CN117402855B - 一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用 - Google Patents
一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117402855B CN117402855B CN202311713690.0A CN202311713690A CN117402855B CN 117402855 B CN117402855 B CN 117402855B CN 202311713690 A CN202311713690 A CN 202311713690A CN 117402855 B CN117402855 B CN 117402855B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- gene
- pubi
- rice
- cas protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 19
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 9
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 8
- 101000945554 Oryza sativa subsp. japonica Calcium-dependent protein kinase 4 Proteins 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 7
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 101000855051 Oryza sativa subsp. indica Transcription factor WRKY45-2 Proteins 0.000 description 6
- 101000742788 Oryza sativa subsp. japonica Transcription factor WRKY45-1 Proteins 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 101000884367 Oryza sativa subsp. japonica Calcium-dependent protein kinase 6 Proteins 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 101000908199 Oryza sativa subsp. japonica Calcium-dependent protein kinase 27 Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000880544 Oryza sativa subsp. japonica Calcium-dependent protein kinase 20 Proteins 0.000 description 1
- 101000884370 Oryza sativa subsp. japonica Calcium-dependent protein kinase 8 Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000002616 endonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明涉及一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
Description
技术领域
本发明涉及功能蛋白领域，特别涉及一种Cas蛋白及基因编辑系统。
背景技术
基因编辑CRISPR/Cas系统是一种能够精确的对物种基因组特定靶基因进行修饰的基因工程技术。通过Cas蛋白识别特定PAM并结合到染色体上的DNA靶位点，Cas蛋白的核酸内切酶活性切割靶位点产生双链断裂DNA（Double strand break，DSB），细胞自身的修复机制主要有非同源末端（non-homologous end joining，NHEJ）修复和同源末端（homology-directed repair，HDR）修复，更大概率的非同源末端修复是简单直接的将断裂位置重新连接，这一过程常常伴随着碱基的插入或缺失导致基因序列移码突变，不能正常翻译从而敲除该基因。在功能基因组学研究和作物遗传改良中，基于Cas蛋白的CRISPR/Cas 系统工具，如碱基编辑系统、引物编辑都被广泛应用。毫无疑问，CRISPR/Cas蛋白库的丰富将有助于产生新的基因组编辑工具。
基因编辑技术的目前已经成为生命科学领域的重要研究工具，同时也推动物种遗传改造进入了高速发展的阶段。除此之外，基因编辑技术在植物基因功能研究、品种改造和作物育种等方面有着广泛的应用和前景。
发明内容
本发明之一提供了一种Cas蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
本发明之二提供了编码如本发明之一所述的Cas蛋白的核酸。
在一个具体实施方式中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No. 2所示。
本发明之三提供了一种基因编辑系统，其包括第I调节元件和第II调节元件；其中，所述第I调节元件为本发明之二所述的核酸，所述第I调节元件编码如本发明之一所述的Cas蛋白；所述第II调节元件包括用于进行基因编辑的靶核苷酸，和位于所述靶核苷酸3’端连接且与所述靶核苷酸转录融合的sgRNA元件，以引导所述第I调节元件编码的蛋白至生物基因组中待突变的靶位点处。
在一个具体实施方式中，所述sgRNA元件位于pENTR4:sgRNA载体（CN202111388739.0）上。
本发明之四提供了根据本发明之一所述的Cas蛋白、本发明之二所述的核酸或本发明之三所述的基因编辑系统在做基因敲除中的应用。
在一个具体实施方式中，所述应用为用于敲除禾本科植物基因组中的基因。
在一个具体实施方式中，所述禾本科植物为水稻。
本发明的有益效果：本发明的CRISPR/SLanCas9 系统相较于CRISPR/LanCas9或CRISPR/GLanCas9在水稻等禾本科植物中具有更优的基因敲除效率，因而将大大节省水稻等禾本科植物中基因敲除的人力、物力和时间成本，更有利于水稻等禾本科植物基因敲除。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
实施例1：pUbi:SLanCas9载体构建及利用pUbi: SLanCas9进行水稻内源基因的敲除。
人工合成碱基序列如SEQ ID No. 1所示的875 bp的核酸，其两端的酶切位点为KspAI和SpeI，将合成的核酸连接到pUC57载体上，得到pUC57-875重组质粒。
将质粒pUC57-875用KspAI/SpeI双酶切，回收875 bp片段；将pUbi:SpCas9（Zhou,H., et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changesinduced byCRISPR/Cas9 in rice. 2014, Nucleic Acids Res 42:10903-10914）用KspAI/SpeI双酶切，回收15k片段。将回收的875 bp片段与回收15k片段连接，获得pUbi:SLanCas9，其中SLanCas9基因的碱基序列如SEQ ID No. 2所示，SLanCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
利用pUbi:SLanCas9对水稻多个内源基因进行敲除，在本实例中以基因敲除效率最低的OsCPK4和最高的OsCPK6为例。
基因OsCPK4和OsCPK6的转录序列和基因组序列从MSU/TIGR水稻基因组数据库中获得（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。
对于OsCPK4基因，设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列（SEQID No. 4，PAM为cag）的引物为gOsCPK4-F1（SEQ ID No. 5，在5’端引入BsaI酶切粘性末端gtgt）和gOsCPK4-R1（SEQ ID No. 6）。
对于OsCPK6基因，设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列（SEQID No. 7，PAM为cgg）的引物为gOsCPK6-F1（SEQ ID No. 8，在5’端引入BsaI酶切粘性末端gtgt）和gOsCPK6-R1（SEQ ID No. 9）。
合成引物后，使用T4多聚核苷酸激酶将gOsCPK4-F1/gOsCPK4-R1进行磷酸化处理，退火形成双链，然后将gOsCPK4-F1/gOsCPK4-R1克隆到 pENTR4:sgRNA载体（CN202111388739.0）的BtgZI酶切位点处，测序结果显示正确，得到pENTR4:sgRNA-gOsCPK4-1，其中以正向引物表示插入 pENTR4:sgRNA载体上酶切位点的靶核苷酸序列。将pENTR4:sgRNA-gOsCPK4-1用ApaI酶切进行线性化，将pUbi:SLanCas9利用SpeI酶将质粒线性化，通过试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将线性化的两个质粒融合，得到pUbi:SLanCas9-gOsCPK4-1。以同样的操作，将gOsCPK6-F1/gOsCPK6-R1磷酸化，克隆到 pENTR4:sgRNA载体的BsaI酶切位点处，测序结果显示正确，得到pENTR4:sgRNA-gOsCPK6-1，将pENTR4:sgRNA-gOsCPK6-1用ApaI酶切进行线性化，将pUbi:SLanCas9利用SpeI酶将质粒线性化，通过试剂盒ClonExpress II One StepCloningKit（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将线性化的两个质粒融合，得到pUbi:SLanCas9-gOsCPK6-1。
将pUbi:SLanCas9-gOsCPK4-1和pUbi:SLanCas9-gOsCPK6-1分别用农杆菌转化法转化粳稻品种Kitaake，然后对T0代再生水稻植株用CTAB法提取DNA。
对于pUbi:SLanCas9-gOsCPK4-1：根据OsCPK4基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsCPK4-F1（SEQ ID No. 10）和OsCPK4-R1（SEQ ID No. 11），以相应的T0代再生水稻植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序检测。分析测序后的OsCPK4靶核苷酸序列，在48株水稻再生幼苗中检测到19株发生核苷酸插入/缺失，可见CRISPR/SLanCas9系统对OsCPK4靶位点编辑效率为39.58%。
对于pUbi:SLanCas9-gOsCPK6-1：根据OsCPK6基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsCPK6-F1（SEQ ID No. 12）和OsCPK6-R1（SEQID No. 13），以相应的T0代再生水稻植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序检测。分析测序显示pUbi:SLanCas9-gOsCPK6-1在OsCPK6靶点编辑效率为100%。
以上结果表明CRISPR/SLanCas9可识别5'-cag-3'和5'-cgg-3'的PAM基序并对靶位点完成基因编辑。
实施例2：pUbi:LanCas9载体构建及利用pUbi:LanCas9进行水稻内源基因的敲除。
将pUbi:LanCas9载体中的表达LanCas9蛋白的基因进行密码子优化，优化后的LanCas9基因的碱基序列如SEQ ID No. 14所示，其两端的酶切位点为SpeI和BamHI，将合成的基因连接到pUC57载体上，得到pUC57-LanCas9。LanCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
将pUC57-LanCas9经SpeI/BamHI双酶切后回收4.3k靶标基因片段，pUbi:SpCas9经SpeI/BamHI双酶切后回收12k骨架片段。将回收的4.3k靶标基因片段与回收的12k骨架片段连接，获得质粒pUbi:LanCas9。
将适用于LanCas9的sgRNA34的表达元件（其碱基序列如SEQ ID No. 16所示）人工合成，其中两端包含同源臂以及用于克隆靶核苷酸序列的BsaI和BtgzI酶切位点。以合成的核酸为模板，以g34-F1（其碱基序列如SEQ ID No. 17所示）/g34-R1（其碱基序列如SEQ IDNo. 18所示）为引物，扩增680bp sgRNA34片段；以pENTR4:sgRNA为模板，以g4-F（其碱基序列如SEQ ID No. 19所示）/g4-R（其碱基序列如SEQ ID No. 20所示）为引物，扩增2.6 kb的载体骨架；将680bp sgRNA34片段与2.6 kb的载体骨架经infusion连接，构建得到载体pENTR4:sgRNA34。
利用pUbi:LanCas9对水稻多个内源基因进行敲除，在本实例中以基因敲除效率最高的OsWRKY45为例。
基因OsWRKY45的转录序列和基因组序列从MSU/TIGR水稻基因组数据库中获得（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。
对于OsWRKY45基因，设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列（SEQID No. 21，PAM为cgg）的引物为gOsWRKY45-F1（SEQ ID No. 22，在5’端引入BsaI酶切粘性末端gtgt）和gOsWRKY45-R1（SEQID No. 23）。
合成引物后，使用T4多聚核苷酸激酶将gOsWRKY45-F1/gOsWRKY45-R1进行磷酸化处理，退火形成双链，然后将gOsWRKY45-F1/gOsWRKY45-R1克隆到 pENTR4:sgRNA34载体的BsaI酶切位点处，测序结果显示正确，得到pENTR4:sgRNA34-gOsWRKY45-1，其中以正向引物表示插入 pENTR4:sgRNA34载体上酶切位点的靶核苷酸序列，将pENTR4:sgRNA34-gOsWRKY45-1用ApaI酶切进行线性化，将pUbi:LanCas9利用SpeI酶将质粒线性化，通过试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将线性化的两个质粒融合，得到pUbi:LanCas9-gOsWRKY45-1。
将pUbi:LanCas9-gOsWRKY45-1用农杆菌转化法转化粳稻品种Kitaake，然后对T0代再生水稻植株用CTAB法提取DNA。
根据OsWRKY45基因的靶位点DNA序列设计用于鉴定的特异性的PCR引物：OsWRKY45-F1（SEQ ID No. 24）和OsWRKY45-R1（SEQ ID No. 25），以相应的T0代再生水稻植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序检测。分析测序后的OsWRKY45靶核苷酸序列，在48株水稻再生幼苗中检测到12株发生核苷酸插入/缺失，可见CRISPR/LanCas9系统对OsWRKY45靶位点编辑效率为25%。
实施例3：pUbi:GLanCas9载体构建及利用pUbi:GLanCas9进行水稻内源基因的敲除。
将质粒pUC57-875用KspAI/SpeI双酶切，回收875 bp片段；将pUbi:Cas9NG（CN202111388739.0）用KspAI/SpeI双酶切，回收15k片段。将回收的875 bp片段与回收15k片段连接，获得pUbi:GLanCas9，其中GLanCas9基因的碱基序列如SEQ ID No. 26所示，GLanCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 27所示。
利用pUbi:GLanCas9分别对水稻内源基因OsCPK4、OsCPK8、OsCPK20、OsCPK27进行敲除，各基因的转录序列和基因组序列从MSU/TIGR水稻基因组数据库中获得（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。
对OsCPK4、OsCPK8、OsCPK20和OsCPK27基因分别设计含有与BsaI酶切位点末端连接匹配的靶核苷酸序列引物（在5’端引入BsaI酶切粘性末端gtgt），其中，OsCPK4基因的靶核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示，其中的PAM序列为CAG；OsCPK8基因的靶核苷酸序列如SEQID No. 28所示，其中的PAM序列为CTG；OsCPK20基因的靶核苷酸序列如SEQ ID No. 29所示，其中的PAM序列为GCG；OsCPK27基因的靶核苷酸序列如SEQ ID No. 30所示，其中的PAM序列为GAG。然后基于四个基因的靶核苷酸分别构建打靶载体。
以实施例1相同的操作步骤将打靶载体采用农杆菌转化法转化到粳稻品种Kitaake中，然后对T0代再生水稻植株用CTAB法提取DNA。以相应的T0代再生水稻植株的基因组DNA为模板，对靶位点进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序。经分析，CRISPR/GLanCas9对4个基因的靶位点的编辑效率均为0。
Claims (4)
1. 一种Cas蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
2.编码如权利要求1所述的Cas蛋白的核酸。
3. 根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No. 2所示。
4.根据权利要求1所述的Cas蛋白、权利要求2或3所述的核酸在做基因敲除中的应用；所述应用为用于敲除水稻基因组中的基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311713690.0A CN117402855B (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311713690.0A CN117402855B (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117402855A CN117402855A (zh) | 2024-01-16 |
| CN117402855B true CN117402855B (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=89500285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311713690.0A Active CN117402855B (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117402855B (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108034671A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-05-15 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种质粒载体及利用其建立植物群体的方法 |
| CN109321593A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-02-12 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一套用于水稻的人工基因编辑系统 |
| CN110214180A (zh) * | 2016-10-14 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器的aav递送 |
| CN110760540A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-02-07 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一套用于水稻的基因编辑人工系统及其应用 |
| CN111373041A (zh) * | 2017-09-26 | 2020-07-03 | 伊利诺伊大学理事会 | 用于基因组编辑和调节转录的crispr/cas系统和方法 |
| CN112430613A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-02 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种宽编辑范围的SpG基因及其应用 |
| WO2021233442A1 (zh) * | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 一种核酸表达的方法 |
| KR20220055904A (ko) * | 2020-10-27 | 2022-05-04 | 한경대학교 산학협력단 | CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 OsSLR1 유전자 돌연변이 벼 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 왜성 표현형을 가지는 벼 식물체 |
| CN116555226A (zh) * | 2022-03-03 | 2023-08-08 | 吉林省农业科学院 | CasF2蛋白、CRISPR/Cas基因编辑系统及其在植物基因编辑中的应用 |
| WO2023191428A1 (ko) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 전남대학교산학협력단 | 반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017031483A1 (en) * | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Applied Stemcell, Inc. | Nuclease with enhanced efficiency of genome editing |
-
2023
- 2023-12-14 CN CN202311713690.0A patent/CN117402855B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110214180A (zh) * | 2016-10-14 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器的aav递送 |
| CN111373041A (zh) * | 2017-09-26 | 2020-07-03 | 伊利诺伊大学理事会 | 用于基因组编辑和调节转录的crispr/cas系统和方法 |
| CN108034671A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-05-15 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种质粒载体及利用其建立植物群体的方法 |
| CN109321593A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-02-12 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一套用于水稻的人工基因编辑系统 |
| CN113913454A (zh) * | 2018-11-07 | 2022-01-11 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一套用于水稻的人工基因编辑系统 |
| CN114045303A (zh) * | 2018-11-07 | 2022-02-15 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一套用于水稻的人工基因编辑系统 |
| CN110760540A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-02-07 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一套用于水稻的基因编辑人工系统及其应用 |
| WO2021233442A1 (zh) * | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 一种核酸表达的方法 |
| KR20220055904A (ko) * | 2020-10-27 | 2022-05-04 | 한경대학교 산학협력단 | CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 OsSLR1 유전자 돌연변이 벼 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 왜성 표현형을 가지는 벼 식물체 |
| CN112430613A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-02 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种宽编辑范围的SpG基因及其应用 |
| CN116555226A (zh) * | 2022-03-03 | 2023-08-08 | 吉林省农业科学院 | CasF2蛋白、CRISPR/Cas基因编辑系统及其在植物基因编辑中的应用 |
| WO2023191428A1 (ko) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 전남대학교산학협력단 | 반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Cas9-NG Greatly Expands the Targeting Scope of the Genome-Editing Toolkit by Recognizing NG and Other Atypical PAMs in Rice;Bin Ren 等;《Molecular Plant》;第12卷(第7期);第1015-1026页 * |
| Computational design of novel Cas9 PAM-interacting domains using evolution-based modelling and structural quality assessment;Cyril Malbranke 等;《PLOS Computational Biology》;第19卷(第11期);全文 * |
| CRISPR/Cas基因编辑技术与植物病毒研究进展;徐子妍 等;《浙江大学学报》;第48卷(第6期);第709-720页 * |
| Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice;Huanbin Zhou 等;《Nucleic Acids Research》;第42卷(第17期);第10903-10914页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117402855A (zh) | 2024-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11345933B2 (en) | CRISPR enabled multiplexed genome engineering | |
| US11767536B2 (en) | Method for obtaining glyphosate-resistant rice by site-directed nucleotide substitution | |
| JP7075170B2 (ja) | 延長された単一ガイドｒｎａ及びその用途 | |
| CN105132451B (zh) | 一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用 | |
| CN105112435B (zh) | 植物多基因敲除载体的构建及应用 | |
| CN110747187B (zh) | 识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法 | |
| US20210403901A1 (en) | Targeted mutagenesis using base editors | |
| WO2018098935A1 (zh) | 一种用于植物基因组定点碱基替换的载体 | |
| CN110300802A (zh) | 用于动物胚胎碱基编辑的组合物和碱基编辑方法 | |
| CN117402855B (zh) | 一种Cas蛋白、基因编辑系统及应用 | |
| KR20190122595A (ko) | 식물의 염기 교정용 유전자 구조체, 이를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 염기 교정 방법 | |
| CN114540356B (zh) | 一种红冬孢酵母启动子及其应用 | |
| CN110760540A (zh) | 一套用于水稻的基因编辑人工系统及其应用 | |
| CN117327742B (zh) | 一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法 | |
| JP7452884B2 (ja) | Ｄｎａが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるためのキット | |
| CN118109441A (zh) | TadA8e突变蛋白及其在介导单碱基C编辑中的应用 | |
| CN116478993A (zh) | 一种植物cgbe碱基编辑系统及其应用 | |
| CN118185927A (zh) | 一种含BsmBI酶切位点的引物对及其应用 | |
| CN117701542A (zh) | 胞嘧啶脱氨酶SfSddA、包含其的碱基编辑器及应用 | |
| CN118127073A (zh) | 水稻烷基嘌呤糖基化酶及其突变体在植物A-to-K单碱基编辑中的应用 | |
| CN117844803A (zh) | 一种靶向OsSHMT1基因的sgRNA、sgRNA表达载体及其应用 | |
| CN118667866A (zh) | 一种杨树碱基编辑系统的构建方法及其在林木碱基编辑中的应用 | |
| CN116064512A (zh) | 一种改进的引导编辑系统及其应用 | |
| CN115851756A (zh) | 一种可筛除假阳性愈伤组织的植物基因编辑重组载体及应用 | |
| CN114875064A (zh) | 杂交枫香基因编辑载体、其构建方法、及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |