CN109486836A

CN109486836A - 柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides核糖体RNA基因及应用

Info

Publication number: CN109486836A
Application number: CN201811625607.3A
Authority: CN
Inventors: 刘吉平; 王狗旦; 孙勋勋
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109486836B

Abstract

本发明公开了一种柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides核糖体RNA基因及应用。柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用该序列可对柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides进行检测，还可将该序列应用于真菌种属分类的研究中。另外，本发明还提供了一组检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的引物，该引物的特异性强，并基于该引物，建立了特异性检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的检测方法和检测试剂盒，在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides中具有良好的应用前景。

Description

柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides核糖体RNA基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides核糖体RNA基因及应用。

背景技术

现有的真菌研究方法中，常通过核糖体DNA(ribosome DNA，rDNA)序列进行测序比对用于真菌的鉴定。核糖体在细胞中具有重要功能，rDNA编码的基因许多都与蛋白质合成的反应过程密切相关，在蛋白质的生物合成中起决定作用。rDNA序列分为转录区和非转录区，转录区由编码核糖体5.8S、18S、28S蛋白结构的基因和基因间的2个转录间隔区(Internal Tanscribed Spacer,ITS)ITS1、和ITS2组成，共同组成一个转录单位。

rDNA中编码5.8S、18S、28S的rDNA序列较为保守，可以用于分析科间或更高级阶元间的系统发育。由于5.8S rDNA序列短、且高度保守，难以用于真菌的系统发育和分子鉴定；而18S rDNA的片段较长，片段中存在保守区和可变区。因此，现有研究中，通过选择不同的特异性扩增引物将某一结构域片段扩增后，经过测序以及对测序结果的分析比对，可用于真菌目、科、属等分类阶元的研究。但是，基于5.8S、18S、28S的rDNA序列难以对真菌种属的分类进行研究，不能确定病原真菌的种属，往往采用ITS序列来进行种(spieces)水平的鉴别。然而ITS区段的高变异性，在应用中出现了许多问题。因此，需要利用转录组学的技术获得rRNA的全长序列，把各基因区域的优缺点整合起来，进行真菌物种的分类和鉴定研究，是现代生物技术发展的必然选择。

柞树白粉病是柞树上的一个重要病害，欧洲、亚洲、美洲均有发生，我国北起吉林，南到四川有柞林的省份亦有此病发生。柞树白粉病发生时，白粉病菌侵染柞叶后，吸收叶内营养物质并使叶绿素含量下降，光合作用减弱，生理机能失常；进而使叶片外形变态，局部或全部萎缩、硬化，逐渐变为黄褐色或赤褐色半枯萎状态，早期脱落；被害柞树发育不良，易受冻害，可使幼树叶片卷曲枯焦，枝条扭曲变形、枯死，给柞树天然林的后备林分资源造成毁灭性损失。7月上旬至9月中旬是柞树白粉病的发病期，发病初期，多数在幼龄柞树的嫩叶两面散生点状白粉斑，有时在新生嫩枝上有类似症状发生白粉层逐渐增多并扩大连片，以至布满整个叶面，即病原菌的菌丝体和分生孢子；发病后期(8月下旬至9月中旬)，在白粉层中出现乳白色、黄白色、黄褐色至黑色小颗粒，是病菌的闭囊壳，多密聚群生。因此，亟需建立一种可对柞树白粉病病原菌进行检测和鉴定的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是弥补现有技术的空白，提供一种柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides核糖体RNA基因及应用。

本发明的第一个目的是提供一种柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因。

本发明的第二个目的是提供柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides或在真菌种属分类中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的方法。

本发明的第四个目的是提供一组检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的引物。

本发明的第五个目的是提供上述引物在检测柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides和/或制备检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供另外一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides的方法。

本发明的第七个目的是提供一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的试剂盒。

本发明的第八个目的是提供上述引物或试剂盒在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因，所述核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述核糖体RNA由18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2、28S rRNA组成；所述18S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第1～1720碱基序列；所示ITS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第1721～1940碱基序列；所述5.8S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第1941～2074碱基序列；所述ITS2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示序列中第2075～2276碱基序列；所述28S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第2277～5312碱基序列。

另外，所述柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides或在真菌种属分类中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的方法，以待测样本核糖体RNA基因的核苷酸序列与权利要求1所述核糖体RNA基因序列比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides。

更优选地，以待测样本DNA为模板，进行文库构建、高通量测序和组装，获得完整的核糖体DNA，然后与上述核糖体RNA基因的核苷酸序列进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides。

具体地，所述检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的方法，包括以下步骤：

S1.收集柞树病叶；

S2.提取柞树病叶的总DNA；

S3.IlluminaDNA文库构建；

S4.Illumina高通量测序；

S5.组装微生物基因组序列；

S6.组装完整核糖体DNA序列；

S7.对比分析核糖体DNA序列。

步骤S3所述IlluminaDNA文库构建的方法为：依照Illumina文库构建流程，将步骤S2所述总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；

步骤S5所述组装微生物基因组序列的方法为：使用组装软件对步骤S5所述已去除柞树基因组序列的测序数据进行组装。

优选地，步骤S5所述组装软件为MetaVelvet v1.2.01软件。

步骤S6所述组装完整核糖体DNA序列的方法为：采用比对软件，对所述组装序列进行比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，使用组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，直至获得完整的核糖体DNA序列。

优选地，步骤S6所述比对软件为bwa 0.7.12-r1039软件。

优选地，步骤S6对所述组装序列进行比对的方法为无错配0mismatch和无断裂0gap比对。

优选地，步骤S6所述组装软件为MetaVelvet v1.2.01软件。

本发明还提供了一组检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。

引物51F(如SEQ ID NO.2所示)：CCACCCGTGTCGATTTGTAT；

引物300R(如SEQ ID NO.3所示)：GTGCGTTCAAAGATTCGATG。

另外，上述引物在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides和/或制备检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

基于上述引物，本发明还提供了另外一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides的方法，根据权利要求1所述基因设计引物，进行PCR检测。

优选地，所述引物为上述的引物。

优选地，以待测样本DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增反应，根据反应结果判定待测样本中是否含有柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides。

更优选地，所述判定的方法为：将PCR扩增反应的产物进行凝胶电泳，如果出现条带，且条带大小为200～300bp，则判定待测样本中含有柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides。

优选地，所述PCR扩增反应的反应体系为：2×Taq Master Mix 10μL，引物51F/300R各0.5μL(10μM)，Template DNA 1μL，余量ddH₂O补足，共20μL。

优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。

另外，本发明还要求保护一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的试剂盒，包括所述核糖体RNA基因的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示引物。

所述试剂盒的使用方法即为上述检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的方法。

另外，上述引物或上述试剂盒在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因，并首次将该基因的核苷酸序列应用于检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides或在真菌种属分类中；通过大量的探索和研究，建立了2种检测柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides的方法；并得到了一组检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的特异引物，基于该引物，建立了特异性检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的检测方法和检测试剂盒，在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是验证核糖体组装结果的4组引物电泳图；其中，M：Takara DL2000Marker；1：验证核糖体组装结果引物组BF1-f1/BF2352-r1；2：验证核糖体组装结果引物组BF2221-f2/BF3663-r3；3：验证核糖体组装结果引物BF3452-f3/BF4627-r3；4：验证核糖体组装结果引物BF4197-f3/BF5320-r3；5：空白水对照。

图2是柞树叶病斑叶片所检测到的真菌微生物分类树；其中，分类树中的数值表示物种的相对丰度。

图3是特异引物用于柞树白粉病病原的PCR检测和鉴定结果；其中，M：TakaraDL1000Marker；1：Candida mucifera(假丝酵母菌)；2：Cladosporium cladosporioides(支孢样支孢霉)；3：Cladosporiumperangustum(细孢枝孢菌)；4：Cladosporium oxysporum(尖孢枝孢菌)；5：Penicillium verruculosum(疣孢青霉)；6：Penicillium citrinum(橘青霉)；7：Aspergillus(曲霉)；8：Phanerochaete chrysosporium(黄孢原毛平革菌)；9：Ceriporia mellea(蜂蜜色蜡质菌)；10：Beauveria bassiana(球孢白僵菌)；11：Schizophyllum commune(裂褶菌)；12：柞树白粉病子实体DNA；13：柞树白粉病病斑DNA；14：阴性对照(健康柞树DNA)；15：空白对照(水)。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因的核苷酸序列的获得

1、实验方法

(1)高通量测序

在发病的柞树园随机寻找到的具有典型白粉病病斑的叶片，收集，剪取柞树叶中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用鼎国真菌DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃；依照Illumina文库构建流程，将总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；使用Illumina Hiseq2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序，共测得11.17M对测序片段，测序读长为双末端125bp，总测序数据量1.67Gb。

(2)组装微生物基因组序列

微生物序列的组装使用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件进行，MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

序列标签注释使用blastn(2.2.31+)序列比对分析软件，组装的序列标签序列与NCBI的nt数据库进行比对，blastn比对设定期望值<1e-20，根据比对结果对序列标签进行注释。核糖体DNA序列是细菌和真菌鉴定的重要的最常用的分子标记，因此物种分类鉴定和定量以核糖体DNA为主要分子标记。根据序列标签注释结果，选择核糖体DNA序列作为微生物鉴定与定量分析依据。使用bwa(0.7.12-r1039)+samtools(v1.2)分析软件，计算测序数据中核糖体DNA片段的平均测序深度，并以此作为该物种的相对丰度值。

(3)组装完整核糖体DNA序列

MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。

(4)对比分析核糖体DNA序列

选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

2、实验结果

核糖体RNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成。本发明得到的柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides完整的核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；其中，18S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第1～1720碱基序列；ITS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第1721～1940碱基序列；5.8S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第1941～2074碱基序列；ITS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第2075～2276碱基序列；28S rRNA基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示序列中第2277～5312碱基序列。

实施例2核糖体组装结果的验证实验

1、核糖体组装结果的验证实验方法

(1)PCR扩增反应

在发病的柞树园随机寻找到的具有典型背面白色病斑的叶片，收集，剪取柞树叶中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，提取柞树病叶的总DNA，贮存于-80℃；

设计4组验证核糖体组装结果的引物(分别为引物组oak1，引物组oak2，引物组oak3和引物组oak4)，4组引物的核苷酸序列分别如表1所示；然后以柞树病叶的总DNA为模板，应用上述4组引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表2所示。

表1PCR扩增反应验证核糖体组装结果的引物序列表

表2PCR扩增反应体系(20μL)

(2)PCR扩增反应的条件

验证核糖体组装结果的引物组oak1PCR扩增反应的反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。验证核糖体组装结果的引物组oak2、引物组oak3和引物组oak4PCR扩增反应的反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。

(3)PCR扩增反应产物的检测

PCR反应结束后，取5μLPCR扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶(EB染色)进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶电泳，回收大小对应的PCR产物片段。

(4)序列比对

将回收的片段进行Sanger测序，然后将测序结果与柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides核糖体RNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)进行比对，由此确定叶片上是否有白粉病病原菌Erysiphe alphitoides，并可由此推测白粉病病原菌Erysiphealphitoides是否是致病菌。

2、实验结果

验证核糖体组装结果的4组引物的电泳结果如图1所示，可以看出，4组引物均扩增到相应的目的条带，进一步测序后的结果与组装的结果高度一致，证明核糖体组装结果正确。

实施例3检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的方法

1、检测方法

(1)高通量测序

在发病的柞树园随机寻找到的具有典型白粉病病斑的叶片，作为待测样本，剪取柞树叶中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用鼎国真菌DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃；依照Illumina文库构建流程，将总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；使用IlluminaHiseq2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序，测序读长为双末端125bp。

(2)组装微生物基因组序列

微生物序列的组装使用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件进行。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

(3)组装完整核糖体DNA序列

(4)对比分析核糖体DNA序列

2、实验结果

具有典型白粉病病斑的叶片所检测到的真菌微生物分类树如图2所示，可以看出，共注释8314条rRNA序列标签，数据包含572条细菌序列标签，7742条真菌序列标签，对应10种真菌；根据分类树中的数值越高，物种的相对丰度越高的原则，通过对序列标签注释结果的查询以及与柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)比对，发现相对丰度最高真菌的为Erysiphe属病原菌。

实施例4检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的方法

1、检测方法

(1)PCR扩增反应

为进一步将上述Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因应用于柞树白粉病的病原检测和鉴定中，本发明进一步设计了一组特异引物51F/300R，其核苷酸序列如表3所示；然后以感染病害的柞树叶(病斑)的总DNA为模板，以其它11种真菌、健康柞树DNA和ddH₂O为阴性对照，应用上述引物组51F/300R进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表4所示，拟扩增的目的片段大小约为250bp。

表3基于Erysiphe alphitoides核糖体RNA基因的核苷酸序列设计的特异引物

表4PCR扩增反应体系(20μL)

(2)PCR扩增反应的条件

验证引物51F/300R特异性的PCR扩增反应的条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。

(3)PCR扩增反应产物的检测

(4)序列比对

将回收的片段进行Sanger测序，然后将测序结果与柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides的核糖体RNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)进行比对，由此确定叶片上是否有柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides，并可由此推测柞树白粉病病原菌Erysiphealphitoides是否是致病菌。

2、检测结果

图3是特异引物用于柞树白粉病病原的PCR检测和鉴定结果，可以看出，只有12和13扩增出单一明亮条带，只有柞树白粉病子实体DNA和柞树白粉病病斑DNA扩增出目的片段，且大小介于200～300bp之间，约为250bp，而其它11种真菌、健康柞树DNA和空白对照均没有扩增出相似大小的片段。因此，本发明设计的引物组51F/300R可特异性的检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides核糖体RNA基因的核苷酸序列(SEQ IDNO.1)：

gaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagtaccttactacttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgctaaaagccccgacttcggaaggggtgtatttattagattaaaaaccaatgcccttcggggctctttggtgattcataataacttaacgaatcgcatggccttgtgccggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtagtatatgggactaccatggtttcaacgggtaacggggaattagggttctattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgatgcagggctcttttgggtcttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaataccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaaccttgggcctggctggccggtccgcctcaccgcgtgcactggtccggccgggtctttcctcctggggagccgcatgcccttcactgggtgtgtcggggaaccaggacttttactttgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcctatgctcgaatacattagcatggaataatagaataggacgtgtggttctattttgttggtttctcggaccgccgtaatgattaatagggatggtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttggatttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcagggaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcgggcgatgttatttttttttgactcgctcggcaccttacgagaaatcaaagtctttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggcaccaccaggagtgggcctgcggcttaattcgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaataaggattgacagattgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagaccttaacctgctaaatagccaggctagcctaggctggtcgccggcttcttagagggactatcggcgcaagtcgatggaagtttgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgacagagccaacgagtatcttccttgttcgaaagatctgggtaatcttgttaaactctgtcgtgctggggatagagcattgcaattattgctcttcaacgaggaattcctagtaagcgcaagtcatcagcttgcgctgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaatggctaagtgaggctttcggactggcctagggagagtggcaacgctcgcccagggccggaaagttgtccaaacttggtcatttagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattacagagcgtgaggctcagtcgtggcatctgctgcgtgctgggccgaccctcccacccgtgtcgatttgtatcttgttgctttggcgggccgggccgcgtcgtcgctgccccgcaaggacaagcgtcggccgcccaccggtttcggctggagcgcgcccgccaaagaccccatcaaaactcatgttgtttatgtcgtcttagctttattattgaaattgataaaactttcaacaacggatctcttggctctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatttagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccttggtattccgaggggcatgcctgttcgagcgtcataacaccccctccagttacctttgtgtggctgcggtgttggggctcgtcgtgatacggcggcccttaaagacagtggcggtcccggcgtgggctctacgcgtagtaacttgcttctcgcgacagagtgacgacggcggcttgccagaacaacccacttgctccagtcacatggatcacaggttgacctcgaatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaagaaaccaaccgggattacctcagtaacggcgagtgaagcggtaacagctcaaatttgaaatctggctcttccggagtccgagttgtaatttgtagaagatgctttgggttgtgggttcggcctaagttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtatgtggccgaggcccgcgcctatgtaaagctctttcaacgagtcgagttgtttgggaatgcagctcaaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatatgggccagagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttggaaagagagttaaacagtacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcaaccagacttgggcgctgccgatcaccttgagttttctcgagtgcactcgacagcgcacaggccagcatcggttcgggtggctggataaaggccgtaggaatgtggctctcttcggggagtgttatagcctacggtgccatgcagcccagccggaccgaggaccgcgccttcgggctaggatgctggcgtaatggttgtaagcgacccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacatctatgcgagtgtttgggtggtaaacccatacgcggaatgaaagtgaacgtaggtgagaacccctttggggcgcatcatcgaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgcagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcaaatttgggcataggggcgaaagactaatcgaaccatctagtagctggttcctgccgaagtttccctcaggatagcagtgttgacttcagttttatgaggtaaagcgaatgattagaggccttggggttgaaacaaccttaacctattctcaaactttaaatatgtaagaagtccttgttacttaattgaacgtggacatccgaatgtaccaacactagtgggccatttttggtaagcagaactggcgatgcgggatgaaccgaacgtgaagttaaggtgccggaatacacgctcatcagacaccacaaaaggtgttagttcatctagacagcaggacggtggccatggaagtcggaatccgctaaggagtgtgtaacaactcacctgccgaatgaactagccctgaaaatggatggcgctcaagcgtgttacccatacttcaccgccagggtagaaacgatgccctggcgagtaggcaggcgtggaggtttgtgacgaagccttgggagtgatcccgggtcgaacagcctctagtgcagatcttggtggtagtagcaaatactcaaatgagaactttgaggactgaagtggggaaaggttccatgtgaacagcagttggacatgggttagtcgatcctaagagatagggaaactccgttttaaagtgcgcacttgtgcgccgtccctcgaaagggaagccggttaatattccggcacctggatgtggattctccacggcaacgtaactgaaagcggagacggcggcgggggccctgggaagagttctcttttcttcttaacagcctatcaccctgaaatcggtttgtccggagctagggtttaacggttggtagagcctgacacctttgtcaggtccggtgcgctctcgacgtcccttgaaaatccgctggaaggaatagttttcacgccaggtcgtactcataaccgcagcaggtctccaaggtgaacagcctctagttgatagaacaatgtagataagggaagtcggcaaaatagatccgtaacttcgggaaaaggattggctctaagggttgggtacgttgggccttggttgggaagtccttggagcaggtcgccactagccttccggccggcggcttccagcatcgagggtctgacggccttggcagctttcgggcgtccggcgtacaattaacaaccaacttagaactggtacggacaaggggaatctgactgtctaattaaaacatagcattgcgatggccagaaagtggtgttgacgcaatgttgatttctgcccagtgctctgaatgtcaaagtgaagaaattcaaccaagcgcgggtaaacggcgggagtaactatgactctcttaaggtagccaaatgcctcgtcatctaattagtgacgcgcatgaatggattaacgagattcccactgtccctatctactatctagcgaaaccacagccaagggaacgggcttggcaaaatcagcggggaaagaagaccctgttgagcttgactctagtttgacattgtgaaaagacatagagggtgtagaataagtgggagcttcggcgccggtgaaataccactacctttatcgtttttttacttattcaatgaagcggaactgggtttaaccgcccacgtgttgcattaaggtccttcgcgggccgatccgggttggagacattgtcaggtggggagtttggctggggcggcacatctgttaaacaataacgcaggtgtcctaagggggactcattgagaacagaaatctcaagtagaacaaaagggtaaaagtccccttgattttgattttcagtgtgaatacaaaccatgaaagtgtggcctatcgatcctttagtccttcggaatttgaagctagaggtgccagaaaagttaccacagggataactggcttgtggcagccaagcgttcatagcgacgttgctttttgatccttcgatgtcggctcttcctatcataccgaagcagaattcggtaagcgttggattgttcacccactaatagggaacgtgagctgggtttagaccgtcgtgagacaggttagttttaccctactgatggattgttgtcgtaatagtaattcagcgtagtacgagaggaactgttgattcagataattggtatttgc

引物51F(SEQ ID NO.2)：5’-ccacccgtgtcgatttgtat-3’

引物300R(SEQ ID NO.3)：5’-gtgcgttcaaagattcgatg-3’

引物BF1-f1(SEQ ID NO.4)：5’-gaaactgcgaatggctca-3’

引物BF2352-r1(SEQ ID NO.5)：5’-tggtttcttttcctccgcttat-3’

引物BF2221-f2(SEQ ID NO.6)：5’-cgacagagtgacgacgg-3’

引物BF3663-r3(SEQ ID NO.7)：5’-cacaaacctccacgcctgcctactc-3’

引物BF3452-f3(SEQ ID NO.8)：5’-gaatacacgctcatcagaca-3’

引物BF4627-r3(SEQ ID NO.9)：5’-ttcccttggctgtggtttcg-3’

引物BF4197-f3(SEQ ID NO.10)：5’-ccgtaacttcgggaaaaggattggc-3’

引物BF5320-r3(SEQ ID NO.11)：5’-gcaaataccaattatctgaatcaac-3’

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides核糖体RNA基因及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5311

<212> DNA

<213> Erysiphe alphitoides

<400> 1

gaaactgcga atggctcatt aaatcagtta tcgtttattt gatagtacct tactacttgg 60

ataaccgtgg taattctaga gctaatacat gctaaaagcc ccgacttcgg aaggggtgta 120

tttattagat taaaaaccaa tgcccttcgg ggctctttgg tgattcataa taacttaacg 180

aatcgcatgg ccttgtgccg gcgatggttc attcaaattt ctgccctatc aactttcgat 240

ggtagtatat gggactacca tggtttcaac gggtaacggg gaattagggt tctattccgg 300

agagggagcc tgagaaacgg ctaccacatc caaggaaggc agcaggcgcg caaattaccc 360

aatcccgaca cggggaggta gtgacaataa atactgatgc agggctcttt tgggtcttgt 420

aattggaatg agtacaattt aaatccctta acgaggaaca attggagggc aagtctggtg 480

ccagcagccg cggtaatacc agctccaata gcgtatatta aagttgttgc agttaaaaag 540

ctcgtagttg aaccttgggc ctggctggcc ggtccgcctc accgcgtgca ctggtccggc 600

cgggtctttc ctcctgggga gccgcatgcc cttcactggg tgtgtcgggg aaccaggact 660

tttactttga aaaaattaga gtgttcaaag caggcctatg ctcgaataca ttagcatgga 720

ataatagaat aggacgtgtg gttctatttt gttggtttct cggaccgccg taatgattaa 780

tagggatggt cgggggcatc agtattcaat tgtcagaggt gaaattcttg gatttattga 840

agactaacta ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcaggg aacgaaagtt 900

aggggatcga agacgatcag ataccgtcgt agtcttaacc ataaactatg ccgactaggg 960

atcgggcgat gttatttttt tttgactcgc tcggcacctt acgagaaatc aaagtctttg 1020

ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag aaattgacgg aagggcacca 1080

ccaggagtgg gcctgcggct taattcgact caacacgggg aaactcacca ggtccagaca 1140

caataaggat tgacagattg agagctcttt cttgattttg tgggtggtgg tgcatggccg 1200

ttcttagttg gtggagtgat ttgtctgctt aattgcgata acgaacgaga ccttaacctg 1260

ctaaatagcc aggctagcct aggctggtcg ccggcttctt agagggacta tcggcgcaag 1320

tcgatggaag tttgaggcaa taacaggtct gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg 1380

cgcgctacac tgacagagcc aacgagtatc ttccttgttc gaaagatctg ggtaatcttg 1440

ttaaactctg tcgtgctggg gatagagcat tgcaattatt gctcttcaac gaggaattcc 1500

tagtaagcgc aagtcatcag cttgcgctga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc 1560

gtcgctacta ccgattgaat ggctaagtga ggctttcgga ctggcctagg gagagtggca 1620

acgctcgccc agggccggaa agttgtccaa acttggtcat ttagaggaag taaaagtcgt 1680

aacaaggttt ccgtaggtga acctgcggaa ggatcattac agagcgtgag gctcagtcgt 1740

ggcatctgct gcgtgctggg ccgaccctcc cacccgtgtc gatttgtatc ttgttgcttt 1800

ggcgggccgg gccgcgtcgt cgctgccccg caaggacaag cgtcggccgc ccaccggttt 1860

cggctggagc gcgcccgcca aagaccccat caaaactcat gttgtttatg tcgtcttagc 1920

tttattattg aaattgataa aactttcaac aacggatctc ttggctctgg catcgatgaa 1980

gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat ttagtgaatc atcgaatctt 2040

tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattccg aggggcatgc ctgttcgagc gtcataacac 2100

cccctccagt tacctttgtg tggctgcggt gttggggctc gtcgtgatac ggcggccctt 2160

aaagacagtg gcggtcccgg cgtgggctct acgcgtagta acttgcttct cgcgacagag 2220

tgacgacggc ggcttgccag aacaacccac ttgctccagt cacatggatc acaggttgac 2280

ctcgaatcag gtaggaatac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga ggaaaagaaa 2340

ccaaccggga ttacctcagt aacggcgagt gaagcggtaa cagctcaaat ttgaaatctg 2400

gctcttccgg agtccgagtt gtaatttgta gaagatgctt tgggttgtgg gttcggccta 2460

agttccttgg aacaggacgt catagagggt gagaatcccg tatgtggccg aggcccgcgc 2520

ctatgtaaag ctctttcaac gagtcgagtt gtttgggaat gcagctcaaa atgggtggta 2580

aatttcatct aaagctaaat atgggccaga gaccgatagc gcacaagtag agtgatcgaa 2640

agatgaaaag cactttggaa agagagttaa acagtacgtg aaattgttga aagggaagcg 2700

cttgcaacca gacttgggcg ctgccgatca ccttgagttt tctcgagtgc actcgacagc 2760

gcacaggcca gcatcggttc gggtggctgg ataaaggccg taggaatgtg gctctcttcg 2820

gggagtgtta tagcctacgg tgccatgcag cccagccgga ccgaggaccg cgccttcggg 2880

ctaggatgct ggcgtaatgg ttgtaagcga cccgtcttga aacacggacc aaggagtcta 2940

acatctatgc gagtgtttgg gtggtaaacc catacgcgga atgaaagtga acgtaggtga 3000

gaaccccttt ggggcgcatc atcgaccgat cctgatgtct tcggatggat ttgagtaaga 3060

gcatagctgt tgggacccga aagatggtga actatgcctg aatagggtga agccagagga 3120

aactctggtg gaggctcgca gcggttctga cgtgcaaatc gatcgtcaaa tttgggcata 3180

ggggcgaaag actaatcgaa ccatctagta gctggttcct gccgaagttt ccctcaggat 3240

agcagtgttg acttcagttt tatgaggtaa agcgaatgat tagaggcctt ggggttgaaa 3300

caaccttaac ctattctcaa actttaaata tgtaagaagt ccttgttact taattgaacg 3360

tggacatccg aatgtaccaa cactagtggg ccatttttgg taagcagaac tggcgatgcg 3420

ggatgaaccg aacgtgaagt taaggtgccg gaatacacgc tcatcagaca ccacaaaagg 3480

tgttagttca tctagacagc aggacggtgg ccatggaagt cggaatccgc taaggagtgt 3540

gtaacaactc acctgccgaa tgaactagcc ctgaaaatgg atggcgctca agcgtgttac 3600

ccatacttca ccgccagggt agaaacgatg ccctggcgag taggcaggcg tggaggtttg 3660

tgacgaagcc ttgggagtga tcccgggtcg aacagcctct agtgcagatc ttggtggtag 3720

tagcaaatac tcaaatgaga actttgagga ctgaagtggg gaaaggttcc atgtgaacag 3780

cagttggaca tgggttagtc gatcctaaga gatagggaaa ctccgtttta aagtgcgcac 3840

ttgtgcgccg tccctcgaaa gggaagccgg ttaatattcc ggcacctgga tgtggattct 3900

ccacggcaac gtaactgaaa gcggagacgg cggcgggggc cctgggaaga gttctctttt 3960

cttcttaaca gcctatcacc ctgaaatcgg tttgtccgga gctagggttt aacggttggt 4020

agagcctgac acctttgtca ggtccggtgc gctctcgacg tcccttgaaa atccgctgga 4080

aggaatagtt ttcacgccag gtcgtactca taaccgcagc aggtctccaa ggtgaacagc 4140

ctctagttga tagaacaatg tagataaggg aagtcggcaa aatagatccg taacttcggg 4200

aaaaggattg gctctaaggg ttgggtacgt tgggccttgg ttgggaagtc cttggagcag 4260

gtcgccacta gccttccggc cggcggcttc cagcatcgag ggtctgacgg ccttggcagc 4320

tttcgggcgt ccggcgtaca attaacaacc aacttagaac tggtacggac aaggggaatc 4380

tgactgtcta attaaaacat agcattgcga tggccagaaa gtggtgttga cgcaatgttg 4440

atttctgccc agtgctctga atgtcaaagt gaagaaattc aaccaagcgc gggtaaacgg 4500

cgggagtaac tatgactctc ttaaggtagc caaatgcctc gtcatctaat tagtgacgcg 4560

catgaatgga ttaacgagat tcccactgtc cctatctact atctagcgaa accacagcca 4620

agggaacggg cttggcaaaa tcagcgggga aagaagaccc tgttgagctt gactctagtt 4680

tgacattgtg aaaagacata gagggtgtag aataagtggg agcttcggcg ccggtgaaat 4740

accactacct ttatcgtttt tttacttatt caatgaagcg gaactgggtt taaccgccca 4800

cgtgttgcat taaggtcctt cgcgggccga tccgggttgg agacattgtc aggtggggag 4860

tttggctggg gcggcacatc tgttaaacaa taacgcaggt gtcctaaggg ggactcattg 4920

agaacagaaa tctcaagtag aacaaaaggg taaaagtccc cttgattttg attttcagtg 4980

tgaatacaaa ccatgaaagt gtggcctatc gatcctttag tccttcggaa tttgaagcta 5040

gaggtgccag aaaagttacc acagggataa ctggcttgtg gcagccaagc gttcatagcg 5100

acgttgcttt ttgatccttc gatgtcggct cttcctatca taccgaagca gaattcggta 5160

agcgttggat tgttcaccca ctaataggga acgtgagctg ggtttagacc gtcgtgagac 5220

aggttagttt taccctactg atggattgtt gtcgtaatag taattcagcg tagtacgaga 5280

ggaactgttg attcagataa ttggtatttg c 5311

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccacccgtgt cgatttgtat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcgttcaa agattcgatg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaactgcga atggctca 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggtttcttt tcctccgctt at 22

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgacagagtg acgacgg 17

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacaaacctc cacgcctgcc tactc 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaatacacgc tcatcagaca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcccttggc tgtggtttcg 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgtaacttc gggaaaagga ttggc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcaaatacca attatctgaa tcaac 25

Claims

1.一种柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因，其特征在于，所述核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的核糖体RNA基因在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides或在真菌种属分类中的应用。

3.一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的方法，其特征在于，以待测样本核糖体RNA基因的核苷酸序列与权利要求1所述核糖体RNA基因序列比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides。

4.一组检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。

5.权利要求4所述引物在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides和/或制备检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides试剂盒中的应用。

6.一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的方法，其特征在于，根据权利要求1所述基因设计引物，进行PCR检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物为权利要求4所述的引物。

8.一种检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述核糖体RNA基因的扩增引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物为权利要求4所述的引物。

10.权利要求4所述引物或权利要求8所述试剂盒在检测柞树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides中的应用。