CN113736747A

CN113736747A - 一种双rna病毒及双rna病毒快速识别的方法和应用

Info

Publication number: CN113736747A
Application number: CN202110830822.2A
Authority: CN
Inventors: 李宁求; 付小哲; 罗明菊; 林强; 梁红茹; 刘礼辉; 牛银杰; 罗霞
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2041-07-22
Also published as: CN113736747B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用。所述双RNA病毒包括基因组A节段和基因组B节段，双RNA病毒全基因组序列包括VP1、VP2、VP3和VP4共4个ORF，所述基因组A节段含有两个基因间隔区，VP2和VP4的基因间隔区为1458bp‑1949bp，VP3和VP4的基因间隔区为2445bp‑2663bp。本发明鉴定了引起拖便、肠炎的发病大口黑鲈症状的病毒病原为一种新的双RNA病毒，并获取了该病毒的全基因组序列，通过病毒宏基因组技术缩小了未知病原的范围，大大提高了确定未知病原的工作效率，为其他未知病原的确定提供了一种新的快速有效的技术方法。

Description

一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用。

背景技术

自然界中存在着数量庞大的未知新型病毒种类，而人类认知的病毒只占所有潜在病毒类型的0.1％。因此，新发病毒性病原体的快速确认技术对于临床治疗及疫情防控至关重要。

大口黑鲈(Micropterus salmoides)是一种优质淡水鱼类。近年来，大口黑鲈平均培苗成活率仅为5％左右，主要是由于未知病原导致的鱼苗拖便、肠炎、打转、熟身等病症，造成鱼苗死亡率近100％，现已严重制约大口黑鲈养殖业的健康发展，已成为大口黑鲈养殖业发展的瓶颈问题。

目前，临床上传统的病毒检测方法主要包括基于病毒基因的各类(RT-)PCR 分子检测方法和基于病毒抗原抗体的血清学检测。但这些方法的局限性是要提前预知病毒的基因序列或蛋白质序列信息，对于未知新型病毒则不能有效检出。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种双RNA病毒，所述双RNA病毒包括基因组 A节段和基因组B节段，双RNA病毒全基因组序列包括VP1、VP2、VP3和 VP4共4个ORF，所述基因组A节段含有两个基因间隔区，VP2和VP4的基因间隔区为1458bp-1949bp，VP3和VP4的基因间隔区为2445bp-2663bp。

作为本发明所述双RNA病毒的优选实施方式，所述基因组A节段的全长为 3525个核苷酸，所述基因组B节段的全长为2737个核苷酸。

作为本发明所述双RNA病毒的优选实施方式，所述基因组A节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因组B节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

更优选地，所述VP1、VP2、VP3和VP4编码的氨基酸序列长度分别为836 aa、422aa、220aa和165aa。

作为本发明所述双RNA病毒的优选实施方式，所述基因组A节段的 Genbank登录号为MW727622，所述基因组B节段的Genbank登录号为 MW727623。

第二方面，本发明提供了一种用于扩增上述双RNA病毒的扩增引物，所述扩增引物包括S1、S2、S3、S4、S5和S6引物，所述S1引物的序列如SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4所示，所述S2引物的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述S3引物的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，所述S4引物的序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述S5引物的序列如SEQ ID NO:11 和SEQ ID NO:12所示，所述S6引物的序列如SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14 所示。

第三方面，本发明提供了一种基于宏基因组测序快速识别上述的双RNA病毒的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本的DNA、RNA，分别构建样本的DNA、cDNA文库，得到样本测序文库；

2)对所述样本测序文库进行测序，之后对测序数据进行筛选，挑选在样品总重叠群中占比最大的病毒，即得上述的双RNA病毒。

第四方面，本发明提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括上述的双 RNA病毒。

第五方面，本发明提供了上述疫苗组合物在预防和/或治疗病毒感染相关疾病的药物中的应用。

本发明收集了临床症状为拖便、肠炎的发病大口黑鲈鱼苗，通过病毒宏基因组分析，发现疑似病原为一种双RNA病毒(Birnavirus)，进一步采用病原的分离鉴定、电镜观察、回归感染实验等方法确定该病的病原为大口黑鲈双RNA 病毒(Largemouth bassbirnavirus，LBBV)。本发明通过病毒宏基因组技术缩小了未知病原的范围，大大提高了确定未知病原的工作效率，为其他未知病原的确定提供了一种新的快速有效的技术方法。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明鉴定了引起拖便、肠炎的发病大口黑鲈症状的病毒病原为一种新的双RNA病毒，并获取了该病毒的全基因组序列，为后期该病毒的研究及病害的防治打下基础；

2)本发明涉及的灭活疫苗具有较好的免疫保护效果，可以为该病的免疫预防奠定基础。

附图说明

图1为采集得到的发病大口黑鲈症状图(靠近鱼头的箭头表示肝脏有出血点；靠近鱼尾的箭头表示肠道有黄色粘液)；

图2为病毒核酸在科水平上的病毒注释统计图；

图3为病毒在不同细胞系中的细胞病变效应图(CCO细胞(图3-(1-a)、图 3-(1-b))、CIK细胞(图3-(2-a)、图3-(2-b))、CPB细胞(图3-(3-a)、图3-(3-b))、 EPC细胞(图3-(4-a)、图3-(4-b))、FHM细胞(图3-(5-a)、图3-(5-b))、PSF细胞(图3-(6-a)、图3-(6-b))；(g)-(i)分别为感染后0h、12h、16h的CPB细胞病变情况；1、2分别为对照组和感染组，图3右下标不清楚不影响文本的公开， 50μm)；

图4为病毒电镜图((a)-(c)分别为发病大口黑鲈脾脏组织、感染CPB细胞的透射电镜；(d)纯化病毒负染图，右下标不清楚不影响文本的公开)；

图5为病毒基因组电泳图；

图6为LBBV的VP1蛋白系统进化树分析图；

图7为LBBV回归感染大口黑鲈的临床症状图(下方图的箭头表示肝脏有出血点；上方图中间箭头表示肠道有黄色粘液；鱼尾箭头表示尾鳍发黑)；

图8为采用不同感染方式对大口黑鲈致死效果的实验结果图；

图9为LBBV在大口黑鲈体内的组织分布图(1-9分别为肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠、心脏、鳃、脑和肌肉)；

图10为灭活疫苗免疫攻毒后的累计死亡率。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、病毒宏基因组测序

1、发病样品采集：2018年广东三水某大口黑鲈养殖场爆发了某未知病原疾病，本实验室研究人员前往发病地，采集发病大口黑鲈组织样品并保存。

如图1所示，发病的大口黑鲈，其临床症状主要为拖便、肠炎，剖检发现肝脏有淤血点、肠道有黄色粘液等炎症临床现象。

2、病毒宏基因组测序

为确定疾病暴发具体病因，申请人将发病大口黑鲈样品送至广州美格基因科技有限公司，进行病毒宏基因组测序。

分别提取发病样品DNA、RNA，将DNA、RNA打成大小不同的小节段， RNA样品经过反转录得到cDNA样品后，将两种样品通过PCR扩增、TA克隆，构建DNA与cDNA文库。将构建好的文库进行测序，通过soapnuke软件去掉接头、低质量序列、PCR重复序列等，然后使用SOAPaligner、BWA等软件去除核糖体与寄主序列，使用blastn及LCA算法，将组装得到的病毒序列与病毒数据库进行比对，从而获取样品中的病毒信息进行病毒分类。

去除核糖体、宿主序列，与病毒数据库比对后，RNA样品中包含601个疑似病毒序列的重叠群(contig)，DNA样品中得到71个contig，RNA样品中的 contig远远多于DNA样品(表1)。单独分析RNA样品，结果显示RNA样品中含有的RNA病毒重叠群(contig)有447个，DNA病毒contig有154个，RNA 病毒远远多于DNA病毒(表2)。通过算法比对计算分析，RNA样品总contig 中，含有39种病毒核酸序列(科水平)，其中一种未分类的双RNA病毒在总contig 的占比最大(图2)，约占总病毒序列的25％，因此，初步鉴定未知病毒属于一种尚未分类的双RNA病毒，暂命名为大口黑鲈双RNA病毒(Largemouth bass birnavirus，LBBV)。

表1病毒序列统计

表2 RNA、DNA病毒类别统计

实施例2、病毒分离及观察

取发病大口黑鲈肝、脾、肾混合组织100mg于1.5mL离心管中，向其内加入1mL PBS，匀浆3min后，每管加10μL双抗(青霉素和链霉素)，4℃孵育 2～4h后，4℃，8000r/min离心20min，0.22μm滤器过滤，过滤后的病毒液稀释100倍后，分别接种培养了16～24h的单层PSF、CCO、FHM、CIK、EPC、 CPB细胞，对照使用L-15培养基代替病毒液，28℃无CO₂培养箱孵育1h后，补加FBS终浓度为2％的L-15培养基，于培养箱培养，每天观察，7天之内若无明显CPE出现，则于第7天进行细胞盲传(最多5代)，待有明显CPE出现，反复冻融2次，过滤收集保存。将病毒连续传3代病变稳定后，取100μL病毒液，10倍连续梯度稀释，加至生长状态良好的CPB细胞中(96孔板)，100μL/ 孔，一个浓度/列，2列对照，28℃无CO₂培养箱孵育一个小时后，补加血清浓度为2％的L-15培养基(100μl/孔)，放置28℃无CO₂的培养箱培养，5～7d后，记录每个稀释度的病变孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀值。

透射病毒电镜观察：将病鱼脾脏组织切成1cm³；或将病毒接种CPB细胞约 11～12小时，胰酶消化细胞，收集细胞悬液至1.5mL离心管内，1000rpm/min离心10min，收集细胞。然后在组织块或细胞块中加入1mL 2.5％戊二醛固定液，4℃固定至少2h及以上，电镜观察并拍照。

电镜负染观察：取过滤过的病毒液制作负染切片，将铜网覆盖至样品滴上，吸附5min后，用滤纸吸干液体，将铜网覆盖至2％磷钨酸染色液上，染色30s；用滤纸吸干液体，电镜观察并拍照。

如图3所示，将过滤的病毒液稀释后，加入CCO(图3-(1-a)、图3-(1-b))、CIK(图3-(2-a)、图3-(2-b))、CPB(图3-(3-a)、图3-(3-b))、EPC(图3-(4-a)、图3-(4-b))、FHM(图3-(5-a)、图3-(5-b))和PSF(图3-(6-a)、图3-(6-b))单层细胞中培养16～24h，仅CPB细胞在培养12～24h后出现典型的CPE，主要的病变过程及特点为：接种病毒后0h，细胞呈梭形，细胞之间排列紧密(图3-(g))；接种后12h，局部细胞开始病变，细胞拉伸变长，细胞间间距变大，最后脱落并皱缩形成白色亮圆的细胞，漂浮于培养基表面(图3-(h))；接种16h后，细胞脱落达到95％以上，基本脱落完全(图3-(i))。连续传代3次之后，其TCID₅₀值为10^-9.25/mL。

如图4所示，透射电子显微镜结果显示，病鱼脾脏组织细胞中有病毒包涵体(图4-(a)，矩形)，放大可以观察到大量病毒粒子(图4-(b)，箭头)；在病毒感染的细胞中观察到，大量正六边形病毒颗粒聚集于胞质中，呈晶格样排列，无囊膜(图4-(c))；病毒负染结果显示，我们可以观察到病毒粒子，大小约60～70 nm、横截面呈六边形，即病毒粒子呈正二十面体结构，病毒外形清晰无破损，结构完整(图4-(d))。

实施例3、病毒基因组核酸型测定

核酸型测定：使用DNA生物合成抑制剂5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BUDR)鉴定病毒核酸型。大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus,LBRV)是一种DNA 病毒，作为阳性对照。取4瓶细胞，分别接种LBBV、LBRV，每种病毒接种2 瓶细胞(处理与对照)，孵育1h后，其中一瓶补加含有BUDR的2％FBS的L-15 培养基(BUDR终浓度为500μg/mL)，另外一瓶补加不含BUDR的2％FBS的 L-15培养基，放入28℃无CO₂培养箱培养，待对照细胞病变80％后，反复冻融两次，收取上清，测定病毒TCID₅₀。

病毒RNA电泳：收取病毒上清，4000rpm/min，离心10min，0.22μm滤器过滤，收集病毒液。采用trizol法提取病毒RNA，具体操作步骤如下：

(1)取500μL病毒液于2mL离心管中，加入1mL trizol，颠倒混匀后，冰上裂解8min；

(2)加入800μL氯仿，剧烈摇晃后，静置10min；

(3)12000r/min，4℃离心15min；

(4)取400～600μL上清于离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒，室温静置10min；

(5)12000r/min，在4℃离心机中离心15min；

(6)倒掉上清，加入1mL75％乙醇，上下颠倒1～2次，12000r/min，离心 5min；

(7)重复(5)；

(8)倒掉上清，室温晾置3～10min(视管中残留液体而定)，直至管壁干燥无水分；

(9)加适量DEPC水溶解；

(10)吸取5μL提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，电压80V，电泳30min。

如图5所示，提取的病毒RNA在琼脂糖核酸凝胶电泳后，呈现大小不同的两条带，下面一条带大小约2500bp～3000bp，另外一条带约3500bp～4000bp，两条带外形清晰，边缘平整，说明LBBV基因组是一种双节段的RNA。

使用BUDR处理LBBV与LBRV后，LBBV处理组与对照组病毒滴度分别为10^-9.2TCID₅₀/mL与10^-9.62TCID₅₀/mL，LBRV处理组与对照组滴度分别为0 (未病变)与10^-7.67TCID₅₀/mL(表3)。进一步说明LBBV基因组是一种RNA。

综上，判定LBBV是一种双节段RNA病毒。

表3 BUDR处理结果

实施例4、LBBV全基因组序列的测定及序列分析

采用Evo M-MLV RTase(Takara,Japan)反转录提取的病毒RNA获得cDNA，根据宏基因组测序结果，使用NCBI设计6对引物S1～S6(SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:14)，利用S1～S6引物进行基因组核心序列扩增(表4)。再根据基因组核心序列，设计四条引物5'Y1、3'Y1、5'Y2、3'Y2(SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:22)，按照SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit(Takara,Japan)中的 5'RACE操作说明用于基因组5'和3'末端的精确扩增(表4)。将PCR产物进行凝胶电泳，然后采用OMGEA胶回收试剂盒回收电泳产物。经DNA A-Tailing Kit 加上A尾，进行TA克隆。挑取阳性单克隆进行测序。

使用Vector 8.0对分段扩增和RACE末端扩增得到的序列进行拼接，得到了病毒基因组A节段和基因组B节段的完整序列。基因组A节段的全长为3525 个核苷酸(nts)，GC含量为57.11％、AT含量为42.89％。5'端的非编码区长度为170bp，3'端的非编码区的长度为83bp，没有poly(A)尾巴。A节段的Genbank 登录号为MW727622。基因组B节段的全长为2737nts，GC含量为56.35％、AT 含量为43.65％。5'端的非编码区长度为96nts，3'端的非编码区的长度为71nts，没有poly(A)的尾巴。B节段的Genbank登录号为MW727623。A节段编码VP2、 VP3、VP4蛋白，有两个基因间隔区，分别为VP2和VP4的基因间隔区(92nts； 1458bp-1949bp)和VP4和VP3的基因间隔区(219nts；2445bp-2663bp)；B节段编码VP1蛋白。具体的基因组编码信息如表5所示，病毒的基因组A节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因组B节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。

表4

表5编码蛋白信息

实施例5、系统进化树的构建

采用MEGA 7.0对来自双RNA病毒科以及其他病毒科病毒的VP1蛋白(依赖RNA的RNA聚合酶)序列进行比对及系统进化树构建，使用临近算法，并采用自引分析法(Bootstrap n＝l 000)进行检验。

结果显示(参考图6)，LBBV与双RNA病毒科(Binavirudae)的成员聚为一大类，其中与Lates calcarifer binavirus(LCBV)同源性最高，聚为一支，因此判定LBBV属于双RNA病毒科的一员。

实施例6、回归感染实验

选取3～5cm大口黑鲈，进行LBBV对大口黑鲈回归感染实验。设置注射组、浸泡组及对照组，注射组采取腹腔注射的方式，每尾鱼注射50μL病毒液(5×10^7.25 TCID₅₀)，15尾/组；浸泡组每组取2.2mL的LBBV，加入4L水中(1.1×10^8.25 TCID₅₀)，15尾/组；对照组注射等量L-15培养基。每天观察记录实验鱼死亡情况，计算累计死亡率。随机取3尾死亡鱼的肝、脾、肾、胃、肠、心脏、鳃、脑组织，相同组织混合为一管并称重，然后使用病毒RNA提取试剂盒(北京天根)提取组织RNA，反转录，TaqMan荧光定量PCR检测每毫克组织中的LBBV 的拷贝数，分析LBBV在大口黑鲈中组织分布情况。

如图7所示，大口黑鲈经腹腔浸泡或注射感染后，临床症状表现为食欲下降、游动缓慢，体表、尾鳍发黑；死亡后剖检，发现鱼肝脏有淤血点，肠道充满黄色粘液，与自然发病得大口黑鲈(图1)拥有相似临床症状。如图8所示，经过注射或浸泡，第1天均出现死亡，注射组第1天死亡率达20％，浸泡组为 6.67％，注射组死亡率大于浸泡组；第2天，死亡进入指数增长期，注射组死亡率为73.33％，浸泡组死亡率为46.67％；第3天，死亡增长进入平台期，此时注射组死亡率为100％，浸泡组死亡率为53.33％，且感染3天后，鱼体再无死亡情况发生。

如图9所示，在死亡鱼的不同组织器官内，均检测到LBBV，其中肝脏中含有24×10³拷贝/mg，脾脏中含有1194×10³拷贝/mg，肾脏中含有303×10³拷贝/mg，胃中含有124×10³拷贝/mg，肠中含有76×10³拷贝/mg，心脏中含有431×10³拷贝/mg，鳃中含有3×10³拷贝/mg，脑中含有351×10³拷贝/mg，肌肉中含有10×10³拷贝/mg。与鳃相比，其余组织LBBV的含量均显著高于鳃。

实施例7、免疫保护实验

取保存的LBBV病毒(10^9.42TCID₅₀/mL)加甲醛至终浓度为0.1％，37℃摇床，80rpm/min，灭活48h后，加20％的焦亚硫酸钠中止灭活(甲醛：焦亚硫酸钠＝1：2)，然后将病毒与佐剂IMS1312按1：1(w/w)比例混合，4℃保存备用。将健康的大口黑鲈(8～10cm)分为两组，即对照组与灭活疫苗组，每组60尾。灭活疫苗组每尾腹腔注射灭活疫苗200μL(1×10^8.42TCID₅₀)，对照组每尾腹腔注射 PBS(pH7.4)200μL。免疫21d后腹腔注射攻毒，200μL/尾(2×10^8.42TCID₅₀)，每天记录死亡情况，计算相对免疫保护率。

如图10所示，攻毒后第1d，对照组与灭活疫苗组开始死亡，第5d，对照组和免疫组均停止死亡，累计死亡率分别达到为84％和48％，灭活疫苗组相对免疫保护率为42.86％。

综上，本发明结合病毒宏基因组技术，快速的分离、鉴定出一种新的大口黑鲈双RNA病毒(命名为Largemouth bass birnavirus,LBBV)，该病毒直径约 60～70nm、横截面呈正六边形的，无囊膜，其核酸为双节段RNA，稳定性好，能耐弱酸碱及高温(60℃)，制备的灭活疫苗具有一定保护效果，具有较好的应用前景。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用

<130> 2021.06.29

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3525

<212> DNA

<213> 病毒的基因组A节段的核苷酸序列

<400> 1

ggaaagagag tgttgaccca gggtgaccac ccctggccac cctcggttct gctacaacgt 60

agctcctctt cttaatcaac acacactact gaattccatt agcactcacg atctgcattc 120

aactagctat caactacaaa ccaacaaaca acaacacagc aaaaccaaag atggagatga 180

caacaaaatc aaccgtagta ccatacctaa aatccctcct catgcccgac actggaccag 240

ccagcatccc cgatgacaac atcgagaggc acaccatcaa gtccgagcca accacctaca 300

acctgccagt cggagagtct gggagtggga caattgtcct ataccccaac tctccaaaca 360

gcctacttgg ggcccactac aagagggaca agaacgaccc ttcaaagctt acctttgacc 420

gggcgatcac cacctcacag gacctgaaga aggcctacaa ctttggtagg ctggtcagca 480

gggtactctc cgtaaggagc tccacgctcc cgtccggggt ctactcactg aacggaaccc 540

tcagtgcagt gacctacatt ggctcactgt cagagattgg cgacctagac tacaacaaga 600

tcctctcgac aacggccagc cacaacgaca aggtagggaa cgtcctagca agagatgggg 660

tcaccgtact atctctgcca actgggtttg acctgcagtt caccaggatg ggcgatgact 720

cgccgtcgtc tgagggaaca gccacagttg accccagctc gcagcccagg gtgtactcct 780

ctcaagcaga gacctcccag accatcacag ctggcagcaa caagaagctg attgcccaca 840

acctggacgc catcacaccg gtaactgtcc aggcccatgt caacctcacc accgccagcc 900

caacccacat cgagatcagc ctgatagggc tggacgggtc ccaagtggcc acccacaacg 960

caatcatcag cggaacagcg gcaaccctga cacaggacgt gacagcagtc ttcacccaag 1020

cagacatcaa acagcccatt gttgcaatga cagtgaaggt cttcgccacc gatgacatca 1080

ccgcagccca gatccaaacc agggccacgg tccacggggg cgacgcacca ggagtcctga 1140

gacccgtcac catcgtagcc tacgagaccc ttgcggagaa ctccatacta actctcgcag 1200

gggtgtccaa ctacgagctg ataccaaacc cagaactctc aaagaacatc attgccacct 1260

atgggaaact caacccacag gaaatgctct acacgaaagt ggtcctatcc cacagagatg 1320

agataggact gaaatccgtc tgggcgactg agcagtacaa ggacttccgt gcctacttcg 1380

ctgaagtagc agacgtctcc aagccactgc agatcgccgg ggccttcggg tggggtgacg 1440

tccttgggtt tctgagacgc tgggtgttcc cagggatcaa cgcagtcctc ccagtggcag 1500

cccccctcac caactacatt ggggaaaaga tccagcaggc ctacccagag gcggcctccg 1560

gccaccccag agctgcatca ggcaggccaa gggcagcagg aaccttcaga cccttcaggc 1620

ccatggcatg tgacgaggtc gaccacaagt tcaactcccc agccctagtc ctgccgggtg 1680

actggtcatt cctcactcca gagggaacca gcaaggaggt gctacccaat ggcacactgg 1740

tcgtaggatc aaccggcgag gaaggagcca tcaagatcac ggactccgtg acaatcgtct 1800

ccagtggagc atggctcaga aaactcctcc catgcctgaa ccccaccccc ctagccagtg 1860

acaggccgta cctcccacca cacatgcgca acaagccaga acccccaacc tgcacgggag 1920

cccccacgaa attcaccacc cacagggggg ccctcttccc cacagtggca ttcggcgagg 1980

gcacgtccgt cgcacagacg tacgtcgcgc tcccgggtga ctacaggcac ctgatggccc 2040

caaacctacg gagcgaatgg gccccaacgc aggacgggtt caaggtctac ggaatgacac 2100

accacacaat ccacgacaac gggaaaccct ccagaaaact gaacatacag gtggccacag 2160

gcgggaacat cactatcctg cccgttgaca aggtccagtg ggacaaggaa gacccaggcc 2220

ttgccactgt cacaacgagc tggaacggct tcccggctgt cgtcggtcag tcaggctcgc 2280

tagcactagc actagcctca aaccttgact actttcccca agcagtgttc accggctgcc 2340

tcaacaatgg gcaggtccag ccagtagcct tcgggtgcat gaaagcccaa gccgcacacg 2400

cactcgggct caagctctgt gggttcacga ctgggagaga cgaagacatc tccctctaca 2460

ctgcaaagga agccctgcag caggcatcca cgtacagggc ggagctgccg tactccacac 2520

aagacagcct ctacaacggc ttcttctact gcatggcagc agacaccagc ctggacgagg 2580

aactggatga gatcctcaag tgggccgaag aaaacctcgg gtcaactgaa gagccagtag 2640

acacctatgc aagctttcca aagtcaaagg acgtcaccac cacagatgtg accaaccagg 2700

ccctggcact gatggaggag gccgccgaga gcgacccaca acttgccaag gtgctgaaca 2760

tcatgtggtg ggtggaaaac tgcgggctca ttgaccacct ctacgactgg accaagatcg 2820

acaagggagg cgccagaatg ttccacatga tcaggaatgc acccactccc ggatccaagt 2880

cccagcgtcg gaagtatgga aaggaagccg cagggtacga ggatgtgcaa gaagccgtgc 2940

tagagagaga actacaagca aagctactga aagcccaacg actgtcatca gctgcaatac 3000

tgaacggctc gccgtttgcc accccagact ggatagccag gaacgactac cgaggcccaa 3060

accaagccca aaaccgctac tttcaggcca caggagaaga accaccagtc aaaatgacgg 3120

agttcctgca gccaggaacc ccctcgccca gaggagcacc aaactttgag acaattgcaa 3180

gcaacatcta cggtctgccc caccaagccc ctgcaccacc agagtttgta gaactggtca 3240

aggaagtgta cgccgacaac ggcgggcgcg gccccaacca aggacagata gccaagctga 3300

gaatgcaagc gaccctaatg aaaggcagta gtcctggtga gacttcagcc gcccccaagc 3360

ccaagaagaa actcacggcc ccgccaaagc caacatcagc tcggctaggc aggttcatga 3420

actttggagg cggcctgatt taacaggccg gcagcaaacc ccgcaaccgg cctgagcctc 3480

gacaggtctt tcgacaatct ccccctcagt caggcgccac actag 3525

<210> 2

<211> 2740

<212> DNA

<213> 基因组B节段的核苷酸序列

<400> 2

ggaaagtgtg ggtcgactcc tcgtgacaca ctaggaccac atcaacctgc tcgtcacgag 60

ctccccttga cacaaaacta ctacgaaacc ttaatcatga gcgacatatt caacaccgca 120

caaggaagat ccaaaatctt agcttcgctg aagctgcaaa acgtgacaga aaacacacag 180

gactggcttc tgcccccccg atgggaccct cctgctgaca ccatcaggaa ctcaaaggag 240

gcagcagaag ccctaaaagc aggtgggtac aggatgctca aacccagatc catccccgag 300

caccaaccca tatccaccgc cgctgccctc cccagtctgg ctgtactcgt cgagatggat 360

gccatcaaag acgaaataga gctacccggg ggagagaccg agtacctgcc cagatactac 420

cccatgcaca agcccgagca cggaaagcag accgagttcg ggatgtacga cctaccacta 480

ctcaagcaga tgacattcca gctcataaat gggaaagaga actcagctga ggaaggtgcc 540

accttcaaac agttcaggga cacaattctg gagtgccagt acggctcagg aaccaacgca 600

gggcagatag ccaggctcct agccatgaga ggggtcgcag tgggcaggaa ccccaacaaa 660

acactagccc agcagggcct gacactagaa cagatggcgg tgctactgga gcagacactg 720

cccatcggcc agcccggaga cgatgagaca ggctggccag ccctcacaac aacgctctca 780

ggtctgctga atccagacac gaacgaggac tacctcccag acgtcaccaa gaaatcctcg 840

gcagggctcc cctacatagg gaagaccaaa ggagacacaa tgctggaggc gctagcaatc 900

ggagacacat tcctcagaga actatccgca gtcctcagca gcaccacccc agaccagaag 960

gaccgattca actcacttct ccaggacttc tggtacctgt cgtgcgggct cctattcccc 1020

aagggggaac ggtacgacag agacgcatgg ctgaccaaga cccgcaacat ctggtccgcg 1080

cctttcccca cgcacttcct gatctcagcc atatcgtggc caatcatgaa gcaatccaaa 1140

aacaacacgc taaacatgga cacaccctcc ctgtatgggt tcaatccctt caacggcggg 1200

cttgactcaa tcatgaggcg cgtggagaag ggggaggacc tgcacctgat ctacgcagac 1260

aacatctaca tacttcagga caggatctgg ttcagcatag acctggagaa aggcgaagcc 1320

aacgccacaa agagccacgc tcaagccatt gcctactacc tcctcaccag aggctgggta 1380

caggacgacg gctcccccgc cttcaacgca acctgggcga cgctggccat gcaaatagcc 1440

cctgctctcg tggtcgactc aagctgcctg ttcatgaacc tgcagctgaa gacatatggg 1500

cagggcagcg gaaacccctg gacgttcctc atcaaccatg ccctctcaac catagttgtc 1560

aacgcctgga tccaggcggg caaaccacgg ccagacacac cacaattcat ggcactggag 1620

aagacaaccg gcgtgaactt caagattgag aggacgatcc ccgaagtacc cacagccgca 1680

ctgaaggcca gggagtcatc tcccctcatt gggtacctag gcgacggcac caacagaccc 1740

ccagagaaag aggcacccac agtggacctc gacctcctgg gctggtccgc cacatacagc 1800

agactactag agtcatgggt gcccgtccta gacaaggaac gcatgctgaa gtcagccgca 1860

tacccaaaag gcttggagaa caaagagctc aaaaaccaac caggagccga actggcatac 1920

accattgtca gaaacgaggc actcaggatg gtcggaggct gggcataccc actcctcgac 1980

cgctccctga aagccatggt cagcgcgaaa cgaaacgcgc tgaccgtgaa agggatcccc 2040

atcgagtcaa tgatgggcgg gtggcagaag atgacagagt tcagcgaagt cttcgaagga 2100

atcgatgcat cgctggaagt gacacccgag ttcctagcga acatgaacaa accaaagggg 2160

aggaagcagc cgcatgttaa caagctagcc cttgacatca agaacatgca gcaggccagc 2220

accgccctaa cgagtggggc cttcaggaac cccaacaaga tggccggcct aaaactaaac 2280

gccatggcca agtcaaaact catgacaacc ctgcaggcct tcaaagaagc agaagcagca 2340

gccgaccaag ctggcaccga cgactgggga gaagcatcag agacactaga caccatgctc 2400

cgcgcctcca ggatatacca agcagaggca gaggcatcac tgaaagacgt ctccgaggcc 2460

ctcgacagcc tctcagctgc cgcagccaac atcaaaacac agcaggagaa gaacaccgac 2520

acgatctcaa atccggtggt gggataccat gtcccagctc agcgctctct tggcgtcctg 2580

agctctgtga ctggggtggg acccgcaccg gtggacggcc gatcaaagaa cgcgaggaag 2640

atggccaaga gacgcagtcg gaagtagaag accaaagtcg acccgcaggc cttcaaagaa 2700

gcagaagcag cagccgacca agctggcacc ggaataatac 2740

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> A节段的S1正向引物序列

<400> 3

tctactcact gaacggaacc c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> A节段的S1反向引物序列

<400> 4

ggcacggaag tccttgtac 19

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> A节段的S2正向引物序列

<400> 5

tacttggggc ccactac 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> A节段的S2反向引物序列

<400> 6

tccctcttgt agtgggc 17

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> A节段的S3正向引物序列

<400> 7

tggacgagga actggatg 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> A节段的S3反向引物序列

<400> 8

tgactgaggg ggagattgt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> A节段的S4正向引物序列

<400> 9

tcttcaccca ggcagacatc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> A节段的S4反向引物序列

<400> 10

cattgtaaag gctgtctcgt g 21

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> B节段的S5正向引物序列

<400> 11

gtcaatgatg ggcgggtg 18

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> B节段的S5反向引物序列

<400> 12

ttgagtgtgg gtcgactttg gtc 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> B节段的S6正向引物序列

<400> 13

ttcaaacagt tcagggacac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> B节段的S6反向引物序列

<400> 14

gaattgtgtc cctgaactgt 20

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> A节段的5'Y1正向引物序列

<400> 15

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> A节段的5'Y1反向引物序列

<400> 16

gattacgcca agcttagcca ggaacgacta ccg 33

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> A节段的3'Y1正向引物序列

<400> 17

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> A节段的3'Y1反向引物序列

<400> 18

gattacgcca agctttgtac gccgacaacg gcggg 35

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> B节段的5'Y2正向引物序列

<400> 19

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> B节段的5'Y2反向引物序列

<400> 20

gattacgcca agctttgctc gggcttgtgc atgggg 36

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> B节段的3'Y2正向引物序列

<400> 21

gattacgcca agctttgctc gggcttgtgc atgggg 36

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> B节段的3'Y2反向引物序列

<400> 22

gattacgcca agcttggccc tcgacagcct ctcagc 36

Claims

1.一种双RNA病毒，其特征在于，所述双RNA病毒包括基因组A节段和基因组B节段，双RNA病毒全基因组序列包括VP1、VP2、VP3和VP4共4个ORF，所述基因组A节段含有两个基因间隔区，VP2和VP4的基因间隔区为1458bp-1949bp，VP3和VP4的基因间隔区为2445bp-2663bp。

2.如权利要求1所述的双RNA病毒，其特征在于，所述基因组A节段的全长为3525个核苷酸，所述基因组B节段的全长为2737个核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的双RNA病毒，其特征在于，所述基因组A节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因组B节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.如权利要求1或2所述的双RNA病毒，其特征在于，所述基因组A节段的Genbank登录号为MW727622，所述基因组B节段的Genbank登录号为MW727623。

5.一种用于扩增权利要求1所述的双RNA病毒的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括S1、S2、S3、S4、S5和S6引物，所述S1引物的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述S2引物的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述S3引物的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，所述S4引物的序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述S5引物的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，所述S6引物的序列如SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14所示。

6.一种基于宏基因组测序快速识别权利要求1所述的双RNA病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)对所述样本测序文库进行测序，之后对测序数据进行筛选，挑选在样品总重叠群中占比最大的病毒，即得权利要求1所述的双RNA病毒。

7.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括如权利要求1所述的双RNA病毒。

8.如权利要求7的疫苗组合物在预防和/或治疗病毒感染相关疾病的药物中的应用。