KR101291669B1

KR101291669B1 - 미코박테리아―유래된 ｄｎａ 오류 복구 뉴클레오타이드 서열 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101291669B1
Application number: KR1020110043380A
Authority: KR
Inventors: 김범준; 김병준
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2013-08-01
Also published as: KR20120125753A; US20120309000A1

Abstract

본 발명은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 미코박테리아(mycobacteria)-유래된 DNA 오류 복구(mismatch repair) DNA 핵산분자, 이의 유전자 발현 조절서열, 그리고, (ⅰ) 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅱ) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 미코박테리아-유래된 MutS4A 및 MutS4B으로 DNA 오류 복구능을 가지고, 상기 서열로 형질전환된 미코박테리아는 UV 및 대식세포에 대한 저항성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 재조합 벡터는 유전자 기능 연구(예컨대, DNA 오류 복구 시스템)에 중요할 뿐 아니라, UV 및 대식세포에 대한 저항성을 높이는 수단으로서 이용될 수 있다.

Description

미코박테리아―유래된 ＤＮＡ 오류 복구 뉴클레오타이드 서열 및 이의 용도{Mycobacteria-Derived DNA Mismatch Repair Nucleotide Sequences and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 미코박테리아-유래된 DNA 오류 복구 뉴클레오타이드 서열 및 이의 용도에 관한 것이다.

DNA가 복제되는 과정에서 DNA 폴리머라제의 실수와 환경적인 요인 등으로 인해 잘못된 복제물을 만들게 되는데 이를 수리하여 복제 효율을 50에서 1,000배 향상시켜 주는 시스템이 DNA 오류 복구(DNA mismatch repair, MMR) 시스템이다[1, 2]. 특히, MMR 시스템의 기능은 대장균에서 많은 연구가 진행되었다. MutS 호모다이머 단백질이 잘못 복제된 DNA 가닥과 결합을 하여 MutS-DNA 복합체를 형성한 후, ATP-의존적으로 MutL 호모다이머 단백질과 결합한다. 이들 복합체는 엔도뉴클레아제인 MutH를 활성화시켜 잘못된 뉴클레오타이드를 잘라내고 옳은 뉴클레오타이드를 삽입하는 과정을 개시한다[1, 2].

대장균 MutS 유전자의 상동체들(homologs)은 많은 박테리아 및 아케아, 심지어 진핵생물에서도 발견되어 왔다. 박테리아나 아케아에서는 MutS1에서 MutS5까지의 상동체들이 존재하고, 진핵생물에서는 MSH1(MutS Homolog 1)에서 MSH7까지 존재한다고 알려져 있다[3].

미코박테리아는 절대 병원성균인 결핵균 군과 환경에서 흔히 검출되는 기회 감염 병원성균인 비결핵항산성균으로 크게 나뉠 수 있다. 이들은 외부 유전자 전달(lateral gene transfer, LGT)보다는 주로 유전자 재배열(gene rearrangement)이나 점 돌연변이를 통해 변이를 일으키는 고 클로날 파퓰레이션(highly clonal population)이며, 결핵균의 경우 염색체 돌연변이에 의해서만 항균제 저항성을 갖는 것으로 알려져 있다[4].

이러한 이유는 아마도 미코박테리아 속 균 종들이 MMR 시스템을 가지고 있지 않아 나타나는 현상이라고 사료된다. MMR 시스템은 중복(duplication)과 같은 유전적 돌연변이의 속도를 낮춰주고, 재조합 이벤트로 얻어진 헤테로듀플렉스 DNA 중간산물(heteroduplex DNA intermediates)을 바로 잡아 주는 역할을 한다[5, 6]. 따라서, MMR 시스템의 부재로 인해 외부 유전자 전달과 같은 재조합 이벤트의 기회가 줄어들고, 그 대신 유전자 중복이나 상동체 형성(paralogue formation)과 같은 유전적 돌연변이가 미코박테리아 균속의 주요한 변이의 원동력이 된다.

신종 미코박테리아에서 발견된 DNA 오류 복구 유전자는 대장균의 MutS와 상동성이 있는 상동체들 중 MutS4 형태의 것이다. MutS4 유전자는 MutS4A와 MutS4B의 두 유전자를 포함한다. 이들 유전자 염기서열의 가장 큰 특징은 MutS4A의 종결코돈이 MutS4B의 개시 코돈과 맞물려 존재한다는 점이다[3]. 이러한 구조는 다른 박테리아나 아케아에서도 보존되어 있는데 이는 두 개의 MutS4 유전자가 하나의 계통에서 직렬 중복 변이(tandem duplication)를 통해 형성되었다가, 수평적 유전자 전달(horizontal gene transfer)에 의해 다른 박테리아 혹은 아케아로 이동한 것으로 판단된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 미코박테리아에서 DNA 오류 복구 시스템을 규명하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 환자 검체 분리 미코박테리아(예컨대, 05-1390)에서 다른 종의 DNA 오류 복구 단백질인 MutS와 높은 상동성을 가지는 2개의 신규한 유전자(MutS4A 및 MutS4B)를 동정하고, 상기 유전자가 형질전환된 미코박테리아(예컨대, Mycobacterium smegmatis)에서 UV 및 대식세포에 대한 저항성이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 미코박테리아(mycobacteria)-유래된 DNA 오류 복구(mismatch repair) DNA 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 UV에 대한 저항성을 부여하는 유전자 발현 조절서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 비결핵항상성균(mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)의 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 비결핵항상성균(mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)-유발 질환 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 미코박테리아(mycobacteria)-유래된 DNA 오류 복구(mismatch repair) DNA 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터로 이루어진 UV에 대한 저항성을 부여하는 유전자 서열을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅱ) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명자들은 미코박테리아에서 DNA 오류 복구 시스템을 규명하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 환자 검체 분리 미코박테리아(예컨대, 05-1390)에서 다른 종의 DNA 오류 복구 단백질인 MutS와 높은 상동성을 가지는 2개의 신규한 유전자(MutS4A 및 MutS4B)를 동정하고, 상기 유전자가 형질전환된 미코박테리아(예컨대, Mycobacterium smegmatis)에서 UV 및 대식세포에 대한 저항성이 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 미코박테리아-유래된 신규한 DNA 오류 복구 유전자를 동정하고 이를 미코박테리아 염색체 내로 삽입시킨 형질전환 미코박테리아 균주의 표현형 규명함으로써 이들의 기능을 조사하였다.

미코박테리움(Mycobacterium) 속에는 결핵, 우형결핵, 나병과 같이 사람과 동물에 심각한 질병을 일으키는 균주(species) 뿐 아니라, 기회감염균으로 일컬어지는 균주, 그리고 자연환경에서 볼 수 있는 사물기생 균주(saprophytic species) 등 현재까지 약 150여종이 알려져 있으며(http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html), 그 중 인체질환과 관련된 것이 25여종에 달한다. 이들 중 게놈 프로젝트가 완료된 것은 17종이다.

본 발명자들은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 미코박테리아(mycobacteria)-유래된 DNA 오류 복구(mismatch repair) DNA 핵산분자를 최초로 동정하였으며, 상기 핵산분자를 이용하여 비결핵항산성균을 감별할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 DNA 핵산분자는 DNA 오류 복구 기능을 가지는 DNA 핵산분자로, 서열 상동성 분석에 기초하여 MutS4A 및 MutS4B로 분류되었다(참고: 도 1). 본 발명의 DNA 핵산분자가 인코딩하는 아미노산 서열에 기반하여 실시된 계통학적 분석(phylogenetic analysis)에 따르면, 다른 종의 MutS4와 가장 유사한 상동성을 나타냈다(참고: 도 1, 표 1 및 표 2). 즉, 본 발명의 DNA 핵산분자가 DNA 오류 복구 기능을 가지는 미코박테리아-유래된 신규 MutS4A 및 MutS4B라는 것을 의미한다.

이를 토대로, 본 발명자들은 상기 DNA 핵산분자를 이용하여 미코박테리아 형질전환용 재조합 벡터를 제조하였다(참고: 도 5). 즉, 본 발명의 재조합 벡터는 (ⅰ) 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅱ) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터이다.

본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 운반하고자 하는 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 어떠한 뉴클레오타이드 서열도 가능하며, 예컨대 DNA 오류 복구 단백질-인코딩 뉴클레오타이드 서열, 리포터 단백질, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 및 piRNA을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 DNA 오류 복구 단백질-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열(MutS4A) 및 서열목록 제2서열(MutS4B)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 리포터 단백질은 형광단백질, β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 인간성장호르몬, 우레아제(urease) 및 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 바람직하게는, 상기 형광단백질은 루시퍼라아제, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein) 또는 이의 변이체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 리포터 유전자의 발현 정도는 다양한 방법을 통하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 루시퍼라아제 유전자의 발현은 de Wet J. et al, Mol. Cell Biol., 7: 725-737(1987)에 개시된 방법, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자의 발현은 Gorman C. et al, Mol. Cell Biol., 2: 1044-1051(1982)에 개시된 방법, β-갈락토시다아제 유전자의 발현은 Hall C.V. et al, J. Mol. Appl. Genet., 2: 101-109(1983)에 개시된 방법, 인간성장호르몬 유전자의 발현은 Selden R. et al., Mol. Cell Biol., 6: 3173-3179(1986)에 개시된 방법, 그리고 녹색형광단백질 유전자의 발현은 Chalfie M. et al, Science, 263: 802-805(1994)에 개시된 방법에 따라 측정될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포(미코박테리아) 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 벡터에서 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 이용될 수 있는 프로모터는 서열목록 제3서열을 포함하는 프로모터, 열충격 단백질의 프로모터, CMV 프로모터, 미코박테리아(Mycobacteria) 65 kD 공통 항원의 미코박테리아 프로모터, 미코박테리아의 리보좀 RNA 프로모터, 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) MPB70, MPB59 및 MPB64 항원의 프로모터, 박테리오파아지 람다의 P1 프로모터, tac 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터, 트랜스포존 Tn903 또는 트랜스포존 Tn5의 카나마이신 저항성 프로모터, 메탈로티오닌(metallothionine) 프로모터, 성장 호르몬 프로모터 및 진핵생물 프로모터와 원핵생물 프로모터 간의 하이브리드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 벡터에서 이용될 수 있는 프로모터는 서열목록 제3서열을 포함하는 프로모터이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 실시되는 클로닝은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 쌍(예컨대, 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열)은 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호) 및 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

또한, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pMV306, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 선택마커를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 카나마이신, 하이그로마이신, 암피실린, 스트렙토마이신, 페니실린, 클로람페니콜, 겐타마이신, 카베니실린, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 재조합 벡터를 이용하기 때문에, 그 발명들 사이의 공통 사항은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 미코박테리아 속 균주 등을 포함한다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “미코박테리움(mycobacterium)”은 왁시(waxy)한 소수성의 마이콜릭 액시드(mycolic acid)가 풍부하게 포함된 두꺼운 세포벽을 갖는 호기성의 항산성 그람 양성 박테리아로 분류되는 박테리아 집단을 의미한다. 미코박테리아는 배양시 빠르게 생장하는 비병원성 미코박테리아(non-pathogenic mycobacteria) 및 배양시 느리게 생장하는 병원성 미코박테리아(pathogenic mycobacteria)로 분류될 수 있다. 비병원성 미코박테리아로는 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 미코박테리움 포튜이툼(M. fortuitum), 미코박테리움 파라포튜이툼(M. parafortuitum), 미코박테리움 바카에(M. vaccae), 미코박테리움 플라베센스(M. flavescens), 미코박테리움 플레이(M. phlei), 미코박테리움 쿠네아툼(M. cuneatum), 미코박테리움 가스트리(M. gastri), 미코박테리움 ID-Y(M. ID-Y), 미코박테리움 네오아우룸(M. neoaurum), 미코박테리움 페레그리움(M. peregrinum), 미코박테리움 디언호페리(M. diernhoferi), 미코박테리움 울린스키(M. wolinsky) 또는 미코박테리움 JC1 스트레인(M. sp. strain JC1) 등을 포함하며, 병원성 미코박테리아로는 미코박테리움 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 미코박테리움 보비스(M. bovis), 미코박테리움 레프래(M. leprae), 미코박테리움 마리눔(M. marinum), 미코박테리움 아비움(M. avium), 미코박테리움 울세란스(M. ulcerans), 미코박테리움 앱세수스(M. abscessus), 미코박테리움 첼로내(M. chelonae), 미코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum), 미코박테리움 포시눔(M. porcinum) 등을 포함한다. 상기 미코박테리아 균주들 중 많은 균주는 일산화탄소를 유일한 탄소원 및 에너지원으로 사용할 수 있다고 보고되어 있으며(Park SW, Hwang EH, Park H, Kim JA, Heo J, Lee KH, Song T, Kim E, Ro YT, Kim SW, Kim YM., J. Bacteriol. 185(1):142-7(2003)), 병원성 미코박테리아를 연구하는 그룹들은 배양의 편의성 및 안전성을 위해 병원성 미코박테리아와 유전적 특성이 유사한 비병원성 미코박테리아를 모델로 하여 병원성 미코박테리아의 특성을 밝히고 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에 의해 형질전환될 수 있는 세포는 미코박테리아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에 의해 형질전환될 수 있는 미코박테리아는 미코박테리움 스메그마티스, 미코박테리움 보비스-BCG, 미코박테리움 아비움, 미코박테리움 플레이, 미코박테리움 포튜이튬, 미코박테리움 파라포튜이툼, 미코박테리움 루푸, 미코박테리움 파튜버큘로시스, 미코박테리움 가스트리, 미코박테리움 하바나, 미코박테리움 스크로퓰라세움, 미코박테리움 인트라셀룰라레, 미코박테리움 바카에, 미코박테리움 플라베센스, 미코박테리움 쿠네아툼, 미코박테리움 ID-Y, 미코박테리움 네오아우룸, 미코박테리움 페레그리움 및 미코박테리움 디언호페리를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 미코박테리아는 UV 또는 대식세포에 대한 저항성을 나타낸다(참고: 도 7 및 도 8).

본 명세서에서 용어 “돌연변이(mutation)”는 환경적 요인 또는 인위적인 요인에 의해 생물체(바람직하게는, 미코박테리아)의 염색체에서 발생하는 뉴클레오타이드 서열의 변이를 의미한다. 일반적으로, DNA 변이는 다양한 인자들(예컨대, 자외선, 바이러스, 트랜스포존, 돌연변이 유발물질, 등)에 의해 유발되며, 생물체 자체(예컨대, 세포 과정 중에 발생하는 초돌연변이(hypermutation))에 의해서 유발될 수 있다. 또한, 돌연변이는 다양한 형태로 DNA 서열의 변화를 초래할 수 있다. 예를 들어, 넌센스 돌연변이, 프레임 시프트 돌연변이, 미스센스 돌연변이 등이 있다. 넌센스 돌연변이는 DNA 서열에서 하나의 뉴클레오타이드가 다른 뉴클레오타이드로 대체 또는 치환되는 점돌연변이로 변이된 뉴클레오타이드에 의해 형성된 코돈에 따라 발현되는 단백질이 결정된다. 프레임 시프트 돌연변이는 여러 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해 유발되는 돌연변이로 삽입 또는 결실된 뉴클레오타이드의 수에 따라 발현되는 단백질이 결정된다. 미스센스 돌연변이는 하나의 뉴클레오타이드가 변화되어 다른 아미노산을 코딩하는 코돈으로의 변이를 유발하는 점돌연변이로, 발현된 변이 단백질이 원래의 활성을 잃어버리는 경우가 종종 발생한다.

대식세포는 인체에 침입한 병원체를 제거하는 기능을 하는 면역세포의 일종으로, 자신이 삼킨 병원체를 소화시키고 파괴하기 위하여 여러 가지 화합물을 만들어 내는데, 그 중의 하나가 일산화질소(nitric oxide, NO)이다. 그러나, 대식세포 내에서 생존할 수 있는 병원성 박테리아들은 대식세포가 만들어내는 천연 NO 저해제를 이용하여 NO의 작용을 저해, 회피하거나 박테리아 스스로 NO를 해독시키는 효소를 만들어 냄으로써 대식세포 내에서 살아남아 증식할 수 있다. 병원성 미코박테리아는 대식세포 내의 일산화질소를 산화하는 NO 디옥시게나아제(NO dioxigenase) 또는 퍼옥시나이트리타아제(peroxynitritase)와 같은 효소를 갖고 있다(Couture, M., S. R. Yeh, B. A. Wittenberg, J. B. Wittenberg, Y. Ouellet, D. L. Rousseau, and M. Guertin., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:11223-11228(1999) 및 Wengenack, N. L., Jensen, M. P., Rusnak, F., and Stern, M. K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 256:485487(1999)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 미코박테리아는 대조군과 비교하여 대식세포에 대해 현저한 저항성(예컨대, 3-4배)을 나타낸다(참고: 도 8).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비결핵항상성균(mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)의 검출방법을 제공한다: (a) 핵산분자를 포함하는 시료를 얻는 단계; 및 (b) 상기 시료로부터 MutS4A 또는 MutS4B를 검출하는 단계로, 상기 MutS4A 또는 MutS4B의 발현이 검출되면 시료 내에 비결핵항상성균이 존재하는 것으로 판단한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열로 이루어진 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는 비결핵항상성균(mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)-유발 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 DNA 핵산분자 및 재조합 발현벡터를 이용하기 때문에, 그 발명들 사이의 공통 사항은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 명세서의 용어 “비결핵항상성균(mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)”는 NTM(Nontuberculous mycobacteria)로도 불리우며, 결핵과 유사한 폐 질환, 림프절염, 피부 질환 또는 파종성 질환(disseminated disease)을 야기할 수 있는 다른 모든 미코박테리아를 의미한다.

본 발명에서 용어“시료”는 인체 또는 포유동물로부터 얻어지는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는, 조직(archival tissues), 기관지 세척액(bronchial washes), 침 및 혈액을 포함하지만, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 비결핵항상성균-유발 질환의 동정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 시료에서 타겟 유전자(바람직하게는, MutS4A 또는 MutS4B)를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 시료 내의 mRNA로부터 합성된 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 경우에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 타겟 유전자를 적합한 방법으로 분석하여 비결핵항상성균의 존재를 검출하는 것이다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 타겟 유전자를 검출할 수 있다.

본 발명의 검출 및 진단은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로도 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 DNA 핵산분자(예컨대, MutS4A 또는 MutS4B)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 비결핵항상성균의 존재를 검출함으로써 비결핵항상성균-유발 질환을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신규한 DNA 오류 복구 뉴클레오타이드 서열 및 이의 용도에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 미코박테리아-유래된 MutS4A 및 MutS4B으로 DNA 오류 복구능을 가진다.

(c) 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 미코박테리아는 UV 및 대식세포에 대한 저항성을 나타낸다.

(d) 따라서, 본 발명의 재조합 벡터는 유전자 기능 연구(예컨대, DNA 오류 복구 시스템)에 중요할 뿐 아니라, UV 및 대식세포에 대한 저항성을 높이는 수단으로서 이용될 수 있다.

도 1은 미코박테리아-유래된 본 발명의 MutS4A 및 MutS4B 아미노산 서열의 상동성 분석 결과이다.
도 2는 비결핵항산성균 검출용 MutS4B 내 PCR 프라이머쌍을 보여주는 개략적인 도면이다. 약어 및 서열: DR-MSF, 5’-TCCAGGTCCGGCGCAAGGTGTT-3’; 및 DR-MSR, 5’-CGCGGGCGGCTGATGAAGAAGATA-3’.
도 3은 다양한 비결핵항산성 미코박테리아에서 도 2의 프라이머쌍을 이용하여 MutS4B를 검출한 결과이다. MOTT-90은 05-1390을 나타내고, MOTT-12, MOTT-27, MOTT-64, h2 및 h4는 모두 환자 검체에서 동정된 미코박테리움 인트라셀룰라레-연관 미코박테리아이며, w 및 y는 각각 흰색 콜로니(white colony) 및 노란색 콜로니(yellow colony)를 나타낸다. 약어: M, 마커; 레인 1, MOTT-90; 레인 2, MOTT-12; 레인 3, MOTT-27; 레인 4, 미코박테리움 인트라셀루라레; 레인 5, h2; 레인 6, h4(w); 레인 7, h4(y); 레인 8, MOTT-64(w); 레인 9, MOTT-64(y); 레인 10, MOTT-36(w); 레인 11, MOTT-36(y); 레인 12, 미코박테리움 보비스 BCG; 및 레인 13, 음성 대조군.
도 4는 MutS4A 및 MutS4B의 잠재적인 프로모터, 그리고 상기 MutS4A 및 MutS4B를 포함하는 DNA 오류 복구 컨스트럭트(약 4 kb)의 구조를 보여주는 도면이다.
도 5는 상기 DNA 오류 복구 컨스트럭트를 클로닝하기 위해 이용된 pMV306 벡터를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 pMV306-DNA 벡터에 의해 형질전환된 미코박테리움 스메그마티스 MC2-155(DRP1 및 DRP2)에서 콜로니 PCR(6a) 및 RT-PCR(6b)을 이용하여 형질전환을 확인한 결과이다. 약어: M, 마커; N, 음성 대조군; P, 양성 대조군; 레인 1, 05-1390; 레인 2, 미코박테리움 인트라셀루라레; 레인 3, Smeg-pMV306; 및 레인 4, Smeg-DNA 오류 복구.
도 7은 본 발명의 pMV306-DNA 벡터에 의해 형질전환된 미코박테리움 스메그마티스의 UV 저항성을 테스트한 결과이다. 형질전환된 미코박테리아를 지시된 시간(0, 3 및 5분) 동안 UV 조사한 후, 상기 미코박테리아를 2-3일 동안 배양하였다. 공벡터를 형질전환시킨 미코박테리아(pMV306)에 비해 본 발명의 pMV306-DNA 벡터에 의해 형질전환된 미코박테리아(DRP1 및 DRP6)의 생존율이 더욱 더 현저하다는 것을 확인하였다.
도 8은 본 발명의 pMV306-DNA 벡터에 의해 형질전환된 미코박테리움 스메그마티스의 대식세포 저항성을 테스트한 결과이다. 공벡터를 형질전환시킨 미코박테리아(pMV306)에 비해 본 발명의 pMV306-DNA 벡터에 의해 형질전환된 미코박테리아(DRP1 및 DRP6)의 저항성이 3-4배 정도 더 높았다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

신종 미코박테리아에서 발견된 DNA 오류 복구(mismatch repair) 유전자 서열

신종 비결핵항산성 미코박테리아에서 발견된 DNA 오류 복구 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열에 기재되어 있다. 상기 뉴클레오타이드 서열을 BLAST 프로그램으로 분석해 본 결과, MutS4A 부분은 사탕수수(Gluconacetobacter diazotrophicus) PAI 5의 DNA 오류 복구 단백질 MutS와 가장 유사하였고(상동성, 79%; 표 1), MutS4B 부분은 마시도터무스 셀룰로리티쿠스(Acidothermus cellulolyticus) 11B의 DNA 오류 복구 단백질 MutS와 가장 유사하였다(상동성, 67%; 표 2). 또한, 각각의 아미노산 서열(서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열)을 토대로 계통학적 분석을 실시하였다(도 1).

본 발명의 MutS4A 아미노산 서열의 상동성 검색결과.

유전자 접근번호	내용	최대 스코어	총 스코어	탐색 범위	E-값	최대 동일성
CP001189.1 AM889285.1 CP000481.1 CP001364.1 CP000909.1	Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5, complete genome Gluconacetobacter diazotrophicus PAl 5 complete genome Acidothermus cellulolyticus 11B strain 11B, complete genome Chloroflexus sp. Y-400-fl, complete genome Chloroflexus aurantiacus J-10-fl, complete genome	105 105 102 93.3 93.3	148 105 102 93.3 93.3	21% 21% 30% 20% 20%	6.00E-19 6.00E-19 8.00E-18 4.00E-15 4.00E-15	79% 69% 65% 67% 67%

본 발명의 MutS4B 아미노산 서열의 상동성 검색결과.

유전자 접근번호	내용	최대 스코어	총 스코어	탐색 범위	E-값	최대 동일성
CP000481.1 AP011532.1 CP002042.1 CP002021.1 FP475956.1 CP001839.1	Acidothermus cellulolyticus 11B strain 11B, complete genome Methanocella paludicola SANAE DNA, complete genome Meiothermus silvanus DSM 9946, complete genome Thiomonas intermedia K12, complete genome Thiomonas sp. str. 3As chromosome, complete genome Thermotoga naphthophila RKU-10, complete genome	116 104 98.7 78.8 71.6 55.4	116 104 98.7 145 137 55.4	26% 19% 16% 23% 24% 6%	4.00E-22 2.00E-18 1.00E-16 9.00E-11 1.00E-08 0.001	67% 68% 68% 81% 82% 72%

신종 미코박테리아의 DNA 오류 복구 유전자를 표적으로 하는 PCR 프라이머 쌍 개발

상기 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있는 다른 비결핵항산성균을 감별하기 위해, 본 발명자들은 DNA 오류 복구 유전자를 표적으로 하는 PCR 프라이머 쌍을 개발하였다. 상기 유전자에 특이적인 PCR 증폭산물을 생산하기 위한 프라이머 서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머(DR-MSF), 5’-TCCAGGTCCGGCGCAAGGTGTT-3’(서열목록 제5서열) 및 역방향 프라이머(DR-MSR), 5’-CGCGGGCGGCTGATGAAGAAGATA-3’(서열목록 제6서열). 상기 프라이머 쌍은 323 bp의 유전자 증폭산물을 증폭하도록 디자인되었는데, 이는 전체 1536 bp의 MutS4B 뉴클레오타이드 서열 중 275번째부터 597번째의 뉴클레오타이드 서열에 해당한다(도 2). 상기 프라이머 쌍을 이용하여 환자에서 분리된 여러 종류의 비결핵항산성 미코박테리아들을 PCR한 결과가 도 3에 예시되어 있다.

신종 미코박테리아의 염색체 DNA로부터 DNA 오류 복구 유전자의 클로닝

DNA 오류 복구 유전자와 이의 잠재적 프로모터를 포함하는 약 4 kb 단편을 다음 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하였다(도 4): 정방향 프라이머, 5’-TTGCGGCCGCCGACCGAGTTGGCGTGG-3’ 및 역방향 프라이머, 5’-CTGACTGCCGTCTAAAGGTCTAGAGC-3’. 밑줄 친 서열은 각각 NotI 및 XbaI 제한효소 위치를 표시한다.

PCR-증폭된 단편 및 pMV306 벡터를 NotI 및 XbaI 제한효소로 절단하여 라이게이션시킨 후, 카나마이신(Sigma) 선택하여 약 8 kb 크기의 pMV306-DNA 오류 복구 컨스트럭트를 제조하였다. pMV306 벡터는 미코박테리아 파아지 L5의 인테그라제 시스템(integrase system)을 이용하여 미코박테리아의 염색체로 원하는 유전자를 삽입할 수 있는 삽입 벡터이다[7, 8; 도 5].

미코박테리움 스메그마티스( Mycobacterium smegmatis ) MC2-155 균주에 DNA 오류 복구 유전자의 형질전환

미코박테리움 스메그마티스 컴피턴트 세포에 DNA 오류 복구 유전자가 들어간 pMV306 벡터를 전기천공법(2.5 kV, 1,000Ω 및 2,500 μF의 조건)으로 형질전환시켰다. 이후, 10% ADC(Albumin-Dextrose-Catalase)가 포함된 Middlebrook 7H9 broth(Difco) 에서 2시간 동안 진탕배양시키고, 10% OADC(Oleic acid-Albumin-Dextrose-Catalase; Difco)와 100 ㎍/ml의 카나마이신이 포함된 Middlebrook 7H10 아가 배지(Difco)에 플레이팅한 후, 콜로니가 형성될 때까지 2-3일 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.

상술한 DR-MSF 및 DR-MSR 프라이머 쌍을 이용하여 형성된 콜로니 중 일부에서 PCR한 결과, DNA 오류 복구 유전자가 상기 미코박테리아의 염색체 내로 삽입되었음을 확인할 수 있었다(도 6a). 또한, 상기 콜로니로부터 mRNA를 추출하여 상기 프라이머 쌍으로 역전사-PCR(reverse transcriptase PCR)을 수행한 결과, DNA 오류 복구 유전자들이 제대로 발현되는 것으로 확인할 수 있었다(도 6b).

형질전환 미코박테리움 스메그마티스 균주의 UV 및 대식세포에 대한 저항성

다음으로, 본 발명자들은 형질전환된 미코박테리움 스메그마티스 균주들을 사용하여 UV 저항성 테스트를 실시하였다. 공벡터-형질전환된 균주 및 DNA 오류 복구 유전자-형질전환된 균주들을 7H10 아가 배지에 스트리킹하고 0분, 3분, 그리고 5분 동안 UV를 조사한 후, 37℃ 인큐베이터에서 2-3일 동안 배양하였다. 그 결과, DNA 오류 복구 유전자-형질전환된 균주들이 대조군에 비해 더욱 더 UV에 대한 저항성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다(도 7).

또한, 형질전환 균주가 대식세포에 대한 저항성을 갖는지를 알아보기 위해 대식세포 세포주인 마우스-유래된 J774A.1(ATCC)을 사용하여 감염 테스트(infection test)를 실시하였다. J774A.1 세포(1×10⁵ 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 플레이팅하여 하룻밤 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 미코박테리움 스메그마티스-pMV306 균주 및 미코박테리움 스메그마티스-DNA 오류 복구 유전자 균주를 항생제-부재 DMEM 배지(Thermo) 에 웰 당 1×10⁶ CFU(colony forming units)로 현탁하여[multiplicity of infection(MOI) = 10] 상기 J774A.1 세포-플레이팅된 웰에 처리하고 1시간 동안 배양하였다. 각 웰을 PBS(Sigma)로 세척하고 10 ㎍/ml의 젠타마이신(Sigma)이 포함된 DMEM을 웰에 처리하여 2시간 동안 배양시킨 후, 신선한 항생제-부재 DMEM 배지로 교체하였다. 감염시키고 2일이 지난 다음, 0.5% Triton X-100(Merck)이 포함된 PBS로 세포를 수득하여 1/100 또는 1/1000으로 희석하여 100 ㎍/ml의 카나마이신이 포함된 7H10 아가 배지에 플레이팅하여 형성된 콜로니 수를 카운팅하였다. 그 결과, pMV306 벡터만 삽입된 균주에 비해, DNA 오류 복구 유전자가 삽입된 균주가 3-4배 정도 더 많은 콜로니를 형성시켰다(도 8).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

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3. Zhenguo, L., Masatoshi, N. and Hong, M. 2007. The origins and early evolution of DNA mismatch repair gees-multiple horizontal gene transfers and co-evolution. Nucleic Acids Res 35, 7591-7603.

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6. Springer B., Sander P., Sedlacek L., Hardt WD., Mizrahi V., SchP., and BEC. 2004. Lack of mismatch correction facilitates genome evolution in mycobacteria. Mol Microbiol 53, 1601-9.

7. Hess, J., Miko, D., Catic, A., Lehmensiek, V., Russell, D. G. & Kaufmann, S. H. 1998. Mycobacterium bovis Calmette-Guerin strains secreting listeriolysin of Listeria monocytogenes. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 5299-5304.

8. Parish, T., Mahenthiralingam, E., Draper, P., Davis, E. O. & Colston, M. J. 1997. Regulation of the inducible acetamidase gene of Mycobacterium smegmatis. Microbiology 143, 2267-2276.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 미코박테리아(mycobacteria)-유래된 DNA 오류 복구(mismatch repair) DNA 핵산분자.
서열목록 제3서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 유전자 발현 조절 서열로, 상기 조절 서열은 UV 자극에 대해 다운스트림(downstream)에 결합된 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드의 전사를 촉진하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 서열.
(ⅰ) 서열목록 제1서열(MutS4A) 또는 서열목록 제2서열(MutS4B)의 DNA 오류 복구 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅱ) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
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제 3 항에 있어서, 상기 프로모터는 상기 제 3 항의 프로모터, 열충격 단백질의 프로모터, CMV 프로모터, 미코박테리아(Mycobacteria) 65 kD 공통 항원의 미코박테리아 프로모터, 미코박테리아의 리보좀 RNA 프로모터, 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) MPB70, MPB59 및 MPB64 항원의 프로모터, 박테리오파아지 람다의 P1 프로모터, tac 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터, 트랜스포존 Tn903 또는 트랜스포존 Tn5의 카나마이신 저항성 프로모터, 메탈로티오닌(metallothionine) 프로모터, 성장 호르몬 프로모터 또는 진핵생물 프로모터와 원핵생물 프로모터 간의 하이브리드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 3 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 선택마커를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
상기 제 3 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포.
제 8 항에 있어서, 상기 세포는 미코박테리아인 것을 특징으로 하는 세포.
제 9 항에 있어서, 상기 미코박테리아는 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 미코박테리움 보비스-BCG(M. bovis-BCG), 미코박테리움 아비움(M. avium), 미코박테리움 플레이(M. phlei), 미코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 미코박테리움 파라포튜이툼(M. parafortuitum), 미코박테리움 루푸(M. lufu), 미코박테리움 파튜버큘로시스(M. partuberculosis), 미코박테리움 가스트리(M. gastri), 미코박테리움 하바나(M. habana), 미코박테리움 스크로퓰라세움(M. scrofulaceum), 미코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 미코박테리움 바카에(M. vaccae), 미코박테리움 플라베센스(M. flavescens), 미코박테리움 쿠네아툼(M. cuneatum), 미코박테리움 ID-Y(M. ID-Y), 미코박테리움 네오아우룸(M. neoaurum), 미코박테리움 페레그리움(M. peregrinum) 또는 미코박테리움 디언호페리(M. diernhoferi)를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 8 항에 있어서, 상기 세포는 UV 또는 대식세포에 대한 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포.
다음의 단계를 포함하는 비결핵항상성균(mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)의 검출방법:
(a) 포유동물로부터 분리된 핵산분자를 포함하는 시료를 얻는 단계; 및
(b) 상기 시료로부터 MutS4A(서열목록 제1서열) 또는 MutS4B(서열목록 제2서열)를 검출하는 단계로, 상기 MutS4A 또는 MutS4B의 발현이 검출되면 시료 내에 비결핵항상성균이 존재하는 것으로 판단한다.
제 12 항에 있어서, 상기 시료는 조직(archival tissues), 기관지 세척액(bronchial washes), 침 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 검출은 유전자 증폭을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 비결핵항상성균은 미코박테리움 아비움(M. avium), 미코박테리움 고도내(M. gordonae), 미코박테리움 시미애(M. simiae), 미코박테리움 칸사이(M. kansaii), 미코박테리움 말미엔세(M. malmiennse), 미코박테리움 가스트리(M. gastri), 미코박테리움 마리뭄(M. marimum), 미코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 미코박테리움 스크로풀라세움(M. scrofulaceum), 미코박테리움 아시아티굼(M. asiaticum) 또는 미코박테리움 스줄가이(M. szulgai)인 것을 특징으로 하는 방법.
서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열로 이루어진 프라이머 쌍을 유효성분으로 포함하는 비결핵항상성균(mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)-유발 질환 진단용 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 진단은 유전자 증폭을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 16 항에 있어서, 상기 비결핵항상성균은 미코박테리움 아비움, 미코박테리움 고도내, 미코박테리움 시미애, 미코박테리움 칸사이, 미코박테리움 말미엔세, 미코박테리움 가스트리, 미코박테리움 마리뭄, 미코박테리움 인트라셀룰라레, 미코박테리움 스크로풀라세움, 미코박테리움 아시아티굼 또는 미코박테리움 스줄가이인 것을 특징으로 하는 키트.