CN101255415A

CN101255415A - 核酸回收方法及核酸回收装置

Info

Publication number: CN101255415A
Application number: CNA2008100809311A
Authority: CN
Inventors: 山下善宽; 樱井智也
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd; Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2007-03-01
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2008-09-03
Also published as: EP1964920A1; JP2008212031A; US20090186345A1; JP4340298B2

Abstract

本发明提供一种核酸回收方法及核酸回收装置，其不完全除去洗液的成分，来回收精制的核酸。本发明的核酸回收方法是，将结合有核酸的固相与洗液接触来洗涤该固相，所述洗液含有构成反应液的成分中的至少一种成分，所述反应液能够应用于使用核酸的反应，从上述固相中分离洗液，使得上述洗液残留规定量，然后，将上述结合有核酸的固相与洗提液接触，使核酸回收到该洗提液中。

Description

核酸回收方法及核酸回收装置

技术领域

本发明涉及从结合有核酸的固相上洗提核酸，并将核酸回收到溶液中的核酸回收方法及核酸回收装置。

背景技术

核酸是携带遗传信息的物质，在学术研究或医疗等多个领域中实施核酸的分析。作为核酸的分析方法，经常利用PCR(Polymerase Chain Reaction)等为主的核酸扩增技术。在进行以PCR等为代表的核酸分析时，为了达到不含对分析反应有干扰物质的状态，需要从生物试样等中提取·精制核酸。

作为从生物试样等中提取核酸的方法，有使用苯酚或氯仿等剧毒物，进行乙醇沉淀等操作的以往方法，但近年，通常采用的方法是，在离液物质的存在下利用核酸结合在含二氧化硅的固相等上的性质的方法。

例如，非专利文献1(J.Clin.Microbiol.，28(3)，495-503(1990))中记载的方法，由以下工序构成：(1)向含有核酸的生物试样中混合含有离液物质的溶解液和含二氧化硅的固相，使核酸结合在固相的工序；(2)利用含有离液物质的洗液来洗涤核酸和固相的复合体的工序；(3)利用含有乙醇的洗液来洗涤核酸和固相的复合体的工序；(4)利用含有丙酮的洗液来洗涤核酸和固相的复合体的工序；(5)加温核酸和固相的复合体，来干燥残留的洗液的工序；(6)从含二氧化硅的固相上洗提核酸的工序。在本方法中，为了洗涤核酸和固相的复合体，依次使用含有离液物质的洗液，接着使用含有乙醇的洗液，然后使用含有丙酮的洗液，之后，加温核酸和固相的复合体来干燥除去残留的洗液(主要是丙酮)。

但是，该方法需要多个用于洗涤核酸和固相的复合体的洗液，而且也需要加热干燥这样的工序，因此存在的问题是，不仅非常麻烦，而且需要很长时间才能得到精制的核酸。此外，在该方法中，用于促进有机溶剂干燥的加温操作也存在由于有机溶剂具有易燃性而存在危险性这样的问题。

另外，专利文献1(日本特开平11-146783)中记载了以下方法。该方法由以下工序构成：(1)向含有核糖核酸的试样中混合含有离液物质的溶解液和含二氧化硅的固相，使核酸结合在固相的工序；(2)利用含有离液物质的洗液来洗涤核酸和固相的复合体的工序；(3)利用包含水或低盐浓度缓冲液的洗液来洗涤核酸和固相的复合体的工序；(4)使包含水或低盐浓度缓冲液的洗提液与核酸和固相的复合体接触并加热，将核酸从含二氧化硅的固相中洗提的工序。该方法虽然利用不含有乙醇等有机溶剂的洗液，来实施洗涤工序，但是，其基于核糖核酸和固相的结合牢固的特性，存在不适用于脱氧核糖核酸的问题。另外，在该方法中，洗液中所含有的离液物质的残留也是个问题。

此外，专利文献2(日本特开平11-127854)中记载了以下方法。该方法由以下工序构成：(1)促进核酸从含有核酸的试样中游离的工序；(2)混合促进游离核酸与固相结合的物质的工序；(3)使混合液与含二氧化硅的固相接触，使核酸结合于固相的工序；(4)从混合液中分离核酸和固相的复合体的工序；(5)利用含盐溶液来洗涤核酸和固相的复合体的工序；(6)从固相洗提核酸的工序。但是，该方法中记载，在(5)的工序中使用含有乙醇的有机溶剂的洗液，需要用于除去乙醇的处理。另外，在该方法中，并没有研究在(5)的工序中使用的洗液所含有的盐，在精制的核酸溶液中可含有到什么程度。

专利文献1：日本特开平11-146783号公报

专利文献2：日本特开平11-127854号公报

发明内容

发明要解决的问题

如上所述，虽然有技术是以洗涤核酸和固相的复合体，然后，在实施从固相洗提核酸的工序时完全除去洗液的成分来作为课题，但是，完全除去洗液的成分困难，并且是非常费功夫的操作。因此，本发明的目的是提供一种不用完全去除洗液的成分，就能回收精制的核酸的回收方法以及核酸回收装置。

解决问题的手段

达成上述目的的本发明涉及的核酸回收方法为，使结合有核酸的固相与洗液接触来洗涤该固相，所述洗液含有构成反应液的成分中的至少一种成分，所述反应液能够应用于使用核酸的反应，从上述固相分离上述洗液，使上述洗液残留规定的量，然后，使上述结合有核酸的固相与洗提液接触，将核酸回收于该洗提液中。

本发明核酸回收方法中的洗提液与残留于上述固相的洗液合并，理想情况是形成能够应用于使用上述核酸的反应的反应液的组成。另外，在本发明涉及的核酸回收方法中，核酸洗提于上述洗提液中后，与上述残留于固相的洗液合并，还可以添加成分以使其成为能够应用于使用上述核酸的反应的反应液。在本发明涉及的核酸回收方法中，可以进一步包含固相与含有核酸的溶液接触从而使该核酸结合于固相的处理。

作为构成上述反应液的成分，可以例举出盐和/或表面活性剂。在本发明涉及的核酸回收方法中，使用含有核酸的洗提液进行核酸扩增反应时，形成的洗液含有该核酸扩增反应的反应液中含有的盐成分或表面活性剂成分的至少一种成分。作为核酸扩增反应，可以例举出聚合酶链反应(PCR：PolymeraseChain Reaction)或环介导等温扩增法(LAMP：Loop-mediated isothermalamplification)。

另外，在本发明涉及的核酸回收方法中，通过调节上述洗液的添加量和废弃量，能够残留上述洗液中的规定量。另外，在本发明涉及的核酸回收方法中，通过调节上述固相的含水量和定位上述固相的固相保持部件的含水量，能够残留上述洗液中的规定量。此外，在本发明涉及的核酸回收方法中，通过调节上述洗液从上述固相分离的排出压力或离心力，能够残留上述洗液中的规定量。

另一方面，达成上述目的的本发明涉及的核酸回收装置具备洗液供给设备、洗液分离设备、洗提液供给设备，所述洗液供给设备对具有核酸结合能力的固相供给洗液，所述洗液含有构成反应液的成分中的至少一种成分，所述反应液能够应用于使用核酸的反应，所述洗液分离设备是从上述固相分离上述洗液，以使供给于上述固相的洗液能够残留规定量，所述洗提液供给设备是在用上述洗液分离设备除去洗液后，向上述结合有核酸的固相供给洗提液，将核酸回收到利用上述洗提液供给设备供给的洗提液内。

在本发明涉及的核酸回收装置中，通过使由洗液供给设备供给的洗液与结合有核酸的固相接触，来洗涤该固相。然后，在本发明涉及的核酸回收装置中，利用洗液分离设备除去洗液，但在固相或其周边残存规定量的洗液。并且，在本发明涉及的核酸回收装置中，通过使由洗提液供给设备供给的洗提液与结合有核酸的固相接触，能够从固相上洗提核酸。

就本发明涉及的核酸回收装置来说，上述洗提液与残留在上述固相的洗液混合，能够形成具有成为反应液的组成的混合液，所述反应液可以应用于使用上述核酸的反应中。另外，在本发明涉及的核酸回收装置中，可以进一步含有成分添加设备，核酸洗提在上述洗提液中后，与残留于上述固相的洗液混合，该成分添加设备添加成分以形成能够应用于使用上述核酸的反应的反应液。

就本发明涉及的核酸回收装置来说，上述洗液供给设备可以例举出向容纳上述固相的容器内填充洗液的设备。作为洗液供给设备，并无特别限制，可以由填充有洗液的箱和能够从该箱向上述容器内供给规定量的洗液的分注装置构成。另外，作为洗液供给设备，并无特别限制，可以由填充有洗液的箱和能够吸引规定量的洗液至该容器内的吸引装置构成。

就本发明涉及的核酸回收装置来说，上述洗液分离设备可以例举出将填充于容纳上述固相的容器内的洗液除去的设备。作为洗液分离设备，并无特别限制，可以由能够从供给于上述溶液内的洗液中吸引回收规定量的洗液的分注装置构成。作为洗液分离设备，并无特别限制，可以例举出能够将供给于上述溶液内的洗液中规定量的洗液排出的排出装置。

例示的吸引装置和排出装置，可以作为能够通过对容纳上述固相的容器内进行减压、加压来吸引或排出洗液的泵装置而构成一体。即，就本发明涉及的核酸回收装置来说，上述洗液供给设备和上述洗液分离设备可以以同一设备构成。

另外，就本发明涉及的核酸回收装置来说，上述洗提液供给设备可以例举出将洗提液填充进容纳上述固相的容器内的设备。作为洗提液供给设备，并无特别限制，可以由填充有洗提液的箱和能够从该箱向上述容器内供给规定量的洗提液的分注装置来构成。或者，作为洗提液供给设备，并无特别限制，可以由填充有洗提液的箱和能够将规定量的洗提液吸引进该容器内的吸引装置来构成。构成洗提液供给设备的吸引装置，作为能够通过减压、加压容纳上述固相的容器内来吸引或排出洗提液的泵装置，上述洗液供给设备和上述洗液分离设备可以以同一设备构成。

此外，就本发明涉及的核酸回收装置来说，上述容器可以例举出具备定位该固相的固相保持部件的容器。此时，在核酸回收装置中，由上述洗液供给设备供给的洗液中的规定量，被保持在该固相保持部件和/或上述固相中。此时，可以依据固相保持部件和固相的材质和/或体积来调节洗液的保持量。

发明效果

根据本发明，通过使结合有核酸的固相和洗提液接触，在洗提该核酸时，能够将核酸回收入所要的组成液中。因而，根据本发明，不用进一步精制洗提液，就能够应用于例如核酸扩增反应等使用核酸的反应中。

附图说明

图1是表示适用本发明的核酸回收方法的一例的流程图。

图2是表示适用本发明的核酸回收方法的其他例的流程图。

图3是表示适用本发明的核酸回收方法的其他例的流程图。

图4是表示构成适用本发明的核酸回收装置的核酸提取器具的一例的截面图。

图5是表示构成适用本发明的核酸回收装置的核酸提取器具的其他例的截面图。

图6是表示实施例1的结果的特性图。

符号说明

40移液管主体部，41一端部，42另一端部，43固相，44固相保持部件，50容器主体部，51一端部，52另一端部，53固相，54固相保持部件，55集液容器

具体实施方式

以下，参照附图来详细说明本发明。

在本发明涉及的核酸回收方法中，首先，将结合有核酸的固相与洗液接触，来洗涤该固相，所述洗液含有构成反应液的成分之中的至少1种成分，所述反应液能够应用于使用核酸的反应。这里，结合有核酸的固相并无特别限制，其意味着核酸结合在具有核酸结合能力的固相的状态。这里，核酸和固相的结合的意思是包括共价结合、离子结合、分子间作用力结合等化学结合中的任一种方式。作为固相，并无特别限制，可以列举出例如玻璃、硅石、硅藻土等含二氧化硅的固相，或乙酰纤维素等有机物等。可以将这些物质加工成微粒状或多孔性膜状来形成固相。

另外，通过利用常用方法对培养细胞等细胞、从各种组织采取的组织片、用规定的培养基培养的细菌、真菌、古细菌等微生物、植物细胞和组织片、昆虫细胞以及昆虫等生物材料进行处理，从而能够以例如悬浊液的形式来得到核酸以及蛋白质成分、脂质成分、细胞壁成分等核酸以外的成分。在核酸结合在固相上时，例如，可以采用利用在离液物质的存在下核酸结合在固相的性质的方法。作为离液物质，可以使用碘化钠、碘化钾、高氯酸钠、硫氰酸钠、硫氰酸胍、盐酸胍等。

例如，在使用微粒状的固相时，向含有核酸的悬浊液中添加离液物质和微粒状的固相，对其进行搅拌。这样，悬浊液中所含有的核酸可结合在微粒状的固相上。

另外，使用多孔膜状的固相时，采用将多孔膜状的固相固定在中空状的配管内部中的器具。此时，多孔膜状的固相在配管内部，可以用一对固相保持部件夹持的方式来固定。此时，一对固相保持部件例如可以由多孔性聚丙烯粒子烧结体来形成。使用该器具时，以配管的一端为开口端，将另一端连接泵装置，通过驱动该泵装置，而可以从一端吸引和排出溶液。这样，能够使溶液与多孔膜状的固相接触。吸引至器具内部的溶液也可以利用离心力来排出。

在本发明涉及的核酸回收方法中，将按上述方法调制的结合有核酸的固相与洗液接触。作为洗液，可以规定洗液含有构成反应液成分中的至少一种成分，所述反应液能够应用于使用核酸的反应。这里，使用核酸的反应可以例示出核酸扩增反应、逆转录反应、核酸延伸反应、限制性内切酶等的酶反应以及电泳等。作为更具体的使用核酸的反应，可以例示出聚合酶链反应(PCR，PolymeraseChain Reaction)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR，ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction)、连接酶链反应(LCR，Ligase ChainReaction)、链置换扩增(SDA，Strand Displacement Amplification)、转录依赖的扩增系统(TAS，Transcription Amplification System)、依赖核酸序列的扩增(NASBA，Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)、转录介导扩增(TMA，Transcription-Mediated Amplification)、环介导等温扩增(LAMP，Loop-mediatedisothermal amplification)、等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN，Isothermaland Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)等。

能够应用于这些反应的反应液是指含有用于维持规定pH值的缓冲剂、规定浓度的无机盐、规定浓度的表面活性剂以及规定的酶等的溶液。反应液根据上述的各种反应而形成不同的组成，对于PCR，可以参照Saiki R.K.et al.(1985)，Science，vol.230，1350-1354的记载；对于PCR和RT-PCR，可以参照Molecular Cloning，a laboratory manual(third edition)，chapter 8.1的记载；对于LCR，可以参照Landegren U.等人(1988)，Science，vol.239，487-491的记载；对于SDA，可以参照Walker G.T.等人(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.89，392-396的记载；对于TAS，可以参照Kwoh D.Y.等人(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.86，1173-1177的记载；对于NASBA，可以参照Compton J.(1991)，Nature，vol.350.91-92的记载；对于TMA，可以参照日本特许3241717的记载；对于LAMP，可以参照Notomi T.等人(2000)，NucleicAcid Res.，vol.28，e63的记载；对于ICAN，可以参照WO2000-56877等的记载，可以明确地确定其组成和组成比。因而，通过参照这些记载，能够确定含有构成反应液的成分的至少1种成分的洗液的组成。

此时，作为洗液，可以使用含有构成反应液的成分的盐(无机盐)或表面活性剂等成分的洗液。这些盐或表面活性剂的浓度优选是可以维持核酸与固相的结合，并且能够除去残留在固相上的杂质(例如，离液物质)的浓度。作为洗液，优选含有0.5M以上的盐，更优选含有1.0M以上的盐，尤其优选含有1.5M以上的盐。洗液的盐浓度小于0.5M时，由于洗涤可能使核酸从固相上被洗提出来，其结果可能使核酸的回收率降低。

另外，在使用洗液洗涤时，为了维持核酸和固相的结合，优选在低温下实施。作为洗涤时的温度(与固相混合时的洗液温度)，优选为40℃以下，更优选为20℃以下，尤其优选为10℃以下。洗涤时的温度超过40℃时，由于洗涤可能使核酸从固相上被洗提出来，其结果可能使核酸的回收率降低。

例如，作为反应液以PCR用反应液为前提时，标准的PCR反应液的成分包含10mM Tris-HCl(pH8.8)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂的反应缓冲液、0.8mMdNTP mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.5μM引物1、0.5μM引物2、2.5UTaq DNA聚合酶和作为分析对象的DNA，因而，例如可以使用洗液的成分是反应缓冲液中所含有的盐的50倍浓度的溶液，即可以使用包含2.5M KCl和75mM MgCl₂的溶液。以包含2.5M KCl和75mM MgCl₂的溶液作为洗液时，能够维持核酸和固相的结合，并且可以除去残留在固相上的杂质。

另外，例如，作为反应液以LAMP用反应液为前提时，标准的LAMP反应液的成分包含10mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM(NH₄)₂SO₄、4mMMgSO₄、0.1％吹通X-100(TritonX-100)的反应缓冲液、1M甜菜碱(Betaine)、1.6mM dNTP mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.8μM引物FIP、0.8μM引物BIP、0.2μM引物F3、0.2μM引物B3、8U Bst DNA聚合酶和作为分析对象的DNA，因而，例如可以使用洗液的成分是反应缓冲液中所含有的盐的50倍浓度的溶液，即可以使用包含500mM KCl、500mM(NH₄)₂SO₄和200mMMgSO₄的溶液。以包含500mM KCl、500mM(NH₄)₂SO₄和200mM MgSO₄的溶液作为洗液时，能够维持核酸和固相的结合，并且可以除去残留在固相上的杂质。

此外，例如，作为反应液以限制性内切酶用反应液为前提时，例如限制性内切酶HindIII所产生的限制性内切酶反应的标准的反应液的成分包含10mMTris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl₂、100mM NaCl、10mM 2-巯基乙醇的反应缓冲液、1U HindIII和作为分析对象的DNA，因此，例如洗液的成分可以使用反应缓冲液中所含有的盐的50倍浓度的溶液，即可以使用包含500mM MgCl₂和5M NaCl的溶液。以包含500mM MgCl₂和5M NaCl的溶液作为洗液时，能够维持核酸和固相的结合，并且可以除去残留在固相上的杂质。

此外，例如，作为反应液以电泳用反应液为前提时，例如，使用标准的MOPS缓冲液(2-(N-吗啉代)-丙烷磺酸缓冲液)的RNA电泳的试样溶液的成分包含20mM MOPS、5mM CH₃COONa、1mM EDTA、1mM EGTA、5％甘油(Glycerol)和作为分析对象的RNA，因此，例如可以使用洗液的成分是除甘油(Glycerol)之外的成分的50倍浓度的溶液，即可以使用包含1M MOPS、250mM CH₃COONa、50mM EDTA、50mM EGTA的溶液。以包含1M MOPS、250mM CH₃COONa、50mM EDTA、50mM EGTA的溶液作为洗液时，能够维持核酸和固相的结合，并且可以除去残留在固相上的杂质。

在本发明涉及的核酸回收方法中，接着，从固相上分离洗液，并使洗液残留规定的量。由于在本工序中残留的洗液含有上述反应液的部分成分，因此可以作为反应液的一部分来利用。换言之，在本发明涉及的核酸回收方法中，因为可以将用于除去残留于固相的杂质的洗液直接作为后阶段的反应液来利用，所以不需要用于完全除去洗液的处理、操作。

作为除去洗液的方法，并无特别限制，可以适当地使用分注装置或泵装置、离心分离装置。使用微粒状的固相时，通过将上述洗液和结合有核酸的固相在容器内搅拌，进行洗涤，然后，利用分注装置从该容器中除去规定量的洗液。这样，能够从固相中分离洗液，并使洗液残留规定的量。另外，用一对固相保持部件夹持方式将多孔膜状的固相固定在配管内时，通过反复吸引和排出洗液来洗涤固相，然后，通过排出洗液，能够使规定量的洗液残留在配管内。此时，由于一对固相保持部件也能保持洗液，因此，即使全部除去配管内部的液体，也会残留保持在固相保持部件的洗液。

关于洗液的残留量，只要从将残留的洗液作为反应液的一部分来利用的角度考虑来适当地设定即可，并无特别的限制。残留的洗液用在后面详细叙述的洗提液稀释，或者用洗提液和除洗提液之外添加的溶液稀释，能够成为适用于使用核酸的反应的反应液的一部分。因而，洗液的残留量可以由洗液中含有的成分浓度和洗提液和/或除洗提液之外添加的溶液的添加量来决定。换言之，为了从洗液中含有的成分浓度和洗提液和/或除洗提液之外添加的溶液的添加量，得到被稀释成所要的成分浓度的反应液，可以规定洗液的残留量。

作为控制洗液的残留量的方法，例如可以通过调节洗液的添加量和废弃量来得到规定的残留洗液量。或者，以一对固相保持部件夹持多孔膜状的固相的方式将其固定于配管内时，通过调节固相和固相保持部件的含水量也可以控制洗液的残留量。例如，能够作为固相使用的玻璃纤维滤纸的含水量，依赖于其体积、材质、纤维径、粒子保持径等。另外，能够作为固相使用的玻璃粒子的含水量，依赖于其粒子数、材质、粒径等。另外，能够作为固相保持部件使用的多孔性聚丙烯粒子烧结体的含水量，依赖于其体积、材质、粒径、粒子保持径等。另外，固相和固相保持部件的含水量依赖于洗液的废弃方法，例如，依赖于用于废弃洗液的排出压力或离心力等的大小。因而，通过调节固相和固相保持部件的物理特性以及洗液的废弃方法，可以控制固相和固相保持部件的洗液的含水量。

接着，在本发明涉及的核酸回收方法中，使结合核酸的固相与洗提液接触，将核酸回收进该洗提液中。这里，所谓洗提液，只要是具有使结合于固相的核酸从该固相上脱离，使该核酸存在于洗提液中的作用的物质，就没有特别限制。作为洗提液，可以例举出如水和Tris缓冲液。另外，作为洗提液，也可以使用这样的溶液，该溶液不仅含有残留于固相的洗液中所含有的成分，而且还含有构成后阶段的反应液的组成的成分。即，洗提液的组成只要能从固相上洗提核酸，则可以规定为含有除了规定的反应液组成中已被洗液含有的成分之外的其余成分。作为洗提液，可以是含有除了规定的反应液组成中已被洗液含有的成分之外的全部其余成分的组成，也可以是含有一部分该其余成分的组成。

另外，洗提液的量优选为如下的量，即，该液量可以将残留于固相等的洗液所含有的成分中的构成反应液的成分的浓度稀释成该反应液中的规定浓度。即，含有构成反应液的成分的洗液以该反应液的规定浓度的50倍的浓度含有该成分时，优选使用将残留的洗液的液量稀释50倍的量的洗提液。这样，洗液所含有的成分，在洗液与洗提液合并的溶液中是以反应液的规定浓度来含有的。此时，洗提液中含有的成分为规定的反应液组成中除了洗液所含有的成分之外的全部其余成分的话，就可以将洗液和洗提液合并的溶液直接作为反应液来使用。洗提液中含有的成分为规定的反应液组成中除了洗液所含有的成分之外的一部分其余成分的情形中，对洗液和洗提液合并的溶液，可通过在之后添加反应液组成中的不足成分来制备反应液。此时，添加含有反应液组成中不足的成分的溶液时，由于会稀释包含洗液和洗提液的溶液，因此要注意洗液和洗提液中所含有的成分的浓度。

例如，作为反应液以PCR用反应液为前提时，标准的PCR反应液的成分包含10mM Tris-HCl(pH8.8)、50mM KCl、1.5mM MgCl₂的反应缓冲液、0.8mMdNTP mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.5μM引物1、0.5μM引物2、2.5UTaq DNA聚合酶和作为分析对象的DNA。使用反应液所含有的盐的50倍浓度的溶液，即，包含2.5M KCl和75mM MgCl₂的溶液作为洗液时，则作为洗提液，就可以使用含有10mM Tris-HCl(pH8.8)、0.8mM dNTP mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.5μM引物1、0.5μM引物2、2.5U Taq DNA聚合酶的溶液。这些浓度为与洗液合并后的浓度。另外，该洗提液的使用量是将该洗液稀释50倍的量。这样，使用洗提液将核酸从固相洗提后的溶液，包含洗提的核酸(作为PCR的模板)和PCR用反应液的全部组成，能够直接供于PCR反应。

以上述的LAMP用反应液、限制性内切酶用反应液或电泳用反应液为前提时，同样可以规定洗提液的组成和量。作为洗提液，为了防止酶由于温度引起的失活，可以是仅不含酶的构成。此时，通过向合并洗液和洗提液的溶液中，添加作为其余成分的酶，从而可以形成规定的反应液组成。

另外，作为洗提时的温度，并无特别的限制，但优选在20℃以上，更优选在40℃以上，最优选在60℃以上。洗提时的温度小于20℃时，可能产生如下问题：核酸不能从固相上完全洗提，或从固相上完全洗提核酸需要很长时间。

以上说明的本发明涉及的核酸回收方法的具体的流程图如图1～3所示。图1～3所示的流程图各自表示本发明涉及的核酸回收方法的一例，并不是用于限定性地解释本发明的技术范围。

本发明涉及的核酸回收方法，例如根据图1所示的流程图，包含如下工序：(1)将核酸和固相的复合体与洗液接触的洗涤工序，所述洗液含有后续核酸分析反应液中所含有的成分；(2)使规定量的洗提液与复合体接触来洗提核酸的工序，所述规定量是能够将由前工序得到的残留洗液所含有的成分稀释至适于后续的核酸分析反应的浓度的量；(3)添加核酸分析反应液的其余成分的工序。另外，最终得到的溶液被供于核酸分析。

另外，本发明涉及的核酸回收方法，例如根据图2所示的流程图，包含如下工序：(1)将核酸和固相的复合体与洗液接触的洗涤工序，所述洗液含有后续核酸分析反应液中所含有的成分；(2)使规定量的洗提液与复合体接触来洗提核酸的工序，所述规定量是能够将由前道工序得到的残留洗液所含有的成分稀释至适于后续的核酸分析反应的浓度的量，并且所述规定量的洗提液含有核酸分析反应中需要的其他成分的一部分；(3)添加核酸分析反应液的其余成分的工序。另外，最终得到的溶液被供于核酸分析中。

此外，本发明涉及的核酸回收方法，例如根据图3所示的流程图，包含如下工序：(1)使洗液与核酸和固相的复合体接触的洗涤工序，所述洗液含有后续核酸分析反应液中所含有的成分；(2)使规定量的洗提液与复合体接触来洗提核酸的工序，所述规定量是能够将由前道工序得到的残留洗液所含有的成分稀释至适于后续的核酸分析反应的浓度的量，所述规定量的洗提液含有核酸分析反应中需要的全部其余成分。另外，最终得到的溶液被供于核酸分析。

实施例

以下，使用本实施例对本发明涉及的核酸回收方法和核酸回收装置进行说明，但本发明的技术范围并不限于这些实施例。

首先，对本实施例中使用的试样、试剂、核酸提取器具、核酸提取方法、核酸定量方法和核酸分析方法依次进行说明。

1.试样

试样A：

将pBR32质粒DNA添加入标准血清的试样(1μg/200μl)

试样B：

将由HBV(乙肝病毒)阳性样品精制的DNA添加入标准血清的假阳性样品(10³copy/200μl)。

2.试剂

溶解液A：

4.0M硫氰酸胍

100mM MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)

25mM EDTA·2Na

20％(v/v)吹通X-100(TritonX-100)

第一洗液：

4.0M硫氰酸胍

100mM MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)

25mM EDTA·2Na

1％(v/v)吹通X-100(TritonX-100)

第二洗液：

10mM Tris-HCl(pH8.0)

80％(v/v)EtOH

第三洗液A：

10mM Tris-HCl(pH8.0)

80％(v/v)EtOH

第三洗液B：

2.5M KCl

75mM MgCl₂

第三洗液C：

2.5M KCl

75mM MgCl₂

500mM Tris-HCl(pH8.0)

第三洗液D：

2.5M KCl

75mM MgCl₂

500mM Tris-HCl(pH8.0)

0.5％吹通X-100(TritonX-100)

第三洗液E：

500mM KCl

500mM(NH₄)₂SO₄

200mM MgSO₄

第三洗液F：

500mM KCl

500mM(NH₄)₂SO₄

200mM MgSO₄

1M Tris-HCl(pH8.0)

第三洗液G：

500mM KCl

500mM(NH₄)₂SO₄

200mM MgSO₄

1M Tris-HCl(pH8.0)

5％吹通X-100(TritonX-100)

洗提液A：

10mM Tris-HCl(pH8.8)

洗提液B：

超纯水

洗提液C：

10mM Tris-HCl(pH8.8)

0.8mM dNTP mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)

0.5μM引物1

0.5μM引物2

2.5U Taq DNA聚合酶

洗提液D：

20mM Tris-HCl(pH8.8)

1M甜菜碱

1.6mM dNTP mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)

0.8μM引物FIP

0.8μM引物BIP

0.2μM引物F3

0.2μM引物B3

8U BstDNA聚合酶

3.核酸提取器具

核酸提取器具A：

核酸提取器具A的截面图示于图4中。核酸提取器具A如图4所示，是由移液管主体部40、加减压机器(未图示)、固相43、固相保持部件44构成的，所述移液管主体部40是成型聚丙烯树脂得到的，所述加减压机器连接在移液管主体部40的开口的一端部41上，所述固相43被配设在移液管主体部40的开口的另一端部42附近，所述固相保持部件44将固相43定位于移液管主体部40的规定的位置上。核酸提取器具A通过加减压机器产生的压力差，能够从另一端部42吸引和排出溶液。通过从另一端部42吸引溶液而被吸引入移液管主体部40内的溶液，会浸润固相43和固相保持部件44。

固相43是玻璃纤维滤纸，固相保持部件44是多孔聚丙烯粒子烧结体。核酸提取器具B：

核酸提取器具B的截面图示于图5中。核酸提取器具B如图5所示，是由容器主体部50、固相53、固相保持部件54、集液容器55构成的，所述固相53配置于另一端部52的附近，该另一端部52位于在容器主体部50的上方开口的一端部51的相反侧上，所述固相保持部件54对固相53的位置进行定位，集液器55具有插入容器主体部50的开口部。核酸提取器具B中，从容器主体部50的一端部51供给溶液。被供给于容器主体部50的溶液到达固相53和固相保持部件54并与它们接触。以此状态对核酸提取器具B施加离心力，施加离心力的方向是从容器主体部50的一端部51至集液容器55的底部，从而，使被供给于容器主体部50的溶液从容器主体部50的另一端部52排入到集液容器55内。

固相53是玻璃纤维滤纸，固相保持部件54是多孔聚丙烯粒子烧结体。核酸提取器具C：

核酸提取器具C未图示，是平均粒径为5μm的玻璃粒子。作为固相的玻璃粒子在规定的容器内与溶液混合，利用离心力与液相分离。

4.核酸提取方法

核酸提取器具A所适用的核酸提取方法如下。以下的核酸提取方法是可以不限于试样、洗液和洗提液等种类来应用的方法。

(1)向0.2ml试样中添加0.8ml溶解液，进行混合。

(2)将加减压机器连接在核酸提取器具A上，将混合液吸引排出5次。

(3)废弃混合液。

(4)将1.0ml第一洗液吸引排出3次。

(5)废弃洗液。

(6)将1.0ml第二洗液吸引排出3次。

(7)废弃洗液。

(8)将0.5ml冰上冷却后的第三洗液吸引排出1次。

(9)废弃洗液(残留液量为2μl)。

(10)将0.1ml加温至60℃的洗提液吸引排出10次。

(11)回收洗提液。

核酸提取器具B所适用的核酸提取方法如下。以下的核酸提取方法是可以不限于试样、洗液和洗提液等种类来应用的方法。

(1)向0.2ml试样中添加0.8ml溶解液，进行混合。

(2)投入进核酸提取器具B中，进行离心分离。

(3)废弃集液容器的混合液。

(4)投入1.0ml第一洗液，进行离心分离。

(5)废弃集液容器的洗液。

(6)投入1.0ml第二洗液，进行离心分离。

(7)废弃集液容器的洗液。

(8)投入0.5ml冰上冷却的第三洗液，进行离心分离。

(9)设置新的集液容器(残留液量为2μl)。

(10)投入0.1ml加温至60℃的洗提液，进行离心分离。

(11)回收洗提液。

核酸提取器具C所适用的核酸提取方法如下。以下的核酸提取方法是可以不限于试样、洗液和洗提液等种类来应用的方法。

(1)向0.2ml试样中添加0.8ml溶解液和10mg玻璃粒子。

(2)混合10分钟。

(3)用离心器进行B/F分离，废弃液相。

(4)添加1.0ml第一洗液，进行混合。

(5)用离心器进行B/F分离，废弃液相。

(6)添加1.0ml第二洗液，进行混合。

(7)用离心器进行B/F分离，废弃液相。

(8)添加0.5ml在冰上冷却的第三洗液，进行混合。

(9)用离心器进行B/F分离，废弃液相(残留液量为2μl)。

(10)添加0.1ml洗提液，在60℃加温5分钟。

(11)用离心器进行B/F分离，回收洗提液。

5.核酸定量方法

洗液中含有的核酸为，用对双链DNA特异的荧光色素对试样中含有的DNA进行染色，通过荧光光度计测定荧光强度来算出DNA量。作为荧光色素，使用PicoGreen双链DNA定量试剂盒(PicoGreen dsDNA Quantitation Kit)(分子探针(Molecular Probe)公司)，作为荧光光度计，使用ARVO sx 1420多标记计数器(ARVO sx 1420Multilabel Counter)(华莱克(wallac)公司)。

6.核酸分析方法

在本实施例中，作为核酸分析方法的例子按照以下要领进行PCR法和LAMP法。利用PCR法和LAMP法得到的扩增产物的确认，是实施以0.8％琼脂糖凝胶为支持体的电泳，用对双链DNA特异的荧光色素进行染色，在紫外透射仪所产生的紫外线照射下进行确认。作为荧光色素，使用SYBR绿色核酸凝胶染液(SYBR Green Inucleic acid gel stain)(分子探针公司)。

PCR：

以来源于HBV的DNA为模板DNA的PCR，是以(J.Clin.Microbiol.，29(9)，1804-1811(1991))的报告为基础，在下述的引物和温度条件下实施。引物1：5’-GCG GAT CCG AGT TAC TCT CGT TTT TGC-3’(序列号1)引物2：5’-GCA AGC TTT CTA ACA ACA GTA GTT TCC GG-3’(序列号2)

温度条件：

在94℃维持5分钟后，以94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟为1个循环，进行30个循环，最后在72℃维持10分钟。

LAMP：

以来源于HBV的DNA为模板DNA的LAMP，是以(Nucleic AcidResearch，28(12)，e63(2000))的报告为基础，在下述的引物和温度条件下实施LAMP。

引物FIP：5’-CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CTT TGA CAA ACG GGCAAC ATA CCT T-3’(序列号3)

引物BIP：5’-GAT AAA ACG CCG CAG ACA CAT CCT TCC AAC CTC TTGTCC TCC AA-3’(序列号4)

引物F3：5’-GGT GGT TGA TGT TCC TGG A-3’(序列号5)

引物B3：5’-CAA AAT TCG CAG TCC CCAAC-3’(序列号6)

温度条件：

在95℃维持5分钟后在冰上放置3分钟，然后，添加Bst DNA聚合酶，在65℃反应1小时，最后在80℃维持10分钟。

[实施例1]

在使用试样A、溶解试剂A、第一洗涤试剂A、第二洗液A、洗提液A、核酸提取器具A的DNA提取中，将第三洗液制成A、B的稀释液(溶质浓度：100％、80％、60％、40％、20％)和E的稀释液(溶质浓度：100％、80％、60％、40％、20％)来实施DNA提取。在各自的第三洗液A的稀释液、第三洗液B的稀释液和第三洗液E的稀释液中，对DNA回收量进行定量。并且，算出每个稀释液所对应的DNA回收率，该回收率是相对于使用第三洗液A的DNA回收量的使用第三洗液B和第三洗液E时的DNA回收率。

结果示于图6中。第三洗液B随着稀释率的增加，DNA回收率增加，溶质浓度在60％以上时，得到与第三洗液A同等的DNA回收量。另一方面，在第三洗液E中，随着稀释率的增加，DNA回收率也增加，但与第三洗液B相比，DNA回收率的值低。认为是第三洗液E的盐浓度比第三洗液B的盐浓度低，核酸和固相的结合维持力也低。从以上看出，在洗涤工序中，含有一定浓度以上的PCR反应液所需要成分的洗液，可以维持核酸和固相的结合来洗涤核酸和固相的复合体。

[实施例2]

在使用试样B、溶解试剂A、第一洗涤试剂A、第二洗液A、核酸提取器具A的DNA提取中，第三洗液、洗提液、核酸分析反应液其余成分、核酸分析都按下表所示来实施，判断是否有核酸分析反应所产生的核酸扩增。

实验系统和实验结果概括示于表1中。

表1

从表1所示的结果可以确认出，在全部组合的核酸提取和核酸扩增法中，有良好的核酸扩增。以上显示，通过用含有核酸扩增反应所需要成分的洗液来洗涤，将残留的洗液和洗提液合并的溶液作为反应液，从而可以得到能够适用于核酸分析反应的核酸溶液。

[实施例3]

在使用试样B、溶解试剂A、第一洗涤试剂A、第二洗液A、第三洗液C、洗提液B的DNA回收以及其后的PCR中，采用核酸提取器具A、B、C，判断是否可以实现PCR扩增。其结果示于表2中。

表2

核酸提取器具	A	B	C
核酸提取器具	A	B	C	核酸扩增	+	+	+

从表2所示的结果可以确认，在全部的核酸提取器具A、B和C中，都能实现核酸提取和核酸扩增。以上显示，本方法在基于核酸和固相的结合特性的各种核酸提取方法中都能够适用。

序列表

<110>株式会社日历高新技术

<120>核酸回收方法及核酸回收装置

<130>P06-1057

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>1

gcggatccga gttactctcg tttttgc 27

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>2

gcaagctttc taacaacagt agtttccgg 29

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>3

cctgctgcta tgcctcatct tctttgacaa acgggcaaca tacctt 46

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>4

gataaaacgc cgcagacaca tccttccaac ctcttgtcct ccaa 44

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>5

ggtggttgat gttcctgga 19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成DNA

<400>6

caaaattcgc agtccccaac 20

Claims

1.一种核酸回收方法，其特征在于，将结合有核酸的固相与洗液接触来洗涤该固相，所述洗液含有构成反应液的成分中的至少一种成分，所述反应液能够应用于使用核酸的反应，

从上述固相中分离洗液，并使上述洗液残留规定的量，

使上述结合有核酸的固相与洗提液接触，将核酸回收到该洗提液中。

2.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述洗提液与残留于上述固相的洗液混合，具有形成反应液的组成，所述反应液能够应用于使用上述核酸的反应。

3.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，添加成分，使核酸洗提入上述洗提液后，与残留于上述固相的洗液混合，成为能够应用于使用核酸的反应的反应液。

4.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述洗液含有盐和/或表面活性剂。

5.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，通过调节上述洗液的添加量和废弃量，使上述洗液残留规定的量。

6.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，根据上述固相的含水量和定位上述固相的固相保持部件的含水量，使上述洗液残留规定的量。

7.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，通过调节上述洗液从上述固相分离时的排出压力或离心力，使上述洗液残留规定的量。

8.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述反应为聚合酶链反应。

9.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述反应为环介导等温扩增法。

10.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述洗液含有从氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl₂)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、硫酸镁(MgSO₄)、Tris-HCl和聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯中选出的至少一种成分。

11.根据权利要求1所述的核酸回收方法，其中，进一步包含使固相与含有核酸的溶液接触，使该核酸结合于固相的处理。

12.一种核酸回收装置，其特征在于，该核酸回收装置具备洗液供给设备、洗液分离设备、洗提液供给设备，将核酸回收到用上述洗提液供给设备供给的洗提液内，

所述洗液供给设备对具有核酸结合能力的固相供给洗液，所述洗液含有构成反应液的成分中的至少一种成分，所述反应液能够应用于使用核酸的反应，

所述洗液分离设备由上述固相分离上述溶液，以使供给于上述固相的洗液残留规定量，

所述洗提液供给设备在用上述洗液分离设备除去洗液之后，将洗提液供给于上述结合有核酸的固相。

13.根据权利要求12所述的核酸回收装置，其中，上述洗提液与残留于上述固相的洗液混合，具有形成反应液的组成，所述反应液能够应用于上述使用核酸的反应。

14.根据权利要求12所述的核酸回收装置，其中，进一步具有成分添加设备，所述成分添加设备添加成分，使核酸洗提入上述洗提液中后，与残留于上述固相的洗液混合，形成能够应用于使用上述核酸的反应的反应液。

15.根据权利要求12所述的核酸回收装置，其中，上述洗液供给设备是将洗液填充进收容上述固相的容器内的设备。

16.根据权利要求12所述的核酸回收装置，其中，上述洗液分离设备是将填充于收容上述固相的容器内的洗液除去的设备。

17.根据权利要求12所述的核酸回收装置，其中，上述洗提液供给设备是将洗提液填充进收容上述固相的容器内的设备。

18.根据权利要求12所述的核酸回收装置，其中，上述固相被保持在容器内，利用上述洗液设备将洗液吸引至该容器内，利用洗液分离设备排出该容器内的洗液，利用上述洗提液供给设备将洗提液吸引至该容器内。

19.根据权利要求18所述的核酸回收装置，其中，上述容器具备定位该固相的固相保持部件，该固相保持部件和/或上述固相保持洗液的规定量。