JP2018522559A - 新規な微生物および農業におけるそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
固有の配列の同定
特に有益な植物コロニー形成特性を有することが判明した継代UAP5541由来のGd株であるIMI504853を単離し、完全ゲノム配列決定した。標準的な方法を用いて、基準株の公的に入手可能なゲノム(PAL5;JGIによる配列決定、米国(Genbank配列登録CP001189))との比較を行った。
PCR検証
ゲノムの解析で同定された配列に基づいて、25種のプライマーセットの組を設計した。IMI504853およびPAL5のゲノムDNAを用いて従来のPCR反応を実施することで、これらの25個のプライマーセット(20個は系統特異的に設計され、5個は種特異的に設計された)の特異性を最初に試験した。IMI504853の結果は図1に示される。結果は、3つの異なるコレクション(ATCC49037、DSM5601、およびLMG7603)から得られたPAL5由来の16個の株特異的プライマーセットがIMI504853を描写することを示した。しかし、4つの推定上の株特異的プライマーセットは、少なくとも1つのPAL5と交差反応し、したがって株特異的研究から除去された。
LAMPアッセイ
配列番号6、7、および9の領域を増幅するように一連のLAMPプライマーを設計し、下の表4に次のように示す。
LAMPを用いた植物サンプル上でのGdの検出
汚染された種子から迅速に抽出されたDNA上でプライマーを確認するために一連の実験を設定し、トマトおよび小麦の2つの植物種の種子の表面にGd DNAをスパイクした。次に、鋼製ビーズおよびTE緩衝液を含有するプラスチック管にサンプルを入れて2分間激しく振盪する、2分間DNA抽出技術でサンプルを処理した。次に、配列番号52〜57を含んでなるプライマーセットを使用して、2マイクロリットルの溶液を実施例4に記載されるようなLAMP反応に入れて、これらのサンプルからのGd DNAの増幅を試験した。
QPCR測定
一連のQPCR反応をGd(IMI504853)由来の既知量のDNAを含んでなるサンプル上で実施し、トウモロコシ、大麦、および小麦ゲノムDNAを含む一連の作物種由来のサンプル上でも実施した。
プラスミド検出
Qiagenミニプレップキット(カタログ番号69104)を用いて、Gd(IMI504853)からのプラスミドDNA抽出を実施した。5mlおよび10mlの48時間細菌培養物を使用した低コピー数プラスミド抽出プロトコルが続いた。抽出したプラスミドは、1kbのハイラダープラスが側面に位置する1%アガロースゲル上で泳動し(図7)、Bio−rad ChemiDoc(商標)を用いて画像化した。
IMI504853の活性の例証
小麦(栽培種品Mulika)用いた圃場試験を設計し、バイオ肥料としてのGd(IMI504853)を試験した。Gd処理および対照(未処理)の2つの試験区にそれぞれ栽植した。発芽後、成長10〜12日目の幼若小麦苗を試料採取し、DNA配列番号7に相当するプライマーG(配列番号26および27)を使用して、Gd存在について試験した。それぞれの陰性および陽性対照と共に1%アガロースゲル上でPCRを分離すると、Gdの存在が検出され(図9)、実環境下において、設計されたキットが良好に機能することが確認された。
IMI504853の使用の収穫量利益
未処理のおよび約105〜107cfu/mlの濃度のIMI504853を含んでなる配合物で処理された茎葉飼料トウモロコシ種子を2つの異なる場所に播種し、それぞれの特定の品種、地域、および土壌窒素利用可能性について、0〜175Kg/haの範囲で、推奨される窒素肥料の割合を変えて施肥した。収穫量の結果は、収穫量のペナルティを受けない、40〜95%の窒素肥料の全体的な潜在的減少を示した。Nレベル全体にわたる平均収穫量利益は、7%〜21%の収穫量の増加をもたらした。したがって、完全推奨N肥料率では、IMI504853処理作物は、トウモロコシにおいて1トン/haまでの収穫量利益を提供し得る。
Claims (18)
- 配列番号1〜10またはその変種もしくはパラログから選択される少なくとも1つの核酸配列の存在および/またはサイズが約17566bpの単一のプラスミドの存在によって特徴付けられる、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)(Gd)の株。
- 配列番号1〜10の少なくとも1つの核酸によって特徴付けられる、請求項1に記載の株。
- 配列番号1〜10の少なくとも3つの異なる核酸配列によって特徴付けられる、請求項1または2に記載の株。
- 列番号1〜10の少なくとも5つの異なる核酸配列によって特徴付けられる、請求項3に記載の株。
- 列番号1〜10の少なくとも8つの異なる核酸配列によって特徴付けられる、請求項4に記載の株。
- 配列番号1〜10の全ての核酸配列の存在によって特徴付けられる、請求項5に記載の株。
- サイズが約17566bpの単一のプラスミドの存在によって特徴付けられる、請求項1に記載の株。
- 前記プラスミドが制限酵素EcoRIによって2つの断片に制限され、前記断片が約12および5.6kbのサイズである、請求項8に記載の株。
- 前記プラスミドが配列番号65、配列番号66、配列番号67および/または配列番号68を欠く、請求項7または8に記載の株。
- IMI504853である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の株。
- 農業上許容される担体と組み合わされて請求項1〜10のいずれか一項に記載の株を含んでなる、農業用組成物。
- 種子コーティングを含んでなる、請求項11に記載の農業用組成物。
- 植物の窒素固定能を高める方法であって、請求項1〜10のいずれか一項に記載のGdの株、請求項11または12に記載の組成物を、前記Gdが植物にコロニー形成するように前記植物またはその環境に投与するステップを含んでなる方法。
- 前記株が前記植物の成長培地、種子の表面、または前記植物の傷に投与される、請求項13に記載の方法。
- 種子であって、その上にコーティングを有し、前記コーティングが請求項1〜10のいずれか一項に記載のGdの株を含んでなる、種子。
- 植物または種子であって、その中にコロニー形成した請求項1〜10のいずれか一項に記載のGdの株を有する、植物または種子。
- 請求項16に記載の植物または種子の種子または子孫であって、前記種子中において細胞内に存在する請求項1〜10のいずれか一項に記載のGdの株を有する、種子または子孫。
- 植物性産物を生産する方法であって、請求項16に記載の植物を栽培し、かつそれから前記産物を得るステップを含んでなる方法。
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