些文献特此通过全文引用的方式并入。
在一些实施例中,使用了多重PCR。在一些实施例中,在核酸样品中扩增靶基因座的方法涉及(i)将核酸样品与同时与至少100个;200个;500个;1,000个;2,000个;5,000个;10,000个;20,000个;50,000个;或100,000个不同的靶基因座杂交的引物文库接触以产生单一反应混合物;以及(ii)使反应混合物经受引物延伸反应条件(如PCR条件)以产生包含靶扩增子的扩增产物。在一些实施例中,至少有50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的靶向基因座被扩增。在各种实施例中,少于60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%或0.05%的扩增产物是引物二聚体。在一些实施例中,引物位于溶液中(如溶解在液相中而不是固相中)。在一些实施例中,引物位于溶液中,并且没有固定在固相载体上。在一些实施例中,引物不是微阵列的一部分。
在某些实施例中,多重扩增反应至少有1/2的反应是在限制性引物条件下进行的。在一些实施例中,限制性引物浓度用于多重反应的1/10、1/5、1/4、1/3、1/2或全部反应。本文提供了在扩增反应(诸如PCR)中实现限制性引物条件时需要考虑的因素。
在某些实施例中,多重扩增反应可以包含例如介于2,500个与50,000个之间的多重反应。在某些实施例中,进行以下范围的多重反应:范围低端在100、200、250、500、1000、2500、5000、10,000、20,000、25000、50000之间,范围高端在200、250,500、1000、2500、5000、10,000、20,000、25000、50000和100,000之间。
在一个实施例中,多重PCR测定被设计用于扩增一条或多条染色体上的潜在杂合SNP或其它多态性或非多态性基因座,并且这些测定被用于单一反应来扩增DNA。PCR测定的数量可以在50个与200个PCR检测之间,200个与1,000个PCR测定之间、1,000个与5,000个PCR测定之间或5,000个与20,000个PCR测定之间(分别为50-plex至200-plex、200-plex至1,000-plex、1,000-plex至5,000-plex、5,000-plex至20,000-plex、大于20,000-plex)。在一个实施例中,至少10,000个PCR测定的多重化池(10,000-plex)被设计用于扩增潜在杂合SNP基因座的单一反应以扩增从血液、血浆、血清、固体组织或尿液样品中获得的cfDNA。每个基因座的SNP频率可以通过克隆或一些其它方法对扩增子进行测序来确定。在另一个实施例中,原始cfDNA样品被分为两个样品,并且进行平行5,000-plex测定。在另一个实施例中,原始cfDNA样品被分为n个样品,并且进行平行(约10,000/n)-plex测定,其中n为2与12之间、或12与24之间、或24与48之间或48与96之间。
在一个实施例中,本文公开的方法使用高效的高度多重化的靶向PCR扩增DNA,然后进行高通量测序以确定每个靶基因座处的等位基因频率。一种允许高度多重化的靶向PCR以高效方式进行的技术涉及设计不太可能相互杂交的引物。PCR探针,通常被称为引物,是通过创建至少100个、至少200个、至少500个、至少1,000个、至少2,000个、至少5,000个、至少10,000个、至少20,000个或至少50,000个潜在引物对或引物与样品DNA之间的意外相互作用的热力学模型来选择的,然后用该模型来消除与池中其他设计不相容的设计。另一种允许高度多重化的靶向PCR以高效方式进行的技术是对靶向PCR使用部分或完全嵌套的方法。使用这些方法中的一种或组合,允许在单个池中多重化至少100个、至少200个、至少500个、至少1,000个、至少2,000个、至少5,000个、至少10,000个、至少20,000个或至少50,000个引物,所得扩增的DNA包括在测序时将映射到靶向基因座的大部分DNA分子。使用这些方法中的一种或组合,允许在单个池中多重化大量引物,所得扩增的DNA包括大于50%、大于80%、大于90%、大于95%、大于98%或大于99%的DNA分子,所述DNA分子映射到靶向基因座。
使用生物信息学方法分析从多重PCR获得的遗传数据。对本文所公开的方法有用且相关的生物信息学方法可在美国专利公开第2018/0025109号中找到,所述美国专利公开通过引用并入本文。
高通量测序
在一些实施例中,扩增子的序列是通过进行高通量测序来确定的。
移植受体和/或移植供体的遗传数据可以通过使用来自以下组的工具和/或技术测量适当的遗传材料,从分子状态转换为电子状态,该组包含但不限于:基因分型微阵列和高通量测序。一些高通量测序方法包含Sanger DNA测序、焦磷酸测序、ILLUMINA SOLEXA平台、ILLUMINA的GENOME ANALYZER或APPLIED BIOSYSTEM的454测序平台、HELICOS的TRUESINGLE MOLECULE SEQUENCING平台、HALCYON MOLECULAR的电子显微镜测序方法,或任何其它测序方法。在一些实施例中,高通量测序是在Illumina上进行的,然后进行解复用并映射到人参考基因组上。所有这些方法都将储存在DNA样品中的遗传数据物理地转化为一组遗传数据,所述数据通常储存在存储器装置中,以便进行处理。
在一些实施例中,选择性富集的DNA的序列是通过进行微阵列分析确定的。在一个实施例中,微阵列可以是ILLUMINA SNP微阵列或AFFYMETRIX SNP微阵列。
在一些实施例中,通过进行定量PCR(qPCR)或数字液滴PCR(ddPCR)分析来确定选择性富集的DNA的序列。qPCR测量特定时间(一般在每个扩增循环后)的荧光强度以确定靶分子(DNA)的相对数量。ddPCR测量分子(靶DNA)的实际数量,因为每个分子在一个液滴中,从而使其成为离散的“数字”测量。其提供了绝对定量,因为ddPCR测量样品的阳性分数,也就是由于正确扩增而发出荧光的液滴数量。此阳性分数准确地表明了模板核酸的初始量。
示踪剂DNA以及其用途
用于估计样品中总cfDNA的量的示踪剂DNA描述于美国临时申请号63/031,879,该申请于2020年5月29日提交,名称为“供体源性游离DNA的改进的检测方法(ImprovedMethods for Detection of Donor Derived Cell-Free DNA)”,通过全文引用的方式并入本文。在一些实施例中,示踪剂DNA包括合成双链DNA分子。在一些实施例中,示踪剂DNA包括非人来源的DNA分子。
在一些实施例中,示踪剂DNA包括长度为约50bp至500bp、或约75bp至300bp、或约100bp至250bp、或约125bp至200bp、或约125bp、或约160bp、或约200bp或约500bp至1,000bp的DNA分子。
在一些实施例中,示踪剂DNA包括具有相同或基本相同长度的DNA分子,如具有约125bp、或约160bp或约200bp长度的DNA分子。在一些实施例中,示踪剂DNA包括具有不同长度的DNA分子,如具有约125bp长度的第一DNA分子,具有约160bp长度的第二DNA分子,以及具有约200bp长度的第三DNA分子。在一些实施例中,使用具有不同长度的DNA分子来确定所述样品中所述游离DNA的大小分布。
在一些实施例中,示踪剂DNA包括靶序列,其中该靶序列包括定位在能够与一对引物对结合的一对引物结合位点之间的条形码。在一些实施例中,至少有一部分示踪剂DNA是基于内源性人SNP基因座设计的,通过用条形码取代含有SNP基因座的内源性序列。在mmPCR靶富集步骤中,靶向SNP基因座的引物对也可以扩增含有条形码的示踪剂DNA部分。
在一些实施例中,条形码是任意条形码。在一些实施例中,所述条形码包括能够由相同引物对扩增的对应的内源性基因组序列的反向补体。
在一些实施例中,示踪剂DNA内的靶序列的一侧或两侧由内源性基因组序列侧接。在一些实施例中,示踪剂DNA内的靶序列的一侧或两侧由非内源性序列侧接。
在一些实施例中,示踪剂DNA包括多个靶序列。在一些实施例中,示踪剂DNA包括第一靶序列,所述第一靶序列包括定位在能够与第一对引物结合的第一对引物结合位点之间的第一条形码,以及定位在能够与第二对引物结合的第二对引物结合位点之间的第二条形码。在一些实施例中,第一和/或第二靶序列是基于一个或多个内源性人SNP基因座设计的,通过用条形码取代含有SNP基因座的内源性序列。在一些实施例中,第一和/或第二条形码是任意条形码。在一些实施例中,第一和/或第二条形码包括能够被第一或第二引物对扩增的对应的内源性基因组序列的反向补体。在一些实施例中,示踪剂DNA内的第一和/或第二靶序列的一侧或两侧由内源性基因组序列侧接。在一些实施例中,示踪剂DNA内的第一和/或第二靶序列的一侧或两侧由非内源性序列侧接。
在一些实施例中,示踪剂DNA包含具有相同或基本相同序列的DNA分子。在一些实施例中,示踪剂DNA包括具有不同序列的DNA分子。
在一些实施例中,示踪剂DNA包括第一DNA,所述第一DNA包括第一靶序列,以及第二DNA,所述第二DNA包括第二靶序列。在一些实施例中,第一靶序列和第二靶序列具有定位在相同引物结合位点之间的不同的条形码。在一些实施例中,第一靶序列和第二靶序列具有定位在相同引物结合位点之间的不同的条形码,其中所述不同的条形码具有相同或基本相同的长度。在一些实施例中,第一靶序列和第二靶序列具有定位在相同引物结合位点之间的不同的条形码,其中所述不同的条形码具有不同的长度。在一些实施例中,第一靶序列和第二靶序列是基于不同的内源性人SNP基因座设计的,并且因此包括不同的引物结合位点。在一些实施例中,第一DNA的量和第二DNA的量在示踪剂DNA中是相同的或基本相同。在一些实施例中,第一DNA的量和第二DNA的量在示踪剂DNA中是不同的。
使用示踪剂DNA确定总的游离DNA的量
在某些实施例中,示踪剂DNA可用于提高本文描述的方法的准确性和精确度,有助于更大的输入范围内进行定量,评估不同尺寸范围内不同步骤的效率,和/或计算输入材料的片段尺寸分布。
本发明的一些实施例涉及一种定量生物样品中总游离DNA的量的方法,所述方法包括:a)从所述生物样品中分离游离DNA,其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA;b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增;c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段;以及d)使用源自第一示踪剂DNA的测序读段来定量总游离DNA的量。
在一些实施例中,所述方法包括在血浆提取之前将所述第一示踪剂DNA添加到全血样品中。在一些实施例中,所述方法包括在血浆提取之后和分离所述游离DNA之前将所述第一示踪剂DNA添加到血浆样品中。在一些实施例中,所述方法包括将所述第一示踪剂DNA添加到包括所分离的游离DNA的组合物中。在一些实施例中,所述方法包括将衔接子与所分离的游离DNA连接以获得包括衔接子连接的DNA的组合物,并且将所述第一示踪剂DNA添加到包括衔接子连接的DNA的组合物中。
在一些实施例中,所述方法进一步包括在所述靶向扩增之前添加第二示踪剂DNA。在一些实施例中,所述方法进一步包括在所述靶向扩增之后添加第二示踪剂DNA。
在一些实施例中,使用示踪剂DNA的NOR(可通过条形码识别)、样品DNA的NOR和添加到血浆样品中的示踪剂DNA的已知量来估计样品中总cfDNA的量。在一些实施例中,使用示踪剂DNA的NOR与样品DNA的NOR之间的比率来定量总游离DNA的量。在一些实施例中,使用条形码的NOR与对应的内源性基因组序列的NOR之间的比率定量总游离DNA的量。在一些实施例中,此信息与血浆体积一起也可用于计算每体积血浆的cfDNA的量。在一些实施例中,这些可以乘以供体DNA的百分比来计算供体cfDNA总量和每体积血浆的供体cfDNA。
因此,另一方面,本发明涉及一种定量生物样品中总游离DNA的量的方法,该方法包括:a)从生物样品中分离游离DNA,其中在分离游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物;b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增;c)通过高通量测序对扩增产物进行测序以生成测序读段;以及d)使用源自第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量总游离DNA的量。
在另外的方面,本发明涉及一种定量移植受体的生物样品中供体源性游离DNA的量的方法,该方法包括:a)从移植受体的生物样品中分离游离DNA,其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA,其中在分离游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物;b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增;c)通过高通量测序对扩增产物进行测序以生成测序读段;以及d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量,其中使用源自第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量总游离DNA的量。
在另外的方面,本发明涉及一种确定移植排斥或移植物损伤发生或可能发生的方法,该方法包括:a)从移植受体的生物样品中分离游离DNA,其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA,其中在分离游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物;b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增;c)通过高通量测序对扩增产物进行测序以生成测序读段;d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量,其中使用源自第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量总游离DNA的量,以及通过将供体源性游离DNA的量与阈值进行比较,使用供体源性游离DNA的量来确定移植排斥或移植物损伤发生或可能发生,其中阈值根据总游离DNA的量确定。
在一些实施例中,所述阈值是所述供体源性游离DNA的测序读段的数量的函数。
在一些实施例中,所述方法进一步包括如果总游离DNA的量超出预定范围,则标记所述样品。在一些实施例中,所述方法进一步包括如果总游离DNA的量高于预定值,则标记所述样品。在一些实施例中,所述方法进一步包括如果总游离DNA的量低于预定值,则标记所述样品。
在一些实施例中,所述方法包括在血浆提取之前将所述第一示踪剂DNA组合物添加到全血样品中。在一些实施例中,所述方法包括在血浆提取之后和分离所述游离DNA之前将所述第一示踪剂DNA组合物添加到血浆样品中。在一些实施例中,所述方法包括将所述第一示踪剂DNA组合物添加到包括所分离的游离DNA的组合物中。在一些实施例中,所述方法包括将衔接子与所分离的游离DNA连接以获得包括衔接子连接的DNA的组合物,并且将所述第一示踪剂DNA组合物添加到包括衔接子连接的DNA的组合物中。
在一些实施例中,所述方法进一步包括在所述靶向扩增之前添加第二示踪剂DNA组合物。在一些实施例中,所述方法进一步包括在所述靶向扩增之后添加第二示踪剂DNA组合物。
在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括具有不同序列的多个DNA分子。
在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括具有不同浓度的多个DNA分子。
在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括具有不同长度的多个DNA分子。在一些实施例中,使用具有不同长度的多个DNA分子来确定所述样品中所述游离DNA的大小分布。
在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括非人来源的多个DNA分子。
在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物各自包括靶序列,其中所述靶序列包括定位在一对能够与其中一对引物对结合的引物结合位点之间的条形码。在一些实施例中,所述条形码包括能够由相同引物对扩增的对应的内源性基因组序列的反向补体。
在一些实施例中,使用所述示踪剂DNA的读段数量与样品DNA读段数量之间的比率来定量总游离DNA的量。在一些实施例中,使用所述条形码的读段数量与所述对应的内源性基因组序列的读段数量之间的比率定量总游离DNA的量。
在一些实施例中,所述靶序列的一侧或两侧由内源性基因组序列侧接。在一些实施例中,所述靶序列的一侧或两侧由非内源性序列侧接。
在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括合成双链DNA分子。在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为50bp至500bp的DNA分子。在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为75bp至300bp的DNA分子。在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为100bp至250bp的DNA分子。在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为125bp至200bp的DNA分子。在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为约200bp的DNA分子。在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为约160bp的DNA分子。在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为约125bp的DNA分子。在一些实施例中,所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为500bp至1,000bp的DNA分子。
在一些实施例中,所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少100个多态性或SNP基因座。在一些实施例中,所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少200个多态性或SNP基因座。在一些实施例中,所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少500个多态性或SNP基因座。在一些实施例中,所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少1,000个多态性或SNP基因座。在一些实施例中,所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少2,000个多态性或SNP基因座。在一些实施例中,所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少5,000个多态性或SNP基因座。在一些实施例中,所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少10,000个多态性或SNP基因座。
在一些实施例中,每个引物对被设计成扩增约35bp至200bp的靶序列。在一些实施例中,每个引物对被设计成扩增约50bp至100bp的靶序列。在一些实施例中,每个引物对被设计成扩增约60bp至75bp的靶序列。在一些实施例中,每个引物对被设计成扩增约65bp的靶序列。
在一些实施例中,所述移植受体是人受试者。在一些实施例中,所述移植是人移植。在一些实施例中,所述移植是猪移植。在一些实施例中,所述移植来自非人动物。
在一些实施例中,所述移植是器官移植、组织移植或细胞移植。在一些实施例中,所述移植是肾移植、肝移植、胰腺移植、肠移植、心脏移植、肺移植、心脏/肺移植、胃移植、睾丸移植、阴茎移植、卵巢移植、子宫移植、胸腺移植、面部移植、手移植、腿移植、骨移植、骨髓移植、角膜移植、皮肤移植、胰岛细胞移植、心脏瓣膜移植、血管移植或输血。
在一些实施例中,所述方法进一步包括将所述移植排斥确定为抗体介导的移植排斥、T细胞介导的移植排斥、移植损伤、病毒感染、细菌感染或边界排斥(borderlinerejection)。在一些实施例中,所述方法进一步包括确定一种或多种癌症的可能性。癌症筛查、检测和监测在PCT专利公开第WO2015/164432号、第WO2017/181202号、第WO2018/083467号和第WO2019/200228号中公开,所述专利公开每个通过全文引用的方式并入本文。在其它实施例中,本发明涉及筛查患者以确定其对一种或多种癌症治疗的预期应答性或抵抗力。可以通过确定靶基因的野生型与突变形式的存在,或者在一些情况下,靶基因的增加或过度表达来进行此确定。此类靶筛查的实例包含KRAS、NRAS、EGFR、ALK、KIT等。例如,多种KRAS突变适合根据本发明进行筛查,包含但不限于G12C、G12D、G12V、G13C、G13D、A18D、Q61H、K117N。另外,PCT专利公开第WO2015/164432号、第WO2017/181202号、第WO2018/083467号和第WO2019/200228号通过全文引用的方式并入本文。
在一些实施例中,在不预先了解供体基因型的情况下进行所述方法。在一些实施例中,在不预先了解受体基因型的情况下进行所述方法。在一些实施例中,在不预先了解供体和/或受体基因型的情况下进行所述方法。在一些实施例中,在进行所述方法之前,不需要所述供体或所述受体的基因分型。
在一些实施例中,所述生物样品是血液样品。在一些实施例中,所述生物样品是血浆样品。在一些实施例中,所述生物样品是血清样品。在一些实施例中,所述生物样品是尿液样品。在一些实施例中,所述生物样品是淋巴液的样品。在一些实施例中,所述样品是固体组织样品。
在一些实施例中,所述方法进一步包括从所述移植受体纵向收集多个生物样品,并对收集的每个样品重复步骤(a)至(d)。
在一些实施例中,所述定量步骤包括确定所述血液样品中供体源性游离DNA占供体源性游离DNA和受体源性游离DNA总量的百分比。在一些实施例中,定量步骤包括确定供体源性游离DNA的量。在一些实施例中,定量步骤包括确定每体积单位血液样品中供体源性游离DNA的量。
另一方面,本发明涉及一种诊断移植受体内的移植发生急性排斥的方法,所述方法包括:a)从移植受体的生物样品中分离游离DNA,其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA,其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物;b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增;c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段;d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量,其中供体源性游离DNA的量高于阈值表示所述移植正在发生急性排斥,其中所述阈值根据总游离DNA的量确定,并且其中使用源自所述第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量总游离DNA的量。
另一方面,本发明涉及一种监测移植受体的免疫抑制疗法的方法,所述方法包括:a)从移植受体的生物样品中分离游离DNA,其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA,其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物;b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座进行靶向扩增;c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段;d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量,其中供体源性游离DNA的水平在一段时间间隔内的变化表示移植状态,其中供体源性游离DNA的水平根据总游离DNA的量缩放,并且其中使用源自所述第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量总游离DNA的量。
在一些实施例中,所述方法进一步包括基于时间间隔内的dd-cfDNA水平调节免疫抑制疗法。
在一些实施例中,dd-cfDNA水平的增加表明移植排斥或移植物损伤和需要调节免疫抑制疗法。在一些实施例中,dd-cfDNA水平没有变化或降低表示移植耐受性或稳定性,并且需要调节免疫抑制疗法。
在一些实施例中,所述方法进一步包括大小选择以富集供体源性游离DNA并减少从破裂的白细胞中安置的受体源性游离DNA的量。
在一些实施例中,该方法进一步包括通用扩增步骤,该通用扩增步骤优选地扩增供体源性游离DNA,而不是源于溶解或受损的白细胞的受体源性游离DNA。
在一些实施例中,所述方法包括在移植后从所述移植受体纵向收集多个血液、血浆、血清、固体组织或尿液样品,并且对收集的每个样品重复步骤(a)至(d)。在一些实施例中,该方法包括在约三个月、或约六个月、或约十二个月、或约十八个月、或约二十四个月等的时间段内收集和分析来自移植受体的血液、血浆、血清、实体组织或尿液样品。在一些实施例中,该方法包括以约一周、或约两周、或约三周、或约一个月、或约两个月、或约三个月等的间隔从移植受体收集血液、血浆、血清、实体组织或尿液样品。
在一些实施例中,dd-cfDNA的量高于临界阈值的确定指示移植的急性排斥。机器学习可以用于解决排斥与非排斥的问题。机器学习在于2019年7月16日作为PCT/US2019/041981提交的名称为“使用神经网络判定多倍体状态的方法和系统(Methods and Systemsfor calling Ploidy States using a Neural Network)”的WO2020/018522中公开,所述文献通过全文引用的方式并入本文。在一些实施例中,根据所述血液样品中的总cfDNA的量来缩放所述临界阈值。
在一些实施例中,临界阈值表示为血液样品中dd-cfDNA的百分比(dd-cfDNA%)。在一些实施例中,所述临界阈值表示为dd-cfDNA的量或绝对量。在一些实施例中,所述临界阈值表示为每体积单位所述血液样品中dd-cfDNA的量或绝对量。在一些实施例中,所述临界阈值表示为每体积单位所述血液样品中dd-cfDNA的量或绝对量乘以所述移植受体的体重、BMI或血液体积。
在一些实施例中,临界阈值考虑了患者的体重、BMI或血液体积。在一些实施例中,所述临界阈值考虑了以下一项或多项:供体基因组拷贝/血浆体积、游离DNA产率/血浆体积、供体身高、供体体重、供体年龄、供体性别、供体种族、供体器官质量,供体器官、存活供体与死亡供体,供体与受体的家族关系(或缺乏),受体身高、受者体重、受者年龄、受者性别、受者种族、肌酐、eGFR(估计的肾小球滤过率)、cfDNA甲基化、DSA(供体特异性抗体)、KDPI(肾脏供体特性指数)、药物(免疫抑制剂、类固醇、血液稀释剂等)、感染(BKV、EBV、CMV、UTI)、受体和/或供体HLA等位基因或表位错配,肾同种异体移植病理的Banff分类,以及原因与监测或方案活检。
在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少50%的灵敏度。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少60%的灵敏度。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少70%的灵敏度。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80%的灵敏度。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少85%的灵敏度。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少90%的灵敏度。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少95%的灵敏度。
在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少50%的特异性。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少60%的特异性。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少70%的特异性。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少75%的特异性。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80%的特异性。在一些实施例中,当所述dd—cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少85%的特异性。在一些实施例中,当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少90%的特异性。在一些实施例中,当所述dd—cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95%的置信区间缩放或调整的所述临界阈值时,所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少95%的特异性。
使用总游离DNA的量调节判定移植排斥或移植物损伤的阈值
本发明的一些实施例涉及一种定量移植受体的生物样品中供体源性游离DNA的量的方法,所述方法包括:a)从所述移植受体的生物样品中分离游离DNA,其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA,其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物;b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增;c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段;以及d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量,其中使用源自所述第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量所述总游离DNA的量。
一些实施例使用每个血浆体积的供体DNA的固定阈值或不固定的阈值,如本文所述的调节或缩放。确定该阈值的方式可以基于使用训练数据集来建立算法,以最大化性能。其也可以考虑其它数据,如患者的体重、年龄或其它临床因素。
在一些实施例中,该方法进一步包括使用供体源性游离DNA的量确定移植排斥或移植物损伤发生或可能发生。在一些实施例中,将供体源性游离DNA的量与临界阈值进行比较以确定移植排斥或移植物损伤发生或可能发生,其中该临界阈值根据总游离DNA的量进行调节或缩放。在一些实施例中,临界阈值是供体源性游离DNA的读段数量的函数。
在一些实施例中,该方法包括应用考虑到样品中总cfDNA的量的缩放或动态阈值指标,以更准确地评估移植排斥或移植物损伤。在一些实施例中,所述方法进一步包括如果总游离DNA的量高于预定值,则标记所述样品。在一些实施例中,所述方法进一步包括如果总游离DNA的量低于预定值,则标记所述样品。
工作实例
实例1
该非限制性实例的工作流程对应于Sigdel等人,《临床医学杂志》(J.Clin.杂志》8(1):19(2019)中公开的工作流程,所述文献通过全文引用的方式并入本文。此实例只是说明性的,并且熟练的技术人员将理解,本文公开的发明可以用各种其它方式实施。
血液样品
男性和女性成人或年轻成人患者接受来自有亲属关系或无亲属关系的活体供体或无亲属关系的已故供体的肾脏。移植外科手术后患者抽血的时间点是在同种异体移植活检时或基于实验室方案的各种预先指定的时间间隔。通常,样品是活检匹配的,并且在临床功能障碍和活检时或在方案活检时抽血(此时大多数患者没有临床功能障碍)。另外,一些患者在移植后连续抽血。研究样品的选择是基于(a)有足够的血浆可用,和(b)样品是否与活检信息相关联。在全部300个样品队列中,72.3%是在活检当天抽取的。
血液样品中的dd-cfDNA测量
使用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从血浆样品中提取游离DNA,并且在LabChip NGS 5k试剂盒(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA))上按照制造商的说明进行定量。使用Natera Library Prep试剂盒将游离DNA引入文库制备中,如Abbosh等人,《自然》(Nature)545:446-451(2017)中所述,并对文库扩增的18个周期进行修饰以稳定文库。使用LabChip NGS 5k对纯化的文库进行定量,如Abbosh等人,《自然》(Nature)545:446-451(2017)中所述。靶标富集是使用大规模多重PCR(mmPCR)完成的,该mmPCR使用Zimmermann等人,《产前诊断(Prenat.Diagn.)》32:1233-1241(2012)中描述的修改版本,其中靶向13,392个单核苷酸多态性(SNP)。然后,在IlluminaHiSeq 2500 Rapid上对扩增子进行测序,50个循环单端,每个样品有1000万至1100万个读段。
dd-cfDNA和eGFR的统计分析
在每个样品中,dd-cfDNA被测量并与排斥状态相关联,并且结果与eGFR进行比较。在适用的情况下,所有的统计测试都是双侧的。显著性设定为p<0.05。由于患者的dd-cfDNA在各组中的分布严重偏斜,因此使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)秩和检验,然后进行邓恩(Dunn)多重比较检验与霍尔姆(Holm)校正分析数据。eGFR(血清肌酐,单位为mg/dL)的计算方法如前所述,用于成人和儿童患者。简而言之,eGFR=186×血清肌酐-1.154×年龄-0.203×(如果是黑人为1.210)×(如果是女性为0.742)。
为了评估dd-cfDNA和eGFR(mL/min/1.73m2)作为排斥标志物的性能,将样品分为AR组和非排斥组(BL+STA+OI)。使用此分类,以下预定的临界被用来将样品归类为AR:对于dd-cfDNA,>1%,并且对于eGFR,<60.0。
为了计算每个标志物的性能参数(灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和曲线下面积(AUC)),采用了自举法来计算患者体内的重复测量。简而言之,在每个自举步骤中,从每位患者中选择单个样品;通过假设患者之间的独立性,计算性能参数以及其标准误差。这样重复10,000次;最终置信区间是用参数的自举平均数和自举标准误差的平均值来计算的,并且具有标准正态分位数。灵敏度和特异性的标准误差是在假设二项分布的情况下计算的;对于PPV和NPV,使用正态近似值;对于AUC,使用德龙(DeLong)方法。对具有匹配活检的所有样品进行了性能计算,包含由与方案活检同时抽取的样品组成的子队列。
还评估了供体类型(活体有亲属关系、活体无亲属关系和已故无亲属关系)的dd-cfDNA水平的差异。如上所述,使用克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验来确定显著性。使用混合效应模型对dd-cfDNA进行对数转换,评估dd-cfDNA随时间变化的之间和内部变量;使用似然曲线法计算患者内部和患者之间标准偏差的95%置信区间(CI)。
事后分析评估了(a)不同的dd-cfDNA阈值以最大化NPV和(b)结合dd-cfDNA和eGFR来定义可能提高AR诊断的PPV的经验排斥区。所有分析都是使用R 3.3.2进行的,使用FSA(用于邓恩检验)、1me4(用于混合效应建模)和pROC(用于AUC计算)包。
活检样品
任选地,病理学家以盲检方式分析肾活检,并根据2017Banff主动排斥分类(AR)进行分级;进行移植内C4d染色以评估急性体液排斥。在活性尿路感染(UTI)或其它感染的情况下,不进行活检。移植“损伤”被定义为血清肌酐较之前的稳态基线值增加>20%,并且相关联的活检被归类为主动排斥(AR)、边界排斥(BL)或其它损伤(OI)(例如,药物毒性、病毒感染)。主动排斥至少由以下标准定义:(1)T细胞介导的排斥(TCMR),由以下组成:小管炎(t)评分>2,伴有间质炎症(i)评分>2或血管变化(v)评分>0;(2)C4d阳性抗体介导的排斥(ABMR),由以下组成:供体特异性抗体(DSA)阳性,肾小球炎(g)评分>0/或管周毛细血管炎(ptc)评分>0或v>0,伴有不明原因的急性肾小管坏死/血栓性微血管病(ATN/TMA),C4d=2;或(3)C4d阴性ABMR,由以下组成:DSA阳性,有不明原因的ATN/TMA,g+ptc≥2,C4d为0或1。临界变化(BL)由t1+i0,或t1+i1,或t2+i0定义,没有明确原因(例如,多瘤病毒相关的肾病(PVAN)/感染性原因/ATN)。用于BL变化的其它标准是g>0和/或ptc>0,或v>0而无DSA,或C4d或DSA阳性,或C4d阳性而没有非零g或ptc评分。正常(STA)同种异体移植的定义是没有Banff模式所定义的明显损伤病理。
实例2
此实例只是说明性的,并且熟练的技术人员将理解,本文公开的发明可以用各种其它方式实施。在提取游离DNA之前,通过向血浆样品中添加一种或多种各自含有SNP基因座的示踪剂DNA对实例1中描述的工作流程进行了修改,如美国临时申请号63/031,879,该申请于2020年5月29日提交,名称为“供体源性游离DNA的改进的检测方法(ImprovedMethods for Detection of Donor Derived Cell-Free DNA)”,通过全文引用的方式并入本文。在mmPCR靶富集步骤期间,靶向SNP基因座的引物对也会扩增示踪剂DNA。使用示踪剂DNA的序列读段(可通过条形码识别)数量、样品DNA的序列读段数量以及添加到血浆样品中的示踪剂DNA的已知量来估计样品中总cfDNA的量。
实例3
此实例只是说明性的,并且熟练的技术人员将理解,本文公开的发明可以用各种其它方式实施。实例1中描述的工作流程用于处理和分析来自同时胰腺-肾移植(SPK)受体和连续胰腺肾移植(PAK)受体的血浆样品。识别1%dd-cfDNA或1.5%dd-cfDNA的临界阈值成功地从具有稳定移植物的移植受体中识别出具有急性排斥的SPK移植受体。
实例4
此实例只是说明性的,并且熟练的技术人员将理解,本文公开的发明可以用各种其它方式实施。
同种异体移植排斥的早期检测对于移植受体的成功管理至关重要。组织活检一直是诊断主动排斥(AR)的“金标准”,但具有侵入性且重复性差。传统的非侵入性生物标志物(例如血清肌酐的变化)可用于检测AR,但由于灵敏度和特异性较低而受到限制。因此,需要新的具有高精度的非侵入性标记物来检测AR。
供体源性游离DNA片段(dd-cfDNA(%))是一种有前途的非侵入性生物标志物,用于检测同种异体移植排斥。然而,高水平的循环cfDNA可能会人为地抑制dd-cfDNA(%),这种情况可能发生在肥胖、近期接受过手术、出现医疗并发症或接受过某些药物治疗的患者中。这可能会导致假阴性结果。
最近,两项研究提供了初步证据,表明dd-cfDNA的绝对量可能比dd-cfDNA(%)表现出更好的AR检测性能。在这里,我们展示了采用新的双阈值算法的检测结果,该算法结合了dd-cfDNA(%)和dd-cfDNA的绝对量(拷贝数/mL)两者,其目的是提高测试灵敏度,特别是通过在cfDNA水平高的情况下改进检测。
该研究包括41名接受同种异体移植管理的患者,他们接受dd-cfDNA检测作为常规临床护理的一部分。年龄在18岁以下、怀孕、在入组后2周内接受过除肾脏以外的器官移植或输血的患者被排除在外。
实验室测试通过使用大规模多重PCR(mmPCR)扩增cfDNA进行,靶向超过13,000个单核苷酸多态性。dd-cfDNA分数根据Altug等人,《移植》(Transplantation),103:2657—2665(2019)进行测量;校准dd-cfDNA的绝对浓度以给出dd-cfDNA的量(cp/mL)。新的双阈值算法结合了先前验证的dd—cfDNA分数截止值(≥1%表示有排斥风险)和先前建立的≥78cp/mL的dd-cfDNA截止值。超过任一阈值的样品被视为AR风险较高。
16名患者可获得匹配的活检结果(针对dd-cfDNA检测4周内发生的病因活检);14/16发生在dd-cfDNA测试后2周内。病理学家根据标准做法使用Banff2017分类对活检样品进行分析和分级。根据临床评估(根据血清肌酐和其他临床指标稳定),未经活检的样品被归类为没有主动排斥。16例活检中有9例(56%)发现AR,其中5例被归类为T细胞介导的排斥(TCMR),1例被归类为抗体介导的排斥(ABMR),3例被归类为混合型(ABMR/TCMR)。
我们针对样本中的41名患者计算了每种算法的灵敏度和特异性。原始方法基于≥1%dd-cfDNA的截止值,灵敏度为7/9(77.8%;95%CI:40.0%至97.2%),特异性为29/32(90.6%,95%CI:75.0%至98.0%)。将双阈值算法应用于数据集,得到的灵敏度为9/9(100%,95%CI:66.4%至100%),特异性为28/32(87.5%;95%CI:71.0%至96.5%)。
我们的结果表明,使用dd-cfDNA量和dd-cfDNA分数来评估同种异体移植的排斥状态可以比仅使用dd-cfDNA分数提高性能。与预期一致,随着新阈值的引入,判定结果发生变化的三名患者的总cfDNA水平较高,因此供体分数降低,其中两例在仅使用1%供体分数截止值时出现假阴性结果。
总之,本研究表明,dd-cfDNA量阈值与先前验证的dd-cfDNA(%)阈值相结合,可以提高同种异体肾移植患者的AR检测灵敏度,同时保持高特异性。
实例5
此实例只是说明性的,并且熟练的技术人员将理解,本文公开的发明可以用各种其它方式实施。
背景:供体源性游离DNA(dd—cfDNA)分数和量均已被证明与同种异体移植排斥有关。本研究检查了这些变量中的每个变量对两者组合的相对预测能力,开发了一种结合这两个变量的算法来检测肾同种异体移植活检中的主动排斥。
方法:纳入了采用微阵列衍生基因表达和dd—cfDNA结果收集的首批426个连续适应症活检样品。在排除以模拟预期临床用途后,对367个样品进行了分析。使用分子显微镜诊断系统(MMDx)和组织学对活检进行评估(Banff2019)。逻辑回归分析检查了将dd—cfDNA分数和量结合起来是否可以增加单独任一者的预测价值。前149个连续样品用于开发双阈值算法,接下来的218个样品用于验证该算法。
结果:在回归中,发现dd-cfDNA分数和量的组合比单独任一变量更具预测性(p值为0.009和<0.0001)。在测试集中,双变量系统的AUC为0.88,双阈值算法的性能显示,分子诊断的灵敏度为83.1%,特异性为81.0%,组织学诊断的灵敏度为73.5%,特异性为80.8%。
结论:这项针对肾移植患者的前瞻性、活检匹配、多中心dd-cfDNA研究发现,dd—cfDNA分数和量的组合比单独使用dd—cfDNA分数或量更有效,并验证了一种新型的结合两个变量的双阈值算法。
实例6
此实例只是说明性的,并且熟练的技术人员将理解,本文公开的发明可以用各种其它方式实施。
背景:胰腺-肾同时移植(SPKTx)中的胰腺移植物状态目前通过非特异性生化标记物(通常为淀粉酶和/或脂肪酶)进行评估。识别出一种在检测早期胰腺移植排斥中具有良好灵敏度的非侵入性生物标志物可以改善SPKTx的管理。
方法:在这里,我们开展了一项试点研究,以探讨供体源性游离DNA(dd-cfDNA)在预测一组SPKTx受体中经活检证实的胰腺移植物急性排斥中的表现。我们使用ProsperaTM测试(Natera,Inc.)测量36名SPKTx受体的dd-cfDNA,这些受体至少有一个活检匹配的血浆样品。Dd-cfDNA以总cfDNA的分数(分数;%)和受体血浆中的浓度(量;拷贝数/mL)两者的形式报告。
结果:在没有胰腺活检证实的急性排斥(P-BPAR)的情况下,SPKTx后前45天内收集的样品中dd-cfDNA显著高于之后测量的样品(中位数(%):1.00 vs 0.30,中位数(cp/mL)分别为128.2 vs 53.3,p=0.001)。在第45天之后获得的样品中,P—BPAR样品的dd—cfDNA分数(0.83%vs 0.30%,p=0.006)和量(81.3cp/mL vs 53.3cp/mL;p=0.001)显著高于稳定样品。将dd-cfDNA量与dd-cfDNA分数相结合在检测主动排斥方面优于单独的dd-cfDNA分数。值得注意的是,当针对P-BPAR诊断使用70cp/mL的量截止值时,dd-cfDNA检测P-BPAR的灵敏度为85.7%,特异性为93.7%,比现有的生物标志物更准确(dd-cfDNA的AUC为0.89,而脂肪酶为0.74,淀粉酶为0.46)。
结论:通过简单的无创血液检测进行的Dd-cfDNA测量可以纳入临床实践,以帮助为SPKTx患者的移植管理提供信息。
实例7
此实例只是说明性的,并且熟练的技术人员将理解,本文公开的发明可以用各种其它方式实施。
胰腺-肾同时移植(SPKTx)被认为是1型糖尿病(T1D)和终末期肾病(ESRD)患者的最佳治疗选择。糖尿病肾病是由持续高血糖引起的微血管并发症,是ESRD的主要原因之一。SPKTx可以显著改善胰岛素依赖型糖尿病患者的预后和健康状况,因为它可以重新建立血糖正常状态,从而降低微血管和大血管并发症的预测风险。
胰腺移植物排斥是移植物失效的主要原因,其中前12个月内急性排斥发生率高达21%。目前评估移植物排斥的工具依赖于评估移植物的外分泌(例如淀粉酶、脂肪酶)或内分泌(例如血糖、HbA1C、C肽)功能的临床实验室测试。值得注意的是,这些测试非常不具有特异性,因为大多数患者保留了天然胰腺的外分泌功能,因此这些参数中的任何参数的升高都可能与胰腺移植排斥无关。胰腺移植物活检是诊断急性排斥的金标准。然而,活检是一种侵入性手术,并发症发生率很高,并且尽管存在移植物功能障碍,但通常无法进行或无法提供重要信息(高达39%的时间)。因此,显然需要一种非侵入性、供体特异性、动态生物标志物来评估同种异体移植状态并监测损伤/排斥,从而最终改善SPKTx移植受体的管理。
多项研究表明,测量实体器官(肺、肾、心脏、肝)移植受体的血液中的供体源性游离DNA(dd-cfDNA)可以区分同种异体移植排斥和非排斥,的风险。评估dd-cfDNA在评估SPKTx移植受体排斥风险方面的潜力的研究有限。在这项试点研究中,我们评估了ProsperaTM测试的性能,该测试使用基于SNP的mmPCR方法来测量dd-cfDNA的分数和量,以评估36名SPK移植受体的排斥风险,这些受体对移植物状态进行了组织学分析。
材料与方法
研究设计和患者群体。分析中包括胰腺活检配对血浆样品(n=41)。为了考虑供体相关并发症和术后即刻并发症对dd-cfDNA定量的可能影响,我们分别考虑了SPK移植后45天之前和之后收集的样品。在总共41例移植物活检中,18例是在移植后≤45天收集的,23例是在移植后>45天收集的。
患者样品。胰腺移植物活检是按照方案或因故进行的。根据中心方案,如果患者的胰酶(淀粉酶和/或脂肪酶)持续升高(≥2次测定,间隔>48小时)(≥2倍正常值),则需要进行活检。通过超声引导经皮针刺获得样品并根据2011Banff标准进行分类。出于分析目的,活检被进一步重新归类为“无排斥”或排斥,后者包括Banff类别:不确定、T细胞介导的排斥(TCMR)和抗体介导的排斥(ABMR)。在进行胰腺移植物活检当天,在进行活检之前获取全血和血清样品,以避免对dd-cfDNA的误导性解释。全血样品用于测量dd-cfDNA水平,而血清样品用于测量淀粉酶(U/1)、脂肪酶(U/1)、肌酐(mg/dL)和抗谷氨酸脱羧酶抗体(GAD)。此外,使用Lifecodes LifeScreen Deluxe流珠测定(Immucor,斯坦福德,康涅狄格州,美国)对血清样品进行HLAI类和II类供体特异性抗体(DSA)筛查。使用Lifecodes Single Antigen原珠测定(Immucor,斯坦福德,康涅狄格州,美国)确定HLA抗体筛查呈阳性的患者的抗体特异性。根据加泰罗尼亚组织相容性实验室的方案,平均荧光强度(MFI)大于1500的DSA被视为阳性。在所有患者中,针对DSA考虑A/B/DRB1 HLA基因座,而DQB1/DP1/C HLA基因座仅在可用的情况下才针对DSA予以考虑。
使用ProsperaTM测试评估dd-cfDNA水平。将全血抽入PAXgene血液ccfDNADNA管(),并按照制造商的说明通过全血双重离心获得血浆样品。然后将血浆储存在-80C下直至样品处理。使用大规模多重PCR(mmPCR)扩增血浆样品中的cfDNA,靶向13,926个SNP,然后按照Altug等人,《移植》(Transplantation),103:2657-2665(2019)中所述对扩增子进行测序(ProsperaTM,Natera Inc.,Austin,TX)。样品根据标准CLIA方案运行,血浆<4mL的样品除外,该样品需要9个额外的PCR循环。Dd-cfDNA水平报告为总cfDNA的一部分(%;中位数[IQR])和受体血浆中的浓度(拷贝数/mL;中位数[IQR])。
统计分析。使用Mann-Whitney U检验进行中值测量的比较,P值<0.05被认为具有统计学意义。需要时,使用Benjamini-Hochberg(BH)调整对多重测试的P值进行调整。构建ROC曲线,并计算各种阈值的灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。使用SciPy包和statsmodels包(Python Software Foundation,版本,(https:// www.python.org/psf/))以Python编程语言进行统计分析。连续变量的图形表示显示为中位数和四分位数范围[IQR]。
Dd-cfDNA和胰腺移植物排斥。经活检证实胰腺移植物急性排斥患者的中位数dd-cfDNA分数(P-BPAR;1.05%[0.81-1.67])显著高于非排斥患者(0.52%[IQR:0.21-0.78]),p=0.0004)。同样,与非排斥患者(51.5cp/mL[IQR:22.2-76.7];p=0.0007)相比,P-BPAR患者的中位数绝对dd-cfDNA量显著较高(103.70cp/mL[IQR:76.70-189.80])。这些数据表明,dd-cfDNA分数和量都可以区分SPKTx受体的胰腺移植物排斥和非排斥状态。
为了探索供体和手术相关器官损伤的潜在混杂因素,我们比较了移植后45天前后的dd-cfDNA水平。在无排斥的患者中,与第45天后进行活检的患者相比,术后早期的dd-cfDNA分数和dd-cfDNA绝对量显著更高(中位数分别为1.00%与0.30%,D=0.001;中位数cp/mL分别为128.2与35.3,p=0.001)。在SPKTx后的前45天内,非排斥样品和BPAR样品之间的dd-cfDNA水平没有统计学差异,无论是作为dd-cfDNA分数(p=0.120)还是作为dd-cfDNA量(p=0.290)。相比之下,在移植后45天以上收集的活检匹配血液样品中,与非排斥队列相比(分别为0.30%[IQR 0.14-0.52],p=0.006和35.3cp/mL[IQR 19.5-55.0],p=0.001),BPAR队列中的dd-cfDNA分数和dd-cfDNA量均显著较高(0.83%[IQR 0.67-1.58];81.3cp/mL[IQR 73.4-152.0])。当从急性排斥组中排除不确定的活检时,与非排斥病例相比,dd-cfDNA水平仍然显著升高(排斥组为0.81%[0.52-0.83],非排斥病例为0.30%[0.14-0.52],p=0.031)。这些数据表明,dd-cfDNA分数和量可以区分移植后45天后的移植物排斥和非排斥状态。
我们接下来的目标是确定dd-cfDNA的最佳截止值,以准确区分胰腺移植物排斥和非排斥。我们通过应用a)1%dd-cfDNA的截止值和b)结合dd-cfDNA分数截止值(≥1%)和≥78cp/mL的dd-cfDNA量截止值的双阈值算法,评估了最近发表的两个阈值在检测肾同种异体移植排斥中的能力。单独使用dd-cfDNA分数的灵敏度为28.6%(2/7)。当使用结合dd-cfDNA分数和dd-cfDNA量的双阈值算法时,灵敏度要高得多,为57.1%(4/7)。两个截止值的特异性都非常好,分别为100%和93.7%。当使用70cp/mL的dd-cfDNA量截止值时,灵敏度增加至85.7%(6/7),同时保持93.7%的高特异性,PPV为85.7%,NPV为93.7%。
Dd-cfDNA和DSA。尽管移植后45天以上收集的活检中只有一份具有抗体介导的排斥(ABMR),但发现三名患者有循环DSA。我们发现DSA测试呈阳性的样品(0.83%(0.82-2.5))与测试呈阴性的样品(0.39%[0.18-0.55];p=0.022)相比,dd-cfDNA分数显著升高。同样,我们发现DSA测试呈阳性的样品(94.2cp/mL[84.7-264.1])与测试呈阴性的样品(48.1cp/mL[21.0-63.0];p=0.024)相比,dd-cfDNA量显著升高。
Dd-cfDNA性能与其他生物标志物的比较。接下来,我们试图将dd-cfDNA的性能与用于评估移植物监测的传统临床测试进行比较。我们测量了与胰腺活检同时抽取的血液样品中的淀粉酶和脂肪酶水平。尽管排斥组和非排斥组之间的淀粉酶水平没有显著变化(p=0.40),但与非排斥组相比,排斥组中的脂肪酶显著较高(p=0.038)。我们根据移植后45天以上的胰腺移植物活检的组织病理学结果,比较了淀粉酶、脂肪酶和dd-cfDNA(分数和量)在区分移植物排斥和非排斥方面的诊断能力。这些生物标志物在区分胰腺移植物排斥和非排斥时的计算AUC如下:(dd-cfDNA量:0.89);(dd-cfDNA分数:0.84);(脂肪酶:0.74);(淀粉酶:0.46)。这些数据表明,dd-cfDNA优于传统上用于区分SPKTx受体胰腺排斥和非排斥的标记物测定。值得注意的是,尝试同时结合dd-cfDNA和脂肪酶并没有增强dd-cfDNA的性能。
讨论:这项试点研究首次探索了dd-cfDNA在诊断SPKTx受体胰腺移植物排斥中的性能。我们发现,在稳定的患者中,与第45天后相比,移植后前45天的dd-cfDNA水平升高。在此早期(<45天),dd-cfDNA无法区分P-BPAR和非排斥。相关的是,在移植后45天以上进行的活检中,dd-cfDNA量可以区分具有P-BPAR的患者和没有急性排斥的患者,其灵敏度和特异性分别为85%和93%。此外,dd-cfDNA表现出比目前可用的生物标记物淀粉酶和脂肪酶更好的性能。值得注意的是,与单独使用dd-cfDNA相比,结合脂肪酶和dd-cfDNA并不能提高诊断准确性。
****
Claims (22)
1.一种对DNA进行扩增和测序的方法,所述方法包括:
(a)从已接受一个或多个器官的移植的移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA,其中经提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA;
(b)使用200个至50,000个引物对在单个反应体积中的200个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增,其中所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座;
(c)通过高通量测序对扩增产物进行测序以获得测序读段,并基于所述测序读段对供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量进行定量;以及
(d)确定所述供体源性游离DNA的量或其函数是否超过指示移植排斥或移植物损伤的临界阈值。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述移植受体是人受试者。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述移植受体已接受选自胰腺、肾、肝、心脏、肠、胸腺和子宫的多个移植器官。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述一个或多个移植器官来自相同的移植供体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述一个或多个移植器官来自不同的移植供体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述移植受体已接受多于一个器官的同时移植。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述移植受体已接受多于一个器官的顺序移植。
8.根据权利要求6所述的方法,其中所述移植受体已接受肾和胰腺的同时移植(SPK)。
9.根据权利要求6所述的方法,其中所述移植受体已接受肾和肝的同时移植、肾和心脏的同时移植、肾和肺的同时移植、胰腺和肝的同时移植、或心脏和肺的同时移植。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述临界阈值是供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述临界阈值是供体源性游离DNA的拷贝数或其函数。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述临界阈值是供体源性游离DNA的量的集合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述临界阈值是供体源性游离DNA的设定浓度。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中所述靶向扩增包括PCR,并且所述200个至50,000个引物对包括正向和反向PCR引物。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法,其中所述靶向扩增包括使用1,000个至10,000个引物对在单个反应体积中的1,000个至10,000个靶基因座处进行靶向扩增以获得扩增产物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述靶基因座包含单核苷酸多态性(SNP)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法,其进一步包括在进行高通量测序之前将标签附着至所述扩增产物,其中所述标签包含测序兼容的衔接子。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法,其进一步包括在进行靶向扩增之前将标签附着至所述经提取的游离DNA,其中所述标签包含用于扩增的衔接子。
19.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述标签包含样品特异性条形码,并且其中所述方法进一步包括在高通量测序之前汇集来自多个样品的扩增产物,并在所述高通量测序期间在单次运行中对扩增产物池一起进行测序。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法,其进一步包括对同一移植受体纵向重复步骤(a)至(d),以及确定所述移植受体中的所述供体源性游离DNA的量或其函数的纵向变化。
21.根据权利要求20所述的方法,其进一步包括基于所述移植受体中的所述供体源性游离DNA的量或其函数的所述纵向变化来调节免疫抑制疗法。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法,其中所述方法是在先前不了解供体基因型的情况下进行的。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202163153800P | 2021-02-25 | 2021-02-25 | |
US63/153,800 | 2021-02-25 | ||
PCT/US2022/017707 WO2022182878A1 (en) | 2021-02-25 | 2022-02-24 | Methods for detection of donor-derived cell-free dna in transplant recipients of multiple organs |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116964223A true CN116964223A (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=80735621
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202280019708.4A Pending CN116964223A (zh) | 2021-02-25 | 2022-02-24 | 用于检测多个器官的移植受体中的供体源性游离dna的方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4298248A1 (zh) |
JP (1) | JP2024507536A (zh) |
CN (1) | CN116964223A (zh) |
AU (1) | AU2022226186A1 (zh) |
BR (1) | BR112023016896A2 (zh) |
CA (1) | CA3211540A1 (zh) |
WO (1) | WO2022182878A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11479812B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-10-25 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
WO2024059514A1 (en) * | 2022-09-12 | 2024-03-21 | Transplant Genomics, Inc. | Methods, systems, and compositions for diagnosing pancreatic transplant rejection |
WO2024076484A1 (en) * | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Natera, Inc. | Methods for determination and monitoring of xenotransplant rejection by measuring nucleic acids or proteins derived from the xenotransplant |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130123120A1 (en) | 2010-05-18 | 2013-05-16 | Natera, Inc. | Highly Multiplex PCR Methods and Compositions |
AU2011358564B9 (en) | 2011-02-09 | 2017-07-13 | Natera, Inc | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
WO2015164432A1 (en) | 2014-04-21 | 2015-10-29 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
ES2913468T3 (es) | 2016-04-15 | 2022-06-02 | Natera Inc | Métodos para la detección del cáncer de pulmón. |
GB201618485D0 (en) | 2016-11-02 | 2016-12-14 | Ucl Business Plc | Method of detecting tumour recurrence |
JP2019534016A (ja) * | 2016-11-02 | 2019-11-28 | ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン,インコーポレイテッドThe Medical College of Wisconsin, Inc. | 全および特異的な無細胞dnaを使用しリスクを評価するための方法 |
JP2021520816A (ja) | 2018-04-14 | 2021-08-26 | ナテラ, インコーポレイテッド | 循環腫瘍dnaの個別化された検出を用いる癌検出およびモニタリングの方法 |
BR112020027023A2 (pt) | 2018-07-03 | 2021-04-06 | Natera, Inc. | Métodos para detecção de dna livre de células derivado de doador |
EP3824470A1 (en) | 2018-07-17 | 2021-05-26 | Natera, Inc. | Methods and systems for calling ploidy states using a neural network |
WO2020214547A1 (en) * | 2019-04-15 | 2020-10-22 | Natera, Inc. | Improved liquid biopsy using size selection |
AU2021280311A1 (en) * | 2020-05-29 | 2022-11-24 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
-
2022
- 2022-02-24 CN CN202280019708.4A patent/CN116964223A/zh active Pending
- 2022-02-24 JP JP2023550565A patent/JP2024507536A/ja active Pending
- 2022-02-24 WO PCT/US2022/017707 patent/WO2022182878A1/en active Application Filing
- 2022-02-24 AU AU2022226186A patent/AU2022226186A1/en active Pending
- 2022-02-24 BR BR112023016896A patent/BR112023016896A2/pt unknown
- 2022-02-24 CA CA3211540A patent/CA3211540A1/en active Pending
- 2022-02-24 EP EP22709914.0A patent/EP4298248A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2024507536A (ja) | 2024-02-20 |
BR112023016896A2 (pt) | 2023-11-21 |
WO2022182878A1 (en) | 2022-09-01 |
EP4298248A1 (en) | 2024-01-03 |
AU2022226186A1 (en) | 2023-09-07 |
CA3211540A1 (en) | 2022-09-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230203573A1 (en) | Methods for detection of donor-derived cell-free dna | |
US9920370B2 (en) | Haplotying of HLA loci with ultra-deep shotgun sequencing | |
KR102210852B1 (ko) | 희귀 돌연변이 및 카피수 변이를 검출하기 위한 시스템 및 방법 | |
JP6328934B2 (ja) | 非侵襲性出生前親子鑑定法 | |
KR102339760B1 (ko) | 대규모 병렬 게놈 서열분석을 이용한 태아 염색체 이수성의 진단 방법 | |
CN116964223A (zh) | 用于检测多个器官的移植受体中的供体源性游离dna的方法 | |
CN107254514B (zh) | 检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途 | |
EP3564391B1 (en) | Method, device and kit for detecting fetal genetic mutation | |
US20170321270A1 (en) | Noninvasive prenatal diagnostic methods | |
KR101992786B1 (ko) | Cyp2e1 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물 | |
CA3213399A1 (en) | Methods for determination of transplant rejection | |
CN114026646A (zh) | 用于评估肿瘤分数的系统和方法 | |
JP2020530261A (ja) | 未知の遺伝子型の寄与体からのdna混合物の正確な計算による分解のための方法 | |
JP2020512000A (ja) | 胎児の染色体異常を検出する方法 | |
US20240132960A1 (en) | Methods for detection of donor-derived cell-free dna in transplant recipients of multiple organs | |
KR20200064891A (ko) | 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법 | |
CN117425734A (zh) | 用于确定移植排斥的方法 | |
KR102156699B1 (ko) | 소음인 판별용 조성물 | |
WO2024076469A1 (en) | Non-invasive methods of assessing transplant rejection in pregnant transplant recipients | |
WO2024076484A1 (en) | Methods for determination and monitoring of xenotransplant rejection by measuring nucleic acids or proteins derived from the xenotransplant | |
JP2004350576A (ja) | 膀胱癌検査キット | |
WO2023244735A2 (en) | Methods for determination and monitoring of transplant rejection by measuring rna | |
JP2021534803A (ja) | 無細胞核酸試料におけるアレル不均衡を検出するための方法およびシステム |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |