CN117402855B - 一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
Description
技术领域
本发明涉及功能蛋白领域，特别涉及一种Cas蛋白及基因编辑系统。
背景技术
基因编辑CRISPR/Cas系统是一种能够精确的对物种基因组特定靶基因进行修饰的基因工程技术。通过Cas蛋白识别特定PAM并结合到染色体上的DNA靶位点，Cas蛋白的核酸内切酶活性切割靶位点产生双链断裂DNA（Double strand break，DSB），细胞自身的修复机制主要有非同源末端（non-homologous end joining，NHEJ）修复和同源末端（homology-directed repair，HDR）修复，更大概率的非同源末端修复是简单直接的将断裂位置重新连接，这一过程常常伴随着碱基的插入或缺失导致基因序列移码突变，不能正常翻译从而敲除该基因。在功能基因组学研究和作物遗传改良中，基于Cas蛋白的CRISPR/Cas 系统工具，如碱基编辑系统、引物编辑都被广泛应用。毫无疑问，CRISPR/Cas蛋白库的丰富将有助于产生新的基因组编辑工具。
基因编辑技术的目前已经成为生命科学领域的重要研究工具，同时也推动物种遗传改造进入了高速发展的阶段。除此之外，基因编辑技术在植物基因功能研究、品种改造和作物育种等方面有着广泛的应用和前景。
发明内容
本发明之一提供了一种Cas蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
本发明之二提供了编码如本发明之一所述的Cas蛋白的核酸。
在一个具体实施方式中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No. 2所示。
本发明之三提供了一种基因编辑系统，其包括第I调节元件和第II调节元件；其中，所述第I调节元件为本发明之二所述的核酸，所述第I调节元件编码如本发明之一所述的Cas蛋白；所述第II调节元件包括用于进行基因编辑的靶核苷酸，和位于所述靶核苷酸3’端连接且与所述靶核苷酸转录融合的sgRNA元件，以引导所述第I调节元件编码的蛋白至生物基因组中待突变的靶位点处。
在一个具体实施方式中，所述sgRNA元件位于pENTR4:sgRNA载体（CN202111388739.0）上。
本发明之四提供了根据本发明之一所述的Cas蛋白、本发明之二所述的核酸或本发明之三所述的基因编辑系统在做基因敲除中的应用。
在一个具体实施方式中，所述应用为用于敲除禾本科植物基因组中的基因。
在一个具体实施方式中，所述禾本科植物为水稻。
本发明的有益效果：本发明的CRISPR/SLanCas9 系统相较于CRISPR/LanCas9或CRISPR/GLanCas9在水稻等禾本科植物中具有更优的基因敲除效率，因而将大大节省水稻等禾本科植物中基因敲除的人力、物力和时间成本，更有利于水稻等禾本科植物基因敲除。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
实施例1：pUbi:SLanCas9载体构建及利用pUbi: SLanCas9进行水稻内源基因的敲除。
人工合成碱基序列如SEQ ID No. 1所示的875 bp的核酸，其两端的酶切位点为KspAI和SpeI，将合成的核酸连接到pUC57载体上，得到pUC57-875重组质粒。
将质粒pUC57-875用KspAI/SpeI双酶切，回收875 bp片段；将pUbi:SpCas9（Zhou,H., et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changesinduced byCRISPR/Cas9 in rice. 2014, Nucleic Acids Res 42:10903-10914）用KspAI/SpeI双酶切，回收15k片段。将回收的875 bp片段与回收15k片段连接，获得pUbi:SLanCas9，其中SLanCas9基因的碱基序列如SEQ ID No. 2所示，SLanCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
利用pUbi:SLanCas9对水稻多个内源基因进行敲除，在本实例中以基因敲除效率最低的OsCPK4和最高的OsCPK6为例。
基因OsCPK4和OsCPK6的转录序列和基因组序列从MSU/TIGR水稻基因组数据库中获得（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。
对于OsCPK4基因，设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列（SEQID No. 4，PAM为cag）的引物为gOsCPK4-F1（SEQ ID No. 5，在5’端引入BsaI酶切粘性末端gtgt）和gOsCPK4-R1（SEQ ID No. 6）。
对于OsCPK6基因，设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列（SEQID No. 7，PAM为cgg）的引物为gOsCPK6-F1（SEQ ID No. 8，在5’端引入BsaI酶切粘性末端gtgt）和gOsCPK6-R1（SEQ ID No. 9）。
合成引物后，使用T4多聚核苷酸激酶将gOsCPK4-F1/gOsCPK4-R1进行磷酸化处理，退火形成双链，然后将gOsCPK4-F1/gOsCPK4-R1克隆到 pENTR4:sgRNA载体（CN202111388739.0）的BtgZI酶切位点处，测序结果显示正确，得到pENTR4:sgRNA-gOsCPK4-1，其中以正向引物表示插入 pENTR4:sgRNA载体上酶切位点的靶核苷酸序列。将pENTR4:sgRNA-gOsCPK4-1用ApaI酶切进行线性化，将pUbi:SLanCas9利用SpeI酶将质粒线性化，通过试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将线性化的两个质粒融合，得到pUbi:SLanCas9-gOsCPK4-1。以同样的操作，将gOsCPK6-F1/gOsCPK6-R1磷酸化，克隆到 pENTR4:sgRNA载体的BsaI酶切位点处，测序结果显示正确，得到pENTR4:sgRNA-gOsCPK6-1，将pENTR4:sgRNA-gOsCPK6-1用ApaI酶切进行线性化，将pUbi:SLanCas9利用SpeI酶将质粒线性化，通过试剂盒ClonExpress II One StepCloningKit（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将线性化的两个质粒融合，得到pUbi:SLanCas9-gOsCPK6-1。
将pUbi:SLanCas9-gOsCPK4-1和pUbi:SLanCas9-gOsCPK6-1分别用农杆菌转化法转化粳稻品种Kitaake，然后对T0代再生水稻植株用CTAB法提取DNA。
对于pUbi:SLanCas9-gOsCPK4-1：根据OsCPK4基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsCPK4-F1（SEQ ID No. 10）和OsCPK4-R1（SEQ ID No. 11），以相应的T0代再生水稻植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序检测。分析测序后的OsCPK4靶核苷酸序列，在48株水稻再生幼苗中检测到19株发生核苷酸插入/缺失，可见CRISPR/SLanCas9系统对OsCPK4靶位点编辑效率为39.58%。
对于pUbi:SLanCas9-gOsCPK6-1：根据OsCPK6基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsCPK6-F1（SEQ ID No. 12）和OsCPK6-R1（SEQID No. 13），以相应的T0代再生水稻植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序检测。分析测序显示pUbi:SLanCas9-gOsCPK6-1在OsCPK6靶点编辑效率为100%。
以上结果表明CRISPR/SLanCas9可识别5'-cag-3'和5'-cgg-3'的PAM基序并对靶位点完成基因编辑。
实施例2：pUbi:LanCas9载体构建及利用pUbi:LanCas9进行水稻内源基因的敲除。
将pUbi:LanCas9载体中的表达LanCas9蛋白的基因进行密码子优化，优化后的LanCas9基因的碱基序列如SEQ ID No. 14所示，其两端的酶切位点为SpeI和BamHI，将合成的基因连接到pUC57载体上，得到pUC57-LanCas9。LanCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
将pUC57-LanCas9经SpeI/BamHI双酶切后回收4.3k靶标基因片段，pUbi:SpCas9经SpeI/BamHI双酶切后回收12k骨架片段。将回收的4.3k靶标基因片段与回收的12k骨架片段连接，获得质粒pUbi:LanCas9。
将适用于LanCas9的sgRNA34的表达元件（其碱基序列如SEQ ID No. 16所示）人工合成，其中两端包含同源臂以及用于克隆靶核苷酸序列的BsaI和BtgzI酶切位点。以合成的核酸为模板，以g34-F1（其碱基序列如SEQ ID No. 17所示）/g34-R1（其碱基序列如SEQ IDNo. 18所示）为引物，扩增680bp sgRNA34片段；以pENTR4:sgRNA为模板，以g4-F（其碱基序列如SEQ ID No. 19所示）/g4-R（其碱基序列如SEQ ID No. 20所示）为引物，扩增2.6 kb的载体骨架；将680bp sgRNA34片段与2.6 kb的载体骨架经infusion连接，构建得到载体pENTR4:sgRNA34。
利用pUbi:LanCas9对水稻多个内源基因进行敲除，在本实例中以基因敲除效率最高的OsWRKY45为例。
基因OsWRKY45的转录序列和基因组序列从MSU/TIGR水稻基因组数据库中获得（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。
对于OsWRKY45基因，设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列（SEQID No. 21，PAM为cgg）的引物为gOsWRKY45-F1（SEQ ID No. 22，在5’端引入BsaI酶切粘性末端gtgt）和gOsWRKY45-R1（SEQID No. 23）。
合成引物后，使用T4多聚核苷酸激酶将gOsWRKY45-F1/gOsWRKY45-R1进行磷酸化处理，退火形成双链，然后将gOsWRKY45-F1/gOsWRKY45-R1克隆到 pENTR4:sgRNA34载体的BsaI酶切位点处，测序结果显示正确，得到pENTR4:sgRNA34-gOsWRKY45-1，其中以正向引物表示插入 pENTR4:sgRNA34载体上酶切位点的靶核苷酸序列，将pENTR4:sgRNA34-gOsWRKY45-1用ApaI酶切进行线性化，将pUbi:LanCas9利用SpeI酶将质粒线性化，通过试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将线性化的两个质粒融合，得到pUbi:LanCas9-gOsWRKY45-1。
将pUbi:LanCas9-gOsWRKY45-1用农杆菌转化法转化粳稻品种Kitaake，然后对T0代再生水稻植株用CTAB法提取DNA。
根据OsWRKY45基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsWRKY45-F1（SEQ ID No. 24）和OsWRKY45-R1（SEQ ID No. 25），以相应的T0代再生水稻植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序检测。分析测序后的OsWRKY45靶核苷酸序列，在48株水稻再生幼苗中检测到12株发生核苷酸插入/缺失，可见CRISPR/LanCas9系统对OsWRKY45靶位点编辑效率为25%。
实施例3：pUbi:GLanCas9载体构建及利用pUbi:GLanCas9进行水稻内源基因的敲除。
将质粒pUC57-875用KspAI/SpeI双酶切，回收875 bp片段；将pUbi:Cas9NG（CN202111388739.0）用KspAI/SpeI双酶切，回收15k片段。将回收的875 bp片段与回收15k片段连接，获得pUbi:GLanCas9，其中GLanCas9基因的碱基序列如SEQ ID No. 26所示，GLanCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 27所示。
利用pUbi:GLanCas9分别对水稻内源基因OsCPK4、OsCPK8、OsCPK20、OsCPK27进行敲除，各基因的转录序列和基因组序列从MSU/TIGR水稻基因组数据库中获得（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。
对OsCPK4、OsCPK8、OsCPK20和OsCPK27基因分别设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列引物（在5’端引入BsaI酶切粘性末端gtgt），其中，OsCPK4基因的靶核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，其中的PAM序列为CAG；OsCPK8基因的靶核苷酸序列如SEQID No. 28所示，其中的PAM序列为CTG；OsCPK20基因的靶核苷酸序列如SEQ ID No. 29所示，其中的PAM序列为GCG；OsCPK27基因的靶核苷酸序列如SEQ ID No. 30所示，其中的PAM序列为GAG。然后基于四个基因的靶核苷酸分别构建打靶载体。
以实施例1相同的操作步骤将打靶载体采用农杆菌转化法转化到粳稻品种Kitaake中，然后对T0代再生水稻植株用CTAB法提取DNA。以相应的T0代再生水稻植株的基因组DNA为模板，对靶位点进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序。经分析，CRISPR/GLanCas9对4个基因的靶位点的编辑效率均为0。
Claims (4)
1. 一种Cas蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2.编码如权利要求1所述的Cas蛋白的核酸。
3. 根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No. 2所示。
4.根据权利要求1所述的Cas蛋白、权利要求2或3所述的核酸在做基因敲除中的应用；所述应用为用于敲除水稻基因组中的基因。
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Non-Patent Citations (4)
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| Publication number | Publication date |
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