CN101302560A - “一管法”乙肝病毒核酸提取与扩增-荧光pcr定量技术 - Google Patents

Abstract

本发明采用申请人发明的微量核酸释放剂，实现在同一管中直接进行乙肝病毒核酸提取和荧光扩增，从根本上解决了多步骤核酸提取法带来的核酸丢失和污染问题，并首次适用于全血标本的荧光PCR检测；采用已定量的原病毒血清作为定量标准品，实现标准品对标本的全程监控；采用双对正反向引物和正反向两条荧光修饰的探针进行荧光PCR扩增，进一步提升其敏感性和扩增效率；引入蓝色的促荧光剂，使配制后的PCR工作液呈浅蓝色，在不影响荧光检测的同时，具有稳定荧光信号、增强扩增效率等作用；设定两段温度梯度程序，采用后段荧光采集法，方便分析并提高仪器的使用寿命；以上技术较传统方法具有革命性创新。

Description

“一管法”乙肝病毒核酸提取与扩增-荧光PCR定量技术

所属技术领域

本发明专利属核酸提取与荧光聚合酶链反应(PCR)定量技术；该技术实现了核酸提取与后续的PCR扩增两个步骤在同一PCR管中进行，从根本上解决了该类实验的污染问题并实现真正的快速和准确定量。

背景技术

目前国内外市场正在临床应用的HBV DNA荧光定量PCR技术主要有以下几个特点：

1.核酸提取：主要有以下几种，1)多聚糖浓缩沉淀病原，然后加碱性裂解液高温裂解、离心获取核酸；2)碱性裂解液直接与含病原液体混匀，然后高温裂解、离心获取核酸；3)层析柱法如采用层析柱吸附、纯化、洗脱获取核酸；4)磁珠法：采用硅粉或聚乙二烯包被的磁珠吸附、纯化、洗脱获取核酸。

以上提取方法都要经过3～8步的换管、离心(负压吸引)、移液等步骤方可获取核酸，以上过程均存在核酸丢失、污染和疲劳操作等因素带来的定量误差或错误。

2.外带定量标准品：标准品大多由试剂公司随试剂盒一并提供的DNA纯品(重组或克隆产物)，不与标本同时参加核酸提取，直接进入PCR扩增，部分试剂盒提供的标准品与标本同时核酸提取，但采用的是核酸掺入法而非原病毒颗粒，与标本有本质不同，无法真实和全程监控标本核酸提取和扩增过程。

3.引物和探针：均采用单条正向引物、荧光标记探针和单条反向引物，构成特异性扩增序列，其扩增效率和敏感性尚有提升空间。

4.PCR工作反应液：PCR扩增缓冲液、引物、探针及Taq DNA聚合酶等所需成分混匀成PCR工作液，为无色液体，容易导致视觉疲劳带来的操作误差。

5.PCR扩增温度条件的设置：采用传统的40个扩增循环全部进行复性期荧光信号采集的程序设置方法，而PCR前10个扩增循环中并无阳性信号，存在信号空测；并且荧光PCR前几个循环存在荧光信号不稳的现象，不利于结果分析。

发明内容

1.核酸提取：采用本发明人发明的“微量核酸释放剂(申请号：200310116699.X)”提取核酸。3μl血清(血浆或全血)标本与3μl蓝色“微量核酸释放剂”在PCR管内混匀，核酸释放剂即退色，可清晰判断加样的位置，从根本上解决了前处理过程中的加样错误；覆盖10～15μl无菌石蜡油，经85℃，30s→99℃，7min→5℃，30s温处理后，加入PCR工作液，直接进入荧光PCR扩增程序，实现检测标本直接进入荧光PCR扩增管的准确定量。

2.HBV标准血清质控品：收集HBV DNA强阳性混合血清，采用HBV DNA阴性正常人血清去纤维后对阳性血清依次进行100倍稀释，分别制备出10⁸、10⁶、10⁵和10³copies/ml的HBV标准血清质控品，采用卫生部标准质控品血清(国家一级标准)，进行10×10的实验内和实验间重复，最终确定HBV标准血清质控品的DNA含量，并进行保存条件的稳定性实验。实现原病毒血清质控品与标本同时进行核酸提取与扩增的全程监控。

3.采用双正反向4条引物和正反向2条探针扩增技术：在传统正向引物、正向探针和反向引物模式基础上，增加了扩增核酸长度一致和TM值相同的临近反向引物、反向探针和正向引物的序列设计技术，该技术较单正向序列的探针扩增敏感性高10～50倍左右，扩增效率提高80％以上。序列设计如下：

正向引物1：NT2109-NT2127，5’CCT GGG TGG GTA ATA ATT T 3’

反向引物1：NT2234-NT2217，5’TTC CAA AAG TAA GGC AAG ATA TAT 3’

正向探针1：NT2142-NT2167，5’FAM-CCA GGG ATC TAG TAG TCA ATT ATG TT-TAMRA 3’

正向引物2：NT2234-NT2215，5’TTC CAA AAG TAA GGC AAG AT 3’

反向引物2：NT2131-NT2109，5’CCT GGG TGG GTA ATA ATT TGG AA 3’

反向探针2：NT2200-NT2175，5’FAM-TAG TTG CCT GAT CTT TAA ACC CAT GT-TAMRA 3’

4.PCR工作液中加入蓝色的“促荧光剂”

在无色的促荧光剂中加入终浓度为0.01％的石绿，使最终配制的PCR工作液呈浅蓝色，在PCR扩增的预变性过程退色，使PCR的操作轻松、准确，不但不影响荧光PCR的检测，而且具有稳定荧光信号和增强荧光PCR扩增效率的重要功能。。

5.荧光PCR扩增温度设置

采用两段变性和复性温度梯度的设定方法，只在后段温度梯度的复性期采集荧光信号，温度条件如下：50℃，2min；94℃2min，(94℃5s，58℃，40s)×3cycles→(94℃5s，58℃30s[采集荧光])×37cycles

由于荧光PCR扩增的起始几个循环存在荧光信号不稳定的情况，并且临床检测的标本在起始10个循环均无阳性扩增，所以本方案在起始3～5个PCR循环未设定荧光采集，有助于荧光曲线的分析及延长仪器荧光通道的使用寿命。

具体实施方式

1.技术试剂组成

1)微量核酸释放剂：160μl(48T)/320μl(96T)

2)PCR反应液：1700μl×1管(48T)/2管(96T)

3)Taq DNA酶/UNG酶：80μl(48T)/160μl(96T)

4)促荧光剂：60μl(48T)/120μl(96T)

5)定量质控品：HBV DNA标准质控血清①(6～9×10⁸copies/ml)/HBV DNA标准质控血清②(0.5～1.2×10⁷copies/ml)/HBV DNA标准质控血清③(1～3×10⁵copies/ml)/HBV DNA标准质控血清④(4～9×10³copies/ml)/阴性对照/各30μl

2.HBV DNA提取：

3μl微量核酸释放剂(浅蓝色)加3μl待检血清和3μl血清质控品，在管底吹打混匀2～3下(变成无色)，加30μl无菌石蜡油，用胶纸封严，进行如下温处理：85℃，30s→99℃，7min→5℃，30s，备用。

3.PCR反应液配制与加样

按以下比例配制和加样：反应液32.5μl×(n+4管血清校准品和1管阴性对照)，每管加TaqDNA聚合酶/UNG混合酶1.5μl和促荧光剂1μl；混匀稍离心后，按35μl/T的量直接加入到HBV DNA提取管中，直接进入荧光PCR仪器扩增。

4.PCR扩增条件

50℃，2min；94℃2min，(94℃5s，58℃，40s)×3cycles→(94℃5s，58℃30s[荧光采集])×37cycles

5.结果判断

结合4个定量校准血清曲线平台荧光值的3～6％确定荧光检测阈值。在定量范围内微调4点血清校准品的量，使质控曲线的斜率在-3.33±0.1为佳；质控曲线的相关系数在0.99以上为有效。本试剂盒的有效定量范围在3.5×10²～2.5×10⁹copies/ml，超出范围应使用阴性血清进行10倍稀释进行复核；建议对低于500copies/ml的阳性标本进行复核后报告。

Claims (6)

1.采用带有指示和变色功能的“微量核酸释放剂”，实现在同一管内直接进行核酸提取与荧光PCR扩增：微量血清与蓝色微量核酸释放剂在荧光PCR内混匀，蓝色微量核酸释放剂即变成无色，覆盖灭菌液体石蜡油经“85℃，30s→99℃，7min→5℃，30s”温处理后，直接加入荧光PCR工作液，即可进行荧光PCR扩增和分析结果。操作简捷、快速、无污染。

2.该技术可直接对血清、血浆和全血标本中的HBV DNA进行荧光PCR检测。

3.采用采用卫生部HBV标准质控血清，制备已知HBV DNA含量的4个梯度“原病毒血清标准品”，作为荧光PCR定量标准品，该标准品与血清(血浆或全血)标本同时进行核酸提取和荧光PCR扩增，实现从核酸提取到扩增的全程监控。

4.采用双正反向4条引物和正反向2条探针扩增技术，在传统正向引物、正向探针和反向引物模式基础上，增加了扩增核酸长度一致和TM值相同的临近反向引物、反向探针和正向引物的序列设计技术，该技术较单正向序列的探针扩增敏感性高10～50倍左右，扩增效率提高80％以上。

5.在无色的促荧光剂中加入终浓度为0.01％的石绿，使最终配制的PCR工作液呈浅蓝色，在PCR扩增的预变性过程退色，使PCR的操作轻松、准确，不但不影响荧光PCR的检测，而且具有稳定荧光信号和增强荧光PCR扩增效率的重要功能。

6.采用两段变性和复性温度梯度的设定方法，只在后段温度梯度的复性期采集荧光信号，该方法不但方便荧光曲线的分析，而且延长荧光PCR仪器的使用寿命。