CN111139251B - 一种桑树拟干枯病病原菌的线粒体全基因组dna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑树拟干枯病病原菌的线粒体全基因组DNA及其应用。所述桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该线粒体全基因组DNA能够用于检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp或真菌种属分类中；基于该线粒体全基因组DNA，本发明还设计了能够特异性检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的特异性引物组ZHM1F/ZHM1R，并建立了快速、特异性的检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法和检测试剂盒，该方法及试剂盒对于降低和有效控制桑树拟干枯病的发病和危害、提高桑树的产量和桑叶的品质具有重要意义，具有良好的应用前景。

Description

一种桑树拟干枯病病原菌的线粒体全基因组DNA及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域。更具体地，涉及一种桑树拟干枯病病原菌的线粒体全基因组DNA及其应用。

背景技术

线粒体是真菌体内较小的复制转录单位，是研究DNA结构、复制、转录及 DNA传递重组的良好模型。对真菌线粒体全基因组的研究能够为真菌的进化、种群遗传学和生物学提供重要的线索。真菌的线粒体全基因组大小和进化速率介于动物和植物之间，且基因组内很少发生重组。真菌线粒体全基因组除包含位于线粒体内膜上与电子传递和氧化磷酸化有关的14个蛋白编码基因(nadl-6、 nad4L、cob、coxl-3和atp6、atp 8及atp 9)外，还包括编码线粒体16S核糖体小亚基RNA基因(rns)、线粒体23S核糖体大亚基RNA基因(rnL)及翻译必须的多种tRNA基因。真菌线粒体基因大部分是保守的，但基因内含子的数目和分布是多样的，且各基因间的顺序也是可变的。因此，需要利用转录组学的技术获得rRNA的全长序列和线粒体DNA的全长序列，从这两个方面着手，把各基因区域的优缺点整合起来，进行真菌物种的分类和鉴定研究，是现代生物技术发展的必然选择。

桑树拟干枯病(Fusarium sp)分布较广，主茎和枝条均可发病。一般桑树拟干枯病病原菌在病枝干上越冬，来年4～5月份病原菌随风、雨及昆虫传播，不断侵入生长衰弱，幼龄的桑树及虫伤的枝条。桑树拟干枯病病原菌为害枝条时，多半发生在半截枝上，常以冬芽为中心，形成褐色长椭圆形的病斑，病斑湿润时为水肿状，干燥后皱缩，被害皮层易剥离，皮下密生黑色小点。若病斑围绕枝条一圈，枝条即枯死。

目前，桑树拟干枯病在桑园发病面积和危害程度逐年加重，严重影响了桑树的产量和品质，而现有技术中没有关于桑树拟干枯病病原菌的检测方法的报道。因此，亟需建立能够用于快速、特异性的检测桑树拟干枯病病原菌的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有桑树拟干枯病病原菌检测技术的空白，提供一种桑树拟干枯病病原菌的线粒体全基因组DNA及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA。

本发明的第二个目的是提供所述桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA在检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp或在真菌种属分类中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法。

本发明的第四个目的是提供一组检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的引物。

本发明的第五个目的是提供所述引物在检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp和/或制备检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供另一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法。

本发明的第七个目的是提供一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的试剂盒。

本发明的第八个目的是提供所述方法或所述试剂盒在检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA，所述线粒体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明首次获得了桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA 的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，总长度为48305bp，GC含量为32.32％。所述线粒体全基因组DNA包含位于线粒体内膜上与电子传递和氧化磷酸化有关的14 个蛋白编码基因(nadl-6、nad4L、cob、coxl-3和atp6、atp 8及atp 9)外，还包括编码线粒体16S核糖体小亚基RNA基因(rns)、线粒体23S核糖体大亚基RNA 基因(rnL)及翻译必须的多种tRNA基因。

所述桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA在检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp或在真菌种属分类中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法，将待测样本线粒体全基因组DNA的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp。

优选地，所述方法为：以待测样本DNA为模板，进行文库构建、高通量测序和组装，获得完整的线粒体全基因组DNA，然后与上述线粒体全基因组DNA 的核苷酸序列进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp。

具体优选地，所述方法包括以下步骤：

S1.收集桑树拟干枯病病枝；

S2.提取桑树拟干枯病病枝的总DNA；

S3.Illumina DNA文库构建；

S4.Illumina高通量测序；

S5.去除测序数据中桑树基因组序列；

S6.组装微生物基因组序列；

S7.组装完整线粒体全基因组DNA序列；

S8.比对分析线粒体全基因组DNA序列。

步骤S3所述Illumina DNA文库构建的方法为：依照Illumina DNA文库构建流程，将步骤S2所述总DNA构建为片段大小350bp的双末端高通量测序文库。

步骤S8所述比对分析线粒体全基因组DNA序列的方法为：使用序列比对分析软件，将步骤S7所述完整线粒体全基因组DNA序列与桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA序列进行比对。

步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列的方法为：利用比对软件对步骤S4所述高通量测序数据进行数据比对分析；选择比对算法，将所述测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的所述测序数据判定为桑树基因组序列；使用编写的计算机程序从所述测序数据中去除桑树基因组序列。

优选地，所述比对软件为bwa 0.7.17-r1188软件。

优选地，所述比对算法为mem比对算法。

优选地，所述编写的计算机程序为python语言程序。

步骤S6所述组装微生物基因组序列的方法为：使用组装软件对步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列得到的测序数据进行组装。

优选地，所述组装软件为SPAdes v.3.5.0软件。

步骤S7所述组装完整线粒体全基因组DNA序列的方法为：采用SPAdes v.3.5.0软件进行拼接组装。

本发明还提供了一组检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的引物，所述引物能够扩增SEQ ID NO.1所示序列或其片段。

优选地，所述引物为引物组ZHM1F/ZHM1R，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2～3所示：

引物ZHM1F的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：5’-AAAATAGTCACCCTCA-3’；

引物ZHM1R的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：5’-TCAATAATAGCCGTTC-3’。

所述引物在检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp和/或制备检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

基于上述引物，本发明还提供了一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp 的方法，根据所述桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA设计引物，进行PCR扩增。

优选地，所述引物为能够扩增SEQ ID NO.1所示序列或其片段的引物、或引物组ZHM1F/ZHM1R。

优选地，所述判定的方法为：将以上PCR扩增的反应产物进行凝胶电泳，如果出现条带，且条带大小为404bp，则判定待测样本中含有桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp。

优选地，所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq Master Mix 10μL，引物 ZHM1F/ZHM1R各0.5μL(10μM)，Template DNA 1μL，余量ddH₂O补足，共 20μL。

优选地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃5min；94℃30s，47℃30s， 72℃2min，35个循环；72℃5min。

本发明还提供了一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的试剂盒，所述试剂盒包含能够扩增SEQ ID NO.1所示序列或其片段的引物、或引物组 ZHM1F/ZHM1R。

另外，所述方法或所述试剂盒在检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次获得了桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA 的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，总长度为48305bp，GC含量为32.32％，该线粒体全基因组DNA能够用于检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp或真菌种属分类中；

基于该线粒体全基因组DNA，本发明还设计了能够特异性检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的特异性引物组ZHM1F/ZHM1R，并建立了快速、特异性的检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法和检测试剂盒，能够广泛应用于桑园中桑树拟干枯病病原菌的检测和及时防控，对于降低和有效控制桑树拟干枯病的发病和危害、提高桑树的产量和桑叶的品质具有重要意义。

附图说明

图1是基于桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA的特异性检测结果；其中，M：TakaraDL2000 Marker；1：Mucor racemosu(总状毛霉)；2：Actinomucorelegans(雅致放射毛霉)；3：Cladosporium perangustum(细孢枝孢菌)；4：Fusariumoxysporum(尖孢镰刀菌)；5：Auricularia polytricha(毛木耳)；6：Fusarium equiseti(木贼镰刀菌)；7：Trichoderma(木霉菌)；8：Mucor circinelloides(卷枝毛霉)；9：Ralstoniasolanacearum(茄科劳尔氏菌)；10： Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)；11：Klebsiellasp(克雷伯氏菌)；12：空白对照(ddH₂O)；13和14：桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp DNA；15和16：患有桑树拟干枯病的病枝总DNA。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA的获得

1、实验方法

(1)高通量测序

在发病的桑树园随机寻找具有典型桑拟干枯病症状的病枝，收集，将表面用无菌水洗净，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用上海生工真菌基因组DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃；检测合格的DNA样品采用Covaris超声波破碎仪(Covaris，USA) 随机打断成长度为350bp左右的片段,构建小片段基因组DNA文库，文库构建流程参照NEB

Ultra DNA Library Prep Kit for

(NEB,USA)文库构建试剂盒说明书进行。文库构建完成后以qPCR方法和Agilent2100Bioanalyzer (Agilent Technologies,USA)进行质控。对质检合格的DNA文库采用Illumina Hiseq 4000(Illumina,USA)高通量测序平台进行测序，测序策略为PE150(Pair-End 150)，每例样品测序数据量不少于2Gb。

(2)组装微生物基因组序列

使用SPAdes v.3.5.0软件对去除测序数据中桑树基因组序列得到的测序数据进行组装，采用SPAdes v.3.5.0软件进行拼接组装得到完整线粒体全基因组DNA 序列。

线粒体全基因组DNA注释的方法为：采用MITOS和ORF Finder对线粒体全基因组DNA进行初步注释，对注释的初步结果，运用Blastp和Blastn的方法与已报道的近缘物种的线粒体全基因组的编码蛋白和rRNA进行比对，验证结果的准确性并进行修正。tRNA的注释采用ARWEN进行，若出现tRNA异常情况，会再结合tRNAscan-SE 2.0的预测情况再次进行验证，最终舍去长度不合理和结构不完整的tRNA。

2、实验结果

本发明获得的桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，总长度为48305bp，GC含量为32.32％。

实施例2检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法

1、实验方法

(1)高通量测序

在发病的桑树园随机寻找具有典型桑拟干枯病症状的病枝，收集，将表面用无菌水洗净，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总DNA的提取使用上海生工真菌基因组DNA提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总DNA保存于-20℃；检测合格的DNA样品采用Covaris超声波破碎仪(Covaris，USA) 随机打断成长度为350bp左右的片段,构建小片段基因组DNA文库，文库构建流程参照NEB

Ultra DNA Library Prep Kit for

(NEB,USA)文库构建试剂盒说明书进行。文库构建完成后以qPCR方法和Agilent2100Bioanalyzer (Agilent Technologies,USA)进行质控。对质检合格的DNA文库采用Illumina Hiseq 4000(Illumina,USA)高通量测序平台进行测序，测序策略为PE150(Pair-End 150)，每例样品测序数据量不少于2Gb。

(2)组装微生物基因组序列

使用SPAdes v.3.5.0软件对去除测序数据中桑树基因组序列得到的测序数据进行组装，采用SPAdes v.3.5.0软件进行拼接组装得到完整线粒体全基因组DNA 序列。

线粒体全基因组DNA注释的方法为：采用MITOS和ORF Finder对线粒体全基因组DNA进行初步注释，对注释的初步结果，运用Blastp和Blastn的方法与已报道的近缘物种的线粒体全基因组的编码蛋白和rRNA进行比对，验证结果的准确性并进行修正。tRNA的注释采用ARWEN进行，若出现tRNA异常情况，会再结合tRNAscan-SE 2.0的预测情况再次进行验证，最终舍去长度不合理和结构不完整的tRNA。

(3)序列注释和遗传进化分析

根据高通量测序数据组装与实验验证结果，组装得到完整线粒体全基因组 DNA序列，然后与桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA的核苷酸序列(SEQ IDNO.1)进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有桑树拟干枯病病原菌Fusariumsp。

实施例3检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法

1、实验方法

(1)PCR扩增反应

为进一步利用上述桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA 应用于桑树拟干枯病的病原检测和鉴定中，本发明进一步设计了一对特异引物组 ZHM1F/ZHM1R，其核苷酸序列如表1所示；

然后，以感染病害的桑树拟干枯病的总DNA为模板，以其它8种真菌、3 种细菌和ddH₂O为阴性对照，应用上述引物组ZHM1F/ZHM1R进行PCR扩增， PCR扩增反应体系如表2所示，拟扩增的目的片段大小约为400bp。

表1特异引物组ZHM1F/ZHM1R的核苷酸序列

表2 PCR扩增反应体系

(2)PCR扩增反应的条件

验证引物组ZHM1F/ZHM1R特异性的PCR扩增反应的条件为：94℃5min； 94℃30s，47℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5min。

(3)PCR扩增反应产物的检测

PCR反应结束后，分别取4μL PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶(EB染色)进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶电泳，回收大小对应的PCR产物片段。

(4)序列比对

将PCR产物片段进行Sanger测序，然后将测序结果与桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)进行比对，由此确定叶片上是否有桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp，并可由此推测桑树拟干枯病病原菌Fusariumsp是否可能是致病菌。

2、实验结果

基于桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA的特异性检测结果如图1所示，可以看出，只有13～16泳道扩增出了单一明亮的条带，即只有桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp DNA(子实体)和患有桑树拟干枯病的病枝总DNA扩增出目的片段，且大小约为400bp，介于400～450bp之间，而其他8种真菌、3种细菌和ddH₂O的阴性对照均没有扩增出相似大小的片段。

以上结果说明：本发明基于桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA设计的特异引物组ZHM1F/ZHM1R能够特异性的检测出桑树拟干枯病病原菌Fusariumsp，而且检测所用时间短，检测结果精确度高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种桑树拟干枯病病原菌的线粒体全基因组DNA及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatcatat tatcaatagt actagtttta ctttcaaacg ccgtcaatat aagacgagat 60

ttatcaatac tatttaatag aatagcgata ttaatattaa tttattgtat tttacatgat 120

atgtcttctt tatctgttat aactaaaggt gtaggtttac acggtggttt attacttatg 180

acaaatatca cacaaatatt ccatattttt atctttttag ttagtatatt aatattacaa 240

ttaactagtt tttatcctag aaaagtatga gtatcagaat attcttcttt aaaagattta 300

ttgttatata aatttattta ttataatacc aaaataataa ataaaatggg agaacatttt 360

aaaattattg aatatccttt aattatatta tttgtaatta caggtgcagt attattaatg 420

tcaactaacg acttagtatc tattttccta gctatagaat tacaaagtta tggtctttat 480

atattaagta ctatatatag aaattcagaa ctatctacta caggaggttt aatatacttt 540

ttattagggg gattaagctc atgttttatc ttattaggta ctagtttatt atatgctaat 600

tcaggtacta ctaacttaga tggtttatat atcataacta gtataagtga tgtttctaca 660

aatttatgat atacacctta ttatattaat ctttctctag taatttttac aataggattc 720

ttatttaaag taagtgcagc accatttcat ttttgatcac ctgacgtata tgacgctata 780

cctacaatag taactacatt cgtggctata atagccaaaa tttctatatt tatattatta 840

ttacaattag tgtattatac taacagtagt ttttcagaaa tgagttgaac atttatttta 900

ctaataagtt cattattctc attaataata ggaactgtgg taggtttaac tcaatttaga 960

attaaaagat tatttgctta tagtactata tctcacgtag ggtttatact tctagcatta 1020

ggtatatcta gtgttgaatc tactcaagca tttatattct atttaacaca atattctata 1080

agtaatttaa atgcatttgt tatattaata gctataggat tctccttata ttgttatata 1140

agcgaaaaca aagaacacga agaattaatg gacaaaaata attcgcctat acaattagta 1200

actcaattga aaggttattt ttatataaat cctttcttag ctataagttt agctattact 1260

atcttttcat ttgtaggagt tcctccttta ataggattct ttggaaaaca gatggtgtta 1320

agtgcagcct tagataaagg tcttatcttc ttatctttaa tcgcaatatt aactagtgtt 1380

ataggaggag tttattattt aggtataata aaagaaatgt tctttagttt acctgaatat 1440

aaaataaatc cattattaga aaatctagaa ttaaaaggta atgttttaga taataataaa 1500

aaaataatta ataaattaaa ctttaattat aaaaatatag ctatatcaag tcctatttct 1560

tttgtaattt ctataattac acttgttatt ctattatttt tatttatgaa caaagaatgg 1620

ctaagcatgg gtaccatatt ggtacaaatt ttatttaaca attaaatgag tagtgtaact 1680

tttctttttg tttttgttac aattttaaca atagtttttt tacttcttaa tttcatactt 1740

gctcctcata acccatacca agaaaaatat agtatttttg aatgtggttt tcatagtttc 1800

cttggtcaaa atagaactca attcggtgtg aaattcttca tatttgcatt agtttatctt 1860

ttattagatt tagaaatatt agtgatatat ccatatggta taagtgttta tgaaaatgga 1920

atttatggat taatagtagt gctaatcttc ataggtataa tcactgcagg atttgtattt 1980

gaattaggta aaaatgcctt gaaaatagat agtagacaat ccaataatta tttttataaa 2040

tcaaaaaaat ttattaatat gtttactgaa cataagtaaa aattttatta atatgtatag 2100

ctgaaatctt cgaaattagt gccgcctatt cgcgaaatta cggacgaata ggcgctagct 2160

cgtcgctaaa cttctagctt gcgcattact atgaaataca catgcaggaa taagcaagct 2220

cttattcgaa ttagaagcat cccttactac agaacctagt ttctagcttt aatagcctta 2280

ttttattttg tgaaatttta atttctaacc ttatatccat cgtgtacgtt tactttagct 2340

ttaggagagc agtacgtaca tcgtttcttg ctaggaaacc ctggtgaaat tctgttttta 2400

tattgtcaat gattatttaa tttaaaaatt atatatataa ttaataaaat gttagaatca 2460

tcaaaactta ttggagctgg attagcaact ataggtctag ccggagctgg agtaggaata 2520

ggtgtagtgt ttgggtgttt aattataggt gtggctagaa atccttcatt aaaaaatcaa 2580

ttattctcat actctatatt aggatttgct ttctcagaag caactgcctt atttgcttta 2640

atgatggctt tattattatt atatgtggta taataatctt tttattatct tgctaatcct 2700

gctcgctttc aagggagccc ctacagggct gtaagctaaa gctatacttg catataaggc 2760

aaactataag cagcagtatt caggcggctg cgtaaagttt tcgccagaac gaagtaaggc 2820

ttcgccgcgc aagctagaac gaacgcaaac taattatata acaggcggca attctattat 2880

atttatacta caattacatc tggcggtcat ataaaccgcc agctatcagc agtaaaacct 2940

tctgcgtacg aaggctataa attataagct cattgtatac acatataatt agaaattata 3000

tattaaaaat ttatatatga aacacttatt taatacattt attaattttg atgcacctat 3060

gccttgaggt atatatttcc aagacagtgc tactccacaa atggaaggat tagtggaact 3120

tcatgataat attatgtact atttagtttt aattttattt gctgtaggat gaatattatt 3180

ttctataata aaaaattttg catcaactaa aacacaaata tcacataaat acttaaatca 3240

cggtacatta attgaattaa tatgaactat aactcctgca gttatattaa tattaatagc 3300

cttcccttct ttcaaattat tatatttaat ggatgaagtt aatgaccctt ctatgactat 3360

tttagctgaa ggtcaccaat gatattgaag ttaccaatat ccagatttca tagattcaaa 3420

tgaagaattt atagaatttg attcttatat agtaccagat tctgatttag aagatggagg 3480

attaagaatg ttagaagttg ataacagagt aatagttcct gaattaacac atataagatt 3540

tgtaataaca tctggtgatg ttattcattc ttttgcttgt ccatctttag gtataaaatg 3600

tgatgcttac cctggtagat taaaccaagt atccgttttc ataaatagag aaggagtatt 3660

ctatggacaa tgttcagaaa tatgtggaat tcttcacagt tcaatgccta tagttataga 3720

atctgtaaat atagataaat ttgtgcattg actttattca gtttaataac gcttatatag 3780

ggcaggataa agttaaacta ataaattttg tattagtatc ttattttaaa taaaagggat 3840

attagtttaa aggtaaaacg cgatgctacg gacatctgga ttgtggttca agtctgcaat 3900

atccctagta tagttattgg taattgggtt tatcgatagt tatacttata attatgggtt 3960

ggcttatgca tagctagcta agtatgaatg cttctctgcg aagcagaaat aggaatatgg 4020

ctagttgtgc tatattataa gctactatat aggtagtgct tgtaagcaat attgtctccg 4080

gtgctgcttt gcagcctgta tatcctaaaa ggatatatac tagtgcaatg ttcgaacgaa 4140

tggagtatag catgctaggt atcagctagc taaagctcat atttaaggtt agctatgtaa 4200

taaagcttgt caccaccgaa caattagtag ttttagataa aatatgaatt taactttagt 4260

acttttttta ataggaatct tagggtttgt atttaataga aaaaatataa tattaatgct 4320

tatttctata gaaataatgc tattatctat aacattctta atattggtaa gttctgttaa 4380

tatcgatgat ataataggac agacatatgc tatatacatt atagtagttg ctggtgcaga 4440

atctgctatc ggtttagcta ttttagtagc tttttataga ctaagaggaa gtattgcaat 4500

agaatataaa taatgtattt aagtataatt atattacctt tattaggatc tatagtatcc 4560

ggtttttttg gtagaaaagt cggtgttacg ggtagccgtg ttttaggttg tttaagtata 4620

atgacaacta caatattagc tatcactagc ttttttgaag taggatttaa taataatcca 4680

gtttcaataa atttatttaa atgattagat aatgaatcat ttaatatggt atgaaacttc 4740

caatttgata gtttaacagt atcaatgtta atacctgtat taataatcag ttctttagtt 4800

catttttatt caataggata tatgagtcat gatccacaca atcaaagatt ctttagttat 4860

ttaagtttat tcacttttat gatgataata ctagtaactg gtaataatta tttagttatg 4920

ttcgtaggat gagaaggtgt aggtgtttgt tcatatctat tagttagttt ttgattcact 4980

agaatagcgg ctaatcaaag ttctctttca gctttcttaa ctaatagagt tggagatgca 5040

ttcttaatga taggtatgtt tatcttatta tgaactttag gtaatctaga ttatagtact 5100

gtattctcat tagctcctta tattaatgaa aatattacta caattgtagg tatatgttta 5160

ttgataggtg ctatggctaa aagttctcaa gtaggtttac atatatgatt acctatggct 5220

atggagggtc ctactcctgt gtcagcttta atacatgctg caacaatggt taccgcaggg 5280

gtgtatttat taatacgttc atctccttta attgaatata gtacagctgt attattaata 5340

tgtttatgac taggtgcagt tacaactgta tttagttctc ttataggatt atttcaacaa 5400

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acatacatga agggtcctag ctggctattt ctgctactag gcgtaaaacg aataggagct 17580

tctatttcat agcttcgttc tctagctacg ctatcgcaca ggagtagagg ctataccttt 17640

agcataaagt tatgctgctt cgtatagctc ataattatta attaaaaata ttagttaata 17700

acttttaagt gaaaattttg ttcacaaaaa gtactataat tatttcctaa ttttgtcttt 17760

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tattagaatt ttaacacgca tacaaaatta tttacatata ggtagaatta gagcagataa 19380

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acatattaat ggattaatca gacttaaagt gccaagtttt aaagaagctt gtgctttata 19500

caatatagat tatattgaag ctgattataa tataaaatta tatgatcctt attatgcagg 19560

tttaatagat actgacggtt ctatagtatt taattatgct ggaaatagaa tagaatgtaa 19620

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taaaatatac tcagatttca tgattaattg aattaaatat aataaccctt tatgatataa 19980

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attttatatt attaacaaca ataataatgc ctatagcatt attatcaaat tgagactcta 25200

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aggtagacat aactcaatag gtagagtggt tatttgtggt gtaacttgtt ctcggttcga 48000

gcccgagtgt ttaccctgct atattttata tccttttaga gattccaatc cgaacttcgt 48060

tcggaattag caagctatgt atgaatgcta ctatttcata agcgtagctc gccagctaaa 48120

agctaggatg catattcttc gaggcgtagc cgccctgcat aatatgcttt attaagccta 48180

agtagtttaa acggttaaaa ctctaatttc atacgttagt aatgagaatt cgattttctc 48240

ctaaggcttg cctaatgatg gccatagcat aatagtcgta ggactatatt tttataaaat 48300

tacac 48305

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaatagtca ccctca 16

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaataatag ccgttc 16

Claims (7)

1.一种桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA在检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp中的应用，其特征在于，所述线粒体全基因组DNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法，其特征在于，将待测样本线粒体全基因组DNA的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列进行比对，根据比对结果判断待测样本中是否含有桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp。

3.一组检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的引物，其特征在于，所述引物为引物组ZHM1F/ZHM1R，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～3所示。

4.权利要求3所述引物在检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp和/或制备检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的试剂盒中的应用。

5.一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的方法，其特征在于，根据权利要求1中所述桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的线粒体全基因组DNA设计引物，进行PCR扩增，所述引物为权利要求3所述引物。

6.一种检测桑树拟干枯病病原菌Fusarium sp的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述引物。

7.权利要求5所述方法或权利要求6所述试剂盒在检测桑树拟干枯病病原菌Fusariumsp中的应用。

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