CN108504776A - 一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测试剂盒，包括两条特异性引物，所述试剂盒还包括M‑MLV反转录酶、M‑MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。本发明还提供一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品总RNA，(2)设计并合成引物，(3)RT‑PCR，(4)电泳检测。本发明提供了一种在甘薯中检测乔治亚曲叶病毒的试剂盒与检测方法，利用RT‑PCR方法检测甘薯中该新型乔治亚曲叶病毒，克服了分离甘薯病毒核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵敏性和可重复性，为甘薯中该乔治亚曲叶病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。

Description

一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
甘薯是无性繁殖作物，主要通过块根或秧蔓进行繁殖，如果受到病毒感染，就会代代相传，从而影响甘薯的正常生长发育，造成产量损失，种质和种性退化。甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curl virus,SPLCV)是侵染甘薯的主要病毒之一，近年来在我国主要甘薯产区严重发生，给甘薯生产带来严重的危害，发生严重导致甘薯绝产，造成巨大的经济损失。甘薯曲叶病毒属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员，SPLCV由烟粉虱(Bemisia tabaci)以持久方式传播。SPLCV侵染甘薯后，甘薯叶片卷曲、坏死、花叶等症状。目前，甘薯病毒病尚无特别有效的化学防治方法，因此，建立高效、快速、实用的病毒检测技术，加强对甘薯病毒的监测和预警，对甘薯病毒病的防控具有重要的意义。
甘薯乔治亚曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Georgia virus,SPLCGV)是我国甘薯上的新记录种。目前该病毒由于缺乏完整的基因组序列，不能制备抗血清，无法利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测；不清楚寄主范围，尚无法确定鉴别寄主。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测试剂盒与检测方法。
技术方案：本发明所述的一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测试剂盒，包括两条特异性引物：
SPLVGV-1：5’-GAATCGTCCTTATCAATGAG-3’；
SPLVGV-2：5’-GCTATCACTATCTGCGACAAG-3’。
进一步的，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
进一步的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明中还提供一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测方法，其包括以下步骤：
(1)提取待测样品总RNA；
(2)设计并合成引物；
(3)RT-PCR
a.反转录合成cDNA，以甘薯总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶合成cDNA
b.PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物，进行PCR反应；
(4)电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该乔治亚曲叶病毒的甘薯样品中有895bp的核酸条带。
进一步的，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。
进一步的，所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
有益效果：本发明提供了一种在甘薯中检测乔治亚曲叶病毒的试剂盒与检测方法，利用RT-PCR方法检测甘薯中该乔治亚曲叶病毒，克服了分离甘薯病毒核酸的繁琐步骤，节省时间，大大提高了检测的可操作性、灵活性和可重复性，为甘薯中该乔治亚曲叶病毒的防治、脱毒苗的检测提供了有效方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例
(1)引物设计与合成
根据甘薯小RNA高通量测序分析结果，设计并合成该乔治亚曲叶病毒的特异性引物：SPLVGV-1(GAATCGTCCTTATCAATGAG)和SPLVGV-2(GCTATCACTATCTGCGACAAG)；
(2)总RNA提取
多肽多酚植物组织裂解法
(3)RT-PCR
a.反转录合成cDNA
以甘薯总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶为MLV，合成cDNA，反转录体系为：
轻弹管壁混匀，稍离心后，42℃保温60min，然后置冰上待用；
b.PCR扩增
cDNA 2μL
2×Taq Mix 10μL
SPLVGV-1(10μmol) 2μL
SPLVGV-2(10μmol) 2μL
ddH2O 至10μL
PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存；
(4)电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，有895bp的核酸条带，为受该乔治亚曲叶病毒侵染的的甘薯样品，无条带为健康植株。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (6)

1.一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括两条特异性引物：
SPLVGV-1：5’-GAATCGTCCTTATCAATGAG-3’；
SPLVGV-2：5’-GCTATCACTATCTGCGACAAG-3’。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
4.一种甘薯中乔治亚曲叶病毒的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)提取待测样品总RNA；
(2)设计并合成引物；
(3)RT-PCR
a.反转录合成cDNA，以甘薯总RNA为模板，以SPLVGV-2引物，通过反转录酶合成cDNA
b.PCR扩增，以cDNA为模板，以SPLVGV-1和SPLVGV-2为引物，进行PCR反应；
(4)电泳检测
吸取2.5μL RT-PCR产物进行0.8-1.5％的琼脂糖凝胶电泳，经核糖染色Goldview，通过凝胶成像仪观察，在感染该乔治亚曲叶病毒的甘薯样品中有895bp的核酸条带。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中总RNA提取法采用的是多糖多酚植物组织的裂解法。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增阶段的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min；54℃退火1min；72℃延伸1min，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
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