CN101684497B - 一种耳聋易感基因筛查试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种遗传性耳聋易感基因筛查试剂盒，该试剂盒以12s rRNA基因1494位点的C→T突变、12s rRNA基因1555位点的A→G突变、SLC26A4基因IVS7(-2)位点的A→G突变、GJB2基因235位点C(±)为检测对象，根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术原理，针对每个待测位点分别设计和优化出一套特异引物，并将成套引物置于同一个反应管中进行扩增，对四个反应管进行一次多重PCR扩增和一次凝胶电泳，即可同时获得四个位点的基因型。

Description

一种耳聋易感基因筛查试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种对耳聋易感基因进行筛查的试剂盒。

背景技术

人体疾病的控制与预防，关键是预知疾病，即知道疾病发病倾向，然后才能进行针对性的保健。目前疾病的检查分5个等级：组织器官水平、临床前、细胞水平、蛋白质水平、基因水平(分子水平)，由此看出，基因检测是最早的预警，也是最精确最高水平的诊断。基因检测是通过对受检者基因编码序列的测定和定位分析，精确定格相关器官的生理健康状态，探知现在，预示未来。国际标准化操作，结果可随时与国际接轨。它能使每个受检者有意识、有针对性地捍卫现时健康，调节与控制易患疾病因素的“适时”表达。

人类目前已经发现的单基因遗传疾病有6000多种，抽取羊水细胞，甚至从母体血中都可获得胎儿细胞。检查这些细胞的该基因是否有缺陷，就能确定胎儿是否从亲体获得遗传性疾病，如是，则可立即终止妊娠。当前更先进的方法是进行体外受精，然后取早期胚胎细胞进行基因检查，选取正常的早期胚胎植入母体妊娠。通过对病原体DNA的检查，可以使传染病的检出率、检出速度大大提高。例如对结核杆菌感染的诊断，以前要靠痰、粪便或血液培养，耗时两周以上，现在用基因诊断的方法，不仅敏感性大大提高，而且在1小时内就能得出结果。基因检查对非感染性疾病的诊断也有帮助。目前基因诊断已扩大到疾病易感性基因的检查。有些基因改变本身并不致病，但这些基因改变的个体易受某些环境因素的作用而得某种疾病，例如现在发现染色体上的BCR1基因发生突变的女性易患乳腺癌，据此可筛选出乳腺癌易感人群，加强预防。现在已发现糖尿病、骨质疏松、高血压、白血病等多种疾病的易感基因。

在各种疾病易感基因中，聋病易感基因已受到越来越多的关注。根据国家卫生部和中国残联的统计资料，我国目前有1.2亿人存在听力障碍，其中听力语言残疾者达2780万人，并以每年3万聋儿的速度在增长，其中一半以上患者的病因与遗传因素有关。发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80％，因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。

在目前已经定位和克隆的耳聋相关基因中，GJB2是最常见的易感基因，在先天性重度耳聋患者中约占30-50％。目前，在该基因已经发现了100多种突变类型，然而，不同种族GJB2基因常见的突变形式不同。在中国常见的突变形式为235delC，其在所有致病性突变中约占74.14％，约22.2％的中国耳聋患者与该突变有关。该基因突变者多数表现为先天性重度耳聋，然而相当一部分GJB2基因突变者在出生时其听力并无异常，在听力筛查中被判定为“通过”，使得此型耳聋的发现被延迟。因此，在新生儿期对GJB2基因突变进行筛查是早期发现潜在耳聋危机、早期预警和早期干预的重要策略。

药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12SrRNA基因1555A→G突变有关，该突变可以增加耳蜗对氨基糖甙类药物的敏感性。在美国，耳毒性药物相关的听力损失患者中，10％的具有12S rRNA基因1555A→G突变，美国语前听力损失患者中，1555A→G突变患者的发病率约为1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因1555A→G突变与15-20％的家族性非综合征型听力损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖甙类药物也可发生因此突变导致的听力下降。而在中国，药物性耳聋的发病率超出了原有的想象，在一系列的文章报道中，发现在门诊散发的耳聋患者中的检测发现约5％的患者是由于12S rRNA基因1555A→G突变导致的，而在聋哑学校这样一个特殊群体，则高达12％的患者是由于12S rRNA基因1555A→G突变接触氨基糖甙类药物而致聋。同时在中国群体中还发现了12S rRNA基因1494C→T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由于1494C→T突变导致的。1555A→G突变和1494C→T突变者在出生时往往听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使用而发生听力损失的隐患。针对线粒体12SrRNA基因1555A→G突变和1494C→T突变的基因检测可以揭示母系遗传的特征，并可以进行有效的预警。

对Pendred综合征病人的研究表明，在SLC26A4基因检测时常带有两个突变位点，而61％的单纯前庭水管扩大患者仅带有单个突变，这一点提示在1.7％的SLC26A4基因突变携带者中，超过30％的人都可能具有发病的危险。同时也表明，在这些单纯前庭水管扩大患者中，可能存在其他基因的突变与SLC26A4基因的单个突变相互作用。最近的研究显示，在810名感音神经性耳聋的患儿中，20.8％的患儿表现为前庭水管扩大并感音神经性聋，理论上讲，这些患儿出生后即有症状，然而这些症状发现的平均年龄却为5.8岁。可以推测，他们之中约7％的患儿表现为语前听力损失，若当时进行早期基因检测和干预的话这些患儿会大大受益。赵亚丽等对中国西北地区101个大前庭水管综合征的家庭中107名患者和159名重度感音神经性耳聋患者进行了系统的研究，初步绘制了前庭水管扩大相关基因SLC26A4在中国人群的突变图谱，发现了存在于中国人群突变热点区域为：内含子7的3’端的IVS7-2A>G。SLC26A4与大前庭导水管综合征密切相关，基因诊断可以对疾病进行早期的预防和预警，有利于明确病因并可以尽可能地防止听力进行性下降。这些进展为临床疾病的诊断提供了更为全面的手段，为病人提供了更为有效的咨询。

通过上述三个易感基因与遗传性耳聋的关系，结合当前施行的聋病治疗策略与技术，我们可以设计一套遗传性耳聋综合防治的方案：1、如果患儿基因诊断结果提示先天性耳聋是由于GJB2基因突变导致的，那么该患儿的耳神经传导通路以及听觉语言中枢应该是正常的，因此在患儿早期即可进行人工耳蜗移植，使患儿获得良好的语言发育。2、如果1555A>G基因检查为阳性，那么患儿的母亲家族中应该永远避免应用氨基糖甙类药物，防止药物性耳聋发生。进行产前基因诊断，对于有生育耳聋患儿风险的夫妇意义特别重大。当他们生育一个聋儿后，迫切想知道第二个孩子的情况，这时的基因诊断加上产前诊断，在怀孕10周后即可确认胎儿的耳聋基因状态，从而可以提前采取干预措施，避免聋儿出生。3、如果对所有新生儿进行迟发性听力损失相关的四个基因突变热点(GJB2235delC、SLC26A4IVS7-2A→G、12S rRNA1555A→G、12S rRNA1494C→T突变)进行检测，再加上对巨细胞病毒感染的检查，那么对于新生儿中具有迟发性听力损失的高危儿来说，其中60％可在新生儿期即做到症状前诊断，同时在先天性听力损失患儿中至少40％的可以明确病因。这是一个令人鼓舞的数据和具有很好前景的革命性工作。这些干预措施可以使数万孩童及其家庭免除一生的痛苦，更可为国家每年节省数百亿元的经济损失，其社会意义和经济意义也同样巨大。

为了实现聋病防治工作的“早发现、早诊断、早干预”，我国自2000年开始在全国普及新生儿听力筛查。目前新生儿的听力筛查正在不断扩展，所用的方法是新生儿在出生后三天内应用耳声发射仪器进行检测，42天后进行复查。国家卫生部以及母婴保健法要求的新生儿听力筛查的阳性发现率为1‰，而实际工作开展至今的统计数据显示，我国新生儿重度耳聋的平均发病率基本符合该比例。但是在对5岁儿童和青春期14岁人群的研究结果中，这一比例则分别约为2.5～3‰和3.5～4‰，差别非常之大，研究显示随着新生儿的生长发育，迟发型耳聋和药物性耳聋的发病率迅速提高。这一现象表明，单纯新生儿听力筛查具有很大的局限性，仅就技术策略来说，听力筛查是无法发现听力正常的药物性耳聋基因携带者和迟发型耳聋患者的，而如果在新生儿听力筛查中融入聋病易感基因筛查的内容将会如何呢？

根据我们前期对10000例新生儿进行易感基因筛查的研究，发现线粒体12SrRNA A1555G基因筛查阳性者比例约为1‰；12SrRNA C1556T基因筛查阳性者比例约为4.4‰；发现GJB2致聋基因突变者比例约为12.9‰；SLC26A4致聋基因突变者比例约为12‰。累计聋病基因检测的阳性发现率约为30‰，比当前听力筛查的检出率高出30倍。以我国每年1800万新生儿计，通过易感基因筛查，每年将可筛查出54万名新生儿是致聋基因的携带者，并且如前文所述可以通过早期干预和提前预知使其中的50～60％免于发病，这样就在很大程度上弥补了新生儿听力筛查的不足。这说明新生儿耳聋易感基因筛查具有重大的社会意义和经济意义。

对于耳聋易感基因的检测，国际及国内都已发展出了多种技术策略及相应的产品。目前市场上现有的聋病易感基因检测方法及其产品主要有如下几种：

1.基因芯片法：目前已有的试剂盒采用了基因芯片的原理，可同时检测4个耳聋相关基因(GJB2，GJB3，SLC26A4和12S rRNA)的10个突变热点。该试剂盒的组成包括PCR扩增引物混合物、PCR扩增试剂混合物、杂交试剂、洗涤试剂、芯片和盖片等。优点是快速、高通量筛查，但操作过于复杂，成本太高，不易普及。

2.LDR法：以连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)为核心技术，目前有针对药物性致聋相关基因多态性位点(SNP)的试剂盒，可以检测到多个位点的突变，但是需要探针技术、杂交，以及洗脱后进行结果的判读，操作环节较多，需要专业人员操作。同时虽然该法较芯片技术成本低，但一次检测操作至少要5小时以上。

3.RFLP法：以限制性酶切片段长度多态性(RFLP)为核心技术，目前已有的该类型试剂盒主要由DNA提取部分、PCR部分、内切酶试剂组成，成本比芯片技术及LDR技术相对较低，操作也相对简单，但是需要模板制备、PCR扩增、酶切和电泳验证，操作时间长，过程繁锁，各个环节之间关系紧密，一步失误则下一步无法进行。DNA的提取还需要消耗一定的时间和成本，而且血样的提取、结果的判读需要有经验的人员进行专门的培训后才能胜任，不适合面向基层的普及应用。

4.定量PCR法：目前有针对药物性致聋相关基因的试剂盒，配以野生型和突变型两种特异性引物、基因特异性荧光探针、PCR反应液、耐热DNA聚合酶、核苷酸单体等成分，用实时荧光定量PCR体外扩增法检测A1555A>G野生型、A1555A>G突变型、C1494T野生型，C1494T突变型四种型别。该试剂盒的特异性较好，但对仪器和操作人员技术要求较高，成本较高，对操作人员需要较高的技术要求，因此不适合普及和推广。

如上所述，这些方法普遍存在技术要求高、步骤多、速度慢、成本高等特点，国内医院的实施难度较大，尤其是很难在基层临床医疗机构进行推广和普及，更无法成为耳聋易感基因筛查的工具。当前，为了从根本上提高国民医疗水平，国家提出了“战略前移、重心下移”的疾病防治新战略，着重强调以预防为主、以农村为主。因此，开发易操作、成本低、适合基层推广的技术方法和相应产品成为当务之急，具有重大的医疗价值和社会意义。

四引物ARMS-PCR法(Tetras primer amplification refractory mutationsystem-PCR，Tetras primer ARMS-PCR)属于等位基因特异PCR技术范畴，其基本原理是：由于Taq DNA聚合酶无3′→5′外切酶活性，当引物的3′末端碱基不能与模板互补时，延伸效率明显降低，当错配碱基的数目达到一定程度或者反应条件达到一定的严谨程度时，延伸无法继续，反应终止，得不到特异长度的扩增条带。基于此，针对一个SNP位点设计两个延伸方向相反的内侧引物(Inner primer)，这两个引物的3′末端碱基分别与SNP位点的一个碱基相同(或互补)，然后按正常的方法设计两个方向相反的外引物(Outer primer)；这四个引物可以组成三个引物对，在同一个扩增体系进行反应，扩增产物用凝胶电泳检测时，出现两条带的是纯合基因型，出现三条带的是杂合基因型。

如上所述，四引物ARMS-PCR法的技术实施不需要特殊的设备和复杂的操作步骤，只需要一个PCR反应和一次凝胶电泳就可以明确区分出三种基因型。因此该技术是一个结果准确可靠、操作简便高效、使用成本低廉的基因分型方法，自2001年被提出以来即获得了广泛的应用，尤其是对于多位点多样本的检测，其操作简捷和成本低廉的特点更是具有当前其它方法所无可比拟的优势。

发明内容

本发明的技术方案是通过以下的措施来达到的：

设计了一种遗传性耳聋易感基因筛查试剂盒，以12s rRNA基因1494位点的C→T突变、12s rRNA基因1555位点的A→G突变、SLC26A4基因IVS7(-2)位点的A→G突变、GJB2基因235位点C(±)为检测对象，根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术原理，针对每个待测位点分别设计和优化出一套特异引物，并将成套引物置于同一个反应管中进行扩增，对四个反应管进行一次多重PCR扩增和一次凝胶电泳，即可同时获得该四个位点的基因型。

线粒体基因组12s rRNA基因第1555位点A→G突变检测的上游外引物位于1555位点上游的第1310-1360nt区域，下游外引物位于1555位点下游的第1640-1690nt区域，对应突变基因型的内引物位于1515-1555nt区域，对应正常基因型的内引物位于1555-1595nt区域。引物序列及设定名称如下：

SEQ NO.01：上游外引物：5’-TgTAgCCCATgAggTggCAAgAAATg-3’

SEQ NO.02：下游外引物：5’-TTAgCTCAgAgCggTCAAgTTAAgTTgAAA-3’

SEQ NO.03：突变内引物：5’-TTTAACTAAAACCCCTACgCATTTATATAgAggAgg-3’

SEQ NO.04：正常内引物：5’-CACTTTCCAgTACACTTACCATgTTACgACTTgT-3’

线粒体基因组12s rRNA基因第1494位点C→T突变检测的上游外引物位于1494位点上游的第1200-1250nt区域，下游外引物位于1494位点下游的第1640-1690nt区域，对应突变基因型的内引物位于1450-1494nt区域，对应正常基因型的内引物位于1494-1534nt区域。引物序列及设定名称如下：

SEQ NO.05：上游外引物：5’-AACCCCgATCAACCTCACCACCT-3’

SEQ NO.06：下游外引物：5’-ggCTAggTTTAgCTCAgAgCggTCAAgT-3’

SEQ NO.07：突变内引物：5’-CgTACACACCgCCCgTCACT-3’

SEQ NO.08：正常内引物：5’-TTTAgTTAAATgTCCTTTgAAgTATACTTgAggAgg-3’

细胞核基因组中SLC26A4基因IVS7(-2)位点A→G突变检测的上游外引物位于IVS7(-2)位点上游的IVS7的第(-360)—(-310)nt区域，下游外引物位于IVS7(-2)位点下游的IVS8的第95-135nt区域，对应突变基因型的内引物位于IVS7的第(-40)—(-2)nt区域，对应正常基因型的内引物位于IVS7(-2)—EXON8(40)nt区域。引物序列及设定名称如下：

SEQ NO.09：上游外引物：5’-CATgTgggAAgATTCATATgAgAATTgATTgT-3’

SEQ NO.10：下游外引物：5’-CCAgATCACACACAAATAggACTATTgAAggAgTAT-3’

SEQ NO.11：突变内引物：5’-ACCAATggAgTTTTTAACATCTTTTgTTTTATTTCg-3’

SEQ NO.12：正常内引物：5’-gCTCCATATgAAATggCAgTAgCAATTATCgTCT-3’

细胞核基因组中GJB2基因第235位点碱基缺失检测的上游外引物位于该基因5’-UTR区的第(-110)—(-60)nt区域，下游外引物位于235位点下游的第450-500nt区域，对应突变基因型的内引物位于190-235nt区域，对应正常基因型的内引物位于235-275nt区域。引物序列及设定名称如下：

SEQ NO.13：上游外引物：5’-gCTCAggAAgAgATTTAAgCATgCTTgCT-3’

SEQ NO.14：下游外引物：5’-CATggAgAAgCCgTCgTACATgACAT-3’

SEQ NO.15：突变内引物：ATCTCCCACATCCggCTATgggCCT

SEQ NO.16：正常内引物：ggCgTggACACgAAgATCAgCTCCCg

为了使筛查工作的实施具有操作简便、结果准确可靠的特点，本试剂盒分别预制了四种可直接上机使用的多重PCR试剂，其组分分别为：

1.12s rRNA基因1555位点分型的反应试剂，包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去离子水、引物SEQ NO.01、SEQ NO.02、SEQ NO.03、SEQ NO.04。

2.12s rRNA基因1494位点分型的反应试剂，包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去离子水、引物SEQ NO.05、SEQ NO.06、SEQ NO.07、SEQ NO.08。

3.SLC26A4基因IVS7(-2)位点分型的反应试剂，包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去离子水、引物SEQ NO.09、SEQ NO.10、SEQNO.11、SEQ NO.12。

4.GJB2基因第235位点分型的反应试剂，包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去离子水、引物SEQ NO.13、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16。

附图说明

图1：四引物ARMS-PCR法技术原理示意图。

图2：1555位点10个样本扩增产物电泳结果。

图3：1494位点10个样本扩增产物电泳结果。

图4：SLC位点10个样本扩增产物电泳结果。

图5：GJB2位点10个样本扩增产物电泳结果。

具体实施方式

借助以下实施例对发明作进一步描述。

下面这些实施例是示范性的，而不是限制性的，可根据上述技术方案和试剂情况，来确定具体的实施方式。

一、待测样本选择

待测样本从解放军总医院承办的中国贫困聋儿救助行动—“华夏万名新生儿听力拯救项目”中选择。该项目中所涉及的所有血样都使用“DNA提取—PCR扩增—测序”的技术方法对样本的线粒体12S rRNA基因的1555位点和1494位点、SLC26A4基因的IVS7-2位点、GJB2基因的235位点进行了基因分型。

本实施例中选择上述已经过基因分型的样本作为待测样本，其中各位点分别选择4个纯合阴性基因型样本、4个杂合基因型样本、2个纯合阳性基因型样本，各取对应样本的基因组DNA备用。

二、PCR反应体系及反应程序设置

1、PCR体系

取四种预制的多重PCR试剂，分别加到四个PCR反应管中，在每个管中各加入10ng gDNA，混匀后密封，将四个反应管一起放置到PCR仪中。

2、扩增程序

4、琼脂糖凝胶电泳

(1)使用0.5×TBE制备2％琼脂糖凝胶；

(2)从PCR管中吸取扩增产物2μl，与2μl的6×Loading Buffer混匀后加入凝胶的梳子孔中；

(3)200V恒压电泳90分钟；

(4)电泳结束后取出胶块置入凝胶成像仪中，紫外灯下显示电泳条带并照相。结果如图2、图3、如图4、图5所示。

5、结果分析及基因型判定

根据电泳结果中各泳道的带型特征，对各样本的四个位点分别进行基因型判定。

结果：基因型分型结果与测序法获得的结果一致。

Claims (2)

1.一种遗传性耳聋易感基因筛查试剂盒，其特征在于，以12s rRNA基因1494位点的C→T突变、12s rRNA基因1555位点的A→G突变、SLC26A4基因IVS7(-2)位点的A→G突变、GJB2基因235位点C(±)为检测对象，根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术原理，针对每个待测位点分别设计和优化出一套特异引物，并将成套引物置于同一个反应管中进行扩增，对四个反应管进行一次多重PCR扩增和一次凝胶电泳，即可同时获得四个位点的基因型，所述特异引物为SEQ NO.01-SEQ NO.16所示序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括下列内容：

(1)12s rRNA基因1555位点分型的反应试剂，包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去离子水、序列特异的两种外引物SEQ NO.01和SEQNO.02、序列特异的两种内引物SEQ NO.03和SEQ NO.04；

(2)12s rRNA基因1494位点分型的反应试剂，包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去离子水、序列特异的两种外引物SEQ NO.05和SEQNO.06、序列特异的两种内引物SEQ NO.07和SEQ NO.08；

(3)SLC26A4基因IVS7(-2)位点分型的反应试剂，包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去离子水、序列特异的两种外引物SEQ NO.09和SEQNO.10、序列特异的两种内引物SEQ NO.11和SEQ NO.12；

(4)GJB2基因第235位点分型的反应试剂，包括10×PCR Buffer、dNTP、Mg²⁺、Taq酶、去离子水、序列特异的两种外引物SEQ NO.13和SEQ NO.14、序列特异的两种内引物SEQ NO.15和SEQ NO.16。

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