CN112779274A - 桑树膏药病病原菌的核糖体rna基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了桑树膏药病病原菌的核糖体RNA基因及其应用。所述桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.的核糖体RNA基因的全长cDNA序列如SEQIDNO.1所示，该桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.的核糖体RNA基因能够应用于检测桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.或真菌种属分类中；基于该基因设计了检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的特异性引物，该引物特异性强，灵敏度高，并建立了高效、快速和特异性检测桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.的方法和检测试剂盒，在检测桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.中具有非常广泛的应用前景。

Description

桑树膏药病病原菌的核糖体RNA基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及桑树膏药病病原菌的核糖体RNA基因及其应用。

背景技术

桑树膏药病又称“烂脚癣”、“烂脚疮”、“烂疤疮”,该病菌丝体在枝干外面形成厚而致密的菌丝膜，紧缠枝干，阻碍枝干加粗生长。桑树膏药病在桑全生育期均可发病，主要为害老枝干，病菌以菌丝膜在枝干上越冬，翌年5、6月间形成担孢子进行传播。病斑扩大的同时，菌丝侵入组织体内吸取养分，导致桑树树势衰弱，滋生快、蔓延性极强，危害严重桑树，桑叶产量和质量均降低，使蚕农深受其害。

桑树膏药病发生于桑树主干中上部或支干基部，桑树感病后，形成密集的菌丝膜，紧贴树皮，产生机械压力，病膜圆形或不规则形。菌丝膜有灰色和褐色两种。削掉患处树皮，可见木栓层组织病变。这种桑树脆弱、易断、寿命缩短、叶量减少、且易脱落。目前有尚未有彻底根治桑树膏药病的方法，也未见有桑树膏药病相关病原菌检测方法的报道。因此，亟需建立一种可对桑树膏药病的病原菌进行检测和鉴定的方法，以便于做好早期预警和防控。

发明内容

本发明要解决的技术问题是弥补现有技术的空白，提供桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的核糖体RNA的全长cDNA序列及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的核糖体RNA基因。

本发明的第二个目的是提供所述桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.的核糖体RNA基因在检测桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.或在真菌种属分类中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的检测方法。

本发明的第四个目的是提供一组检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的引物。

本发明的第五个目的是提供所述引物在检测桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.或制备检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的方法。

本发明的第七个目的是提供一种检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的试剂盒。

本发明的第八个目的是提供以上任一所述方法或所述试剂盒在检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.的核糖体RNA基因，所述核糖体RNA基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

所述核糖体RNA基因由18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2、28S rRNA组成；所述18SrRNA的cDNA序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1～1768碱基序列；所示ITS1的cDNA序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1769～1901碱基序列；所述5.8S rRNA的cDNA序列为SEQ IDNO.1所示序列中第1902～2059碱基序列；所述ITS2的cDNA序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2060～2323碱基序列；所述28S rRNA的cDNA序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2324～5666碱基序列。

以上所述核糖体RNA基因在检测桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.或在真菌种属分类中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的检测方法，以待测样本核糖体RNA的全长cDNA序列与权利要求1所述核糖体RNA基因进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.。

优选地，以待测样本DNA为模板，进行文库构建、高通量测序和组装，获得完整的核糖体DNA，然后与上述核糖体RNA的cDNA序列进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.。

更优选地，所述桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的检测方法具体包括以下步骤：

S1.收集患膏药病的桑树枝条；

S2.提取桑树膏药病枝条的总DNA；

S3.Illumina DNA文库构建；

S4.Illumina高通量测序；

S5.去除测序数据中桑树基因组序列；

S6.组装微生物基因组序列；

S7.组装完整核糖体DNA序列；

S8.比对分析核糖体DNA序列。

步骤S3所述Illumina DNA文库构建的方法为：依照Illumina DNA文库构建流程，将步骤S2所述总DNA构建为片段大小375bp的双末端高通量测序文库。

步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列的方法为：利用比对软件对步骤S4所述高通量测序数据进行数据比对分析；选择比对算法，将所述测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的所述测序数据判定为桑树基因组序列；使用编写的计算机程序从所述测序数据中去除桑树基因组序列。

步骤S6所述组装微生物基因组序列的方法为：使用组装软件对步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列得到的测序数据进行组装。

步骤S7所述组装完整核糖体DNA序列的方法为：采用比对软件，对所述组装序列进行比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，使用组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，直至获得完整的核糖体DNA序列。

步骤S8所述比对分析核糖体DNA序列的方法为：使用序列比对分析软件，将步骤S7所述完整核糖体DNA序列与桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.核糖体RNA基因的核苷酸序列进行比对。

本发明还提供了一组检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。

所述引物的核苷酸序列具体如下所示：

GYB1901F(SEQ ID NO.2)：5’-CGCAGCGAAATGCGATAAGT-3’；

GYB2323R(SEQ ID NO.3)：5’-AGTTCAGCGGGTAGTCCCAT-3’。

所述引物在检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.或制备检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

基于上述引物，本发明还提供了一种检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的方法，以待测样本的核酸为模板，利用以上所述引物进行PCR扩增，将PCR扩增后的产物进行凝胶电泳，如果出现大小为375bp的条带，则判定待测样本中含有桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.。

优选地，所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq Master Mix 10μL，10μM以上所述引物各0.5μL，核酸模板2μL，余量ddH₂O补足，共20μL。

优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，34个循环；72℃5min。

本发明还要求保护一种检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求4所述引物。

此外，所述试剂盒在检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了桑树膏药病病原菌的核糖体RNA基因及其应用。本发明首次获得了膏药病原菌Septobasidium sp.的核糖体RNA基因的全长cDNA序列，其长度为5666bp，该膏药病原菌Septobasidium sp.的核糖体RNA基因能够应用于检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.或真菌种属分类中；基于该基因设计了检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的特异性引物，该引物特异性强，灵敏度高，并建立了高效、快速和特异性检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的方法和检测试剂盒，在检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.中具有非常广泛的应用前景。

附图说明

图1是桑树膏药病病样图；采样点：华南农业大学桑园；采样时间：2019年12月。

图2是桑树膏药病所检测到的真菌微生物分类树。

图3是桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的特异性检测结果图；其中，M：TakaraDL2000 Marker；1：Septobasidium sp.(子实体)；2：桑膏药病病枝总DNA；3：正常桑枝干总DNA；4：Colletotrichumsp.(炭疽菌)；5：Fusarium sp.(镰刀菌属)；6：Cladosporiumsp.(枝孢菌)；7：Penicillium sp.(青霉属)；8：Cladosporium sp.(枝孢菌属)；9：Fusarium lateritum(砖红镰刀菌)；10：Mucor sp.(毛霉菌)；11：Alternariasp.Nees(链格孢菌)；12：Fusarium graminearum(禾谷镰刀菌)；13：Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)；14：Klebsiella sp.(克雷伯氏菌)；15：Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)；16：空白对照(ddH₂O)；

图4是桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.检测灵敏度的测定结果图；其中泳道1为3.74ng/μl；泳道2为3.74×10^-1ng/μl；泳道3为3.74×10^-1ng/μl；泳道4为3.74×10^-2ng/μl；泳道5为3.74×10^-3ng/μl；泳道6为3.74×10^-4ng/μl；泳道7为3.74×10^-5ng/μl；泳道8为ddH₂O。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测桑树桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的RNA序列的获得

1、实验方法

(1)高通量测序

在发病的桑树随机寻找具有典型桑树膏药病枝条(图1)，收集，剪取桑树病枝中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用上海生工真菌基因组DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明书进行，将提取后的总DNA保存于-20℃；依照IlluminaDNA文库构建流程，将总DNA构建为片段大小为375bp的双末端高通量测序文库；使用Illumina Hiseq2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序，测序策略为Pair-End150bp。

(2)组装微生物基因组序列

微生物序列的组装使用Meta Velvet(v1.2.01)组装软件进行；目标病原真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

序列标签注释使用blastn(2.2.31+)序列比对分析软件，组装的序列标签序列与NCBI的nt数据库进行比对，blastn比对设定期望值<1e-20，根据比对结果对序列标签进行注释。核糖体DNA序列是细菌和真菌鉴定的重要的最常用的分子标记，因此物种分类鉴定和定量以核糖体DNA为主要分子标记。根据序列标签注释结果，选择核糖体DNA序列作为微生物鉴定与定量分析依据。使用bwa(0.7.12-r1039)+samtools(v1.2)分析软件，计算测序数据中核糖体DNA片段的平均测序深度，并以此作为该物种的相对丰度值。

(3)组装完整核糖体DNA序列

真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。

(4)对比分析核糖体DNA序列

选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

2、实验结果

本发明得到的桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.完整的核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核糖体RNA基因由18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2、28SrRNA组成；其中，18S rRNA基因的核苷酸序列序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1～1768碱基序列；ITS1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1769～1901碱基序列；5.8SrRNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1902～2059碱基序列；ITS2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2060～2323碱基序列；28S rRNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2324～5666碱基序列。

实施例2桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的分类鉴定

1、实验方法

(1)高通量测序

在发病的桑树园随机寻找具有典型桑膏药病的枝条(桑树膏药病病样图如图1所示，采样点：华南农业大学桑园；采样时间：2019年12月)，收集，剪取桑树枝条的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用上海生工真菌DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃；依照Illumina DNA文库构建流程，将总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；使用Illumina Hiseq 2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序。

(2)组装微生物基因组序列

微生物序列的组装使用Meta Velvet(v1.2.01)组装软件进行。真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成，序列总长度约为5800bp。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

序列标签注释使用blastn(2.2.31+)序列比对分析软件，组装的序列标签序列与NCBI的nt数据库进行比对，blastn比对设定期望值<1e-20，根据比对结果对序列标签进行注释。核糖体DNA序列是细菌和真菌鉴定的重要的最常用的分子标记，因此物种分类鉴定和定量以核糖体DNA为主要分子标记。根据序列标签注释结果，选择核糖体DNA序列作为微生物鉴定与定量分析依据。使用bwa(0.7.12-r1039)+samtools(v1.2)分析软件，计算测序数据中核糖体DNA片段的平均测序深度，并以此作为该物种的相对丰度值。

(3)对比分析核糖体DNA序列

选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

2、实验结果

根据微生物种类及数量分析结果，结合材料病征及相关资料的查阅，推定桑树膏药病病原菌为Septobasidium sp.。桑膏药病枝条样本所检测到的真菌微生物分类树如图2所示，根据数值越高(本次测序高达14517.63)，则物种的相对丰度越高的原则，通过对序列标签注释结果的查询以及与桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的核糖体RNA序列的比对，发现相对丰度最高的真菌为Septobasidium属的病原菌。

实施例3桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的检测试剂盒和检测方法

1、引物的设计

为进一步利用上述桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.的核糖体RNA基因的全长cDNA序列应用于桑树膏药病的病原检测和鉴定中，本发明进一步设计了一对特异引物组GYB1901F/GYB2323R，其核苷酸序列如表1所示。

表1特异引物组GYB1901F/GYB2323R的核苷酸序列

2、PCR检测试剂盒

PCR检测试剂盒的组成成分包括：特异引物组GYB1901F/GYB2323R、2×Taq MasterMix、Template DNA、ddH₂O。

3、检测方法

(1)PCR扩增反应

使用上海生工真菌基因组DNA提取试剂盒提取样本核酸，以提取的样本核酸为模板，采用步骤2所述的PCR检测试剂盒进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系如表2所示；

表2 PCR扩增的反应体系

PCR扩增反应的条件为：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min。

(2)PCR扩增反应产物的检测

PCR扩增反应结束后，取6μL PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶(EB染色)进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶电泳，回收大小对应的PCR产物片段。

(3)结果判定

PCR扩增反应产物进行凝胶电泳后，如果出现条带，且条带大小约为375bp，介于200到500bp条带之间，则判定待测样本中含有桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.；或通过序列比对：将回收的PCR产物片段进行Sanger测序，然后将测序结果与桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.核糖体RNA基因的的全长cDNA序列(SEQ ID NO.1)进行比对，由此确定样本中是否含有桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.。

实施例4桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的特异性实验

1、实验方法

以感染桑膏药病病害的桑树树叶的总DNA为模板，以其它12种真菌和ddH₂O为阴性对照，应用实施例3的检测试剂盒和检测方法进行检测，验证引物的特异性。

12种真菌为本发明人实验室分离培养保存的真菌，且按照国际物种条形码进行了物种鉴定，其分别为：Colletotrichumsp.(炭疽菌)、Fusarium sp.(镰刀菌属)、Cladosporiumsp.(枝孢菌)、Penicillium sp.(青霉属)、Cladosporium sp.(枝孢菌属)、Fusarium lateritum(砖红镰刀菌)、Mucor sp.(毛霉菌)、Alternaria sp.Nees(链格孢菌)、Fusarium graminearum(禾谷镰刀菌)、Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)、Klebsiella sp.(克雷伯氏菌)、Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)。

2、实验结果

实验结果如图3所示，可以看出，只有泳道1和泳道2扩增出单一明亮条带，即只有桑树膏药病原菌Septobasidium sp.(子实体)DNA和患有桑树膏药病病枝的总DNA可扩增出目的片段，且大小约为375bp，介于200到500bp条带之间；而其它12种真菌、细菌和空白对照(泳道3～16)均没有扩增出相似大小的片段。

以上结果说明：本发明根据桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的核糖体RNA基因的全长cDNA序列设计的特异引物组GYB1901F/GYB2323R能够特异性的检测出桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.。

实施例5桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的灵敏度实验

1、实验方法

桑树膏药病病枝总DNA提取后测定浓度，然后对总DNA模板进行十倍梯度稀释，分别为3.74ng/μl、3.74×10^-1ng/μl、3.74×10^-1ng/μl、3.74×10^-2ng/μl、3.74×10^-3ng/μl、3.74×10^-4ng/μl、3.74×10^-5ng/μl；以上述各浓度的总DNA为模板，应用实施例3的检测试剂盒和检测方法进行检测，验证引物的灵敏度。

2、实验结果

灵敏度检测结果如图4所示，可以看出，以浓度分别为3.74ng/μl、3.74×10^-1ng/μl、3.74×10^-2ng/μl、3.74×10^-3ng/μl、3.74×10^-4ng/μl、3.74×10^-5ng/μl的桑膏药病总DNA为模板均能扩增出清晰的条带，条带大小为375bp左右，说明本发明设计的特异性引物组的检出限为3.74×10^-4ng/μl，灵敏度高。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 桑树膏药病病原菌的核糖体RNA基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 5666

<212> DNA

<213> 桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.

<400> 2

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa caaatctata 60

ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatagttt atttgatggt accttactac 120

atggataact gtggtaattc tagagctaat acatgccgaa aagccccgac ctctggaagg 180

ggtgtattta ttagataaaa aaccaatggc cttcgggtct ccttggtgaa tcatgataac 240

tgctcgaatc gtatggcctt gtgccgacga tgcttcattc aaatatctgc cctatcaact 300

ttcgatggta ggatagaggc ctaccatggt gatgacgggt aacggggaat aagggttcga 360

ttccggagag agggcctgag aaacggccct caaatctaag gattgcagca ggcgcgcaaa 420

ttacccaatc ccgacacggg gaggtagtga caataaataa caatataggg ccctttaggg 480

tcttataatt ggaatgagta caatttaaat cccttaacga ggatcaattg gagggcaagt 540

ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt atattaaagt tgttgacgtt 600

aaaaagctcg tagtcgaact tcggcctctg atggctggtc cgccttttgg tgtgtactgg 660

tctatcggag gcttacctcc tggtgagctc tgatgctctt tactgggtgt cagagggaac 720

caggatcttt actttgaaaa aattagagtg ttcaaagcag gcctatgccc gaatacatta 780

gcatggaata atagaatagg acgtgcggtc ctattttgtt ggtttctagg atcgccgtaa 840

tgattaatag ggatagtcgg gggcatttgt attacatcgt cagaggtgaa attcttggat 900

tgatgtaaga caaactactg cgaaagcatt tgccaaggat gttttcattg atcaagaacg 960

aaggttaggg gatcaaaaac gatcagatac cgttgtagtc ttaacagtaa actatgccga 1020

ctggggattg gacaaggctt tttaatgact tgttcagcac ccaaagggaa accttaagtt 1080

taggttcgtg ggggagtacg gtcacaaggc tgaaacttaa aggaattgac ggaagggcac 1140

caccaggagc ctgcggctta atttgactca acacggggaa actcaccagg tccagacaca 1200

ataaggattg acagattgat agctctttct tgatcttgtg gttggtggtg catggccgtt 1260

cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa ttccgataac gaacgagacc ttcccctgct 1320

aaatagccca gtcggctacg gctgactgtt ggcttcttag agggactatc gacgtttagt 1380

cgatggaagt tggaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc 1440

gcgctacact gaccgagcca gcgagtatat caccttatcc ggaaggattg ggtaatcttg 1500

tgaaactcgg tcgtgatggg gatagagcat tgcaattatt gctcttcaac gaggaatacc 1560

tagtaagcgt atgtcatcag catgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc 1620

gtcgctacta ccgattgaat ggcttagtga ggcgttcgga gagcctatgg gaagctggcg 1680

acggcatccc actggcttga agttctacga acttggtcat ttagaggaag taaaagtcgt 1740

aacaaggttt ccgtaggtga acctgcggaa ggatcattat tgaagcacaa gagcgcactt 1800

tactgtggct cgaccttcat atccacccac cctgtgcacc gtgtaccttt tttattcaga 1860

ccctacaagt cgatgaatgt accactttaa taaagtaaac aaaactttca acaacggatc 1920

tcttggttct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga 1980

attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca ccttgcacct tttggcattc caaaaggtac 2040

atctgtttga gtgtcatgaa tccctcaacc cctacacttt cttgtagagt gcaggagcgt 2100

tggatgttga gcgctgctgt cccagccgac agctcgcttc aaatgcataa gcaatcttga 2160

tggtgatcgg attgacccga cgtgataaga tcttcgttgg ggatgctttc tttagcagcc 2220

ggacagctat acaagtcgct tccaatcgta ccgtgcaccc ttgtggtgtg cgacaccctt 2280

acttttagac ctcaaatcag atgggactac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga 2340

ggaaaagaaa ctaacaagga ttcccccagt aacggcgagt gaagagggaa cagcccaaat 2400

ttgtaatctg gccctttcag ggtccgagtt gtaatctcga gaactgtttt ccgtgctgga 2460

ccgcgtacaa gtctgttgga atatagcttc atagagggtg agaatcccgt acatgacgcg 2520

gactaccagt acattgtgat acagtctcta agagtcgagt tgtttgggaa tgcagctcaa 2580

aatgggtggt aaattccatc taaggctaaa tattggcgag agaccgatag cgaacaagta 2640

ccgtgaggga aagatgaaaa gcactttgga aagagagtta acagtacgtg aaattgttga 2700

aagggaaacg cttgaagtca gccttgtact tggttgttca gccttcgggt gtattcaatc 2760

ttgaacaggc cagcatcagt tttagatgcc ggataagggt agaggaaacg tagcagcctc 2820

ggctgtgtta tagtcctcta cttgatacgg cgtccgggac tgaggaacgc agtgagccgt 2880

atggcgggtc ttcggacctt ctcactatgg atgttggcgc aatggcttta aacgacccgt 2940

cttgaaacac ggaccaagga gtctaacatg cttgcgagtg tttgggtgtc aaacccgggc 3000

gcgtaatgaa agtgaatgta ggtgggaatc gtaagatgca ccatcgaccg gtccggattt 3060

ttaatgatgg atctgagtaa gagcaagtac gttgggaccc gaaagatggt gaactatgcc 3120

tgaatagggt gaagccagag gaaactctgg tggaggctcg tagcggttct gacgtgcaaa 3180

tcgatcgtcg aatttgggta taggggcgaa agactaatcg aaccatctag tagctggttc 3240

ctgccgaagt ttccctcagg atagcagaga ctcgcatcag ttttatgagg taaagcgaat 3300

gattagaggc cttggggatg aaacatcctt aacctattct caaactttaa atatgtaaga 3360

agcccttgtt tcttaattga acgtgggcat gcgaatgaga gtctctagtg ggccattttt 3420

ggtaagcaga actggcgatg cgggatgaac cgaacgtgag gttaaggtgc cggaatgtac 3480

gctcatcaga caccacaaaa ggtgttagtt catctagaca gccgcacggt ggccatggaa 3540

gtcggaatcc gctaaggagt gtgtaacaac tcaacggccg aatgaactag ccctgaaaat 3600

ggatggcgct caagcgtact acccatacct caccatcagc gtttagcgat gcgctgatga 3660

gtaggcaggc gtggaggtta tgtgaagaag cctaggcagt gatgctgggt cgaacagcct 3720

ctagtgcaga tcttggtgga agtagcaaat attcaagtga gaaccttgaa gaccgaagtg 3780

gggaagggtt ccatggtaac agcagttgga catgggttag tcggtcctaa gagataggga 3840

aactccgttt taaagcacac tcttgttagt gtcgcctatc gaaagggaat gtggttaaga 3900

ttccacaacc gagatacaga ttatgaacgg caacgtgaat gaacttggtg acatccgcaa 3960

gggccctggg aagagttttc ttttctcctt tacagcctac caccctggaa tcggattatc 4020

cggagatagg gttcaatggc tggtagagct ctacacctct gtagagtccg gtgcgtcctt 4080

gaggatcctt gaaaaaccga gggattgaaa aagtcttgta ctcggccgta cccatatccg 4140

catcaggtcc ccaaggtgat cagcctctgg tcaatagaat aatgtagata agggaagtcg 4200

gcaaaataga tccgtaactt cgggaaaagg attggctcat agggcagggc ttgtcgggcc 4260

cttggatgac cttttgggac ctgtcgagga ctacctcgga gcaatctgag gcggactttg 4320

atgggacctg attgcaagtc cttgggcagc cttcgggcgt ccggcaagcg tttaactgtc 4380

aactatgaac tggtacggac aaggggaatc tgactgtcta attaaaacat agcattgcga 4440

tggccagaaa gtggtgttga cgcaatgtga tttctgccca gtgctctgaa tgtcaaagtg 4500

aagaaattca accaagcgcg ggtaaacggc gggagtaact atgactctct taaggtagcc 4560

aaatgcctcg tcatctaatt agtgacgcgc atgaatggat taacgagatt cccactgtcc 4620

ctatctacta tctagcgaaa ccacagccaa gggaacgggc ttggcagaat cagcggggaa 4680

agaagaccct gttgagcttg actctagttt gacattgtga aaagacatag agggtgtaga 4740

ataagtggga gcgcaagcgc cggtgaaata ccactacctt tatcgtcttt ttacttattc 4800

aatgaagcgg agctgggatg aaagtcccac cttttagcat taaggtcctt cgcgggccga 4860

tccgggttga agacattgtc aggtggggag tttggctggg gcggcacatc tgttaaaaaa 4920

taacgcaggt gtcctaaggg ggactcattg agaacagaaa tctcaagtag aacaaaaggg 4980

taaaagtccc cttgattttg attttcagtg tgaatacaaa ccatgaaagt gtggcctatc 5040

gatcctttag tccttcggaa tttgaagcta gaggtgccag aaaagttacc acagggataa 5100

ctggcttgtg gcagccaagc gttcatagcg acgttgcttt ttgatccttc gatgtcggct 5160

cttcctatca taccgaagca gaattcggta agcgttggat tgttcaccca ctaataggga 5220

acgtgagctg ggtttagacc gtcgtgagac aggttagttt taccctactg atggagggtc 5280

atcgtaatag taattgaact tagtacgaga ggaaccgttc attcacgtaa ttggtatttg 5340

cgcctgcccg ataggacaat ggcgcgaagc taccacgtgc tggattatgg ctgaacgcct 5400

ctaagccaga atccgtgcta gaaacgatga tgttttcccg catattctag ttgtgttaga 5460

atagagctct gctcgtagac cacatttggc ggacatcggc cactttagcg gaaatgctgg 5520

agtgctcagt ctgcgtatat cacttaaaat atatgcgggg ttaaatcctt tgcagacgac 5580

ttgaattgga acggagtact gtaagcagta gagtagcctt gttgctacga tctgctgagg 5640

ttcagctctt gttcttcaga tttgtt 5666

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcagcgaaa tgcgataagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agttcagcgg gtagtcccat 20

Claims (10)

1.一种桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.的核糖体RNA基因，其特征在于，所述核糖体RNA基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述核糖体RNA基因在检测桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.或在真菌种属分类中的应用。

3.一种桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的检测方法，其特征在于，以待测样本核糖体RNA的全长cDNA序列与权利要求1所述核糖体RNA基因进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.。

4.一组检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。

5.权利要求4所述引物在检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.或制备检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.试剂盒中的应用。

6.一种检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的方法，其特征在于，以待测样本的核酸为模板，利用权利要求4所述引物进行PCR扩增，将PCR扩增后的产物进行凝胶电泳，如果出现大小为375bp的条带，则判定待测样本中含有桑树膏药病病原菌Septobasidiumsp.。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2×TaqMaster Mix 10μL，10μM权利要求4所述引物各0.5μL，核酸模板2μL，余量ddH₂O补足，共20μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，34个循环；72℃5min。

9.一种检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4所述引物。

10.权利要求9所述试剂盒在检测桑树膏药病病原菌Septobasidium sp.中的应用。

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