CN109652580B

CN109652580B - 柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列及其应用

Info

Publication number: CN109652580B
Application number: CN201811574086.3A
Authority: CN
Inventors: 刘吉平; 王狗旦; 孙勋勋
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: CN109652580A

Abstract

本发明公开了一种柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列及其应用。柞树早烘病病原菌Septoriasp的核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用该序列可对柞树早烘病病原菌Septoriasp进行检测，还可将该序列应用于真菌种属分类的研究中。此外，本发明还提供了一种检测柞树早烘病病原菌Septoriasp的引物，该引物具有很好的特异性，并基于该引物，建立了具体的检测方法和检测试剂盒，检测所需时间短、快速、高效，在检测柞树早烘病病原菌Septoriasp中具有良好的应用前景。

Description

柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列及其应用。

背景技术

现有的真菌研究方法中，常通过核糖体DNA(ribosome DNA,rDNA)序列进行测序比对用于真菌的鉴定。核糖体在细胞中具有重要功能，rDNA编码的基因许多都与蛋白质合成的反应过程密切相关，在蛋白质的生物合成中起决定作用。rDNA序列分为转录区和非转录区，转录区由编码核糖体5.8S、18S、28S蛋白结构的基因和基因间的2个转录间隔区(Internal Tanscribed Spacer,ITS)ITS1、和ITS2组成，共同组成一个转录单位。

rDNA中编码5.8S、18S、28S的rDNA序列较为保守，可以用于分析科间或更高级阶元间的系统发育。由于5.8S rDNA序列短、且高度保守，难以用于真菌的系统发育和分子鉴定；而18S rDNA的片段较长，片段中存在保守区和可变区。因此，现有研究中，通过选择不同的特异性扩增引物将某一结构域片段扩增后，经过测序以及对测序结果的分析比对，可用于真菌目、科、属等分类阶元的研究。但是，基于5.8S、18S、28S的rDNA序列难以对真菌种属的分类进行研究，不能确定病原真菌的种属，往往采用ITS序列来进行种(spieces)水平的鉴别。然而ITS区段的高变异性，在应用中出现了许多问题。因此，需要利用转录组学的技术获得rRNA的全长序列，把各基因区域的优缺点整合起来，进行真菌物种的分类和鉴定研究，是现代生物技术发展的必然选择。

早烘病一般在8月下旬发病，在9月上旬大面积的发生，不同地区发病时期略有不同。此病发生首先出现在柞树的下部枝条基部叶片上，发病初期在柞树叶缘处开始出现小米粒大小的褐色斑点，形状不规则，分布也不均匀，以后病斑继续扩大，再由叶缘部位很不均匀的向叶中部扩展，且叶缘呈现卷起状，然后慢慢连成较大的褐色病斑，最终整叶全烘，导致蚕不能取食，但病叶并不脱落。新叶最初不表现症状，在各自的发病部位可以持续1～10d，以后发展到柞树全株。因此，亟需建立一种可对柞树早烘病的病原菌进行检测和鉴定的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是弥补现有技术的空白，提供柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA的基因。

本发明的第二个目的是提供柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列在检测柞树早烘病病原菌Septoria sp或在真菌种属分类中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法。

本发明的第四个目的是提供一组检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的引物。

本发明的第五个目的是提供另外一种检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法。

本发明的第六个目的是提供一种检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的试剂盒。

本发明的第七个目的是提供上述引物或试剂盒在检测柞树早烘病病原菌Septoria sp中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种柞树早烘病病原菌Septoria sp核糖体RNA的基因，所述核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述核糖体RNA由18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2、28S rRNA组成；所述18S rRNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1～1737碱基序列；所示ITS1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1738～2324碱基序列；所述5.8S rRNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2325～2482碱基序列；所述ITS2基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示序列中第2483～2640碱基序列；所述28S rRNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2641～5737碱基序列。

另外，所述柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列在检测柞树早烘病病原菌Septoria sp或在真菌种属分类中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法，以待测样本核糖体RNA基因的核苷酸序列与权利要求1所述基因比对。

更优选地，以待测样本DNA为模板，进行文库构建、高通量测序和组装，获得完整的核糖体DNA，然后与上述核糖体RNA基因的核苷酸序列进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有早烘病病原菌Septoria sp。

具体地，所述检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法，包括以下步骤：

S1.收集柞树病叶；

S2.提取柞树病叶的总DNA；

S3.IlluminaDNA文库构建；

S4.Illumina高通量测序；

S5.去除测序数据中柞树基因组序列；

S6.组装微生物基因组序列；

S7.组装完整核糖体DNA序列；

S8.比对分析核糖体DNA序列。

步骤S3所述Illumina DNA文库构建的方法为：依照Illumina DNA文库构建流程，将步骤S2所述总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库。

步骤S8所述比对分析核糖体DNA序列的方法为：使用序列比对分析软件，将步骤S7所述完整核糖体DNA序列与柞树早烘病病原菌Septoria sp核糖体RNA基因的核苷酸序列进行比对。

步骤S5所述去除测序数据中柞树基因组序列的方法为：利用比对软件对步骤S4所述高通量测序数据进行数据比对分析；选择比对算法，将所述测序数据与柞树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的所述测序数据判定为柞树基因组序列；使用编写的计算机程序从所述测序数据中去除柞树基因组序列。

优选地，步骤S5所述比对软件为bwa 0.7.12-r1039软件。

优选地，步骤S5所述比对算法为mem比对算法。

优选地，步骤S5所述编写的计算机程序为python计算机语言编写。

步骤S6所述组装微生物基因组序列的方法为：使用组装软件对步骤S5所述去除测序数据中柞树基因组序列得到的测序数据进行组装。

优选地，步骤S6所述组装软件为MetaVelvet v1.2.01软件。

步骤S7所述组装完整核糖体DNA序列的方法为：采用比对软件，对所述组装序列进行比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，使用组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，直至获得完整的核糖体DNA序列。

优选地，步骤S7所述比对软件为bwa 0.7.12-r1039软件。

优选地，步骤S7对所述组装序列进行比对的方法为无错配0mismatch和无断裂0gap比对。

优选地，步骤S7所述组装软件为MetaVelvet v1.2.01软件。

本发明还提供了一组检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示。

另外，所述引物在检测柞树早烘病病原菌Septoria sp中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

基于上述引物，本发明还提供了另外一种检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法，根据所述核糖体RNA设计引物，进行PCR检测。

优选地，所述引物为以上所述引物。

优选地，以待测样本DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增反应，根据反应结果判定待测样本中是否含有早烘病病原菌Septoria sp。

更有选的所述判定的方法为：将PCR扩增反应的产物进行凝胶电泳，如果出现条带，且条带大小为400～500bp，则判定待测样本中含有早烘病病原菌Septoria sp。

所述判定的方法为：将PCR扩增反应的产物进行凝胶电泳，如果出现条带，且条带大小为400～500bp，则判定待测样本中含有早烘病病原菌Septoria sp。

优选地，所述PCR扩增反应的反应体系为：2×Taq Master Mix 10μL，引物YK1739F/YK2229R各0.5μL(10μM)，Template DNA 1μL，余量ddH₂O补足，共20μL。

优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。

另外，一种包括上述引物YK1739F/YK2229R的检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的试剂盒，也应在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒的使用方法即为上述检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法。

另外，上述引物或上述试剂盒在检测柞树早烘病病原菌Septoria sp中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了所述柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA基因的核苷酸序列，将柞树早烘病病原菌Septoria sp核糖体RNA基因的核苷酸序列应用于检测柞树早烘病病原菌Septoria sp或在真菌种属分类中；建立了两种检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法，通过大量的探索和研究，得到了一组检测柞树早烘病病原菌Septoriasp的引物，该引物具有很好的特异性，并基于该引物，建立了能够特异性地检测柞树早烘病病原菌Septoria sp检测方法和检测试剂盒，在检测柞树早烘病病原菌Septoria sp中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是验证核糖体组装结果的4对引物电泳图；其中，M：Takara DL2000Marker；1：验证核糖体组装结果的引物对YK26-f1/YK1570-r1；2：验证核糖体组装结果的引物对YK1461-f1/3455-f2；3：验证核糖体组装结果的引物对YK3100-f3/YK4500-r3；4：验证核糖体组装结果的引物对YK4282-f4/YK5737-r4。

图2是柞树叶病斑叶片所检测到的真菌微生物分类树；其中，分类树中的数值表示物种的相对丰度。

图3是特异引物用于柞树早烘病的病原PCR检测和鉴定结果；其中，M：TakaraDL1000Marker；1：Candida mucifera(假丝酵母菌)；2：Cladosporiumcladosporioides(支孢样支孢霉)；3：Cladosporiumperangustum(细孢枝孢菌)；4：Cladosporium oxysporum(尖孢枝孢菌)；5：Penicillium verruculosum(疣孢青霉)；6：Penicillium citrinum(橘青霉)；7：Aspergillus(曲霉)；8：Phanerochaetechrysosporium(黄孢原毛平革菌)；9：Ceriporia mellea(蜂蜜色蜡质菌)；10：Septoria spDNA(子实体)；11：早烘病病斑DNA；12：空白对照(ddH₂O)。1～9为实验室分离培养的真菌，且按照国际物种条形码进行了物种鉴定，10和11分别为柞树早烘病病原菌Septoria sp子实体和柞树早烘病病斑DNA。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的RNA序列的获得

1、实验方法

(1)高通量测序

在发病的柞树园随机寻找具有典型早烘病病斑的叶片，收集，剪取柞树叶中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用康为世纪真菌DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃；依照Illumina DNA文库构建流程，将总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；使用Illumina Hiseq2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序，共测得18.13M测序片段，测序读长为双末端125bp，总测序数据量5.44Gb。

(2)组装微生物基因组序列

微生物序列的组装使用Meta Velvet(v1.2.01)组装软件进行；目标病原真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成，序列总长度约为5800bp。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

序列标签注释使用blastn(2.2.31+)序列比对分析软件，组装的序列标签序列与NCBI的nt数据库进行比对，blastn比对设定期望值<1e-20，根据比对结果对序列标签进行注释。核糖体DNA序列是细菌和真菌鉴定的重要的最常用的分子标记，因此物种分类鉴定和定量以核糖体DNA为主要分子标记。根据序列标签注释结果，选择核糖体DNA序列作为微生物鉴定与定量分析依据。使用bwa(0.7.12-r1039)+samtools(v1.2)分析软件，计算测序数据中核糖体DNA片段的平均测序深度，并以此作为该物种的相对丰度值。

(3)组装完整核糖体DNA序列

真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成，序列总长度约为5800bp。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。

(4)对比分析核糖体DNA序列

选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

2、实验结果

本发明得到的柞树早烘病病原菌Septoria sp完整的核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中，18S rRNA基因的核苷酸序列序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1～1737碱基序列；ITS1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第1738～2324碱基序列；5.8S rRNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2325～2482碱基序列；ITS2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2483～2640碱基序列；28S rRNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列中第2641～5737碱基序列。

实施例2核糖体组装结果的验证实验

1、核糖体组装结果的验证实验方法

(1)PCR扩增反应

在发病的柞树园随机寻找具有典型黑色病斑的叶片，收集，剪取柞树叶中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，提取柞树病叶的总DNA，贮存于-80℃；

设计4对验证核糖体组装结果的引物(分别为引物对YK26-f1/YK1570-r1，引物对YK1461-f2/YK3455-r2，引物对YK3100-f3/YK4500-r3和引物对YK4282-f4/YK5737-r4)，4对引物的核苷酸序列分别如表1所示；然后以柞树病叶的总DNA为模板，应用上述4对引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表2所示。

表1PCR验证引物序列表

表2PCR扩增反应体系(20μL)

(2)PCR扩增反应的条件

验证核糖体组装结果的YK26-f1/YK1570-r1引物组和YK3100-f3/YK4500-r3引物组PCR扩增反应的反应条件：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。验证核糖体组装结果的YK1461-f1/3455-f2引物组和YK4282-f4/YK5737-r4引物组PCR扩增反应的反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。

(3)PCR扩增反应产物的检测

PCR反应结束后，取5μLPCR扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶(EB染色)进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶电泳，回收大小对应的PCR产物片段。

(4)序列比对

将回收的片段进行Sanger测序，然后将测序结果与柞树早烘病病原菌Septoriasp核糖体RNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)进行比对，由此确定叶片上是否有早烘病病原菌Septoria sp，并可由此推测早烘病病原菌Septoria sp是否可能是致病菌。

2、实验结果

图1为验证核糖体组装结果的4对引物电泳图，可以看出，验证核糖体组装结果的4对引物均扩增到相应的目的条带，进一步测序后的结果与组装的结果高度一致，证明核糖体组装结果正确。

实施例3检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法

1、检测方法

(1)高通量测序

在发病的柞树园随机寻找具有典型早烘病病斑的叶片，收集，剪取柞树叶中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用康为世纪真菌DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃；依照Illumina DNA文库构建流程，将总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；使用Illumina Hiseq 2500测序仪对构建好的DNA文库进行高通量测序，共测得18.13M测序片段，测序读长为双末端125bp，总测序数据量5.44Gb。

(2)组装微生物基因组序列

微生物序列的组装使用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件进行。真菌的核糖体DNA由18S区段，ITS1区段，5.8S区段，ITS2区段和28S区段组成，序列总长度约为5800bp。MetaVelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体DNA序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体DNA。选择包含目标病原菌ITS序列的核糖体DNA序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用MetaVelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体DNA序列。

(3)组装完整核糖体DNA序列

(4)对比分析核糖体DNA序列

2、实验结果

柞树叶病斑叶片所检测到的真菌微生物分类树如图2所示，可以看出，共注释8853条rRNA序列标签，数据包含732条细菌序列标签，8121条真菌序列标签，对应11种真菌；根据数值越高，则物种的相对丰度越高的原则，通过对序列标签注释结果的查询以及与柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列的比对，发现相对丰度最高的真菌为Septoria属病原菌。

实施例4检测柞树早烘病病原菌Septoria sp的方法

1、检测方法

(1)PCR扩增反应

为进一步利用上述Septoria sp的核糖体RNA序列应用于柞树早烘病的病原检测和鉴定中，本发明进一步设计了一对特异引物YK1739F/YK2229R，其核苷酸序列如表3所示；然后以感染病害的柞树叶(病斑)的总DNA为模板，以其它9种真菌和ddH₂O为阴性对照，应用上述引物YK1739F/YK2229R进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表4所示，拟扩增的目的片段大小约为490bp。

表3基于Septoria sp核糖体RNA基因的核苷酸序列设计的特异引物

表4PCR扩增反应体系(20μL)

(2)PCR扩增反应的条件

验证引物YK1739F/YK2229R特异性的PCR扩增反应的条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。

(3)PCR扩增反应产物的检测

(4)序列比对

2、检测结果

图3是特异引物用于柞树早烘病的病原PCR检测和鉴定结果，可以看出，只有10和11扩增出单一明亮条带，即只有柞树早烘病病斑DNA或柞树早烘病病原菌Septoria sp DNA(子实体)扩增出目的片段，且大小约为490bp，介于400～500bp之间，而其它9种真菌和空白对照均没有扩增出相似大小的片段。因此，本发明设计的引物YK1739F/YK2229R可特异性的检测柞树早烘病病原菌Septoria sp。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 柞树早烘病病原菌Septoria sp的核糖体RNA序列及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5737

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagtataagc aactatacgg tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtt atcgtttatt 60

tgatagtacc ctactacatg gataaccgtg gtaattctag agctaataca tgctaaaaac 120

cccgacttcg gaaggggtgt atttattaga taaaaaacca atgcccttcg gggctccttg 180

gtgaatcata ataactttac gaatcgcatg gccttgcgcc ggcgatggtt cattcaaatt 240

tctgccctat caactttcga tggtaggata gaggcctacc atggtttcaa cgggtaacgg 300

ggaattaggg ttcgactccg gagagggagc ctgagaaacg gctaccacat ccaaggaagg 360

cagcaggcgc gcaaattacc caatcccgac acggggaggt agtgacaata aatactgata 420

cagggctctt ttgggtcttg taattggaat gagtacaatt taaatccctt aacgaggaac 480

aattggaggg caagtctggt gccagcagcc gcggtaattc cagctccaat agcgtatatt 540

aaagttgttg cagttaaaaa gctcgtagtt gaaccttggg cctggctggc cggtccgcct 600

caccgcgtgt actggtccgg ccgggccttt ccttctgggg agccgcatgc ccttcactgg 660

gcgtgtcggg gaaccaggac ttttactttg aaaaaattag agtgttcaaa gcaggccttt 720

gctcgaatac attagcatgg aataatagaa taggacgtgt ggttctattt tgttggtttc 780

taggaccgcc gtaatgatta atagggatag tcgggggcat ccgtattcaa ttgtcagagg 840

tgaaattctt ggatttattg aagacgaact actgcgaaag catttgccaa ggatgttttc 900

attaatcagt gaacgaaagt taggggatcg aagacgatca gataccgtcg tagtcttaac 960

cataaactat gccgactagg gatcggtgga tgttatcttt ttgactccat cggcacctta 1020

cgagaaatca aagtttttgg gttctggggg gagtatggtc gcaaggctga aacttaaaga 1080

aattgacgga agggcaccac caggcgtgga gcctgcggct taatttgact caacacgggg 1140

aaactcaccg ggtccggaca cgataaggat tgacagattg agagctcttt cttgatttcg 1200

tgggtggtgg tgcatggccg tttttagttc gtggagtgat ttgtctgctt aattgcgata 1260

acgaacgaga ccttttcctg ctgaatagcc cgaccagctc cggctggccg ctggcttctc 1320

agagggacta tcggctcaaa gccgttggaa gtgaggcaaa aacaggtctg tgatgccctt 1380

agatgtcccg ggcagcacgc gcgctacact gacggagcca gcgagtatcc tcctttgccg 1440

aaaggcctgg gtaatcttgt taaactccgt cgtgctgggg atagagcatt gcaattattg 1500

ctcttcaacg aggaatgcct agtaagcgcg tgtcatcagc acgcgttgat tacgtccctg 1560

ccctttgtac acaccgcccg tcgctactac cgattgaacg gcttagtgag gccttcggac 1620

tggccgaggg aggtcggcga cgaccaccca tggccggaaa gttggtcaaa cttggtcgtt 1680

tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtttc cgtagctgta agtcaggaac gcgaatgagc 1740

cttccgtggt gaatcttacc gaagcctgag cagcccgaaa gggttgccgt ccgcgactgt 1800

aaatattgag acggcatgaa atgctagtcc gctcgctgag cgggcgacac tgccaaattg 1860

cggggacacc ttaaagcctt tgacaccaag ccgtcgccga aaggcggcgg tggccgagct 1920

aacagccctg ggtatggtaa tagttcaaag gatgacccgt ccggaaacgg cggcgaaata 1980

ggcaatccgc agccaagtcc tacgggcccg ttcgcgggct acggacgctg ttcacaggcc 2040

aaatggtagt gggtgggacc gccgcgtcct gcttaagata tggtcgggcc ttgagagaaa 2100

tctcggggac aattcactac tgcccccccc ccttaccgtt ccgtaggtga acctgcggaa 2160

ggatcattca tcgagcgagt gggcccgtcc cctccctcca tcccgtgcgt accctccagt 2220

ctctgcctcg gccggccccc ccgctccggc gggtcgcccg ccgaggcccc tctcaaacct 2280

agttgtccaa cgttgacgtc tgagtgatta tacaaaccaa aacaaaactt tcaacaatgg 2340

atctcttggc tccggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 2400

agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg ccccccggta ttccgggggg 2460

cacacctgtc cgagcgccgt tgcgcaccct caagcatacg cttggtgttg ggctcccccc 2520

tgctttacgg cgcggggccg cctctaatcg atgggcgcca gacctcgggc ctcagcgttg 2580

cggtatgcaa tcgcgctctg gcccggcggt ttggccgccg gaaaagacct ttcttgaacg 2640

attggcctcg gatcaggtgg ggatacccgc tgaacttaag catatcaata agcggaggaa 2700

aagaaaccaa ccgggattgc cctagtaacg gcgagtgaag cggcagcagc tcaaatttga 2760

aatctggcgc ccctggcgtc cgagttgtaa tttgcagagg atgctttggc gttggcgccg 2820

gcccaagacc cctggaatgg ggcgtcctag agggtgagaa ccccgtgtac ggccgggcag 2880

tctttgcctt gtatagctcc ctcgacgagt cgagttgttt gggaatgcag ctctaagcgg 2940

gtggtaaatt ccatctaaag ctaaataccg gccggagacc gatagcgcac aagtagagtg 3000

atcgaaagat gaaaagcact ttgaaaagag agttaaaaag cacgtgaaat tgttgaaagg 3060

gaagcgctcg cgatcagact tggggcgcgc gctcagccgg ccgtcaggcc ggtctattcg 3120

cgcgtcctgg gccagcatca gtttgggcgg cgggataaag gcgccgggaa tgtggcccct 3180

cggggtgtta tagcccggcg tgcaatgccg cccgcccaga ctgaggacct cgctctgcta 3240

ggatgctggc gtaatggtcg tgagcggccc gtcttgaaac acggaccaag gagtctacca 3300

tctgtgcgag tgtttgggtg taaaacccgc tcgcgaaatg aaagtgaacg gaggcgggaa 3360

cccgcaaggg cgcaccgtcg accgatcctg atgtgttcgg aaggatttga gtaagagcac 3420

agctggtggg acccgaaaga tgttgaacta tgcgtgaata gggcgaagcc agaagaaatt 3480

ctggtggagg ctcgcagggg ttctgacgtg caaatcgatc ctcaaatttg cgtatggggg 3540

cgaaagacca atcgaagcat ctagtagctg gttcctgtcg aagtttccct caggaaagca 3600

gtatggcacg cagttttatg aggtaaagcg aatgattaga ggtttggggg atgaaacatc 3660

cttcacctat tctcaaactt taaatatgta agaagccctt gttacttagt tgaacgtggg 3720

ccttcgaatg cgccgtacta gtgggccatt tttggtaagc agaactggcg atgcgggatg 3780

aaccgaacgc gcggttaagg tgccggaatg cacgctcatc agaccccaca aaaggtgtta 3840

gttcatccag acagcaggac ggtggccatg gaagtcggaa tccgctaagg agtgtgtaac 3900

aactcacctg ccgaatgaac tagccctgaa aatggatggc gctcaagcgt gttacccata 3960

cctcgccgcc ggggcgggct ctttgccccg gcgagtaggc aggcgtggag gcccgtgacg 4020

aagccttggg ggtgaccccg ggtcgaacgg cctctagtgc agatcttggt ggtagtagca 4080

aatactcaaa cgagaacttt gaggactgaa gtggggaaag gttccgtgtg aacagcagtt 4140

ggacacgggt cagccgatcc taaggggtag ggtagttccg actcaacgtg cgcgcttgcg 4200

cgccgccccc cgaaagggaa gccggttaaa attccggcgc ctggatgtgg attcttcgcg 4260

gcaacgcaac tgaaggtgga gacgtcggtg ggggccccgg gaagagttat cttttcttct 4320

taacggtcaa cgcaccctgg aatcggttta tccggcgata gggtgacacg atcggaagag 4380

ccccgcactt ttgcggggtc cggcgcgcct ccaacggccc ttgaaaatcc gccggaagca 4440

atagttttca cgccaggtcg tactcataac cgcagcaggt ctccaaggtg aacagcctct 4500

ggttgataga acaatgtaga taagggaagt cggcaaaaca gatccgtaac ttcgggaaaa 4560

ggattggctc taagggtcgg gcgcgttggg ccttgggccg atgcccgtgg agcaggttgg 4620

cactagcctc acggccggcg cctcccagca ccgcgtggcg ggcgcccttg gcaggcttcg 4680

gccgtccggc gcgcaattaa cgaccaactt agaactgtca cggacaaggg gaatctgact 4740

gtctaattaa aacatagcat tgcgatggcc ggaaagcggt gttgacgcaa tgtgatttct 4800

gcccagtgct ctgaatgtca aagcgatgca attcgaccaa gcgcgggtaa acggcgggag 4860

taactatgac tctcttaagg tagccaaatg cctcgtcatc taattagtga cgcgcatgaa 4920

tggattaacg agattcccac tgtccctatc tactatctag cgaaaccaca gccaagggaa 4980

cgggcttggc agaatcagcg gggaaagaag accctgttga gcttgactct agtttgacat 5040

tgtgaaaaga catagggggt gtagaatagg tgggagcttc ggcgccggtg aaataccact 5100

acccttatcg tttttttact taatcaatga agcggaactg gtcttcaccg accattttct 5160

ggcgttaagg tccttcgcgg gccgatccgg gttgatgaca ttgtcaggtg gggagtttgg 5220

ctggggcggc acatctgtta aaccataacg caggtgtcct aagggggact catggagaac 5280

agaaatctcc agtagagcaa aagggcaaaa gtccccttga ttttgatttt cagtgtgaat 5340

acaaaccatg aaagtgtggc ctatcgatcc tttagtccct cgaaatttga ggctagaggt 5400

gccagaaaag ttaccacagg gataactggc ttgtggcagc caagcgttca tagcgacgtt 5460

gctttttgat ccttcgatgt cggctcttcc tatcattgtg aagcagaatt caccaagtgt 5520

tggattgttc acccaccaat agggaacgtg agctgggttt agaccgtcgt gagacaggtt 5580

agttttaccc tactgatgac agtgtcgcaa tagtaattca acctagtacg agaggaaccg 5640

ttgattcgca caattggtca tcgcgcttgg ttgaaaagcc agtggcgcga agctaccgtg 5700

cgctggatta tgactgaacg cctctaagtc agaatcc 5737

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccttccgtg gtgaatctta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggcagaga ctggagggta 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgcgaatgg ctcattaaat c 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtacaaaggg cagggacgta 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaactccgt cgtgctgggg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgcatagtt caacatcttt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgcacaagt agagtgatcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgacgtctcc accttcagtt 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcaacgcaa ctgaaggt 18

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggattctgac ttagaggcgt tc 22

Claims

1.一种柞树早烘病病原菌Septoriasp的核糖体RNA的基因，其特征在于，所述核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述柞树早烘病病原菌Septoriasp的核糖体RNA序列在检测柞树早烘病病原菌Septoriasp或在真菌种属分类中的应用。

3.一种检测柞树早烘病病原菌Septoriasp的方法，其特征在于，以待测样本核糖体RNA基因的核苷酸序列与权利要求1所述基因比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有早烘病病原菌Septoriasp。

4.一对检测柞树早烘病病原菌Septoriasp的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.2～3所示。

5.权利要求4所述引物在检测柞树早烘病病原菌Septoriasp和/或制备检测柞树早烘病病原菌Septoriasp试剂盒中的应用。

6.一种检测柞树早烘病病原菌Septoriasp的方法，其特征在于，使用权利要求4所述引物，进行PCR检测。

7.一种检测柞树早烘病病原菌Septoriasp的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述引物。

8.权利要求4所述引物或权利要求7所述试剂盒在检测柞树早烘病病原菌Septoriasp中的应用。