CN112553219B - 一种基于核糖体28s基因检测桑轮斑病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物病原与病害检测技术领域，具体涉及一种基于核糖体28s基因检测桑轮斑病的方法。本发明首先提供了一种可实现桑轮斑病特异检测的核糖体28s基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因对于桑轮斑病的分子诊断检测具有重要的应用价值和意义；本发明还根据该基因还设计了桑轮斑病的PCR检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示，该引物特异性好，并基于该引物建立了优化的检测方法，检测所需时间短、快速、高效，在检测桑轮斑病中具有良好的应用前景。

Description

一种基于核糖体28s基因检测桑轮斑病的方法
技术领域
本发明属于植物病原与病害检测技术领域。更具体地，涉及一种基于核糖体28s基因检测桑轮斑病的方法。
背景技术
桑轮斑病是最早在1978年于高知县发现的桑树新病害，为害桑叶。据查有关资料，我国台湾省、广西省有过报导。近些年在江西省修水县蚕种场，以及广西的部分蚕区发现了桑轮斑病并呈较快的趋势蔓延，影响了广大蚕农经济效益和从事养蚕业的积极性。
桑树轮斑病一般发生在7～8月间，首先危害枝条的下位叶，在桑叶病斑扩大的同时，扩展到危害枝条的上位叶；桑叶病斑初期为褐色水渍状同心轮斑斑点(直径1～6cm)，随着病情的加剧，直径可达10cm，桑叶病斑中心往往破裂变成孔洞，导致饲料价值降低，中秋蚕和晚秋蚕受害严重。
目前尚未有有效的防控手段，早期监测显得更加尤为重要。但是目前也尚未建立相应的检测方法，桑轮斑病导致的蚕区经济效益降低日益严重，因此，亟需建立一种可对桑树轮斑病的病原菌进行检测和鉴定的方法，以便于做好早期防控。
发明内容
本发明要解决的技术问题是弥补现有桑轮斑病检测技术的空白，提供一种基于核糖体28s基因检测桑轮斑病的检测手段。
本发明的目的是提供一种桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的核糖体28s基因。
本发明的另一目的是提供所述核糖体28s基因和/或其检测试剂在检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.中的应用。
本发明的再一目的是提供所述核糖体28s基因在制备桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.检测试剂和/或检测产品中的应用。
本发明的再一目的是提供一种检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermumsp.的引物组。
本发明的再一目的是提供所述引物组在检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.中的应用。
本发明的再一目的是提供所述引物组在制备桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.检测试剂盒中的应用。
本发明的再一目的是提供一种桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的检测试剂盒。
本发明的再一目的是提供一种检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermumsp.的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明通过高通量测序的手段，对桑轮斑病样本的测序结果进行组装及基因的注释，经数据库比对之后，筛选轮斑病病原菌Acrospermum sp.的核糖体28s基因，能够实现桑轮斑病的特异检测，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
因此，本发明要求保护一种桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的核糖体28s基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
以及要求保护所述核糖体28s基因和/或其检测试剂在检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.中的应用。
所述核糖体28s基因在制备桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.检测试剂和/或检测产品中的应用，也属于本发明的保护范围之内。
本发明还要求保护一种检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。
优选地，所述检测桑轮斑病的引物组是根据上述核糖体28s基因设计的。
同时，所述引物组在检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.中的应用，以及在制备桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还要求保护一种桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的检测试剂盒，含有以上所述核糖体28s基因的检测试剂。
优选地，所述检测试剂为以上所述检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的引物组。
优选地，还包括PCR扩增所需试剂。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq Master Mix 10μL，10μM以上所述引物组各0.5μL，Template DNA 2μL，余量ddH2O补足，共20μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min。
本发明还要求保护一种检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的方法，以待测样本的总DNA为模板，利用以上所述引物组进行PCR扩增；将PCR扩增反应的产物进行凝胶电泳，出现大小为400～500bp的扩增条带，则判定待测样本为桑轮斑病阳性样本或含有桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次提供了一种基于基因层面特异检测桑轮斑病的方案，首先提供了一种可实现桑轮斑病特异检测的核糖体28s基因，该基因对于桑轮斑病的分子诊断检测具有重要的应用价值和意义。
本发明根据该基因还设计了桑轮斑病病的PCR检测引物，该引物特异性好，并基于该引物建立了优化的检测方法，检测所需时间短、快速、高效，在检测桑树轮斑病中具有良好的应用前景。
附图说明
图1是特异性引物对桑轮斑病的病原PCR检测和鉴定结果；其中，M：TakaraDL2000Marker；1：桑轮斑病病斑DNA；2：桑轮斑病嫩病叶总DNA；3：桑轮斑病老病叶总DNA；4：Fusarium equiseti(木贼镰刀菌)；5：Gibberella sp(赤霉菌属)；6：Alternaria sp(链格孢属)；7：Fusarium graminearum(禾谷镰刀菌)；8：Clonostachys(粉红螺旋聚孢霉)；9：Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)；10：Mucor circinelloides(卷枝毛霉)；11：Penicillium sp(青霉属)；12：Phanerochaete chrysosporium(黄孢原毛平革菌)；13：Mucor racemosus(总状毛霉)；14：Actinomucor elegans(雅致放射毛霉)；15：空白对照(ddH2O)；4～14为实验室分离培养保存的真菌，且按照国际物种条形码进行了物种鉴定。
图2是桑轮斑病病叶总DNA灵敏度的测定；其中泳道1为4.5ng/μl；泳道2为4.5×10-1ng/μl；泳道3为4.5×10-2ng/μl；泳道4为4.5×10-3ng/μl；泳道5为4.5×10-4ng/μl；泳道6为4.5×10-5ng/μl；泳道7为4.5×10-6ng/μl；泳道8为4.5×10-7ng/μl。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的核糖体28s基因的获得
1、实验方法
桑树样本于2018年12月25日采集于广西忻城，(23.99759°N，108.94722°E)。
(1)高通量测序
在发病的桑树随机寻找具有典型桑树轮纹病病斑的叶片，收集，剪取桑树病叶中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用上海生工真菌基因组DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃；依照IlluminaDNA文库构建流程，将总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；使用IlluminaHiseq2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序，测序策略Pair-End 150bp。
(2)组装微生物基因组序列
微生物序列的组装使用Meta Velvet(v1.2.01)组装软件进行；目标病原真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。
序列标签注释使用blastn(2.2.31+)序列比对分析软件，组装的序列标签序列与NCBI的nt数据库进行比对，blastn比对设定期望值<1e-20，根据比对结果对序列标签进行注释。核糖体DNA序列是细菌和真菌鉴定的重要的最常用的分子标记，因此物种分类鉴定和定量以核糖体DNA为主要分子标记。根据序列标签注释结果，选择核糖体DNA序列作为微生物鉴定与定量分析依据。使用bwa(0.7.12-r1039)+samtools(v1.2)分析软件，计算测序数据中核糖体DNA片段的平均测序深度，并以此作为该物种的相对丰度值。
(3)组装完整核糖体DNA序列
真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。
(4)对比分析核糖体DNA序列
选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。
2、实验结果
本发明得到的桑轮纹病病原菌Acrospermum sp核糖体28s基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的检测试剂盒
为进一步利用上述Acrospermum sp.的核糖体RNA基因的序列应用于桑轮斑病的病原检测和鉴定中，本发明进一步设计了大量检测引物进行选择、优化调整，最终获得一对特异性灵敏性俱佳的特异引物LW6978F/LW7401R，其核苷酸序列如表1所示；
表1基于Acrospermum sp核糖体RNA基因的核苷酸序列设计的特异引物
Figure BDA0002870651420000051
根据以上引物，进一步制备一种桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的检测试剂盒，由以下成分组成：
(1)核苷酸序列如表1所示的检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌Acrospermumsp.的引物组；
(2)PCR扩增的反应试剂：2×Taq Master Mix，Template DNA，ddH2O。
实施例3桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.的检测方法
1、检测方法
(1)PCR扩增反应
采用实施例2的检测试剂盒，然后以感染桑轮斑病病害的桑树树叶的总DNA为模板，以其它11种真菌(表3)和ddH2O为阴性对照，利用实施例2中的引物组LW6978F/LW7401R进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表2所示，拟扩增的目的片段大小约为443bp。
表2 PCR扩增反应体系(20μL)
Figure BDA0002870651420000061
表3 11种阴性对照真菌
Figure BDA0002870651420000062
以上真菌均分离保藏于亚太地区蚕桑培训中心。
(2)PCR扩增反应的条件
验证引物LW6978F/LW7401R特异性的PCR扩增反应的条件为：94℃4min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min。
(3)PCR扩增反应产物的检测
PCR反应结束后，取4μL PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶(EB染色)进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶电泳，回收大小对应的PCR产物片段。
(4)序列比对
将回收的片段进行Sanger测序，然后将测序结果与桑轮斑病病原菌Acrospermumsp.核糖体RNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)进行比对，由此确定叶片上是否有桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.，并可由此推测桑轮斑病病原菌Acrospermum sp.是否可能是致病菌。
2、检测结果
图1是特异性引物对桑轮斑病的病原PCR检测和鉴定结果，可以看出，只有泳道1、泳道2和泳道3扩增出单一明亮条带，即只有桑轮斑病叶斑DNA；患有轮斑病的叶片总DNA可扩增出目的片段，且大小约为443bp，介于400～500bp之间，而其它11种真菌和空白对照均没有扩增出相似大小的片段。因此，本发明设计的引物LW6978F/LW7401R可特异性地检测桑轮斑病病原菌Acrospermum sp。
实施例4桑轮斑病检测灵敏度的测定
1、实验方法
桑轮斑病病叶总DNA提取后测定浓度，然后对总DNA模板进行十倍梯度稀释，分别为4.5ng/μl、4.5×10-1ng/μl、4.5×10-2ng/μl、4.5×10-3ng/μl、4.5×10-4ng/μl、4.5×10- 5ng/μl、4.5×10-6ng/μl、4.5×10-7ng/μl，以上述各浓度的总DNA为模板，用实施例2的检测试剂盒并按照实施例3的方法进行检测。
2、实验结果
由图2可知该引物具有良好的灵敏度，4.5ng/μl、4.5×10-1ng/μl、4.5×10-2ng/μl、4.5×10-3ng/μl、4.5×10-4ng/μl、4.5×10-5ng/μl桑轮斑病总DNA为模板均能扩增出清晰的条带，条带大小为443bp左右，检出限为4.5×10-5ng/μl的桑轮斑病病叶总的基因组。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种基于核糖体28s基因检测桑轮斑病的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5159
<212> DNA
<213> 核糖体28s基因(Acrospermum sp.)
<400> 1
tttgaaatct ggcgcctccg ggcgtccgag ttgtaatttg cagaggatgc ttcgggatcg 60
gcgctgcccc aggttctttg gaacaggacg ccacagaggg tgagagcccc gtctctgggc 120
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aaacggcggg agtaactatg actctcttaa ggtagccaaa tgcctcgtca tctaattagt 2160
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agggcgatgt tttcctgcac gtcgtagacg gatacgaata ggtcctcgac ctagaacctt 3060
agcaggccgg caacggcggc ccccgagaag cggaggtcgc tagctggcgg attgcaattt 3120
cacagcgcgc agggtgagat cccttgcaga cgacttggtt gtcccagatg gtcgtgtaag 3180
tagtcgagta gccttgttgt tacgagctac tgagcgtaat ccaatcctgg gcttgatttg 3240
tggcagatca ctgctccatc gtgctcgacg gccgccgcgc cctcgtccgg aggagtccgt 3300
ctctccctag cccgccatct cgcgcggcct ctgcccccaa cccgtgcccg ccacgccccc 3360
cgtctcgcgc ctacgtcccc ctcgatgccc ccccggtcta ggcggtcgaa gtgtcgaagt 3420
gccgaactgg tcgaagtgtc gaactggtcg agtcggtcga acggtcgaag tgtcgaatcg 3480
gtcgaacggt cgaagtgtcg aagtgtcgaa tcggtcgaac ggtcgaagtg tcgaagtgtc 3540
gaatcggtcg aacggtcgaa gtgtcgaagt gtcgaaccgg tcgaacggtc gaagtgtcga 3600
agtgtcgaac cggtcgaacg gtcgaatcgg tcgaagggtc gaactggtcg aacggtcgaa 3660
cggtcgaagg gtcgaatcgg tcgaacggtc gaactggtcg aacggtcgaa tcggtcgaac 3720
ggtcgaactg gtcgaacggt cgaacggtcg aagtgtcgaa tcggtcgaac ggtcgaatcg 3780
gtccaagtag tccaagtagt taaactagtt agagtataat aggtatataa tagtttatta 3840
acagtgttat attaaaccgc gggggttgac cggtttttcg aaaattatat atcaacgagt 3900
tttttaaaaa accgatttta taccagttaa actggttgga acacttaact attatgttaa 3960
ttttaaaaga taacccccat aaccgtctct acctttgtta ccttctatac tagttaaagt 4020
gttaaagtgg ttaaagcgtt aaaatcggcc gaaacactct aactataata tttattctaa 4080
ataagaattt ttatataaag tatccaagct attatcttta tatagttaaa gtattaaagt 4140
actaaactat tttactagaa tataaacttt taggaagaat ctctagaata ggctttgtta 4200
agttacttaa gttaataaag cggacttact aaactagtta gagtgttaaa gtaataggtt 4260
agtctctaat actctatcta actaacttgt taaagtaatt aaagtattaa attagtttaa 4320
ctggttaagc tagctaaata gtcgaatagt taaagggttg aatggttaaa gggtcgaata 4380
gtcgaatcgg ttaaaatagt cgaagtgtcg aatggtcgaa tcggtcgaac tggtcgaagt 4440
gtcgaagtgt cgaatggtcg aatcgtctag gtagataagc cagctagcct aactaggtaa 4500
actggttaaa gtgtcgaatt ggtcgaatgg tcgaatcggt cgaatcggtc gaacggtcga 4560
agtgtcgaag tggtcgaagt ggtcgaacgg tcgaagtgtc gaagtgtcga atcggtcgaa 4620
ctggtcgatc ggtcgaactg gtcgaacggt cgaatggtcg aaggtatgcg acggtccatc 4680
gatagtgtcg tgtcgaaccg cgggggtcga ccagtttttc gaaaatcgca tacaaacgag 4740
ttttttaaaa aatcgatttc gtaccaaagc ttggggttcg ccggcggcgg gcccgaatgg 4800
ggtcgcagag tacataagag aggagggcag ctcgaaggcg cctcctcccc ccacggcggc 4860
cgaaagccgc cgctggggcg gtctcttgca ggtctggcca cactagaccg cgcggtttca 4920
taacggctgc tctttcacgg tgacgctaca cgaaggggtg ggcgccgcta gctgtcagac 4980
gccgggtcac ctgctctgtc ttatccgctc gcggagggag gagtgctggg acccctaaat 5040
ccagccgacg tcgtcggatg gtgctgcatt gctctgagga ttgcttgccg atggcgaacc 5100
ttctcacgag tgaacggggg gtatcctcgc gggggacggc gcgctcgcgc agtccttcg 5159
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
gcgacggtcc atcgatagtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
ctcgtgagaa ggttcgccat 20

Claims (9)

1.一种桑轮斑病病原菌扁棒壳菌（Acrospermum sp.）的核糖体28s基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述核糖体28s基因和/或其检测试剂在检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌扁棒壳菌中的应用。
3.权利要求1所述核糖体28s基因在制备桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌扁棒壳菌检测试剂中的应用。
4.一种检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌扁棒壳菌的引物组，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。
5.权利要求4所述引物组在检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌扁棒壳菌中的应用。
6.权利要求4所述引物组在制备桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌扁棒壳菌检测试剂盒中的应用。
7.一种桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌扁棒壳菌的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述核糖体28s基因的检测试剂。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增所需试剂。
9.一种检测桑轮斑病和/或桑轮斑病病原菌扁棒壳菌的方法，其特征在于，以待测样本的总DNA为模板，利用权利要求4所述引物组进行PCR扩增；将PCR扩增反应的产物进行凝胶电泳，出现大小为400～500bp的扩增条带，则判定待测样本为桑轮斑病阳性样本或含有桑轮斑病病原菌扁棒壳菌。
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