CN110699475A - 薄壳山核桃黑斑病菌的padlock探针及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测薄壳山核桃黑斑病菌(Pestalotiopsis microspora)的padlock探针及其检测方法，属于生物技术领域。用于检测薄壳山核桃黑斑病菌的padlock探针P‑Pm，其特征在于，所述探针P‑Pm的序列为：P‑Pm:5’‑GCGCATGGAAATGTCCAGAGTGCAGGGGCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTacgtcgtattaggtagtcacTCTCACAGAACCAG‑3’。以此探针为基础的检测试剂盒具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为薄壳山核桃黑斑病菌检测提供了快速、灵敏、特异的技术方法。

Description

薄壳山核桃黑斑病菌的padlock探针及其检测方法

技术领域

本发明涉及检测薄壳山核桃黑斑病菌(Pestalotiopsis microspora) 的padlock探针及其检测方法，属于生物技术领域。适用于口岸检验检疫、农林业生产、植物保护等部门使用。

背景技术

薄壳山核桃（Carya illinoinensis ）也称美国山核桃，为胡桃科山核桃属落叶大乔木，学名长山核桃，喜光、喜温暖湿润气候，适应性强，丘陵山区、沿海滩涂、低洼湿地均能生长，且果材兼用，是平原绿化的优选树种（彭方仁等，2012；巨云为等，2014；杨建华等，2007；田爱梅等，2002）。薄壳山核桃是世界上著名的干果之一，作为一种营养保健食品越来越受到大众的喜爱。我国从20世纪初开始引种薄壳山核桃，目前主要分布在浙江、江苏，云南等地。

薄壳山核桃黑斑病主要为害果实、叶片、嫩枝、叶柄、 花序，病害一旦发生，果实产量可达10%-40%，严重影响薄壳山核桃果实的产量和品质。目前，该病害已在我国浙江，江苏等地发生（戚钱钱等，2016）。薄壳山核桃黑斑病病原菌为小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora(Speg.)。目前关于小孢拟盘多毛孢的鉴定方法，主要通过病原菌的培养和形态特征及其 ITS 序列测序等方法判断。传统的病原菌检疫检测技术主要是以病原生物形态特征为主的传统检测方法。这种方法耗时较长而且效率非常低，通常需要将疑似携带病原菌的材料或发病植物组织进行分离培养纯化，然后将纯培养的病原生物回接到寄生植物上，进一步在室内通过形态学和生理学性状进行病原物鉴定，这种方法不但耗时较长，检出率不高，此外鉴定时还受到其他因子的干扰，如专性寄生的病原菌无法培养，近似种依据形态与生物学特征难以鉴别等。因此传统检测方法无法满足口岸检疫、田间检疫和健康种苗生产的需要。

为了克服以上问题，近年来各国均致力于分子检测技术的研究，并取得了很大的进展。Padlock探针(PLPs)的发明为植物病原菌的分子检测提供了一条新的思路。Padlock探针是一条长度为100bp左右的单核苷酸探针，包括磷酸化的5’端和羟基化的3’端，这两端能够识别特定目标物的DNA序列(Nilsson et al., 1994)，我们通常称之为T1端和T2端。在T1端和T2之间，存在着一段通用序列和一段特异序列，我们称之为P1、P2端和ZipCode。在进行反应时，首先将padlock探针和要检测的目标DNA进行连接，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的T1端和T2端通过和特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’端和3’端连成环状。由于TaqDNA连接酶的特性，只有DNA序列和探针的T1端和T2端完全互补时，探针才能形成环状，否则，探针以线性存在。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针，然后采用所有探针的通用端T1端和T2端的引物对切除后的产物进行滚环扩增。然后将扩增后的产物与固定在膜上或者Microarray上的与ZipCode序列互补的核酸序列进行杂交(Shoemaker et al., 1996)。通过膜上的地高辛标记信号或者Microarray上的荧光来判断检测样品中是否有特定的病原物。由于padlock探针可与Macroarray或者Microarray技术相结合，因此能够在检测的过程中实现高通量(Hardenbol et al., 2003)。目前，padlock探针独特的设计，仅一个碱基的差别就可以用于区分目的菌和其近似种。因此，因该技术的特异性强、灵敏度高等特点已用于多种病原菌的分子检测(Baner J et al., 2007； Jobset al., 2013；Kuroda et al., 2014; Liu et al., 2013; Tian et al., 2014;Velayos et al., 2018;)和单核苷酸突变检测当中(Baner J et al., 2003)。然而，目前缺少Padlock探针的方法用于薄壳山核桃黑斑病菌的检测。此项发明满足了这些需求。

小孢拟盘多毛孢 (P. microspore (Speg.)可以引起多种植物的叶斑病或黑斑病。已报道的寄主包括广东的土蜜树（戴芳澜，1979）和菠萝（向梅梅和戚佩坤，1988）、云南的土蜜藤（戴芳澜，1979），日本的金丝桃灌木（Zhang et al., 2010）以及浙江的杨树（任海英等，2016）.此外，任海英等（2016）等还利用常规PCR 和实时荧光定量PCR技术建立了杨梅凋萎病菌(Pestalotiopsis versicolor和P.microspora)的检测方法，该方法可快速灵敏的检测分离于杨树的P.microspora菌株。然而，该方法在检测时未使用分离于薄壳山核桃黑斑病样品的菌株，所以，无法判断该方法是否适用于薄壳山核桃黑斑病菌的检测。此项发明亦满足了这些需求。

参考文献。

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发明内容

技术问题。

本发明的目的是解决现有技术中薄壳山核桃黑斑病菌的生物学检测方法所需周期长、鉴定困难等问题，提供薄壳山核桃黑斑病菌的检测方法，对薄壳山核桃黑斑病菌进行Padlock探针检测，准确性高、周期短、灵敏性好。

技术方案。

我们利用生物信息学技术中的Blast比对方法将薄壳山核桃黑斑病菌与其他近似菌进行比对发现，薄壳山核桃黑斑病菌的管家基因组蛋白乙酰转移酶基因（histoneacetyltransferase, mst2）序列存在特异性片段。于是我们选择mst2基因作为靶标基因设计探针，采用padlock探针技术对携带薄壳山核桃黑斑病菌的山核桃果实进行检测，可以从表观健康的山核桃果实中快速准确的鉴定出携带病菌的果实。

用于检测薄壳山核桃黑斑病菌的padlock探针序列：

P-Pm:5’-GCGCATGGAAATGTCCAGAGTGCAGGGGCTCGACCGTTAGCAGC

ATGACCGAGATGTACCGCTATCGTacgtcgtattaggtagtcacTCTCACAGAACCAG -3’

通过反应条件的优化和筛选，探针最终的浓度为100pm。

有益效果 本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在。

（1）实用性好：直接从病组织中检测薄壳山核桃黑斑病菌具重要的实际应用价值。薄壳山核桃黑斑病菌随贸易往来最可能的传播途径是随植物材料（如种苗、接穗等）传播。但是目前的检测方法需要对该病原菌进行分离纯化，需要几天的时间；且分离过程中很容易受一些腐生菌的干扰，无法满足实际需要。为了使我们的检疫方法具有实际的应用价值，我们采取从病组织快速提取DNA后，直接进行检测，可在4个小时内完成对多个待测样本的薄壳山核桃黑斑病菌检测，且检测结果灵敏可靠。因此本方法大大提高了检测的效率。

（2）准确性高：由于传统薄壳山核桃黑斑病菌的检测技术只是根据分离菌的生理生化特征来确定对象，无法区分相近种，从而导致准确性不高；而本发明根据薄壳山核桃黑斑病菌的管家基因组蛋白乙酰转移酶基因（histone acetyltransferase, mst2）序列，利用Bioedit软件对该序列与其它相似种的mst2基因序列进行比较，选择薄壳山核桃黑斑病菌特有的一段保守序列做特异引物，能根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的鉴定和检测提供准确的靶标位点。经过与薄壳山核桃黑斑病菌以及其它不同植物病原菌的比较，该引物的准确率为100%。

（3）灵敏度高：我们在该靶标基因也设计的常规PCR检测引物（上游引物Mst2-F1:5'- AGGCGCATGGAAATGTCCAG -3'，下游引物Mst2-R1: 5'-CGTTTCGAGAACTTTT CACA-3'），并优化了反应条件，通过比较发现，padlock探针检测方法的灵敏度为最低为50个/ul孢子或200 pg/ul DNA，高于常规的PCR方法。

（四）说明书附图。

图1A Padlock探针P-Pm对薄壳山核桃黑斑病菌检测的特异性验证。

图1B 常规PCR对薄壳山核桃黑斑病菌的特异性验证。

1-16：2016-2017分离于我国不同核桃产区的小孢拟盘多毛孢菌株(Pestalotiopsis micospora) 、17：异色拟盘多毛孢 (P. versicolor) 、18：广布拟盘多毛孢(P.dissmeninta) 、19：欧克安拟盘多毛孢(P.oxyanthi) 、20：韦司梅拟盘多毛孢(P.vismiae) 、21：长毛拟盘多毛孢(P.longisetula) 、22：棒形拟盘多毛孢(P.clavispora) 、23：甘薯拟盘多毛孢(P.batatae) 、24：马可罗拟盘多毛孢(P.macrochaeta) 、25：疏毛拟盘多毛孢(P.pauciseta)、26：茶拟盘多毛孢(P. theae)、27：卡斯特尼拟盘多毛孢(P.karstenii)、28：杭州拟盘多毛孢(P.hangzhougensis)、29：二色拟盘多毛孢( Pestalotiopsis bicolor ) 、30：枯斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis funerea)、31： 核桃圆黑盘孢(Melanconium juglandinum) 、32： 聚生小穴壳菌(Dothiorella gregaria) 、33： 核桃腐烂病菌(Crytospora juglandis) 、34： 核桃褐斑病菌(Marssonina juglandis) 、35： 葡萄座腔菌(Botryosphoeria dothidea) 、36： 核桃炭疽病菌(Gloeosporium fructigenum) 、37： 核桃灰斑病菌(Phyllosticta juglandi) 、38： 山核桃疮痂病菌(Fusicladium effusum) 、 39： 互隔交链孢菌(Alternaria alternata) 、 40：称茂物隔担耳菌 (Septobasidium tanakae) 、 41： 核桃黄单胞菌(Xanthomonas jugladis) 、 42： 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 、 43：炭团菌 (Hypoxylon sp. )、 44： 枝孢菌(Cladosporium sp. ) 、 45：豌豆脚腐病菌 (Phoma pinodella) 、 46： 向日葵拟茎点霉(Phomopsis helianthi) 、 47： 菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina) 、48：ddH₂O 。

图2A Padlock探针P-Pm对薄壳山核桃黑斑病菌基因组DNA检测的灵敏度。检测体系以薄壳山核桃黑斑病菌基因组DNA作为模板, 1-7代表的检测体系中所用模板的DNA浓度依次为：2 pg/uL，20 pg/uL，200 pg/uL，2 ng/uL, 20 ng/uL，200 ng/uL 和2 ug/uL。

图2B Padlock探针P-Pm对薄壳山核桃黑斑病菌孢子悬浮液检测的灵敏度。检测体系以薄壳山核桃黑斑病菌菌悬液作为模板，1-7代表的检测体系所用模板的的孢子菌悬液浓度依次为：0个/uL，20个/uL，50个/uL，100个/uL，500个/uL，1000个/uL和2000个/uL。

图2C利用引物Mst2-F1/R1 对薄壳山核桃黑斑病菌基因组DNA常规PCR扩增的灵敏度。M为DNA Maker DL2000，PCR反应以薄壳山核桃黑斑病菌DNA作为模板,1-7代表的检测体系中所用模板的DNA浓度依次为：2 pg/uL，20 pg/uL，200 pg/uL，2 ng/uL, 20 ng/uL，200ng/uL 和2 ug/uL，NC: ddH₂O。

图2D利用引物Mst2-F1/R1 对薄壳山核桃黑斑病菌孢子悬浮液常规PCR扩增的灵敏度。M为DNA Maker DL2000，padlock探针P-Pm和PCR反应以薄壳山核桃黑斑病菌菌悬液作为模板，1-7代表的检测体系所用模板的的孢子菌悬液浓度依次为：0个/uL，20个/uL，50个/uL，100个/uL，500个/uL，1000个/uL和2000个/uL。

图3A 利用Padlock探针P-Pm对实际样品检测结果。NC, 阴性对照ddH₂O; PC, 模板为薄壳山核桃黑斑病菌01; 1-11, 模板为11份来自国内不同地区的山核桃样品。

图3B 利用引物Mst2-F1/R1对实际样品常规PCR的检测结果。NC, 阴性对照ddH₂O;PC, 模板为薄壳山核桃黑斑病菌01; 1-11, 模板为11份来自国内不同地区的山核桃样品；M为DNA Maker DL2000。

（五）具体实施方式。

（1）样品制备。

纯菌的基因组DNA: 基因组 DNA 均由 OMEGA 公司的真菌基因组 DNA 小量制备试剂盒提取，具体步骤详见说明书。提取后将浓度定为2 ug/ uL ，进行特异性检测。倍比稀释为2 pg/uL，20 pg/uL，200 pg/uL，2 ng/uL, 20 ng/uL，200 ng/uL 和2 ug/ uL，进行灵敏度验证。

孢子悬浮液：将诱导产孢后的孢子器悬浮于无菌水中，采用血球计数板对孢子进行计数。将孢子悬浮液进行倍比稀释，得到 0个/uL，20个/uL，50个/uL，100个/uL，500个/uL，1000个/uL和2000个/uL浓度，分别作为检测模板。

实际样品检测：本实验选取了11份来自国内不同地区的山核桃样品进行检测。适量选取一段核桃组织（1-2 g），参照Wang 等（1993）（具体见参考文献）的方法，快速提取基因组DNA。具体方法为：每克组织加入100 µl 0.5 M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的EP管中，12000 rpm离心5 min，取5 µl上清液加入495 µl 0.1 M Tris (pH 8.0)，混匀后取1 µl作为检测模板。

（2）常规PCR检测结果。

25 µl检测体系为：分别选取1）中制备的样品1 µl作为检测的模板，12.5 µl TaqPCR MasterMix（TakaRa, 货号为DN3001），0.3 µl引物Mst2-F1（浓度20 uM），0.3 µl引物Mst2- R1（浓度20 uM），10.9 µl ddH₂O。反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃5分钟。产物取8 µl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果发现，引物Mst2-F1/ R1能够从16个于2016-2017年分离于我国不同核桃产区的小孢拟盘多毛孢菌株的基因组DNA中扩增出一条约475bp大小的目的条带，其他参试菌株菌和阴性对照（ddH₂O）一样，无条带（图1B）。常规PCR检测的灵敏度为最低为50个/ul孢子悬浮液或2 ng/ul 基因组DNA（图2C, D）。在对11份来自国内不同地区的山核桃样品进行检测时，常规PCR方法可以检测出4个阳性样品，分别为样品2、5、7和9（图3B）。

（3）Padlock探针P-Pm检测结果。

3.1探针连接。

连接反应液包括：20mM Tris-HCL, pH 9.0, 25 mM KCH₃COO, 10 mM Mg(CH₃COO)₂, 10 mM DTT, 1 mM NAD, 0.1% Triton X-100, 2.4 U Taq DNA 连接酶，1μl模板，100pm探针P-Pm。连接的反应程序为：95℃预变性5分钟；然后进入循环，95℃变性30秒，65℃连接5分钟，反应共进行20个循环；然后95℃灭活5分钟。在连接后的产物中加入2个单位的核酸外切酶I和2个单位的核酸外切酶III，37℃反应0.5 h，然后将反应后的产物95℃灭活5 min。

采用引物P1-F (5’-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3’), P2-R (5’-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3’)对连接产物进行PCR扩增，反应液包括：0.5 µM P1-F和P2-R，4种dNTP各50 µM，2.5 µl 10×PCR反应缓冲液，2 mM Mg²⁺，2.5 µl 1% BSA，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，3µl 经核酸外切酶处理后的连接产物。反应程序为：94℃预变性5 min；然后进入循环，94℃变性30 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。

3.2 Macroarray多重检测。为了实现多个样品的高通量检测，本研究将PLP结合正向斑点杂交检测薄壳山核桃黑斑病菌。正向斑点杂交方法主要参照Saiki等（Saiki et al., 1989）。 主要步骤为：取1 µL的 2) 中的PCR扩增产物点在尼龙膜（Hybond-N+；Amersham）上，紫外交联30 s，然后用2 × SSC+1 % SDS室温下浸泡2 min，将尼龙膜自然晾干。将地高辛标记的cZipcode探针（GTGACTACCTAATACGACGT）加入杂交液中，42°C杂交4 h。杂交结束后，用2 ×SSC+1% SDS洗液室温振荡洗涤尼龙膜2次，每次5 min，然后利用0.5 ×SSC+0.1% SDS洗液68°C洗涤2次，每次15 min。显色前将尼龙膜置于马来酸缓冲液中室温浸泡2 min。然后按照试剂盒（Roche Applied Science）说明书进行显色。

3.3 检测结果。

结果发现，Padlock探针P-Pm能够从16个于2016-2017年分离于我国不同核桃产区的小孢拟盘多毛孢菌株的基因组DNA中检测出信号，其他参试菌株菌和阴性对照（ddH₂O）一样，无信号（图1A）。Padlock探针P-Pm检测的灵敏度为最低为50个/ul孢子悬浮液或200 pg/ul基因组DNA（图2A, B）。与常规PCR相比，Padlock探针P-Pm检测基因组DNA的灵敏度更高。此外，在进行50个/ul孢子悬浮液检测时，常规PCR结果肉眼观察十分费力，容易出现误判。在对11份来自国内不同地区的山核桃样品进行检测时，Padlock探针P-Pm可以检测出7个阳性样品，分别为样品2、3、4、5、6、7和9（图3A），同时，我们对这些阳性样品进行病原菌的分离得到纯培养物后经测序证明Padlock探针P-Pm检测结果是正确的（具体实验数据未列出）。上述结果说明，Padlock探针P-Pm检测的灵敏度高于常规PCR方法。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 薄壳山核桃黑斑病菌的padlock探针及其检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 102

<212> DNA

<213> 小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicospora)

<400> 2

gcgcatggaa atgtccagag tgcaggggct cgaccgttag cagcatgacc gagatgtacc 60

gctatcgtac gtcgtattag gtagtcactc tcacagaacc ag 102

Claims (2)

1.用于检测薄壳山核桃黑斑病菌的padlock探针P-Pm，其特征在于，所述探针P-Pm的序列为：

P-Pm:5’-GCGCATGGAAATGTCCAGAGTGCAGGGGCTCGACCGTTAGCAGCATG

ACCGAGATGTACCGCTATCGTACGTCGTATTAGGTAGTCACTCTCACAGAACCAG-3’

2.权利要求1的探针结合Macroarray技术对薄壳山核桃黑斑病菌进行检测的方法，其检测步骤为：

（1）探针的连接与外切酶处理，首先将padlock探针和待检测的目标进行杂交，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’末端和3’末端连成环状。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针；

（2）探针的扩增，采用引物对步骤(1)中生成的连接产物进行扩增；所述的引物为P1-F：5’-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3’ , P2-R：5’-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3’；

（3）Macroarray多重检测，将步骤(2)扩增后的产物点在尼龙膜上，与经地高辛标记的cZipcode探针进行杂交。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中哪些含有病原物，所述的cZipcode探针为GTGACTACCTAATACGACGT。

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