CN117425734A

CN117425734A - 用于确定移植排斥的方法

Info

Publication number: CN117425734A
Application number: CN202280030350.5A
Authority: CN
Inventors: P·高迪尔; H·塔布里兹阿尼; P·范胡梅伦; J·唐
Original assignee: Natera Inc
Current assignee: Natera Inc
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2024-01-19

Abstract

本公开提供了用于制备和分析移植受体的生物样品以确定移植排斥的方法，所述方法包括：(a)测量移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(Torque teno virus，TTV)的量；(b)测量所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量；以及(c)分别确定供体源性游离DNA的量或其函数是否超过指示移植排斥的截止阈值以及所述移植受体是否具有指示减少或增加的免疫应答的增加或减少的量的TTV。

Description

用于确定移植排斥的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年3月18日提交的美国临时申请序列第63/162,750号和于2022年2月28日提交的美国临时申请序列第63/314,647号的权益，所述美国临时申请的特此通过全文引用的方式并入本文。

背景技术

快速检测移植物损伤和/或排斥仍然是移植受体面临的挑战。常规的基于活检的测试具有侵入性且成本高昂，并且可能导致移植损伤和/或排斥的延误诊断。因此，需要一种对移植损伤和/或排斥的非侵入性测试，所述测试比常规的基于活检的测试更敏感并且更具特异性。

发明内容

本公开涉及用于确定移植排斥的移植受体的生物样品的制备和分析，所述制备和分析包括：(a)测量移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(Torque tenovirus，TTV)的量；(b)测量所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量；以及(c)分别确定供体源性游离DNA的量或其函数是否超过指示移植排斥的截止阈值以及所述移植受体是否具有指示减少的或增加的免疫应答的增加或减少的量的TTV。

本公开还涉及用于确定移植排斥的移植受体的生物样品的制备和分析，所述制备和分析包括：测量移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(TTV)的量和供体源性游离DNA的量；以及确定供体源性游离DNA的量或其函数(作为器官健康的标志物)和TTV的量或其函数(作为免疫抑制的标志物)的组合是否超过指示移植排斥的截止阈值。TTV和dd-cfDNA的组合可以作为排斥的生物标志物和免疫抑制的净状态的生物标志物。

本公开进一步涉及用于确定移植排斥的移植受体的生物样品的制备和分析，所述制备和分析包括：(a)测量移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的TTV DNA的量；(b)测量所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比；以及(c)基于供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比，以及所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的TTV DNA的量来确定所述移植受体的排斥风险。

附图说明

图1.TTV滴度Log(cps/mL)在移植后第3个月达到峰值。包含所有细环病毒(TTV)测量值(n＝516)。TTV载量显示在方框图中，其中下细线＝最小观察值大于或等于下铰链-1.5*IQR；下铰链，25％分位数；中间，中值，50％分位数；上铰链，75％分位数；上细线＝最大观察值小于或等于上铰链+1.5*IQR。蓝色水平线表示健康对照血浆样品(n＝56)的中值TTV滴度，并且第95个百分位表示为虚线。

图2.低和高移植物排斥风险的TTV滴度Log(cps/mL)绘制在方框图中，其中方框表示第25个和第75个百分位，并且水平线表示中值。细线表示大约95％的数据。*p＜0.001。

图3.TTV基于171个样品的子集，改善了与Prospera(DFE)组合的同种异体移植物排斥的预测，包含67个活检证实的排斥，其为在移植后≤18个月采样的。TTV+DFE的AUC与单独的DFE相比增加了3％。使用逻辑回归模型产生接受者工作特性(ROC)曲线，通过计算曲线下面积(AUC)来评估TTV是否增加了Prospera的供体分数估计(DFE)的值。所有的分析都使用了同种异体移植物病理学的BANFF分类来进行排斥/非排斥的最终调用。TPR：真阳性率，FPR：假阳性率。“+”意指模型包含多种特征，如DFE、dd-cfDNA量、TTV、移植后时间、年龄和性别。包含了组列+测试集以产生ROC曲线。

具体实施方式

Sigdel等人，“通过大规模多重PCR评估供体源性游离DNA来优化肾移植损伤的检测(Optimizing Detection of Kidney Transplant Injury by Assessment of Donor-Derived Cell-Free DNAvia Massively Multiplex PCR)”，《临床医学杂志(J.Clin.Med.)》8(1)：19(2019)，通过全文引用的方式并入本文。

题为“供体源性游离DNA的检测方法(Methods for Detection of Donor-DerivedCell-Free DNA)”，并且于2019年7月3日作为PCT/US2019/040603提交的WO2020/010255通过全文引用的方式并入本文。

题为“用于检测供体源性游离DNA的改进的方法(Improved Methods forDetection of Donor Derived Cell-Free DNA)”，并且于2020年5月29日提交的美国临时申请第63/031，879号通过全文引用的方式并入本文。

在至少一方面，本发明涉及一种制备源自移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品的扩增的DNA的组合物的方法，所述方法可用于确定移植排斥，所述方法包括：(a)从所述移植受体的所述血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA，其中所提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；(b)通过在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增来制备扩增的DNA的组合物，并且通过高通量测序对扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量供体源性游离DNA的量；(c)测量所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(TTV)的量；以及(d)分别确定供体源性游离DNA的量或其函数是否超过指示移植排斥的截止阈值以及所述移植受体是否具有指示减少或增加的免疫应答的增加或减少的量的TTV。

在至少一方面，本发明涉及一种制备源自移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品的扩增的DNA的组合物的方法，所述方法可用于确定移植排斥，所述方法包括：(a)从所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA，其中所提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；(b)通过在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增来制备扩增的DNA的组合物，并且通过高通量测序对扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量供体源性游离DNA的量和细环病毒(TTV)的量；以及(c)确定供体源性游离DNA的量或其函数(作为器官健康的标志物)和TTV的量或其函数(作为免疫抑制的标志物)的组合是否超过截止阈值。TTV和dd-cfDNA的组合可以作为排斥的生物标志物和免疫抑制的净状态的生物标志物。

在至少另一方面，本发明涉及一种制备源自移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品的扩增的DNA的组合物的方法，所述方法可用于确定移植排斥，所述方法包括：(a)从所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA，其中所提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；(b)通过在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增来制备扩增的DNA的组合物，并且通过高通量测序对扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比；(c)测量所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的TTV DNA的量；以及(d)基于供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比，以及所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的TTV DNA的量来确定所述移植受体的排斥风险。

在至少另一方面，本发明涉及一种制备源自移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品的扩增的DNA的组合物的方法，所述方法可用于确定移植排斥，所述方法包括：(a)从所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA，其中所提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；(b)通过在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增来制备扩增的DNA的组合物，并且通过高通量测序对扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的估计的百分比，以及血液、血浆、血清或尿液样品中的TTV DNA的量；以及(c)基于供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比，以及所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的TTV DNA的量来确定所述移植受体的排斥风险。

在一些实施例中，将dd-cfDNA测定结果与截止阈值进行比较以确定移植排斥的发生或可能发生，其中所述截止阈值是供体源性游离DNA的量和TTV的量的函数。在一些实施例中，将dd-cfDNA测定结果与截止阈值进行比较以确定移植排斥的发生或可能发生，其中所述截止阈值是供体源性游离DNA的量、TTV的量和总游离DNA的量的函数。在一些实施例中，将dd-cfDNA测定结果与截止阈值进行比较以确定移植排斥的发生或可能发生，其中所述截止阈值是供体源性游离DNA的读段数量和TTV的读段数量的函数。在一些实施例中，将dd-cfDNA测定结果与截止阈值进行比较以确定移植排斥的发生或可能发生，其中所述截止阈值是供体源性游离DNA的读段数量、TTV的读段数量和总游离DNA的读段数量的函数。在一些实施例中，所述函数是多项式函数。在一些实施例中，所述函数是对数函数。在一些实施例中，所述函数是指数函数。在一些实施例中，所述函数是线性函数。在一些实施例中，所述函数是非线性函数。

在一些实施例中，其中使用逻辑回归、随机森林或决策树机器学习分析来确定移植受体的排斥风险。在一些实施例中，机器学习分析结合移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量或其函数作为参数。在一些实施例中，机器学习分析结合供体源性游离DNA的读段数量或其函数作为参数。在一些实施例中，机器学习分析结合供体源性游离DNA占总游离DNA的估计的百分比作为参数。在一些实施例中，机器学习分析结合移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的TTV DNA的量作为参数。在一些实施例中，机器学习分析进一步结合移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的总游离DNA的量或其函数作为参数。在一些实施例中，机器学习分析进一步结合总游离DNA的读段数量或其函数作为参数。在一些实施例中，机器学习分析进一步结合移植后时间作为参数。在一些实施例中，机器学习分析进一步结合移植受体和/或移植供体的年龄作为参数。在一些实施例中，机器学习分析进一步结合移植受体和/或移植供体的性别作为参数。

在一些实施例中，血液、血浆、血清或尿液样品在移植后少于18个月，移植后少于17个月，移植后少于16个月，移植后少于15个月，移植后少于14个月，移植后少于13个月或移植后少于12个月从移植受体获得。在一些实施例中，血液、血浆、血清或尿液样品在移植后0个月至2个月，移植后2个月至4个月，移植后4个月至6个月，移植后6个月至9个月，移植后9个月至12个月或移植后12个月至18个月从移植受体获得。

在一些实施例中，移植受体的排斥风险以至少0.81，或至少0.82，或至少0.83，或至少0.84，或至少0.85，或至少0.86，或至少0.87，或至少0.88，或至少0.89，或至少0.90的灵敏度来确定。在一些实施例中，移植受体的排斥风险以至少0.81，或至少0.82，或至少0.83，或至少0.84，或至少0.85，或至少0.86，或至少0.87，或至少0.88、或至少0.89，或至少0.90的特异性来确定。在一些实施例中，移植受体的排斥风险以至少至少0.86，或至少0.87，或至少0.88，或至少0.89，或至少0.90，或至少0.91，或至少0.92，或至少0.93，或至少0.94，或至少0.95的曲线下面积(AUC)来确定。

在一些实施例中，TTV是细环病毒1。在一些实施例中，TTV是细环病毒2。在一些实施例中，TTV是细环病毒3。在一些实施例中，TTV是细环病毒4。在一些实施例中，TTV是细环病毒5。在一些实施例中，TTV是细环病毒6。在一些实施例中，TTV是细环病毒7。在一些实施例中，TTV是细环病毒9。在一些实施例中，TTV是细环病毒10。在一些实施例中，TTV是细环病毒13。在一些实施例中，TTV是细环病毒14。在一些实施例中，TTV是细环病毒15。在一些实施例中，TTV是细环病毒17。在一些实施例中，TTV是细环病毒18。在一些实施例中，TTV是细环病毒19。在一些实施例中，TTV是细环病毒20。在一些实施例中，TTV是细环病毒21。在一些实施例中，TTV是细环病毒24。在一些实施例中，TTV是细环病毒25。在一些实施例中，TTV是细环病毒26。在一些实施例中，TTV是细环病毒29。在一些实施例中，TTV是细环病毒31。在一些实施例中，TTV的减少的量指示移植受体中的增加的免疫应答或增加的免疫活性。在一些实施例中，TTV的增加的量指示移植受体中的减少的免疫应答或减少的免疫活性。

在一些实施例中，通过定量PCR测量TTV的量。在一些实施例中，通过实时PCR测量TTV的量。在一些实施例中，通过数字PCR测量TTV的量。在一些实施例中，通过如高通量测序、下一代序列或通过边合成边测序等测序测量TTV的量。

在一些实施例中，移植供体是人受试者。在一些实施例中，移植供体是非人哺乳动物受试者(例如，猪)。在一些实施例中，移植受体是人受试者。

在一些实施例中，移植受体已经接受了选自一个或多个以下的移植的器官：肾脏、肝脏、心脏、肺、胰腺、肠、胸腺和子宫。在一些实施例中，移植受体已经接受了肾脏移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了肝脏移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了心脏移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了肺移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了胰腺移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了肠移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了胸腺移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了子宫移植。

在一些实施例中，靶基因座包括单核苷酸多态性(SNP)基因座。

在一些实施例中，靶向扩增包括PCR。在一些实施例中，用于靶向扩增的引物包含200对至50,000对、500对至20,000对，或1,000对至10,000对，或200对至500对，或500对至1,000对，或1,000对至2,000对，或2,000对至5,000对，或5,000对至10,000对，或10,000对至20,000对，或20,000对至50,000对正向和反向PCR引物。在一些实施例中，靶向扩增包括在单个反应体积中使用500个至20,000个，或1,000个至10,000个，或200个至500个，或500个至1,000个，或1,000个至2,000个，或2,000个至5,000个，或5,000个至10,000个，或10,000个至20,000个，或20,000个至50,000个引物对在500个至20,000个，或1,000个至10,000个，或200个至500个，或500个至1,000个，或1,000个至2,000个，或2,000个至5,000个，或5,000-10,000个，或10,000-20,000个，或20,000个至50,000个靶基因座处进行扩增，以获得扩增产物。

在一些实施例中，靶向扩增包括嵌套PCR。在一些实施例中，用于靶向扩增的引物包含第一通用引物和200个至50,000个、500个至20,000个，或1,000个至10,000个，或200个至500个，或500个至1,000个，或1,000个至2,000个，或2,000个至5,000个，或5,000个至10,000个，或10,000个至20,000个，或20,000个至50,000个靶特异性引物，以及第二通用引物和200个至50,000个、500个至20,000个，或1,000个至10,000个，或200个至500个，或500个至1,000个，或1,000个至2,000个，或2,000个至5,000个，或5,000个至10,000个，或10,000个至20,000个，或20,000个至50,000个内靶特异性引物。在一些实施例中，靶向扩增包括在单个反应体积中使用第一通用引物和200个至50,000个、500个至20,000个，或1,000个至10,000个，或200个至500个，或500个至1,000个，或1,000个至2,000个，或2,000个至5,000个，或5,000个至10,000个，或10,000个至20,000个，或20,000个至50,000个靶特异性引物在500个至20,000个，或1,000个至10,000个，或200个至500个，或500个至1,000个，或1,000个至2,000个，或2,000个至5,000个，或5,000-10,000个，或10,000-20,000个，或20,000个至50,000个靶基因座处进行扩增，以获得扩增产物。在一些实施例中，靶向扩增包括在单个反应体积中使用第二通用引物和200个至50,000个、500个至20,000个，或1,000个至10,000个，或200个至500个，或500个至1,000个，或1,000个至2,000个，或2,000个至5,000个，或5,000个至10,000个，或10,000个至20,000个，或20,000个至50,000个内靶特异性引物在500个至20,000个，或1,000个至10,000个，或200个至500个，或500个至1,000个，或1,000个至2,000个，或2,000个至5,000个，或5,000-10,000个，或10,000-20,000个，或20,000个至50,000个靶基因座处进行扩增，以获得扩增产物。

在一些实施例中，截止阈值是供体源性游离DNA占总游离DNA的估计百分比或其函数。在一些实施例中，截止阈值是1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2.0％dd-cfDNA。在一些实施例中，根据移植的器官的类型来调节截止阈值。在一些实施例中，根据移植的器官的数量来调节截止阈值。

在一些实施例中，截止阈值与绝对供体源性游离DNA浓度成比例。在一些实施例中，截止阈值是供体源性游离DNA的拷贝数或其函数。在一些实施例中，截止阈值表示为dd-cfDNA的量或绝对量。在一些实施例中，截止阈值表示为每体积单位所述血液样品中dd-cfDNA的量或绝对量。在一些实施例中，截止阈值表示为每体积单位所述血液样品中dd-cfDNA的量或绝对量乘以移植受体的体重、BMI或血液体积。

在一些实施例中，所述方法进一步包括在进行高通量测序之前将标签与扩增产物附接，其中所述标签包括测序兼容的衔接子。在一些实施例中，所述方法进一步包括在进行靶向扩增之前将标签与提取的游离DNA附接，其中所述标签包括用于扩增的衔接子。在一些实施例中，所述标签包括样品特异性条形码，并且其中所述方法进一步包括在高通量测序之前汇集来自多个样品的扩增产物，并且在所述高通量测序期间在单次运行中将扩增产物池一起测序。

在一些实施例中，所述方法进一步包括对同一移植受体纵向重复步骤(a)至(d)，并且确定TTV的量或其函数的纵向变化和供体源性游离DNA的量或其函数的纵向变化。

在至少另一方面，本发明涉及在移植受体中施用免疫抑制疗法的方法，所述方法包括：(a)测量移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(TTV)的量；以及(b)测量移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量；以及(c)根据TTV的量或其函数和供体源性游离DNA的量或其函数来滴定免疫抑制疗法的剂量。

在一些实施例中，所述方法进一步包括对同一移植受体纵向重复步骤(a)至(b)，并且确定TTV的量或其函数的纵向变化和供体源性游离DNA的量或其函数的纵向变化。

在一些实施例中，所述方法进一步包括根据TTV的量或其函数的纵向变化和供体源性游离DNA的量或其函数的纵向变化来滴定免疫抑制疗法的剂量。

在一些实施例中，所述方法包括如果移植受体具有纵向减少的量的TTV和纵向增加的量的供体源性游离DNA，则增加免疫抑制疗法的剂量。

在一些实施例中，所述方法包括如果移植受体具有纵向增加的量的TTV和纵向减少的量的供体源性游离DNA，则减少免疫抑制疗法的剂量。

在一些实施例中，供体源性游离DNA的量通过以下方式测量：从移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA，其中所提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增；通过高通量测序对扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量供体源性游离DNA的量。

在一些实施例中，在不预先了解供体基因型的情况下进行所述方法。在一些实施例中，所述方法不包括对移植供体进行基因分型。

在一些实施例中，例如，示踪剂DNA，或内部校准DNA是指以下一种或多种已知的DNA的组成：长度、序列、核苷酸组成、量或生物来源。示踪剂DNA可以添加到源自人受试者的生物样品中，以帮助估计所述样品中的总cfDNA的量。其也可以添加到除生物样品本身以外的反应混合物中。

在一些实施例中，例如，单核苷酸多态性(SNP)是指同一物种的两个成员的基因组之间可能存在差异的单核苷酸。所述术语的使用并不意味着对每个变体出现的频率有任何限制。

在一些实施例中，例如，序列是指DNA或RNA序列或基因序列。其可以指个体中DNA或RNA分子或链的基本物理结构。其可以指在DNA或RNA分子中发现的核苷酸序列，或DNA或RNA分子的互补链。其可以指DNA或RNA分子中所包含的信息，作为其生物信息学表示。

在一些实施例中，例如，基因座是指个体的DNA或RNA上的特定所关注的区，包含但不限于一个或多个SNP、可能插入或缺失的位点，或一些其它相关基因变异的位点。疾病相关SNP也可以指疾病相关基因座。

在一些实施例中，例如，多态性等位基因，也称为“多态性基因座”是指等位基因或基因座，其中基因型在给定物种的个体之间存在差异。多态性等位基因的一些实例包含单核苷酸多态性(SNP)、短串联重复、缺失、重复和倒位。

在一些实施例中，例如，等位基因是指占据特定基因座的核苷酸或核苷酸序列。

在一些实施例中，例如，遗传数据，也称为“基因型数据”，是指描述一个或多个个体基因组方面的数据。其可以指一个或一组基因座，部分或整个序列，部分或整个染色体，或整个基因组。其可以指一个或多个核苷酸的同一性；其可以指一组序列核苷酸，或来自基因组中不同位置的核苷酸，或其组合。基因型数据通常为生物信息学，然而也可以将序列中的物理核苷酸视为化学编码的遗传数据。基因型数据可以说是在个体“上”、个体“的”、“在”个体处、“来自”个体或在个体“上”。基因型数据可以指来自基因分型平台的输出测量，这些测量是在遗传材料上进行的。

在一些实施例中，例如，遗传材料，也称为“遗传样品”，是指来自一个或多个包括核酸(例如，包括DNA或RNA)的个体的物理物质，如组织或血液。

在一些实施例中，例如，等位基因数据是指一组关于一组一个或多个等位基因的基因型数据。其可以指阶段性、单倍型数据。其可能指SNP身份，也可以指核酸的序列数据，包含插入、缺失、重复和突变。

在一些实施例中，例如，等位基因状态是指一组一个或多个等位基因中基因的实际状态。其可以指由等位基因数据描述的基因的实际状态。

在一些实施例中，例如，等位基因比率(allelic ratio)或等位基因比率(alleleratio)是指样品或个体中存在的基因座处的每个等位基因的量之间的比率。当通过测序测量样品时，等位基因比率可以指映射到基因座处的每个等位基因的序列读段的比率。当用基于强度的测量方法测量样品时，等位基因比率可以指通过测量方法估计的该基因座处存在的每个等位基因的量的比率。

在一些实施例中，例如，等位基因计数是指是映射到特定基因座的序列数量，如果该基因座是多态性的，则指映射到每个等位基因的序列数量。如果以二进制方式计数每个等位基因，则等位基因计数将为整数。如果对等位基因进行概率计数，则等位基因计数可以是分数。

在一些实施例中，例如，引物，也称为“PCR探针”是指单个DNA分子(DNA寡聚物)或DNA分子(DNA低聚物)的集合，其中DNA分子相同或近似相同，并且引物含有设计用于与靶向的多态性基因座杂交的区域，并且含有设计用于允许扩增(如PCR扩增)的引发序列。引物也可以含有分子条形码。引物可以含有每个单独的分子不同的随机区域。

在一些实施例中，例如，杂交捕获探针是指通过PCR或直接合成等各种方法生成的任何核酸序列(可能经过修饰)，旨在与样品中特定靶DNA或RNA序列的一条链互补。外源性杂交捕获探针可以添加到制备的样品中，并且通过变性再退火过程进行杂交，以形成外源性内源性片段的双链体。然后，可以通过各种方式将这些双链体与样品物理分离。

在一些实施例中，例如，序列读段是指表示核苷酸碱基序列的数据，所述碱基序列是使用克隆测序方法测量的。克隆测序可以产生表示单个或克隆或一个原始DNA或RNA分子的簇的序列数据。序列读段也可以在序列的每个碱基位置处有相关联的质量评分，表明核苷酸被正确判定的概率。

在一些实施例中，例如，映射序列读段是确定序列读段在特定生物体基因组序列中的来源位置的过程。序列读段的来源位置基于读段与基因组序列的核苷酸序列相似性。

在一些实施例中，例如，供体来源的DNA或RNA是指最初是细胞的一部分的DNA或RNA，其基因型与移植供体的基因型基本相同。供体可以是人或非人哺乳动物(例如，猪)。

在一些实施例中，例如，受体来源的DNA或RNA是指最初是细胞的一部分的DNA或RNA，其基因型与移植受体的基因型基本相同。

在一些实施例中，例如，移植受体血浆是指来自己经接受同种异体移植或异种移植(例如，器官移植受体)的患者的女性的血液的血浆部分。

在一些实施例中，例如，对应于基因座的DNA或RNA的优先富集，或基因座处的DNA或RNA的优先富集是指任何导致富集后DNA或RNA混合物中对应于基因座的DNA或RNA分子的百分比高于富集前DNA或RNA混合物中对应于基因座的DNA或RNA分子的百分比的技术。所述技术可以涉及选择性扩增对应于基因座的DNA或RNA分子。所述技术可以涉及去除不与基因座对应的DNA或RNA分子。所述技术可以涉及方法的组合。富集程度被定义为富集后混合物中对应于基因座的DNA或RNA分子的百分比除以富集前混合物中对应于基因座的DNA或RNA分子的百分比。优先富集可以在多个基因座上进行。在本公开的一些实施例中，富集程度大于20。在本公开的一些实施例中，富集程度大于200。在本公开的一些实施例中，富集程度大于2,000。当在多个基因座上进行优先富集时，富集程度可以指所述基因座组中所有基因座的平均富集程度。

在一些实施例中，例如，扩增是指增加DNA或RNA分子的拷贝数量的技术。

在一些实施例中，例如，选择性扩增可以指增加特定DNA或RNA分子或对应于特定DNA或RNA区的DNA或RNA分子的拷贝数量的技术。其也可以指一种技术，所述技术增加特定靶向DNA或RNA分子或靶向DNA或RNA区的拷贝数量多于增加非靶向DNA或RNA分子或区的拷贝数量。选择性扩增可以是优先富集的方法。

在一些实施例中，例如，通用引发序列是指可以附加到靶DNA分子群体中的DNA序列，例如通过连接、PCR或连接介导的PCR。一旦添加到靶分子群体中，可以使用通用引发序列特异性引物，使用单对扩增引物来扩增靶群体。通用引发序列不需要与靶序列相关。

在一些实施例中，例如，通用衔接子或‘连接衔接子’或‘文库标签’是含有通用引发序列的DNA分子，可与靶双链DNA分子群体的5′末端和31末端共价连接。衔接子的添加为靶群体的5′末端和3′末端提供了通用引发序列，可以从中进行PCR扩增，使用单对扩增引物扩增靶群体的所有分子。

在一些实施例中，例如，靶向是指用于选择性地扩增或以其它方式优先富集那些对应于DNA或RNA的混合物中的基因座组的DNA或RNA分子的方法。

用于监测移植排斥的供体源性游离DNA的分析

一方面，本发明涉及一种定量移植受体的血液样品中的供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的量的方法，所述方法包括：从所述移植受体的所述血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中在500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增，其中所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座，并且其中每个引物对被设计为扩增不超过100bp的靶序列；以及定量扩增产物中的供体源性游离DNA的量。

另一方面，本发明涉及一种定量移植受体的血液样品中的供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的量的方法，所述方法包括：从所述移植受体的所述血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA，并且其中所述提取步骤包括大小选择以富集供体源性游离DNA并减少从破裂的白细胞中排放的受体源性游离DNA的量；使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中在500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增，其中所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；以及定量扩增产物中的供体源性游离DNA的量。

另一方面，本发明涉及一种检测移植受体的血液样品中的供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的方法，所述方法包括：从移植受体的血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中在500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增，其中所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；通过高通量测序对扩增产物进行测序；以及定量供体源性游离DNA的量。

在一些实施例中，所述方法进一步包括对提取的DNA进行通用扩增。在一些实施例中，通用扩增优先扩增供体源性游离DNA，而不是从破裂的白细胞中排放的受体源性游离DNA。

在一些实施例中，移植受体是哺乳动物。在一些实施例中，移植受体是人。

在一些实施例中，移植受体已经接受了选自以下的移植：器官移植、组织移植、细胞移植和流体移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了选自以下的移植：肾移植、肝移植、胰腺移植、肠移植、心脏移植、肺移植、心脏/肺移植、胃移植、睾丸移植、阴茎移植、卵巢移植、子宫移植、胸腺移植、面部移植、手移植、腿移植、骨移植、骨髓移植、角膜移植、皮肤移植、胰岛细胞移植、心脏瓣膜移植、血管移植和输血。在一些实施例中，移植受体已经接受了SPK移植。

在一些实施例中，所述定量步骤包括确定所述血液样品中供体源性游离DNA占供体源性游离DNA和受体源性游离DNA总量的百分比。在一些实施例中，所述定量步骤包括确定每体积单位所述血液样品中供体源性游离DNA的拷贝数。

在一些实施例中，所述方法进一步包括使用定量的量的供体源性游离DNA检测移植的主动排斥的发生或可能发生。在一些实施例中，在不预先了解供体基因型的情况下进行所述方法。

在一些实施例中，每个引物对被设计成扩增约50bp至100bp的靶序列。在一些实施例中，每个引物对被设计成扩增不超过75bp的靶序列。在一些实施例中，每个引物对被设计成扩增约60bp至75bp的靶序列。在一些实施例中，每个引物对被设计成扩增约65bp的靶序列。

在一些实施例中，靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少1,000个多态性基因座。在一些实施例中，靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少2,000个多态性基因座。在一些实施例中，靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少5,000个多态性基因座。在一些实施例中，靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少10,000个多态性基因座。

在一些实施例中，方法进一步包括测量作为多态性基因座的靶基因座处的一个或多个等位基因的量。在一些实施例中，多态性基因座和非多态基因座在单个反应中扩增。

在一些实施例中，定量步骤包括使用微阵列检测扩增的靶基因座。在一些实施例中，定量步骤不包括使用微阵列。

在一些实施例中，靶向扩增包括在单个反应体积中使用(i)至少500个至50,000个不同的引物对，或(ii)至少500个至50,000个靶特异性引物和通用或标签特异性引物500个至50,000个引物对同时扩增500个至50,000个靶基因座。

在另外的方面，本发明涉及一种确定移植受体内移植排斥的可能性的方法，所述方法包括：从所述移植受体的血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；对所提取的DNA进行通用扩增；使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中在500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增，其中所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；通过高通量测序对扩增产物进行测序；以及定量所述血液样品中的供体源性游离DNA的量，其中dd-cfDNA的量越大表示移植排斥的可能性越大。

在另外的方面，本发明涉及一种诊断移植受体内的移植经历急性排斥的方法，所述方法包括：从所述移植受体的血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；对所提取的DNA进行通用扩增；使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中在500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增，其中所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；通过高通量测序对扩增产物进行测序；以及定量所述血液样品中的供体源性游离DNA的量，其中大于1％(或1.1％、或1.2％、或1.3％、或1.4％、或1.5％、或1.6％、或1.7％、或1.8％、或1.9％、或2.0％)的dd-cfDNA的量指示移植正在经历急性排斥。

在一些实施例中，移植排斥是抗体介导的移植排斥。在一些实施例中，移植排斥是T细胞介导的移植排斥。

在一些实施例中，小于1％(或0.9％、或0.8％、或0.7％、或0.6％、或0.5％)的dd-cfDNA的量指示移植正在经历临界排斥，经历其它损伤或稳定。

在另外的方面，本发明涉及一种监测受试者的免疫抑制疗法的方法，所述方法包括：从所述移植受体的血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；对所提取的DNA进行通用扩增；使用500个至50,000个引物对在单个反应体积中在500个至50,000个靶基因座处进行靶向扩增，其中所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；通过高通量测序对扩增产物进行测序；以及定量所述血液样品中的供体源性游离DNA的量，其中时间间隔内dd-cfDNA的水平变化指示移植状态。

在一些实施例中，所述方法进一步包括基于时间间隔内的dd-cfDNA水平调节免疫抑制疗法。

在一些实施例中，dd-cfDNA水平的增加表明移植排斥和需要调节免疫抑制疗法。在一些实施例中，dd-cfDNA水平没有变化或降低表示移植耐受性或稳定性，并且需要调节免疫抑制疗法。

在一些实施例中，大于1％(或1.1％、或1.2％、或1.3％、或1.4％、或1.5％、或1.6％、或1.7％、或1.8％、或1.9％、或2.0％)的dd-cfDNA的量指示移植正在经历急性排斥。在一些实施例中，移植排斥是抗体介导的移植排斥。在一些实施例中，移植排斥是T细胞介导的移植排斥。

在一些实施例中，所述方法不包括对移植供体和/或移植受体进行基因分型。

在一些实施例中，所述方法进一步包括测量作为多态性基因座的靶基因座处的一个或多个等位基因的量。

在一些实施例中，靶基因座包括至少1,000个多态性基因座，或至少2,000个多态性基因座，或至少5,000个多态性基因座，或至少10,000个多态性基因座。

在一些实施例中，在长度为约50bp至100bp，或长度为约50bp至90bp，或长度为约60bp至80bp，或长度为约60bp至75bp，或长度为约65bp的扩增子中扩增靶基因座。

在一些实施例中，移植受体是人。在一些实施例中，移植受体已经接受了选自以下的移植：肾脏移植、肝脏移植、胰腺移植、胰岛细胞移植、肠移植、心脏移植、肺移植、骨髓移植、心脏瓣膜移植或皮肤移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了SPK移植。

在一些实施例中，提取步骤进一步包括大小选择以富集供体源性游离DNA并减少从破裂的白细胞中排放的受体源性游离DNA的量。

在一些实施例中，通用扩增步骤优先扩增供体源性游离DNA，而不是从破裂的白细胞中排放的受体源性游离DNA。

在一些实施例中，所述方法包括在移植后从移植受体纵向收集多个血液样品，并且对所收集的每个血液样品重复步骤(a)至(e)。在一些实施例中，所述方法包括在约三个月，或约六个月，或约十二个月，或约十八个月或约二十四个月等时间段内收集和分析来自移植受体的血液样品。在一些实施例中，所述方法包括以约一周，或约两周，或约三周，或约一个月，或约两个月或约三个月等的间隔从移植受体收集血液样品。

在一些实施例中，所述方法在鉴定急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％的灵敏度，其中截止阈值为1％dd-cfDNA并且置信区间为95％。

在一些实施例中，所述方法在鉴定AR方面相对于非AR具有至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％的特异性，其中截止阈值为1％dd-cfDNA并且置信区间为95％。

在一些实施例中，所述方法在鉴定AR方面相对于非AR具有至少0.8，或至少0.85，或至少0.9，或至少0.95的曲线下面积(AUC)，其中截止阈值为1％dd-cfDNA并且置信区间为95％。

在一些实施例中，所述方法在鉴定AR方面相对于正常、稳定的同种异体移植物(STA)具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％的灵敏度，其中截止阈值为1％dd-cfDNA并且置信区间为95％。

在一些实施例中，所述方法在鉴定AR方面相对于STA相对于具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％的特异性，其中截止阈值为1％dd-cfDNA并且置信区间为95％。

在一些实施例中，所述方法在鉴定AR方面相对于STA具有至少0.8，或至少0.85，或至少0.9，或至少0.95，或至少0.98，或至少0.99的AUC，其中截止阈值为1％dd-cfDNA并且置信区间为95％。

在一些实施例中，所述方法具有如通过0.5％或更小的空白限(LoB)和0.5％或更小的检测限(LoD)所确定的灵敏度。在一些实施例中，LoB是0.23％或更小，并且LoD是0.29％或更小。在一些实施例中，通过定量限(LoQ)进一步确定灵敏度。在一些实施例中，LoQ是LoD的10倍；LoQ可以是LoD的5倍；LoQ可以是LoD的1.5倍；LoQ可以是LoD的1.2倍；LoQ可以是LoD的1.1倍；或者LoQ可以等于或大于LoD。在一些实施例中，LoB等于或小于0.04％，LoD等于或小于0.05％，和/或LoQ等于LoD。

在一些实施例中，所述方法具有通过评估从测量的供体分数的线性回归分析获得的线性值作为对应的尝试尖峰水平的函数而确定的准确度，其中线性值是R2值，其中R2值为约0.98至约1.0。在一些实施例中，R2值为0.999。在一些实施例中，所述方法具有如通过使用测量的供体分数的线性回归作为对应的尝试尖峰水平的函数来计算斜率值和截距值所确定的准确度，其中斜率值为约0.9至约1.2，并且截距值为约-0.0001至约0.01。在一些实施例中，斜率值大约为1，并且截距值大约为0。

在一些实施例中，所述方法具有如通过计算变异系数(CV)确定的精度，其中所述CV小于约10.0％。CV小于约6％。在一些实施例中，CV小于约4％。在一些实施例中，CV小于约2％。在一些实施例中，CV小于约1％。

在一些实施例中，AR是抗体介导的排斥(ABMR)。在一些实施例中，AR是T细胞介导的排斥(TCMR)。

本文进一步公开了用于在来自移植受体的样品中检测移植供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的方法。在一些实施例中，在本文所公开的方法中，移植受体是哺乳动物。在一些实施例中，移植受体是人。在一些实施例中，移植受体已经接受了选自以下的移植：肾脏移植、肝脏移植、胰腺移植、胰岛细胞移植、肠移植、心脏移植、肺移植、骨髓移植、心脏瓣膜移植或皮肤移植。在一些实施例中，移植受体已经接受了SPK移植。在一些实施例中，所述方法可以在移植外科手术当天或之后，在移植外科手术之后至多一年对移植受体进行。

在一些实施例中，本文公开了一种扩增来自移植受体的血液样品的供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的靶基因座的方法，所述方法包括：a)从所述移植受体的所述血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括源自移植的细胞和所述移植受体两者的游离DNA，b)在靶基因座处富集所提取的DNA，其中所述靶基因座包括50个至5000个靶基因座，所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；以及c)扩增所述靶基因座。

在一些实施例中，本文公开了一种在来自移植受体的血液样品中检测供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的方法，所述方法包括：a)从所述移植受体的所述血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括源自移植的细胞和所述移植受体两者的游离DNA，b)在靶基因座富集所提取的DNA，其中所述靶基因座包括50个至5000个靶基因座，所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；c)扩增所述靶基因座；d)使扩增的靶基因座与和靶基因座特异性杂交的探针接触；以及e)检测所述靶基因座与所述探针的结合，由此检测所述血液样品中的dd-cfDNA。在一些实施例中，用可检测标志物标记探针。

在一些实施例中，本文公开了一种确定移植受体内移植排斥的可能性的方法，所述方法包括：a)从所述移植受体的血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括源自移植的细胞和所述移植受体两者的游离DNA，b)在靶基因座处富集所提取的DNA，其中所述靶基因座包括50个至5000个靶基因座，所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；c)扩增所述靶基因座；以及d)测量所述受体血液样品中的移植DNA的量和受体DNA的量；其中dd-cfDNA的量越大，指示移植排斥的可能性越大。

在一些实施例中，本文公开了一种诊断移植受体内的移植经历急性排斥的方法，所述方法包括：a)从所述移植受体的血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括源自移植的细胞和所述移植受体两者的游离DNA，b)在靶基因座处富集所提取的DNA，其中所述靶基因座包括50个至5000个靶基因座，所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；c)扩增所述靶基因座；以及d)测量所述受体血液样品中的移植DNA的量和受体DNA的量；其中大于1％(或1.1％、或1.2％、或1.3％、或1.4％、或1.5％、或1.6％、或1.7％、或1.8％、或1.9％、或2.0％)的dd-cfDNA的量指示所述移植正在经历急性排斥。

在一些实施例中，在本文所公开的方法中，移植排斥是抗体介导的移植排斥。在一些实施例中，移植排斥是T细胞介导的移植排斥。在一些实施例中，小于1％(或0.9％、或0.8％、或0.7％、或0.6％、或0.5％)的dd-cfDNA的量指示移植正在经历临界排斥，经历其它损伤或稳定。

在一些实施例中，本文公开了一种监测受试者的免疫抑制疗法的方法，所述方法包括a)从所述移植受体的血液样品中提取DNA，其中所述DNA包括源自移植的细胞和所述移植受体游离DNA，b)在靶基因座处富集所提取的DNA，其中所述靶基因座包括50个至5000个靶基因座，所述靶基因座包括多态性基因座和非多态性基因座；c)扩增所述靶基因座；以及d)测量所述受体血液样品中的移植DNA的量和受体DNA的量；其中时间间隔内dd-cfDNA的水平变化指示移植状态。在一些实施例中，所述方法进一步包括基于时间间隔内的dd-cfDNA水平调节免疫抑制疗法。在一些实施例中，dd-cfDNA的水平的增加指示移植排斥和需要调节免疫抑制疗法。在一些实施例中，dd-cfDNA的水平的变化或降低指示移植耐受性或稳定性，并且需要调节免疫抑制疗法。

在一些实施例中，在本文所公开的方法中，靶基因座在长度为约50bp至100bp或长度为约60bp至80bp的扩增子中扩增。在一些实施例中，扩增子的长度为约65bp。

在一些实施例中，本文所公开的方法进一步包括测量受体血液样品中移植DNA的量和受体DNA的量。

在一些实施例中，本文所公开的方法不包括对移植供体和移植受体进行基因分型。

在一些实施例中，本文所公开的方法进一步包括使用微阵列检测扩增的靶基因座。

在一些实施例中，在本文所公开的方法中，多态性基因座和非多态基因座在单个反应中扩增。

在一些实施例中，在本文所公开的方法中，DNA优先在靶基因座处富集。

在一些实施例中，在多个多态性基因座处优先富集样品中的DNA包含获得多个预环化的探针，其中每个探针靶向所述多态性基因座中的一个，并且其中所述探针的3′和5′端被设计为与DNA的区杂交，所述区通过少量碱基与所述基因座的多态性位点分离，其中所述少量是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个至25个、26个至30个、31个至60个或其组合，将所述预环化的探针与来自所述样品的DNA杂交，使用DNA聚合酶填充杂交的探针末端之间的间隙，使所述预环化的探针环化，并且扩增环化的探针。

在一些实施例中，优先富集多个多态性基因座处的DNA包含获得多个连接介导的PCR探针，其中每个PCR探针靶向所述多态基因座中的一个，并且其中上游和下游PCR探针被设计为与DNA的一条链上的DNA的区杂交，所述区通过少量碱基与所述基因座的多态性位点分离，其中所述少量碱基是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个至25个、26个至30个、31个至60个或其组合，将所述连接介导的PCR探针与来自第一样品的DNA杂交，使用DNA聚合酶填充所述连接介导的PCR探针末端之间的间隙，连接所述连接介导的PCR探针，并且扩增连接的连接介导的PCR探针。

在一些实施例中，在多个多态性基因座处优先富集DNA包含获得靶向多态性基因座的多个杂交捕获探针，将所述杂交捕获探针与样品中的DNA杂交，并且从DNA的第一个样品中物理去除一些或所有未杂交的DNA。

在一些实施例中，杂交捕获探针被设计为与位于多态性位点的侧翼但不与其重叠的区杂交。在一些实施例中，杂交捕获探针被设计为与位于多态性位点的侧翼但不与其重叠的区杂交，并且其中侧翼捕获探针的长度可选自由以下组成的组：少于约120个碱基，少于约110个碱基，少于约100个碱基，少于约90个碱基，少于约80个碱基，少于约70个碱基，少于约60个碱基，少于约50个碱基，少于约40个碱基，少于约30个碱基，以及少于约25个碱基。在一些实施例中，杂交捕获探针被设计为与重叠于多态性位点的区杂交，并且其中多个杂交捕获探针包括用于每个多态性位点的至少两个杂交捕获探针，并且其中每个杂交捕获探针被设计为与该多态性基因座处的不同等位基因互补。

在一些实施例中，优先富集多个多态性基因座处的DNA包含获得多个内部正向引物，其中每个引物靶向所述多态性基因座中的一个，并且其中所述内部正向引物的3′端被设计为与多态性位点上游的DNA的区杂交，并且通过少量碱基与所述多态性位点分离，其中所述少量选自由以下组成的组：1个、2个、3个、4个、5个、6个至10个、11个至15个、16个至20个、21个至25个、26个至30个或31个至60个碱基对，任选地获得多个内部反向引物，其中每个引物靶向所述多态性基因座中的一个，并且其中所述内部反向引物的3′端被设计为与所述多态性位点上游的DNA的区杂交，并且通过少量碱基与所述多态性位点分离，其中所述少量碱基选自由以下组成的组：1个、2个、3个、4个、5个、6个至10个、11个至15个、16个至20个、21个至25个、26个至30个或31个至60个碱基对，将所述内部引物与所述DNA杂交，并且使用聚合酶链式反应扩增所述DNA以形成扩增子。

在一些实施例中，所述方法还包含获得多个外部正向引物，其中每个引物靶向多态性基因座中的一个，并且其中所述外部正向引物被设计为与内部正向引物上游的DNA的区杂交，任选地获得多个外部反向引物，其中每个引物靶向所述多态性基因座中的一个，并且其中所述外部反向引物被设计为与紧邻所述内部反向引物下游的DNA的区杂交，将第一引物与所述DNA杂交，并且使用聚合酶链式反应扩增所述DNA。

在一些实施例中，所述方法还包含获得多个外部反向引物，其中每个引物靶向多态性基因座中的一个，并且其中所述外部反向引物被设计为与紧邻内部反向引物下游的DNA的区杂交，任选地获得多个外部正向引物，其中每个引物靶向所述多态性基因座中的一个，并且其中所述外部正向引物被设计为与所述内部正向引物上游的DNA的区杂交，将第一引物与所述DNA杂交，并且使用聚合酶链式反应扩增所述DNA。

在一些实施例中，制备第一样品进一步包含将通用衔接子附加到第一样品中的DNA上，并且使用聚合酶链式反应扩增第一样品中的DNA。在一些实施例中，扩增的扩增子的至少一部分小于100bp，小于90bp，小于80bp，小于70bp，小于65bp，小于60bp，小于55bp，小于50bp或小于45bp，并且其中所述部分是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％。

在一些实施例中，扩增DNA在一个或多个个体反应体积中进行，并且其中每个个体反应体积含有多于100个不同的正向和反向引物对，多于200个不同的正向和反向引物对，多于500个不同的正向和反向引物对，多于1，000个不同的正向和反向引物对，多于2,000个不同的正向和反向引物对，多于5,000个不同的正向和反向引物对，多于10,000个不同的正向和反向引物对，多于20,000个不同的正向和反向引物对，多于50,000个不同的正向和反向引物对或多于100,000个不同的正向和反向引物对。

在一些实施例中，制备样品进一步包括将样品分为多个部分，并且其中每个部分中的DNA在多个多态性基因座的子集处优先富集。在一些实施例中，通过鉴定可能形成不期望的引物双链体的引物对并从多个引物中去除被鉴定为可能形成不期望的引物双链体的引物对中的至少一个来选择内部引物。在一些实施例中，内部引物含有被设计为与靶向的多态性基因座的上游或下游杂交的区，并且任选地含有被设计为允许PCR扩增的通用引发序列。在一些实施例中，至少一些引物另外含有对于每个单独的引物分子不同的随机区。在一些实施例中，至少一些引物另外含有分子条形码。

在一些实施例中，所述方法包括：(a)在包括靶基因座的核酸样品上进行多重聚合酶链式反应(PCR)，以在单个反应体积中使用(i)至少1，000个不同的引物对，或(ii)至少1，000个靶特异性引物和通用或标签特异性引物同时扩增至少1，000个独特的靶基因座，以产生包括靶扩增子的扩增的产物；以及(b)对扩增的产物进行测序。在一些实施例中，所述方法不包括使用微阵列。

在一些实施例中，所述方法包括：(a)在包括靶基因座的游离DNA样品上进行多重聚合酶链式反应(PCR)，以在单个反应体积中使用(i)至少1，000个不同的引物对，或(ii)至少1，000个靶特异性引物和通用或标签特异性引物同时扩增至少1，000个独特的靶基因座，以产生包括靶扩增子的扩增的产物；以及(b)对扩增的产物进行测序。在一些实施例中，所述方法不包括使用微阵列。

在一些实施例中，所述方法还包含从移植供体和移植受体中的一个或两个获得基因型数据。在一些实施例中，从移植供体和移植受体中的一个或两个获得基因型数据包含从供体和受体制备DNA，其中所述制备包括优先富集多个多态性基因座处的DNA以得到制备的DNA，任选地扩增所述制备的DNA，以及在所述多个多态性基因座处测量制备的样品中的DNA。

在一些实施例中，使用从移植供体和移植受体中的一个或两个获得的遗传数据来建立染色体上的多个多态性基因座的预期的等位基因计数概率的联合分布模型。在一些实施例中，第一样品已经从移植受体血浆中分离，并且其中从移植受体获得基因型数据是通过根据对制备的样品进行的DNA测量来估计受体基因型数据来完成的。

在一些实施例中，优先富集导致制备的样品与第一样品之间的因子的平均等位基因偏倚程度，所述因子选自由以下组成的组：不大于2的因子、不大于1.5的因子、不大于1.2的因子、不大于1.1的因子、不大于1.05的因子、不大于1.02的因子、不大于1.01的因子、不大于1.005的因子、不大于1.002的因子、不大于1.001的因子和不大于1.0001的因子。在一些实施例中，多个多态性基因座是SNP。在一些实施例中，测量制备的样品中的DNA通过测序来完成。

在一些实施例中，公开了一种用于帮助确定移植受体中的移植状态的诊断盒，其中所述诊断盒能够执行所公开的方法的制备和测量步骤。

在一些实施例中，等位基因计数是概率的而不是二进制的。在一些实施例中，在多个多态性基因座处对制备的样品中的DNA的测量也用于确定移植是否遗传了一个或多个连锁的单倍型。

在一些实施例中，通过使用关于染色体在染色体中的不同位置处交叉的概率的数据来建模染色体上多态性等位基因之间的依赖性，来完成建立等位基因计数概率的联合分布模型。在一些实施例中，使用不需要使用参考染色体的方法来完成建立等位基因计数的联合分布模型和确定每个假设的相对概率的步骤。

在一些实施例中，确定每个假设的相对概率利用制备的样品中供体源性游离DNA(dd-cfDNA)的估计的分数。在一些实施例中，用于计算等位基因计数概率和确定每个假设的相对概率的来自制备的样品的DNA测量值包括主要遗传数据。在一些实施例中，使用最大可能性估计或最大后验估计来选择与具有最大概率的假设相对应的移植状态。

在一些实施例中，调用移植状态还包含将使用联合分布模型确定的每个状态假设的相对概率和等位基因计数概率与使用取自由以下组成的组的统计技术计算的每个状态假设的相对概率组合：读段计数分析、比较杂合率、仅当使用供体遗传信息时可用的统计数据、特定供体/受体环境的归一化的基因型信号的概率、使用第一样品或制备的样品的估计移植分数计算的统计数据以及其组合。

在一些实施例中，针对调用的移植状态计算置信度估计。在一些实施例中，所述方法还包含基于调用的移植状态采取临床行动。

在一些实施例中，使用所述方法产生显示确定的移植状态的报告。在一些实施例中，公开了一种用于确定移植状态的试剂盒，所述试剂盒被设计为与本文所公开的方法一起使用，所述试剂盒包含多个内部正向引物和任选地多个内部反向引物，其中所述引物中的每一个被设计为与靶染色体上的一个多态性位点的紧邻上游和/或下游的DNA的区杂交，以及任选地与另外的染色体杂交，其中杂交区通过少量碱基与所述多态性位点分离，其中所述少量选自由以下组成的组：1个、2个、3个、4个、5个、6个至10个、11个至15个、16个至20个、21个至25个、26个至30个、31个至60个以及其组合。

在一些实施例中，本文所公开的方法包括选择较短cfDNA的选择步骤。

在一些实施例中，本文所公开的方法包括富集cfDNA的通用应用步骤。

在一些实施例中，dd-cfDNA的量高于截止阈值的确定指示移植的急性排斥。机器学习可以用于解决排斥与非排斥的问题。

在一些实施例中，截止阈值表示为血液样品中的dd-cfDNA的百分比(dd-cfDNA％)。

在一些实施例中，截止阈值表示为每体积单位的血液样品中的dd-cfDNA的拷贝数。

在一些实施例中，截止阈值表示为每体积单位的血液样品中的dd-cfDNA的拷贝数乘以移植受体的体重或血液体积。

在一些实施例中，截止阈值考虑了患者的体重或血液体积。

在一些实施例中，截止阈值考虑了以下一项或多项：供体基因组拷贝/血浆体积、游离DNA产率/血浆体积、供体身高、供体体重、供体年龄、供体性别、供体种族、供体器官质量，供体器官、存活供体与死亡供体、相关供体与不相关供体、受体身高、受体体重、受体年龄、受体性别、受体种族、肌酐、eGFR(估计的肾小球滤过率)、cfDNA甲基化、DSA(供体特异性抗体)、KDPI(肾脏供体特性指数)、药物(免疫抑制剂、类固醇、血液稀释剂等)、感染(BKV、EBV、CMV、UTI)、受体和/或供体HLA等位基因或表位错配，肾同种异体移植病理的Banff分类，以及原因与监测或方案活检。

在一些实施例中，根据所述血液样品中的总cfDNA的量来缩放所述截止阈值。

在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80％的灵敏度。

在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少70％的特异性。

在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80％的灵敏度。在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少85％的灵敏度。在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少90％的灵敏度。在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少95％的灵敏度。

在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少70％的特异性。在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少75％的特异性。在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少85％的特异性。在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少90％的特异性。在一些实施例中，当dd-cfDNA量高于根据血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放的截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少95％的特异性。

多重扩增

在一些实施例中，所述方法包括在确定选择性富集的DNA的序列之前进行多重扩增反应，以在一个反应混合物中扩增多个多态性基因座。

在某些说明性的实施例中，核酸序列数据是通过对使用多重扩增反应生成的一系列扩增子的多个拷贝进行高通量DNA测序生成的，其中所述系列扩增子的每个扩增子跨越了多态性基因座组中的至少一个多态性基因座，并且其中所述组的多态性基因座中的每个都被扩增。例如，在这些实施例中，可以进行多重PCR以扩增跨越至少100个；200个；500个；1,000个；2,000个；5,000个；10,000个；20,000个；50,000个；或100,000个多态性基因座(例如，SNP基因座)的扩增子。此多重反应可以设置为单一反应，也可以设置为不同子集多重反应的池。本文提供的多重反应方法，如本文公开的大规模多重PCR提供了进行扩增反应的示例性过程，以帮助达到改进的多重化，从而达到灵敏度水平。

在一些实施例中，使用直接多重PCR、连续PCR、嵌套PCR、双重嵌套PCR、一侧和半侧嵌套PCR、完全嵌套PCR、一侧完全嵌套PCR、一侧嵌套PCR、半嵌套PCR、半嵌套PCR、三重半嵌套PCR、半嵌套PCR、单侧半嵌套PCR、反向半嵌套PCR方法或单侧PCR进行扩增，其在于2012年11月21日提交的美国申请第13/683,604号，美国公开第2013/0123120号，于2011年11月18日提交的美国申请第13/300,235号，美国公开第2012/0270212号和于2014年5月16日提交的美国序列号61/994,791中进行了描述，所有这些文献特此通过全文引用的方式并入。

在一些实施例中，使用了多重PCR。在一些实施例中，扩增核酸样品中的靶基因座的方法涉及(i)使核酸样品与引物的文库接触，所述引物同时与至少100个；200个；500个；1,000个；2,000个；5,000个；10,000个；20,000个；50,000个；或100,000个不同的靶基因座杂交以产生单个反应混合物；以及(ii)使反应混合物经历引物延伸反应条件(如PCR条件)以产生包含靶扩增子的扩增的产物。在一些实施例中，至少有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的靶向基因座被扩增。在各种实施例中，少于60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％或0.05％的扩增产物是引物二聚体。在一些实施例中，引物位于溶液中(如溶解在液相中而不是固相中)。在一些实施例中，引物位于溶液中，并且没有固定在固相载体上。在一些实施例中，引物不是微阵列的一部分。

在某些实施例中，多重扩增反应至少有1/2的反应是在限制性引物条件下进行的。在一些实施例中，限制性引物浓度用于多重反应的1/10、1/5、1/4、1/3、1/2或全部反应。本文提供了在扩增反应(如PCR)中实现限制性引物条件时需要考虑的因素。

在某些实施例中，多重扩增反应可以包含例如介于2,500个与50,000个之间的多重反应。在某些实施例中，进行以下范围的多重反应：范围低端在100、200、250、500、1000、2500、5000、10,000、20,000、25000、50000之间，范围高端在200、250，500、1000、2500、5000、10,000、20,000、25000、50000和100,000之间。

在一个实施例中，多重PCR测定被设计用于扩增一条或多条染色体上的潜在杂合SNP或其它多态性或非多态性基因座，并且这些测定被用于单一反应来扩增DNA。PCR测定的数量可以在50个与200个PCR检测之间，200个与1,000个PCR测定之间、1,000个与5,000个PCR测定之间或5,000个与20,000个PCR测定之间(分别为50-plex至200-plex、200-plex至1,000-plex、1,000-plex至5,000-plex、5,000-plex至20,000-plex、大于20,000-plex)。在一个实施例中，至少10,000个PCR测定的多重化池(10,000-plex)被设计用于扩增潜在杂合SNP基因座的单一反应以扩增从血液、血浆、血清、固体组织或尿液样品中获得的cfDNA。每个基因座的SNP频率可以通过克隆或一些其它方法对扩增子进行测序来确定。在另一个实施例中，原始cfDNA样品被分为两个样品，并且进行平行5,000-plex测定。在另一个实施例中，原始cfDNA样品被分为n个样品，并且进行平行(约10,000/n)-plex测定，其中n为2与12之间、或12与24之间、或24与48之间或48与96之间。

在一个实施例中，本文公开的方法使用高效的高度多重化的靶向PCR扩增DNA，然后进行高通量测序以确定每个靶基因座处的等位基因频率。允许高度多重化的靶向PCR以高效的方式进行的一种技术涉及设计不太可能相互杂交的引物。PCR探针，通常被称为引物，是通过创建至少100、至少200个、至少500个、至少1,000个、至少2,000个、至少5,000个、至少10,000个、至少20,000个或至少50,000个潜在引物对或引物与样品DNA之间的意外相互作用的热力学模型来选择的，然后用所述模型来消除与池中其它设计不相容的设计。另一种允许高度多重化的靶向PCR以高效方式进行的技术是对靶向PCR使用部分或完全嵌套的方法。使用这些方法中的一种或组合，允许在单个池中多重化至少100个、至少200个、至少500个、至少1，000个、至少2，000个、至少5,000个、至少10,000个、至少20,000个或至少50,000个引物，所得扩增的DNA包括在测序时将映射到靶向基因座的大部分DNA分子。使用这些方法中的一种或组合，允许在单个池中多重化大量引物，所得扩增的DNA包括大于50％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％的DNA分子，所述DNA分子映射到靶向基因座。

使用生物信息学方法分析从多重PCR获得的遗传数据。对本文所公开的方法有用且相关的生物信息学方法可在美国专利公开第2018/0025109号中找到，所述美国专利公开通过引用并入本文。

高通量测序

在一些实施例中，扩增子的序列是通过进行高通量测序来确定的。

移植受体和/或移植供体的遗传数据可以通过使用来自以下组的工具和/或技术测量适当的遗传材料，从分子状态转换为电子状态，所述组包含但不限于：基因分型微阵列和高通量测序。一些高通量测序方法包含Sanger DNA测序、焦磷酸测序、ILLUMINA SOLEXA平台、ILLUMINA的GENOME ANALYZER或APPLIED BIOSYSTEM的454测序平台、HELICOS的TRUESINGLE MOLECULE SEQUENCING平台、HALCYON MOLECULAR的电子显微镜测序方法，或任何其它测序方法。在一些实施例中，高通量测序是在Illumina上进行的，然后进行解复用并映射到人参考基因组上。所有这些方法都将储存在DNA样品中的遗传数据物理地转化为一组遗传数据，所述数据通常储存在存储器装置中，以便进行处理。

在一些实施例中，选择性富集的DNA的序列是通过进行微阵列分析确定的。在一个实施例中，微阵列可以是ILLUMINA SNP微阵列或AFFYMETRIX SNP微阵列。

在一些实施例中，通过进行定量PCR(qPCR)或数字液滴PCR(ddPCR)分析来确定选择性富集的DNA的序列。qPCR测量特定时间(一般在每个扩增循环后)的荧光强度以确定靶分子(DNA)的相对数量。ddPCR测量分子(靶DNA)的实际数量，因为每个分子在一个液滴中，从而使其成为离散的“数字”测量。其提供了绝对定量，因为ddPCR测量样品的阳性分数，也就是由于正确扩增而发出荧光的液滴数量。此阳性分数准确地表明了模板核酸的初始量。

示踪剂DNA以及其用途

用于估计样品中的总cfDNA的量的示踪剂DNA在于2020年5月29日提交的并且题为“用于检测供体源性游离DNA的改进的方法”的美国临时申请第63/031，879号中进行了描述，所述美国临时申请通过全文引用的方式并入本文。在一些实施例中，示踪剂DNA包括合成双链DNA分子。在一些实施例中，示踪剂DNA包括非人来源的DNA分子。

在一些实施例中，示踪剂DNA包括长度为约50bp至500bp、或约75bp至300bp、或约100bp至250bp、或约125bp至200bp、或约125bp、或约160bp、或约200bp或约500bp至1，000bp的DNA分子。

在一些实施例中，示踪剂DNA包括具有相同或基本相同长度的DNA分子，如具有约125bp、或约160bp或约200bp长度的DNA分子。在一些实施例中，示踪剂DNA包括具有不同长度的DNA分子，如具有约125bp长度的第一DNA分子，具有约160bp长度的第二DNA分子，以及具有约200bp长度的第三DNA分子。在一些实施例中，使用具有不同长度的DNA分子来确定所述样品中所述游离DNA的大小分布。

在一些实施例中，示踪剂DNA包括靶序列，其中所述靶序列包括定位在能够与一对引物对结合的一对引物结合位点之间的条形码。在一些实施例中，至少有一部分示踪剂DNA是基于内源性人SNP基因座设计的，通过用条形码取代含有SNP基因座的内源性序列。在mmPCR靶富集步骤中，靶向SNP基因座的引物对也可以扩增含有条形码的示踪剂DNA部分。

在一些实施例中，条形码是任意条形码。在一些实施例中，所述条形码包括能够由相同引物对扩增的对应的内源性基因组序列的反向补体。

在一些实施例中，示踪剂DNA内的靶序列的一侧或两侧由内源性基因组序列侧接。在一些实施例中，示踪剂DNA内的靶序列的一侧或两侧由非内源性序列侧接。

在一些实施例中，示踪剂DNA包括多个靶序列。在一些实施例中，示踪剂DNA包括第一靶序列，所述第一靶序列包括定位在能够与第一对引物结合的第一对引物结合位点之间的第一条形码，以及定位在能够与第二对引物结合的第二对引物结合位点之间的第二条形码。在一些实施例中，第一和/或第二靶序列是基于一个或多个内源性人SNP基因座设计的，通过用条形码取代含有SNP基因座的内源性序列。在一些实施例中，第一和/或第二条形码是任意条形码。在一些实施例中，第一和/或第二条形码包括能够被第一或第二引物对扩增的对应的内源性基因组序列的反向补体。在一些实施例中，示踪剂DNA内的第一和/或第二靶序列的一侧或两侧由内源性基因组序列侧接。在一些实施例中，示踪剂DNA内的第一和/或第二靶序列的一侧或两侧由非内源性序列侧接。

在一些实施例中，示踪剂DNA包括具有相同或基本相同序列的DNA分子。在一些实施例中，示踪剂DNA包括具有不同序列的DNA分子。

在一些实施例中，示踪剂DNA包括第一DNA，所述第一DNA包括第一靶序列，以及第二DNA，所述第二DNA包括第二靶序列。在一些实施例中，第一靶序列和第二靶序列具有定位在相同引物结合位点之间的不同的条形码。在一些实施例中，第一靶序列和第二靶序列具有定位在相同引物结合位点之间的不同的条形码，其中所述不同的条形码具有相同或基本相同的长度。在一些实施例中，第一靶序列和第二靶序列具有定位在相同引物结合位点之间的不同的条形码，其中所述不同的条形码具有不同的长度。在一些实施例中，第一靶序列和第二靶序列是基于不同的内源性人SNP基因座设计的，并且因此包括不同的引物结合位点。在一些实施例中，第一DNA的量和第二DNA的量在示踪剂DNA中是相同的或基本相同。在一些实施例中，第一DNA的量和第二DNA的量在示踪剂DNA中是不同的。

使用示踪剂DNA确定总游离DNA的量

在某些实施例中，示踪剂DNA可以用于提高本文描述的方法的准确度和精度，有助于更大的输入范围内进行定量，评估不同尺寸范围内不同步骤的效率，和/或计算输入材料的片段尺寸分布。

本发明的一些实施例涉及一种定量生物样品中总游离DNA的量的方法，所述方法包括：a)从所述生物样品中分离游离DNA，其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA；b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增；c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段；以及d)使用源自第一示踪剂DNA的测序读段来定量总游离DNA的量。

在一些实施例中，所述方法包括在血浆提取之前将所述第一示踪剂DNA添加到全血样品中。在一些实施例中，所述方法包括在血浆提取之后和分离所述游离DNA之前将所述第一示踪剂DNA添加到血浆样品中。在一些实施例中，所述方法包括将所述第一示踪剂DNA添加到包括所分离的游离DNA的组合物中。在一些实施例中，所述方法包括将衔接子与所分离的游离DNA连接以获得包括衔接子连接的DNA的组合物，并且将所述第一示踪剂DNA添加到包括衔接子连接的DNA的组合物中。

在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述靶向扩增之前添加第二示踪剂DNA。在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述靶向扩增之后添加第二示踪剂DNA。

在一些实施例中，使用示踪剂DNA的NOR(可通过条形码识别)、样品DNA的NOR和添加到血浆样品中的示踪剂DNA的已知量来估计样品中总cfDNA的量。在一些实施例中，使用示踪剂DNA的NOR与样品DNA的NOR之间的比率来定量总游离DNA的量。在一些实施例中，使用条形码的NOR与对应的内源性基因组序列的NOR之间的比率定量总游离DNA的量。在一些实施例中，此信息与血浆体积一起也可用于计算每体积血浆的cfDNA的量。在一些实施例中，这些可以乘以供体DNA的百分比来计算供体cfDNA总量和每体积血浆的供体cfDNA。

因此，另一方面，本发明涉及一种定量生物样品中总游离DNA的量的方法，所述方法包括：a)从所述生物样品中分离游离DNA，其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物；b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增；c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以产生测序读段；以及d)使用源自第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量总游离DNA的量。

在另外的方面，本发明涉及一种定量移植受体的生物样品中供体源性游离DNA的量的方法，所述方法包括：a)从所述移植受体的生物样品中分离游离DNA，其中所述分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA，其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物；b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增；c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以产生测序读段；以及d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量，其中使用源自所述第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量所述总游离DNA的量。

在另外的方面，本发明涉及一种确定移植排斥发生或可能发生的方法，所述方法包括：a)从移植受体的生物样品中分离游离DNA，其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA，其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物；b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增；c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段；d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量，其中使用源自所述第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量所述总游离DNA的量，以及通过将供体源性游离DNA的量与阈值进行比较，使用所述供体源性游离DNA的量来确定移植排斥发生或可能发生，其中所述阈值根据总游离DNA的量确定。

在一些实施例中，所述阈值是所述供体源性游离DNA的测序读段的数量的函数。

在一些实施例中，所述方法进一步包括如果总游离DNA的量超出预定范围，则标记所述样品。在一些实施例中，所述方法进一步包括如果总游离DNA的量高于预定值，则标记所述样品。在一些实施例中，所述方法进一步包括如果总游离DNA的量低于预定值，则标记所述样品。

在一些实施例中，所述方法包括在血浆提取之前将所述第一示踪剂DNA组合物添加到全血样品中。在一些实施例中，所述方法包括在血浆提取之后和分离所述游离DNA之前将所述第一示踪剂DNA组合物添加到血浆样品中。在一些实施例中，所述方法包括将所述第一示踪剂DNA组合物添加到包括所分离的游离DNA的组合物中。在一些实施例中，所述方法包括将衔接子与所分离的游离DNA连接以获得包括衔接子连接的DNA的组合物，并且将所述第一示踪剂DNA组合物添加到包括衔接子连接的DNA的组合物中。

在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述靶向扩增之前添加第二示踪剂DNA组合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述靶向扩增之后添加第二示踪剂DNA组合物。

在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括具有不同序列的多个DNA分子。

在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括具有不同浓度的多个DNA分子。

在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括具有不同长度的多个DNA分子。在一些实施例中，使用具有不同长度的多个DNA分子来确定所述样品中所述游离DNA的大小分布。

在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括非人来源的多个DNA分子。

在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物各自包括靶序列，其中所述靶序列包括定位在一对能够与其中一对引物对结合的引物结合位点之间的条形码。在一些实施例中，所述条形码包括能够由相同引物对扩增的对应的内源性基因组序列的反向补体。

在一些实施例中，使用所述示踪剂DNA的读段数量与样品DNA读段数量之间的比率来定量总游离DNA的量。在一些实施例中，使用所述条形码的读段数量与所述对应的内源性基因组序列的读段数量之间的比率定量总游离DNA的量。

在一些实施例中，所述靶序列的一侧或两侧由内源性基因组序列侧接。在一些实施例中，所述靶序列的一侧或两侧由非内源性序列侧接。

在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括合成双链DNA分子。在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为50bp至f500 bp的DNA分子。在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为75bp至300bp的DNA分子。在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为100bp至250bp的DNA分子。在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为125bp至200bp的DNA分子。在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为约200bp的DNA分子。在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为约160bp的DNA分子。在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为约125bp的DNA分子。在一些实施例中，所述第一示踪剂DNA组合物和/或所述第二示踪剂DNA组合物包括长度为500bp至1，000bp的DNA分子。

在一些实施例中，所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少100个多态性或SNP基因座。在一些实施例中，所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少200个多态性或SNP基因座。在一些实施例中，所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少500个多态性或SNP基因座。在一些实施例中，所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少1，000个多态性或SNP基因座。在一些实施例中，所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少2,000个多态性或SNP基因座。在一些实施例中，所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少5，000个多态性或SNP基因座。在一些实施例中，所述靶向扩增包括在单个反应体积中扩增至少10，000个多态性或SNP基因座。

在一些实施例中，每个引物对被设计成扩增约35bp至200bp的靶序列。在一些实施例中，每个引物对被设计成扩增约50bp至100bp的靶序列。在一些实施例中，每个引物对被设计成扩增约60bp至75bp的靶序列。在一些实施例中，每个引物对被设计成扩增约65bp的靶序列。

在一些实施例中，移植受体是人受试者。在一些实施例中，移植受体接受了同种异体移植。在一些实施例中，移植受体接受了异种移植。

在一些实施例中，所述移植是人移植。在一些实施例中，所述移植是猪移植。在一些实施例中，所述移植来自非人动物。

在一些实施例中，所述移植是器官移植、组织移植或细胞移植。在一些实施例中，所述移植是肾移植、肝移植、胰腺移植、肠移植、心脏移植、肺移植、心脏/肺移植、胃移植、睾丸移植、阴茎移植、卵巢移植、子宫移植、胸腺移植、面部移植、手移植、腿移植、骨移植、骨髓移植、角膜移植、皮肤移植、胰岛细胞移植、心脏瓣膜移植、血管移植或输血。

在一些实施例中，所述方法进一步包括将所述移植排斥确定为抗体介导的移植排斥、T细胞介导的移植排斥、移植损伤、病毒感染、细菌感染或边界排斥(borderlinerejection)。在一些实施例中，所述方法进一步包括确定一种或多种癌症的可能性。癌症筛查、检测和监测在PCT专利公开第WO2015/164432号、第WO2017/181202号、第WO2018/083467号和第WO2019/200228号中公开，所述专利公开每个通过全文引用的方式并入本文。在其它实施例中，本发明涉及筛查患者以确定其对一种或多种癌症治疗的预期应答性或抵抗力。可以通过确定靶基因的野生型与突变形式的存在，或者在一些情况下，靶基因的增加或过度表达来进行此确定。此类靶筛查的实例包含KRAS、NRAS、EGFR、ALK、KIT等。例如，多种KRAS突变适合根据本发明进行筛查，包含但不限于G12C、G12D、G12V、G13C、G13D、A18D、Q61H、K117N。另外，PCT专利公开第WO2015/164432号、第WO2017/181202号、第WO2018/083467号和第WO2019/200228号通过全文引用的方式并入本文。

在一些实施例中，在不预先了解供体基因型的情况下进行所述方法。在一些实施例中，在不预先了解受体基因型的情况下进行所述方法。在一些实施例中，在不预先了解供体和/或受体基因型的情况下进行所述方法。在一些实施例中，在进行所述方法之前，不需要所述供体或所述受体的基因分型。

在一些实施例中，所述生物样品是血液样品。在一些实施例中，所述生物样品是血浆样品。在一些实施例中，所述生物样品是血清样品。在一些实施例中，所述生物样品是尿液样品。在一些实施例中，所述生物样品是淋巴液的样品。在一些实施例中，所述样品是固体组织样品。

在一些实施例中，所述方法进一步包括从所述移植受体纵向收集多个生物样品，并对收集的每个样品重复步骤(a)至(d)。

在一些实施例中，所述定量步骤包括确定所述血液样品中供体源性游离DNA占供体源性游离DNA和受体源性游离DNA总量的百分比。在一些实施例中，所述定量步骤包括确定供体源性游离DNA的拷贝数。在一些实施例中，所述定量步骤包括确定每体积单位所述血液样品中供体源性游离DNA的拷贝数。

另一方面，本发明涉及一种诊断移植受体内的移植发生急性排斥的方法，所述方法包括：a)从移植受体的生物样品中分离游离DNA，其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA，其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物；b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增；c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段；d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量，其中供体源性游离DNA的量高于阈值表示所述移植正在发生急性排斥，其中所述阈值根据总游离DNA的量确定，并且其中使用源自所述第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量总游离DNA的量。

另一方面，本发明涉及一种监测移植受体的免疫抑制疗法的方法，所述方法包括：a)从移植受体的生物样品中分离游离DNA，其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA，其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物；b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座进行靶向扩增；c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段；d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量，其中供体源性游离DNA的水平在一段时间间隔内的变化表示移植状态，其中供体源性游离DNA的水平根据总游离DNA的量缩放，并且其中使用源自所述第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量总游离DNA的量。

在一些实施例中，所述方法进一步包括大小选择以富集供体源性游离DNA并减少从破裂的白细胞中安置的受体源性游离DNA的量。

在一些实施例中，所述方法进一步包括通用扩增步骤，所述通用扩增步骤优先地扩增供体源性游离DNA，而不是源于破裂或凋亡的白细胞的受体源性游离DNA。

在一些实施例中，所述方法包括在移植后从所述移植受体纵向收集多个血液、血浆、血清、固体组织或尿液样品，并且对收集的每个样品重复步骤(a)至(d)。在一些实施例中，所述方法包括在约三个月、或约六个月、或约十二个月、或约十八个月或约二十四个月等时间段内收集和分析来自所述移植受体的血液、血浆、血清、固体组织或尿液样品。在一些实施例中，所述方法包括以约一周、或约两周、或约三周、或约一个月、或约两个月或约三个月等的间隔从所述移植受体收集血液、血浆、血清、固体组织或尿液样品。

在一些实施例中，dd-cfDNA的量高于截止阈值的确定指示移植的急性排斥。机器学习可以用于解决排斥与非排斥的问题。机器学习在于2019年7月16日作为PCT/US2019/041981提交的标题为“使用神经网络判定多倍体状态的方法和系统(Methods and Systemsfor calling Ploidy States using a Neural Network)”的WO2020/018522中公开，所述文献通过全文引用的方式并入本文。在一些实施例中，根据所述血液样品中的总cfDNA的量来缩放所述截止阈值。

在一些实施例中，截止阈值表示为血液样品中的dd-cfDNA的百分比(dd-cfDNA％)。在一些实施例中，截止阈值表示为dd-cfDNA的量或绝对量。在一些实施例中，截止阈值表示为每体积单位的血液样品中的dd-cfDNA的量或绝对量。在一些实施例中，截止阈值表示为每体积单位的血液样品中的dd-cfDNA的量或绝对量乘以移植受体的体重、BMI或血液体积。

在一些实施例中，截止阈值考虑了所述患者的体重、BMI或血液体积。在一些实施例中，所述截止阈值考虑了以下一项或多项：供体基因组拷贝/血浆体积、游离DNA产率/血浆体积、供体身高、供体体重、供体年龄、供体性别、供体种族、供体器官质量，供体器官、存活供体与死亡供体，供体与受体的家族关系(或缺乏)，受体身高、受体体重、受体年龄、受体性别、受体种族、肌酐、eGFR(估计的肾小球滤过率)、cfDNA甲基化、DSA(供体特异性抗体)、KDPI(肾脏供体特性指数)、药物(免疫抑制剂、类固醇、血液稀释剂等)、感染(BKV、EBV、CMV、UTI)、受体和/或供体HLA等位基因或表位错配，肾同种异体移植病理的Banff分类，以及原因与监测或方案活检。

在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少50％的灵敏度。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少60％的灵敏度。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少70％的灵敏度。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80％的灵敏度。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少85％的灵敏度。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少90％的灵敏度。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少95％的灵敏度。

在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少50％的特异性。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少60％的特异性。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少70％的特异性。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少75％的特异性。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少80％的特异性。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少85％的特异性。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少90％的特异性。在一些实施例中，当所述dd-cfDNA量高于根据所述血液样品中的总cfDNA的量和95％的置信区间缩放或调整的所述截止阈值时，所述方法在识别急性排斥(AR)方面相对于非AR具有至少95％的特异性。

使用总游离DNA的量调节判定移植排斥的阈值

本发明的一些实施例涉及一种定量移植受体的生物样品中供体源性游离DNA的量的方法，所述方法包括：a)从所述移植受体的生物样品中分离游离DNA，其中所分离的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA，其中在分离所述游离DNA之前或之后添加第一示踪剂DNA组合物；b)使用100个或更多个不同的引物对在单个反应体积中的100个或更多个不同的靶基因座处进行靶向扩增；c)通过高通量测序对所述扩增产物进行测序以生成测序读段；以及d)定量供体源性游离DNA的量和总游离DNA的量，其中使用源自所述第一示踪剂DNA组合物的测序读段来定量所述总游离DNA的量。

一些实施例使用每个血浆体积的供体DNA的固定阈值或不固定的阈值，如本文所述的调节或缩放。确定该阈值的方式可以基于使用训练数据集来建立算法，以最大化性能。其也可以考虑其它数据，如患者的体重、年龄或其它临床因素。

在一些实施例中，所述方法进一步包括使用供体源性游离DNA的量确定移植排斥发生或可能发生。在一些实施例中，将供体源性游离DNA的量与截止阈值进行比较以确定移植排斥发生或可能发生，其中所述截止阈值根据总游离DNA的量进行调节或缩放。在一些实施例中，截止阈值是供体源性游离DNA的读段数量的函数。

在一些实施例中，所述方法包括应用考虑到样品中总cfDNA量的缩放或动态阈值指标，以更准确地评估移植排斥。在一些实施例中，所述方法进一步包括如果总游离DNA的量高于预定值，则标记所述样品。在一些实施例中，所述方法进一步包括如果总游离DNA的量低于预定值，则标记所述样品。

工作实例

实例1

此非限制性实例的工作流程对应于Sigdel等人，《临床医学杂志(J.Clin.Med.)》8(1)：19(2019)中所公开的工作流程，所述文献通过全文引用的方式并入本文。此实例只是说明性的，并且熟练的技术人员将理解，本文公开的发明可以用各种其它方式实施。

血液样品

男性和女性成人或年轻成人患者接受来自有亲属关系或无亲属关系的活体供体或无亲属关系的已故供体的肾脏。移植外科手术后患者抽血的时间点是在同种异体移植活检时或基于实验室方案的各种预先指定的时间间隔。通常，样品是活检匹配的，并且在临床功能障碍和活检时或在方案活检时抽血(此时大多数患者没有临床功能障碍)。另外，一些患者在移植后连续抽血。研究样品的选择是基于(a)有足够的血浆可用，和(b)样品是否与活检信息相关联。在全部300个样品队列中，72.3％是在活检当天抽取的。

血液样品中的dd-cfDNA测量

使用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从血浆样品中提取游离DNA，并且在LabChip NGS 5k试剂盒(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA))上按照制造商的说明进行定量。游离DNA使用NateraLibrary Prep试剂盒输入文库制备，如Abbosh等人，《自然(Nature)》545：446-451(2017)中描述的，其中对文库扩增的18个循环进行修饰，使文库达到稳定状态。使用LabChip NGS 5k对纯化的文库进行定量，如Abbosh等人，《自然》545：446-451(2017)中描述的。靶标富集是使用大规模多重PCR(mmPCR)完成的，所述mmPCR使用Zimmermann等人，《产前诊断(Prenat.Diagn.)》32：1233-1241(2012)中描述的修改版本，其中靶向13，392个单核苷酸多态性(SNP)。然后，在Illumina HiSeq 2500Rapid上对扩增子进行测序，50个循环单端，每个样品有1000万至1100万个读段。

dd-cfDNA和eGFR的统计分析

在每个样品中，dd-cfDNA被测量并与排斥状态相关联，并且结果与eGFR进行比较。在适用的情况下，所有的统计测试都是双侧的。显著性设定为p＜0.05。由于患者的dd-cfDNA在各组中的分布严重偏斜，因此使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)秩和检验，然后进行邓恩(Dunn)多重比较检验与霍尔姆(Holm)校正分析数据。eGFR(血清肌酐，单位为mg/dL)的计算方法如前所述，用于成人和儿童患者。简而言之，eGFR＝186×血清肌酐^-1.154×年龄^-0.203×(如果是黑色人种为1.210)×(如果是女性为0.742)。

为了评估dd-cfDNA和eGFR(毫升/分钟/1.73平方米)作为排斥标志物的性能，将样品分为AR组和非排斥组(BL+STA+OI)。使用此分类，以下预定的临界被用来将样品归类为AR：对于dd-cfDNA，＞1％，并且对于eGFR，＜60.0。

为了计算每个标志物的性能参数(灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和曲线下面积(AUC))，采用了自举法来计算患者体内的重复测量。简而言之，在每个自举步骤中，从每位患者中选择单个样品；通过假设患者之间的独立性，计算性能参数以及其标准误差。这样重复10,000次；最终置信区间是用参数的自举平均数和自举标准误差的平均值来计算的，并且具有标准正态分位数。灵敏度和特异性的标准误差是在假设二项分布的情况下计算的；对于PPV和NPV，使用正态近似值；对于AUC，使用德龙(DeLong)方法。对具有匹配活检的所有样品进行了性能计算，包含由与方案活检同时抽取的样品组成的子队列。

还评估了供体类型(活体有亲属关系、活体无亲属关系和已故无亲属关系)的dd-cfDNA水平的差异。如上所述，使用克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验来确定显著性。使用对dd-cfDNA进行对数转换的混合效应模型来评估dd-cfDNA随时间的相互和内部变异性；使用似然曲线法计算患者内和患者间标准偏差的95％置信区间(CI)。

事后分析评估了(a)不同的dd-cfDNA阈值以最大化NPV和(b)结合dd-cfDNA和eGFR来定义可能提高AR诊断的PPV的经验排斥区。所有分析都是使用R 3.3.2进行的，使用FSA(用于邓恩检验)、lme4(用于混合效应建模)和pROC(用于AUC计算)包。

活检样品

任选地，病理学家以盲检方式分析肾活检，并根据2017Banff主动排斥分类(AR)进行分级；进行移植内C4d染色以评估急性体液排斥。在活性尿路感染(UTI)或其它感染的情况下，不进行活检。移植“损伤”被定义为血清肌酐较之前的稳态基线值增加＞20％，并且相关联的活检被归类为主动排斥(AR)、边界排斥(BL)或其它损伤(OI)(例如，药物毒性、病毒感染)。主动排斥至少由以下标准来定义：(1)T细胞介导的排斥(TCMR)，由以下组成：小管炎(t)评分＞2，伴有间质炎症(i)评分＞2或血管变化(v)评分＞0；(2)C4d阳性抗体介导的排斥(ABMR)，由以下组成：供体特异性抗体(DSA)阳性，肾小球炎(g)评分＞0或管周毛细血管炎(ptc)评分＞0或v＞0，伴有不明原因的急性肾小管坏死/血栓性微血管病(ATN/TMA)，C4d＝2；或(3)C4d阴性ABMR，由以下组成：DSA阳性，有不明原因的ATN/TMA，g+ptc≥2，C4d为0或1。临界变化(BL)由t1+i0，或t1+i1，或t2+i0定义，没有明确原因(例如，多瘤病毒相关的肾病(PVAN)/感染性原因/ATN)。用于BL变化的其它标准是g＞0和/或ptc＞0，或v＞0而无DSA，或C4d或DSA阳性，或C4d阳性而没有非零g或ptc评分。正常(STA)同种异体移植的定义是没有Banff模式所定义的明显损伤病理。

实例2

此实例只是说明性的，熟练的技术人员将理解，本文公开的发明可以用各种其它方式实施。实例1中所描述的工作流程通过在提取游离DNA之前向血浆样品中添加一种或多种示踪剂DNA来修改，每种所述示踪剂DNA都含有SNP基因座，如在于2020年5月29日提交的并且题为“用于检测供体源性游离DNA的改进的方法”的美国临时申请第63/031,879号中所描述的，所述美国临时申请通过全文引用的方式并入本文。在mmPCR靶富集步骤期间，靶向SNP基因座的引物对也会扩增示踪剂DNA。使用示踪剂DNA(可通过条形码鉴定)的序列读段数量、样品DNA的序列读段数量和添加到血浆样品的已知量的示踪剂DNA来估计样品中的总cfDNA的量。

实例3

细环病毒(TTV)是一种非致病性且普遍存在的病毒，与实体器官移植受体的免疫抑制和移植物排斥相关。定量了肾脏移植受体(n＝687)和健康正常对照(n＝56)的血浆TTV滴度拷贝/mL(cps/mL)。在移植后的前3个月期间，TTV滴度急剧增加了大约4个对数倍，然后略有下降并随着时间的推移趋于稳定。较低的TTV水平显著对应于同种异体移植物排斥的高风险(中值7.49E+04，如与低风险排斥(中值7.70E+05)(p＜0.001)相比的。对移植后≤18个月(n＝82)具有活检排斥数据的移植样品的亚组的逻辑回归分析显示，与单独DFE+(AUC＝0.87)或单独TTV(AUC＝0.72)相比，当将TTV滴度与供体分数估计(DFE)加供体源性游离DNA、移植后时间、年龄和性别(DFE+)组合时，曲线下面积(AUC)增加到AUC＝0.89。在移植后≤18个月的亚组中，当与DFE+相比时，TTV的添加增加了灵敏度(0.84，95％CI[0.64，0.95]与0.80，95％CI[0.59，0.93])和特异性(0.86，95％CI[0.74，0.94]与0.82，95％CI[0.70，0.91])。总的来说，这些结果表明TTV是一种与免疫抑制和同种异体移植物排斥相关的非侵入性生物标志物。

背景技术。移植医师在评估其患者的免疫抑制的净状态方面仍然面临挑战，这是移植前病状、诱导和维持免疫抑制方案、移植物功能、抗排斥疗法、营养状态和潜在合并症之间复杂相互作用的结果。免疫抑制剂的治疗药物监测似乎是当前临床实践中使用最广泛的策略。然而，这种方法本质上是严格的药代动力学，并且不能捕捉到给定浓度下T细胞应答的个体间变异性，或组合免疫抑制方案的协同效应。在实体器官移植受体中，开发反映免疫抑制状态的非侵入性生物标志物以调节维持性免疫抑制的移植需求仍未得到满足。

TTV是一种高度流行的非致病性单链DNA病毒，其血浆水平可能与宿主的免疫状态相关。若干项研究报告称，同种异体移植受体的TTV血浆DNA水平显著增加，并且表明升高的病毒滴度与免疫抑制和移植相关并发症(如排斥)相关。因此，主要目的是确定TTV滴度是否与免疫抑制和肾脏移植排斥风险相关。

方法

患者样品。肾脏移植受体血浆或cfDNA样品(来自Prospera测试的n＝687)用于筛选TTV。健康人血浆购自创新研究公司(Innovative Research)。所有样品均来自基于美国的诊所，并且患者同意进行研究使用。移植后的时间范围为10天至40年，其中中值为9个月。已知总cfDNA、供体状态、供体关系、性别和供体分数估计。在样品的亚组中，根据BANFF分类，也有组织学、活检证实的移植物排斥状态和临床解释。

从血浆中提取核酸。使用两种核酸提取方法从人血浆中提取DNA和RNA。首先，使用MagMAX^TM病毒/病原核酸分离试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)，目录号A42352)根据制造商的手册从300μl血浆中分离DNA和RNA，并且在KingFisherFlex提取仪器(赛默飞世尔科技公司)上将方案自动化。简而言之，将10μl蛋白酶K、530μl结合溶液和20μl总核酸磁珠添加到300μl血浆中，温育12分钟，用洗涤缓冲液和80％乙醇进行珠洗涤，并且在50μl洗脱溶液中洗脱核酸。第二种核酸分离方法是Natera公司(Natera)的内部提取方法。

TTV引物、探针和参考设计。为了定量TTVDNA，用引物和探针组开发了TTV定量PCR(qPCR)测定，其基于Okamoto，Hiroaki等人，“不同基因型的TT病毒在来自受感染人类的多个组织中的异质分布(Heterogeneous distribution of TT virus of distinctgenotypes in multiple tissues frominfected humans)”.《病毒学(Virology)》288.2(2001)：358-368的设计。引物和探针设计在TTV病毒基因型1a的全基因组的5′-UTR(核苷酸位置3075-3853和1-352)的高度保守区上(GenBank：AB017610.1)(表1)。对基因组数据库NCBI RefSeq中的引物的分析表明，这些TTV引物估计覆盖93％的指环病毒科(Anelloviridae)菌株。

在Okamoto等人的论文中，正向和反向引物具有两个不完全指定的碱基(表1)。Okamoto正向引物的符号为“D”，其可以是A、G或T，并且反向引物的符号为“R”，其可以是A或G。用核苷酸“A”取代了这两个符号，以匹配TTV病毒基因型1a的序列。另外，对于探针，将单TAMRA淬灭剂切换为ZEN/Iowa Black(3′IABkFQ)的双淬灭探针，与单淬灭探针相比，背景减少，并且性能优越(表1)。

商用TTV参考DNA在进行此实验时不可用。TTV的体外转录已经在多种细胞系中进行了研究，并且很难实现导致病毒产生的长期复制。学术实验室已经通过将序列克隆到载体中来扩增TTV基因组，但在实验时这些还无法用于工业用途。因此，设计了5′UTR的同等保守的序列，作为覆盖约83％不同TTV亚株的TTVqPCR测定的参考标准。此500bp gBlock包含与引物和探针匹配的核苷酸位置(表1)。引物、探针和gBlock由IDT公司(IDT)制造。

TTV定量。通过qPCR，使用以下对TTVDNA进行定量：5μl核酸溶液作为模板，400nM正向/反向引物、80nM探针、TaqMan^TM Fast Advanced Master Mix(赛默飞世尔科技公司，目录号4444964)、分子级水，并且将TaqMan^TM外源性内部阳性对照(IPC)试剂(赛默飞世尔科技公司，目录号4308321)掺入25μl反应体积中。qPCR循环条件为1)尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)激活在50℃下保持2分钟，2)AmpliTaq^TM Fast DNA聚合酶激活95℃下保持2分钟，以及3)40个循环的PCR，其中变性步骤在95℃下进行1秒，退火/延伸步骤在60℃下进行20秒。所有反应均在QuantStudio6(赛默飞世尔科技公司)中进行。荧光通道是存在TaqMan^TMFastAdvancedMasterMix中的TTV靶核酸的FAM、IPC的VIC、淬灭剂的NFQ-MGB和被动参考的ROX。每个反应板镀有TTV参考gBlock标准品，所述标准品由1E+07、1E+06、1E+05、1E+04、1E+03、1E+02个拷贝/mL(cps/mL)和三个阴性对照组成：分子级水、细胞系DNA(10ng/mL)和无扩增对照IPC Block。TTVqPCR测定的定量检测范围为Log 1E+03至1E+10cps/mL，并且在25μlPCR反应中，理论检测限(LOD)为1个拷贝，其对应于300μl血浆中存在33个拷贝。

统计和数据分析。绘制移植后TTV滴度随时间变化的双变量分析，以观察病毒载量动力学。使用正则化逻辑回归模型来估计移植物排斥与TTV滴度之间的相关性的效应大小。在数据集的亚组上评估了若干种统计测试(曼-惠特尼(Mann-Whitney)、曼特尔-亨塞尔(Mantel-Haenszel))、基于阈值的模型和机器学习模型(决策树、逻辑回归和随机森林)。使用特征重要性分析和灵敏度/特异性比较来确定TTV在预测排斥中的重要性。各种模型被用作统计和机器学习测试的正交方法。测试与模型之间的一致性可以为发现提供更多的置信度。QuantStudio软件v1.7.2、JMP 12、R和Jupyter应用于数据分析和图形绘制。

多参数AI方法的描述。为了定量TTV滴度对排斥预测的质量的另外的影响，在其它特征不变的情况下，将TTV作为特征并入的机器学习模型与没有TTV的模型进行比较。其它特征包含DFE、dd-cfDNA量、受体年龄、受体性别、供体状态、供体/受体关系和移植后时间。对于逻辑回归，使用对训练集的交叉验证来导出L2正则化参数。对于随机森林，为了避免过度拟合，选择了较小的树的最大深度。所有模型都在测试集上进行了评估。比较了以上模型之间的曲线下面积(AUC)、各种阈值的灵敏度和特异性，所述模型要么将TTV作为特征并入，要么不将其作为特征并入。还将以上结果与基于阈值的模型进行了比较，所述基于阈值的模型直接使用DFE、dd-cfDNA量和TTV作为预测因子。

结果

移植后TTV载量在前3个月达到峰值。开发了TTV qPCR测定来测量人血浆中的TTV滴度拷贝/mL(cps/mL)。使用TTV qPCR测定来筛选肾脏移植受体(n＝68)和健康、正常对照(n＝56)血浆样品。使用MagMAX^TM病毒/病原核酸分离试剂盒从75％的移植受体血浆样品和所有对照中提取病毒核酸。使用Natera公司的内部提取方法从第二队列的活检匹配的样品中提取核酸。在Prospera和TTV筛查时，在移植后10天至26年之间收集血浆。97％的移植受体的样品中存在TTV，而在健康、正常对照中为61％。

移植受体的TTV滴度水平(范围＝0至2.24E+10cps/mL；中值＝4.25E+05cps/mL)显著高于正常对照(范围＝0至1.49E+05cps/mL；中值＝3.20E+02cps/mL，p≤1.08E-08)(图1)。较高的TTV滴度反映了这样的事实，即大多数(如果不是所有话)移植受体都受到免疫抑制。在移植后的前3个月期间，TTV滴度急剧增加了大约4个对数倍，然后略有下降并随着时间的推移趋于稳定(图1)。这可能对应于诱导并且然后维持免疫抑制疗法方案。

较低的TTV水平对应于同种异体移植物排斥的高风险。为了确定TTV是否有可能预测移植物排斥的风险，比较了高或低同种异体移植物排斥风险之间的TTV滴度。排斥风险由DFE根据患者的Prospera结果确定，所述Prospera是Natera公司的移植排斥评估测试，所述测试测量供体源性游离DNA(dd-cfDNA)。较低的TTV水平显著对应于高风险排斥(中值7.49E+04，如与低风险排斥(中值7.70E+05)(p＜0.001)相比的(图2)。同种异体移植物排斥的高风险表明增加的免疫活性，同时具有较低的TTV载量。

TTV提供了Prospera灵敏度和特异性的改善。旨在评估TTV是否与排斥相关。如果是这样，可以使用此生物标志物来改善Prospera调用，使其具有增加的灵敏度和特异性。具有特定亚组的样品(n＝171)的活检证实的排斥信息。这些样品是假阴性(n＝20)、假阳性(n＝21)、真阴性(n＝84)和真阳性(n＝47)样品的混合物。来自此样品集的Prospera结果的产生了70.1％的灵敏度，80.0％的特异性，69.1％的PPV和80.8％的NPV。

曼-惠特尼和曼特尔-亨塞尔统计测试以及基于阈值的决策树、逻辑回归和随机森林机器学习测试确定了在分析整格样品集时，TTV并没有显著提高灵敏度和/或特异性。假设移植后11天至25年的大范围时间为TTV滴度的数据集添加了相当大的噪音。诱导疗法和维持免疫抑制方案在移植后的前18个月达到其最高剂量。如文献所示，这提供了最大水平的免疫抑制和对TTV滴度的最大影响。因此，对移植后≤18个月的样品的亚组(n＝82)进行了逻辑回归和随机森林机器学习分析。

在移植后≤18个月的样品的亚组中，基于逻辑回归的接受者工作特性(ROC)曲线显示，当将TTV滴度与DFE+组合时，与单独的DFE+(AUC＝0.87)或单独的TTV(AUC＝0.72)相比，AUC增加到AUC＝0.89(图3)。与单独的DFE+相比，TTV在基于逻辑回归的模型中增加了灵敏度(0.84，95％CI[0.64，0.95]与0.80，95％CI[0.59，0.93])和特异性(0.86，95％CI[0.74，0.94]与082，95％CI[0.70，0.91])。应注意，这些初步结果来自小样品集，并且由于TTV滴度的患者间变异性，置信区间很宽。对纵向样品进行的另外的研究将进一步定量TTV可以为Prospera增加的值。

总结。TTV阳性移植血浆样品的百分比、TTV滴度范围和动力学与文献一致，这表明TTV qPCR检测是灵敏且稳健的。发现较低的TTV水平与同种异体移植物排斥的高风险显著对应。此外，发现在移植后≤18个月的样品中，与单独的DFE+相比，TTV增加了ProsperaAUC，其中具有增加的灵敏度和特异性。总之，数据为TTV定量作为免疫抑制和移植物排斥风险分层的非侵入性生物标志物与Prospera联合应用的价值提供了证据，其中在移植后18个月内具有最大的效用。

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序列表

<110> 纳特拉公司（NATERA, INC.）

<120> 用于确定移植排斥的方法

<130> LHB2367578P

<140> PCT/US2022/020640

<141> 2022-03-16

<150> 63/162,750

<151> 2019-03-18

<150> 63/314,647

<151> 2022-02-28

<160> 7

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

cgggtgccga aggtgagttt acac 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<213> n是a、g或t

<400> 2

cgggtgccgn aggtgagttt acac 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 3

gagccttgcc catagcccgg ccag 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n是a或g

<400> 4

gagccttgcc catngcccgg ccag 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 5

agtcaagggg caattcgggc tcggga 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 6

agtcaagggg caattcgggc tcggga 26

<210> 7

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 7

attttgctac gtcactaacc acgtgacacc cacaggccaa ccgaatgcta tgtcatccat 60

ttcctgggcc gggtctacgt cctcatataa gtaagtgcac ttccgaatgg ctgagttttc 120

cacgcccgtc cgcagcggtg aagccacgga gggagatctc cgcgtcccga gggcgggtgc 180

cgaaggtgag tttacacacc gaagtcaagg ggcaattcgg gctcgggact ggccgggcta 240

tgggcaaggc tctgaaaaaa gcatgtttat tggcaggcat tacagaaaga aaagggcgct 300

gtcactgtgt gctgtgcgaa caacaaagaa ggcttgcaaa ctactaatag taatgtggac 360

cccacctcgc aatgatcaac actaccttaa ctggcaatgg tactcaagta tacttagctc 420

ccacgctgct atgtgcgggt gtcccgacgc tgtcgctcat tttaatcatc ttgcttctgt 480

gcttcgtgcc ccgcaaaacc 500

Claims

1.一种制备源自移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品的扩增的DNA的组合物的方法，所述方法可用于确定移植排斥，所述方法包括：

(a)从所述移植受体的所述血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA，其中所提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；

(b)通过生单个反应体积中生200个至50,000个靶基因座处对所述所提取的DNA进行靶向扩增来制备扩增的DNA的组合物，并且通过高通量测序对所述扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量供体源性游离DNA的量；

(c)测量所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(Torquetenovirus，TTV)的量；以及

(d)确定供体源性游离DNA的量或其函数是否超过指示移植排斥的截止阈值以及所述移植受体是否具有指示减少或增加的免疫应答的增加或减少的量的TTV。

2.一种制备源自移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品的扩增的DNA的组合物的方法，所述方法可用于确定移植排斥，所述方法包括：

(b)通过在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增来制备扩增的DNA的组合物，并且通过高通量测序对所述扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量供体源性游离DNA的量和细环病毒(TTV)的量；以及

(c)确定供体源性游离DNA的量或其函数和TTV的量或其函数的组合是否超过指示移植排斥的截止阈值。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述TTV是细环病毒1。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述移植受体是人受试者。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述移植受体已经按受一个或多个选自以下的移植的器官：胰腺、肾脏、肝脏、心脏、肺、肠、胸腺和子宫。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过定量PCR、实时PCR、数字PCR或测序来测量TTV的量。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述靶基因座包括单核苷酸多态性(SNP)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括使用200对至50,000对正向和反向PCR引物对200个至50,000个靶基因座进行PCR扩增；任选地其中步骤(b)包括使用500对至20,000对正向和反向PCR引物对500个至20,000个靶基因座进行PCR扩增。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述截止阈值是供体源性游离DNA占总游离DNA的估计的百分比或其函数。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述截止阈值与绝对供体源性游离DNA浓度成比例。

11.一种在移植受体中施用免疫抑制疗法的方法，所述方法包括：

(a)测量所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(TTV)的量；以及

(b)测量所述移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量；以及

(c)根据TTV的量或其函数以及供体源性游离DNA的量或其函数来滴定免疫抑制疗法的剂量。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述TTV是细环病毒1。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述移植受体是人受试者。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述移植受体已经接受一个或多个选自以下的移植的器官：胰腺、肾脏、肝脏、心脏、肺、肠、胸腺和子宫。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中通过定量PCR、实时PCR、数字PCR或测序来测量TTV的量。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中供体源性游离DNA的量通过以下方式测量：

从所述移植受体的所述血液、血浆、血清或尿液样品中提取游离DNA，其中所提取的游离DNA包括供体源性游离DNA和受体源性游离DNA；

在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增；

通过高通量测序对扩增的DNA进行测序以获得测序读段；以及基于所述测序读段定量供体源性游离DNA的量。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其进一步包括对同一移植受体纵向重复步骤(a)至(b)，并且确定TTV的量或其函数的纵向变化和供体源性游离DNA的量或其函数的纵向变化。

18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括根据TTV的量或其函数的所述纵向变化和供体源性游离DNA的量或其函数的所述纵向变化来滴定所述免疫抑制疗法的剂量。

19.根据权利要求18所述的方法，其包括如果所述移植受体具有纵向减少的量的TTV和纵向增加的量的供体源性游离DNA，则增加免疫抑制疗法的剂量。

20.根据权利要求18所述的方法，其包括如果所述移植受体具有纵向增加的量的TTV和纵向减少的量的供体源性游离DNA，则减少免疫抑制疗法的剂量。

21.一种制备源自移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品的扩增的DNA的组合物的方法，所述方法可用于确定移植排斥，所述方法包括：

(b)通过在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增来制备扩增的DNA的组合物，并且通过高通量测序对所述扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量所述血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比；

(c)测量所述移植受体的所述血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(TTV)DNA的量；以及

(d)基于供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比，以及所述移植受体的所述血液、血浆、血清或尿液样品中的TTV DNA的量来确定所述移植受体的排斥风险。

22.一种制备源自移植受体的血液、血浆、血清或尿液样品的扩增的DNA的组合物的方法，所述方法可用于确定移植排斥，所述方法包括：

(b)通过在单个反应体积中在200个至50,000个靶基因座处对所提取的DNA进行靶向扩增来制备扩增的DNA的组合物，并且通过高通量测序对所述扩增的DNA进行测序以获得测序读段，并且基于所述测序读段定量所述血液、血浆、血清或尿液样品中的供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的估计的百分比，以及所述血液、血浆、血清或尿液样品中的细环病毒(TTV)DNA的量；以及

(c)基于供体源性游离DNA的量和/或供体源性游离DNA占总游离DNA的百分比，以及所述移植受体的所述血液、血浆、血清或尿液样品中的TTVDNA的量来确定所述移植受体的排斥风险。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述TTV是细环病毒1。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述移植受体是人受试者。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述移植受体已经按受一个或多个选自以下的移植的器官：胰腺、肾脏、肝脏、心脏、肺、肠、胸腺和子宫。

26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中通过定量PCR、实时PCR、数字PCR或测序来测量TTV的量。

27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述靶基因座包括单核苷酸多态性(SNP)。

28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括使用200对至50,000对正向和反向PCR引物对200个至50,000个靶基因座进行PCR扩增；任选地其中步骤(b)包括使用500对至20,000对正向和反向PCR引物对500个至20,000个靶基因座进行PCR扩增。

29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中使用逻辑回归、随机森林或决策树机器学习分析来确定所述移植受体的排斥风险。

30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述逻辑回归、随机森林或决策树机器学习分析进一步结合选自以下的一个或多个参数：移植后时间、移植受体和/或移值供体的年龄、移植受体和/或移植供体的性别或所述血液、血浆、血清或尿液样品中的总游离DNA的量或其函数。

31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述血液、血浆、血清或尿液样品在移植后少于18个月从所述移植受体获得。