CN102559910B - 一种聋病易感基因slc26a4 ivs7-2a＞g荧光检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G的荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的引物混合物；所述扩增后试剂包括：基因分型标准物和内标。本发明以IVS7-2A＞G、Amelogenin基因座为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义；在耳聋基因筛查领域中首次复合采用了荧光标记技术、LNA核苷单体掺入-引物修饰技术、毛细管电泳技术实现对耳聋基因位点IVS7-2A＞G的高灵敏度特异性检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
SLC26A4基因与弧立的大前庭水管综合征及Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)的关系密切，临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。通过颞骨CT扫描可以得出结论，但目前由于设备和专业人员的限制，中国大部分地区的医院不能进行高分辨率的颞骨CT扫描，导致许多地区无法诊断大前庭水管综合征。
通过对SLC26A4基因的检测，则可以在全国范围内实现对80％以上大前庭水管综合征的准确诊断，并先于CT检查发现和确诊大前庭水管综合征，这一方法可以避免放射线检查的辐射问题，更易为患者家属接受，并且由于基因诊断操作能够批量进行，可以在大标本范围内进行筛查。大量研究表明，存在于中国人群突变热点区域为：SLC26A4基因外显子8的侧翼序列的IVS7-2A＞G。
目前常用的基因检测方法有：直接测序(directsequencing，DS)、连接酶检测反应(ligasedetectionreaction，LDR)、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturinghighperformanceliquidchromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。
采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带荧光标记物的引物对SLC26A4基因的IVS7-2A＞G位点特异性的扩增，并在此引物中掺入核酸类似物提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对耳聋基因位点的检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确，仅需采取少量血样或口腔拭子样本，即可进行检测，采样方便尤其适合新生婴幼儿样本的采集。
发明内容
本发明目的是提供一种聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G荧光检测试剂盒。
为了实现上述目的，采取的技术方案：一种聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；
所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs的混合物，Taq酶，2对引物混合物以及超纯水；
所述扩增后试剂包括：用于基因分型的对应于SLC26A4基因突变热点IVS7-2A＞G检测和Amelogenin性别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标ROX-300；
使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，2对引物混合物中的单对引物终浓度为0.2-0.4μM。
使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增SLC26A4基因的IVS7-2A＞G和Amelogenin基因座。
用于SLC26A4基因IVS7(-2)位点A＞G突变检测的引物为：SEQNO.01和SEQNO.02.X。
SEQNO.02.X为下列掺入了LNA核苷的引物中的任意一条(LNA核苷以黑体字表示)：
SEQNO.02.1：5’-GTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3’
SEQNO.02.2：5’-GTTTTTAACATCTTTGTTTTATTTAG-3’
SEQNO.02.3：5’-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTG-3’。
用于Amelogenin基因座检测的引物为：SEQNO.03：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’、SEQNO.04：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
所述的2对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料可以为相同或不同的荧光素。
所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
其中所检测的人基因组DNA为：使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA；所述的来源样本为：来源于人类的：滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑/口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。
使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序：94-98℃1-5min；26-32个循环的94-98℃15-60s，55-65℃15-60s，72℃15-60；60℃30-60min。
对于IVS7-2位点突变的检出，使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了引物的Tm值，缩短了引物长度，从而增加了引物的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。
对于Amelogenin的检出，一方面是内参的作用：指示模板DNA是否有效或浓度范围；另一方面能有效指示是否存在PCR产物污染，防止因污染产生的假阳性。
附图说明
图1是本发明的试剂盒(采用不同荧光染料标记)对突变个体血斑来源DNA扩增后的分型结果；
图2是本发明的试剂盒(采用不同荧光染料标记)对正常个体血斑来源DNA扩增后的分型结果；
图3是本发明的试剂盒(采用相同荧光染料标记)对突变及正常个体血斑来源DNA扩增后的分型结果。
图4是经修饰和未修饰的引物对同一男性确证病例不同浓度DNA的分型结果。
图5是经修饰和未修饰的引物对同一男性正常个体不同浓度DNA的分型结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1
聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G荧光检测试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本，用于聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G检测的引物采用蓝色荧光染料6-FAM标记，用于Amelogenin基因座扩增的引物采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；内标采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。
1、待测样本100份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对SLC26A4突变热点IVS7-2位点进行过测序检测，其中突变样本5份。
2、检材的基因组DNA提取
Chelex提取法：剪下1～3mm血斑置于1.5mL离心管中，加入sdH2O1mL，振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5％Chelex-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200μL加入离心管中，振荡数秒，。于56℃水浴保温30min后，振荡数秒。95℃沸水浴10min，轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3.1PCR扩增体系：
3.2PCR扩增程序：
4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔(0.2μL分子量内标)×(进样数)+(9.8μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将10μL上样混合物与1μL扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95℃变性5min，冰浴5min，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。
5、结论
本发明分型完整清晰，结果如图1-2所示：
图1：第1、2行：确诊病例，男，IVS7-2位点判读位置(88bp)出现峰值1500H的检测峰，性别出X、Y双峰(105bp，峰值2700H和111bp，峰值2800H)
图1：第3、4行：确诊病例，女，IVS7-2位点判读位置(88bp)出现峰值5500H的检测峰，性别出X单峰(105bp，峰值7500H)
图2：第1、2行：正常个体，男，IVS7-2位点判读位置(88bp)不出峰，性别出X、Y双峰(105bp，峰值2800H和111bp，峰值2800H)
图2：第3、4行：正常个体，女，IVS7-2位点判读位置(88bp)不出峰，性别出X单峰(105bp，峰值2800H)
与测序方法相比较：对同一来源的样本的相同基因座分型结果是一致的。
实施例2
聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G荧光检测试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本，用于聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G检测的引物采用蓝色荧光染料6-FAM标记，用于Amelogenin基因座扩增的引物采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；内标采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。
1、待测样本同实施例1。
2、检材的基因组DNA提取
采用Chelex法进行基因组DNA的提取。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3.1PCR扩增体系：
3.2PCR扩增程序：
4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
同实施例1。
5、结论
本发明分型完整清晰，结果如图3所示，
第1行：确诊病例，男，IVS7-2位点判读位置(88bp)出现峰值1400H的检测峰，性别出X、Y双峰(105bp，峰值2600H和111bp，峰值2800H)
第2行：确诊病例，女，IVS7-2位点判读位置(88bp)出现峰值5800H的检测峰，性别出X单峰(105bp，峰值7800H)
第3行：正常个体，男，IVS7-2位点判读位置(88bp)不出峰，性别出X、Y双峰(105bp，峰值2900H和111bp，峰值3000H)
第4行：正常个体，女，IVS7-2位点判读位置(88bp)不出峰，性别出X单峰(105bp，峰值2800H)
与测序方法相比较：对同一来源的样本的相同基因座分型结果是一致的。
实施例3
聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G荧光检测试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本，用于聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G检测的引物、用于Amelogenin基因座扩增的引物均采用黄色荧光染料TAMRA标记；内标采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。其中，用于聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G检测的引物使用：经过LNA核苷单体掺入修饰的引物(SEQNO.02.2：5’-GTTTTTAACATCTTTGTTTTATTTAG-3’)和普通引物(SEQNO.02.0：5’-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3’)进行扩增效果的比较。
1、待测样本同实施例1。
2、检材的基因组DNA提取
采用Chelex法进行基因组DNA的提取。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3.1PCR扩增体系：
3.2PCR扩增程序：
4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
同实施例1。
5、结论
如图4所示，对于男性确诊病例，
掺入了LNA核苷单体的引物SEQNO.02.2(本发明试剂盒引物)所得结果(左图)和未经修饰的SEQNO.02.0引物所得结果(右图)一致，即在各个DNA浓度下均能获得正确的判定结果：IVS7-2位点A＞G判读位置出峰，性别出X、Y双峰，均随DNA浓度的增加峰值增加。具体如下：
如图5所示，对于男性正常个体，
掺入了LNA核苷单体的引物SEQNO.02.2(本发明试剂盒引物)所得结果(左图)和未经修饰的SEQNO.02.0引物所得结果(右图)对IVS7-2位点不一致：前者在各个DNA浓度下均不出峰；而后者当DNA的量大于1ng时，IVS7-2位点判读位置出峰，与测序结果不一致，即使用未经修饰的SEQNO.02.0引物易出现假阳性的结果。两者对于性别的判定一致：性别出X、Y双峰，均随DNA浓度的增加峰值增加。具体如下：
因此，本发明试剂盒引物能够特异性地检出IVS7-2位点突变，结果与测序结果一致，不出现假阳性。
以上实施例中所用的不同pH的2.5×PCR缓冲液，用不同pH值的Tris-HCl缓冲液配制，1×PCR缓冲液中的Tris-HCl浓度为10mM，KCl浓度为50mM；本发明中所用的Taq聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。
Claims (4)
1.一种聋病易感基因SLC26A4IVS7-2A＞G荧光检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的引物、及基因突变位点IVS7-2A＞G和Amelogenin基因座的基因分型标准物和内标：所述突变热点IVS7-2A＞G检测的引物为SEQIDNO.01和SEQIDNO.02.2：
SEQNO.01：5’-CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3’，
SEQNO.02.2：5’-GTTTTTAACATCTTTGTTTTATTTAG-3’，
其中LNA核苷以黑体字表示；所述用于IVS7-2A＞G和Amelogenin扩增的引物，每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述Amelogenin基因座检测的引物为：
SEQNO.03：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’
SEQNO.04：5’-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述突变热点IVS7-2A＞G检测的引物和用于Amelogenin基因座扩增的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记；内标选用不同于上述的荧光染料标记。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述IVS7-2A＞G和Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
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