KR100285254B1 - 결핵균 및 비결핵균 항산성균의 탐지용 진단시약 - Google Patents

결핵균 및 비결핵균 항산성균의 탐지용 진단시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA 중합효소 β 서브유닛을 코딩하는 유전자(rpoB)를 표적으로 하여 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis complex)과 비결핵 항산성균(Mycobacteria other than Tubercle bacilli: MOTT)을 감별-탐지할 수 있는 이중 중합효소 연쇄반응(duplex-polymerase chain reaction: duplex-PCR)용 프라이머쌍, 그를 이용한 결핵균군과 MOTT의 감별-탐지방법 및 전기 감별-탐지 방법으로서 결핵과 MOTT 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 표적 DNA로서 rpoB 유전자를 이용하여 간편하고 효과적으로 결핵균군과 MOTT를 감별하여 탐지할 수 있는 이중 PCR용 프라이머 쌍을 개발하였다. 전기 두 특이 프라이머 쌍을 이용하여 동시에 PCR을 수행함으로써, 검체에 존재하는 주형 DNA의 종류에 따라 결핵균군 또는, MOTT의 rpoB DNA가 각기 다른 크기의 단일밴드로 증폭되고 이에 의하여, 그 크기에 따라 감염여부를 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 프라이머쌍을 이용한 이중 PCR 방법에 의하면 모든 마이코박테리아에 단일 복제수(single copy)로 존재하면서, 매우 잘 보존되어 있는 rpoB 유전자 하나만을 표적으로 하여, 종래의 어떠한 방법보다도 간편하고 특이적으로 결핵균군과 MOTT를 감별-탐지할 수 있다.

Description

ｒｐｏＢ 유전자를 표적으로 한 결핵균 및 비결핵균 항산성균의 감별탐지방법
본 발명은 RNA 중합효소 β 서브유닛을 코딩하는 유전자(rpoB)를 표적으로 하여 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis complex: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum)과 이들을 제외한 다른 마이코박테리아 (비결핵 항산성균, Mycobacteria other than Tubercle bacilli: MOTT)를 감별-탐지할 수 있는 이중 중합효소 연쇄반응(duplex polymerase chain reaction: duplex PCR)용 프라이머쌍, 그를 이용한 결핵균군과 MOTT의 감별-탐지방법 및 전기 감별-탐지 방법으로서 결핵과 MOTT 감염여부를 감별진단하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 일반세균의 rpoB DNA는 증폭시키지 않으면서, 마이코박테리움 속의 결핵균군과 비결핵 항산성균의 rpoB DNA 분절을 각기 다른 크기의 단일밴드로 증폭시킴으로써, 결핵균과 비결핵 항산성균을 감별-탐지할 수 있는 이중 중합효소 연쇄반응용 프라이머쌍, 그를 이용한 감별-탐지방법 및 전기 감별-탐지 방법으로서 결핵과 MOTT 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
마이코박테리움(Mycobacterium) 속(屬)에는 결핵, 우형결핵(牛形結核), 나병(癩病)과 같이 사람과 동물에 심각한 질병을 일으키는 균종(species)뿐 아니라, 기회감염균으로 일컬어지는 균종, 그리고 자연환경에서 볼 수 있는 사물(死物)기생의 균종(saprophytic species) 등 현재까지 약 72 종(species)이 알려져 있으며, 그 중 인체질환과 관련된 것이 25종에 이르는 것으로 알려져 있다(참조: Shinnick, T. M., and Good, R.C., Mycobacterial taxonomy, Eur. J. Microbiol Infect. Dis., 13(11):884-901(1994); Murray, P.R., E. J., Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken., Manual of Clinical Microbiology, 6th Ed. ASM Press, Washington, D. C. 400-437(1995)).
마이코박테리아 감염증 가운데 가장 많은 질병은 결핵(Tuberculosis)으로, 강한 병원성을 갖는 결핵균군(群)(M. tuberculosis complex: TB complex)으로 구분되는 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti의 4종이 원인균이며, 이 중 결핵균(M. tuberculosis)이 가장 흔하고 중요한 원인균으로 알려져 있다. 결핵은 국내에서 아직까지도 중요시되는 질환이며, 전세계적으로는 해마다 약 8백만의 새로운 환자가 발생하는 것으로 보고되고 있다.
그러나, 최근에는 AIDS 환자가 전세계적으로 급속히 확산되면서 예전에는 별로 문제가 되지 않던 비결핵 항산성균(MOTT 또는 nontuberculous mycobacteria: NTM)에 의한 감염증이 증가하고 있다(참조: Barnes, P.F. et al, Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection., N. Engl. J. Med., 6;324(23): 1644-1650(1991); Wolinsky, E., Mycobacterial diseases other than tuberculosis., Clin. Infect. Dis., 15(1):1-10(1992)).
MOTT는 결핵균군보다 병원성은 떨어지나, 감염시 결핵과 유사한 임상증상을 나타내는데, 이중 인체감염을 흔히 일으키는 균종으로 M. avium, M. intracellulare, M. kansasii 및 M. fortuitum complex 등 오래전부터 알려진 균종들과 M. celatum, M. genavense 등과 같이 AIDS 환자에서 감염을 일으켜 새로이 최근에 알려진 균종이 있다.
결핵균군과 MOTT는 같은 마이코박테리움 속에 속하고, 임상증상이 유사하며, MOTT의 경우 기존의 결핵치료에 사용하는 항결핵제에 근원적인 내성을 보이는 경우가 흔하기 때문에, 이들의 치료를 위하여는 결핵균군과 MOTT를 감별하는 것이 절대적으로 필요하다. 원인균으로서 MOTT임이 확인되면 치료제의 선택을 달리해야 하므로, 초기 대응책으로 마이코박테리아의 존재여부를 탐지하는 것과 더불어 원인균이 결핵균군인지, MOTT인지를 빨리 감별하는 것이 필수적인 것이다.
한편, 마이코박테리아의 종(species)을 동정하기 위해서는 까다롭고 번거로운 생화학적 검사가 많이 필요하다. 마이코박테리아의 생장 속도(growth rate)는 다른 세균에 비하여 매우 느려, 마이코박테리아 분리-동정 과정에 있어 가장 큰 장애물이 되어 왔다. 객담, 혈액 또는 뇌척수액 등의 환자 검체로부터 균배양을 통해 마이코박테리아 균종을 확인하려면, 결핵균군의 경우, 환자검체로부터 1차 분리에 소요되는 기간이 4 내지 6주이며, 다시 이 순수배양된 균으로 생화학적 검사를 거치려면 다시 비슷한 기간이 소요되는 것이다. 결핵균의 경우, 비교적 동정이 수월할 수도 있으나, 다른 저속 성장(slow-growing) 마이코박테리아의 경우, 배양이 까다로운 것이 많아 순수 분리-동정 과정이 용이하지 않다.
전기한 장시간이 소요되는 균배양에 의한 마이코박테리아 탐지-동정법은 백텍(BACTEC)처럼 방사성 동위원소를 사용하는 방법으로서 일주일 정도 단축될 수도 있으나, 고가장비가 있어야 한다는 단점으로 인하여 국내외의 많은 실험실에서는 비교적 단시간에 결과를 확인할 수 있고, 고가장비가 필요치 않다는 장점때문에 중합효소 연쇄반응(PCR)을 선호하고 있다. 이러한 PCR을 이용한 진단법에는 마이코박테리움 속-특이(genus specific), 좀 더 구체적으로는, 결핵균군 특이 유전자가 증폭의 표적으로 이용된다. 이러한 유전자들은 잘 보존되어(highly conserved) 있으며, 또한, 균속(genus) 또는 균종(species)간에는 다소 변화가 있는 것이다.
마이코박테리아 탐지-분류를 위한 PCR에는 속-특이 염기서열을 포함한 16S rRNA 유전자가 흔히 이용되어 왔으나, 구체적으로 결핵균임을 확인하기 위하여는, 결핵균군만의 특이 염기서열을 갖는 유전자인 IS6110 같은 삽입 유전자를 표적으로 이용하며, 이 외에 MTP40, MPB 70, dnaJ 등을 이용할 수도 있다.
그러나, 이처럼 다양한 유전자가 제시되는 것은 전술한 유전자가 PCR의 표적 유전자로서 완전히 적합하지는 않다는 것을 반증하는 것이다. 이같은 상황은 각 종간에 잘 보존되어 있어서 종을 구분하는 가장 중요한 유전적 근거로 사용하는 16S rRNA(또는 16S rDNA) 염기서열에서도 그 예를 찾을 수 있다: 16S rRNA(또는 16S rDNA) 염기서열은 마이코박테리아 각 종간의 연관성을 잘 표현하는 것으로 알려져(참조: Stahl, D.A., and Urbance J. W., The division between fast- and slow-growing species corresponds to natural relationships among the mycobacteria., J. Bacteriol., 172(1):116-124(1990); Rogall T. et al, Differentiation of Mycobacterium species by direct sequencing of amplified DNA., J. Gen. Microbiol., 136(9):1915-1920(1990); Rogall T. et al, Towards a phylogeny and definition of species at the molecular level within the genus Mycobacterium., Int. J. Syst. Bacteriol., 40(4):323-330(1990)), 이를 근거로 하는 균종확인 방법이 널리 사용되고 있으나, 이를 이용한 계통분석(phylogenetic analysis)은 균종간의 경계(species boundary)를 명확히 규명하지 못하는 경우가 있다는 지적이 있으며(참조: Fox, G. E., Wisotzkey J. D., Jurtshuk P. Jr., How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity., Int. J. Syst. Bacteriol., 42(1):166-170(1992)), 서로 염기서열이 다른, 다수 복제수(multiple copy)의 유전자를 갖는 균이 있다는 사실이 알려진 바 있다(참조: Ninet B., Monod M., Emler S., Pawlowski J., Metral C., Rohner P., Auckenthaler R., Hirschel B., Two different 16S rRNA genes in a mycobacterial strain., J. Clin. Microbiol., 34(10):2531-2536(1996)). 다른 연구자들이 시도한 복합 PCR(multiplex PCR)에서 16S rRNA 유전자를, 종특이(species specific)한 것이 아니라 마이코박테리움 속특이(genus specific) 유전자로 사용한 것도 이 때문이다.
이에, 이를 대체할 유전자로서 스트레스 단백질 유전자인 dnaJ 유전자가 제시되기도 하였으나(참조: Takewaki S., Okuzumi K., Ishiko H., Nakahara K., Ohkubo A., Nagai R., Genus-specific polymerase chain reaction for the mycobacterial dnaJ gene and species-specific oligonucleotide probes., J. Clin. Microbiol., 31(2):446-450(1993); Takewaki S., Okuzumi K., Manabe I., Tanimura M., Miyamura K., Nakahara K., Yazaki Y., Ohkubo A., Nagai R., Nucleotide sequence comparison of the mycobacterial dnaJ gene and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacterial species., Int. J. Syst. Bacteriol., 44(1):159-166(1994)), 급속성장(rapid-growing) 마이코박테리아 균종을 구분하기에는 적합하지 못한 몇가지 문제점이 발견되었다.
PCR로 결핵을 진단하는 경우에 있어서, 가장 흔히 사용되는 표적유전자는 IS6110 삽입유전자(insertion element)로서, 인체병원성이 강한 결핵균군에 속하는 균종(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis)에 서로 다른 수로 존재하는 것으로 알려져 있다(참조: Thierry D., Cave M.D., Eisenach K. D., Crawford J. T., Bates J. H., Gicquel B., Guesdon J. L., IS6110, an IS-like element of Mycobacterium tuberculosis complex., Nucleic Acids Res., 18(1):188(1990)). 전기 유전자를 탐지하는 PCR이 결핵균 검출에 효과적임이 알려져 많이 사용되고 있으며, 국내에서도 상품화(TB-CR, TB detection kit, 주식회사바이오니아, 대한민국)되고 있으나, 다음과 같은 몇가지 문제점이 드러나고 있다.
첫째, 최근 IS6110 삽입유전자를 갖지 않는 결핵균이 보고되어 IS6110을 표적으로 하는 PCR을 결핵진단에 사용할 경우, 위음성(false negative) 결과가 나타날 가능성이 제시되었다(참조: Yuen L. K., Ross B. C., Jackson K. M., Dwyer B., Characterization of Mycobacterium tuberculosis strains from Vietnamese patients by Southern blot hybridization., J. Clin. Microbiol., 31(6):1615-1618(1993)).
둘째, IS6110이 결핵균군에 특이적인 것이 아니며, 이들과는 관계가 먼 M. ulcerans, M. gilvum, M. kansasii 및 M. fortuitum에도 존재함이 알려짐으로써, 위양성(false positive)의 가능성도 예상되고 있다(참조: Kent L, Mchugh T. D., Billington O., Dale J. W., Gillespie S. H., Demonstration of homology between IS6110 of Mycobacterium tuberculosis and DNAs of other Mycobacterium spp., J. Clin. Microbiol., 33(9):2290-2293(1995); Liebana E., Aranaz A., Francis B., Cousins D., Assessment of genetic markers for species differentiation within the Mycobacterium tuberculosis complex, J. Clin. Microbiol., 34(4):933-938(1996)).
이러한 IS6110를 표적으로 할 경우 검체로부터 결핵균군만 탐지할 수 있을 뿐이고, 비결핵 항산성균(MOTT)은 탐지할 수 없다. 최근 MOTT들에 의한 감염예가 증가한다는 보고가 계속되는 현실을 감안할 때, 결핵으로 의심되면서도 증상이 미심쩍거나, 검사결과로도 결핵균이 탐지되지 않으면 이후 발생할 수 있는 일은 자명한 것이다. 검사과정 불신, 재검사, 잘못된 치료제 선택, 환자증세 악화, 재검사 등 시간과 경비가 소모되는 악순환이 이어질 것이다. 따라서, 결핵균군과 MOTT를 감별하여 탐지할 수 있는 특이적인, 새로운 유전자 마커(genetic marker)를 사용하는 방법이 요구되어 왔다.
상기한 단점을 보완하기 위하여, 최근에는 동시에 서로 다른 몇 개의 유전자를 표적으로 하는 복합(multiplex) PCR이 사용되고 있는데, 이는 환자 검체 또는 배양된 균에 적용할 수 있는 간단하고 민감한 방법이다. 전기 복합 PCR은 마이코박테리아 속의 서로 다른 균종을 특이적으로 탐지하고 동정할 수 있는 일반적인 실험실 진단법으로(참조: Kox L. F., Jansen H. M., Kuijper S., Kolk A. H., Multiplex PCR assay for immediate identification of the infecting species in patients with mycobacterial disease., J. Clin. Microbiol., 35(6):1492-1498(1997); Kulski J. K., Pryce T., Preparation of mycobacterial DNA from blood culture fluids by simple alkali wash and heat lysis method for PCR detection., J. Clin. Microbiol., 34(8):1985-1991(1996); Cousins D., Francis B., Dawson D., Multiplex PCR provides a low-cost alternative to DNA probe methods for rapid identification of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare., J. Clin. Microbiol., 34(9):2331-2333(1996)), 또는, 서로 유사한 마이코박테리아를 감별하는 신속하고 특이적이며 간편한 방법으로(참조: Herrera, E. A., Perez O., Segovia M., Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex-polymerase chain reaction., J. Appl. Bacteriol., 80(6):596-604(1996)) 사용된 예가 있다. 이는 마이코박테리움 속에 속하는 특정균종을 탐지하기 위하여 표적유전자로서, 마이코박테리움 속-특이 유전자와 특정균종만이 갖는 종-특이 유전자를 복합적으로 사용함으로써 가능하였던 것이다.
마이코박테리움 속-특이 유전자로는 16S rRNA 유전자(참조: Wilton S., Cousins D., Detection and identification of multiple mycobacterial pathogens by DNA amplification in a single tube., PCR Methods Appl., 1(4):269-273(1992)), groEL 유전자(참조: Herrera E. A., Perez O., Segovia M., Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex-polymerase chain reaction., J. Appl. Bacteriol., 80(6):596-604(1996)) 및 alpha-항원 유전자(참조: Del Portillo P., Thomas M. C., Martinez E., Maranon C., Valladares B., Patarroyo M. E., Carlos Lopez M., Multiprimer PCR system for differential identification of mycobacteria in clinical samples., J. Clin. Microbiol., 34(2):324-328(1996)) 등이 사용되었으며, 결핵균군(M. tuberculosis complex)특이 유전자로는 IS6110 삽입 유전자(참조: Plikaytis B. B., Marden J. L., Crawford J. T., Woodley C. L., Butler W. R., Shinnick T. M., Multiplex PCR assay specific for the multidrug-resistant strain W of Mycobacterium tuberculosis., J. Clin. Microbiol., 32(6):1542-1546(1994)), MPB70 유전자(참조: Kulski, 1995; Wilton, 1992) 및 MTP40 유전자(Del Portillo, 1996; Herrera, 1996) 등이 사용되었다. 이와 같이 이미 시도된 복합 PCR의 표적 유전자와 감별-탐지법을 하기 표 1에 요약하였다.
마이코박테리아 감별 및 탐지를 위해 사용한 본 발명의 방법과 종래의 복합 PCR 방법의 비교
목 적 표적 유전자 참조*
수 유전자명 균 종 크기 (bp)
M. tuberculosis (Complex)와MOTT 감별 1 rpoB - TB complex- MOTT 136 (235)204 (136) 본 발명의 방법
M. tuberculosis complex, M. avium,M. intracellulare 감별 2 - 16S rRNA- MPB70 - all MycobacteriumM. aviumM. intracellulare- TB complex 1030180850372 Wilton, 1992
Mycobacterium 속의 M. tuberculosisM. avium, M. intracellulare 탐지-동정. 2 - 16S rRNA- MPB70 ① MycobacteriumM. aviumM. intracellulare② M. tuberculosis 1030180850372 Kulski, 1995
Multidrug-resistant M. tuberculosis(strain W) 탐지 2 - IS6110- NTF-1 M. tuberculosis 556 Plikaytis, 1994
M. tuberculosis complex (2 band)와M avium (2 band), 그외 마이코박테리아 의 (single band) 감별탐지 3 ① 65kDa② MPB64③ 16S rRNA ① all Mycobacteria② TB complex③ M avium 439240180 Cormican, 1995
Mycobacteria 탐지 및 TB complex확인에 의한 결핵진단 가능성 검토 3 ① 65 kDa② MPB64③ 19 kDa ① all Mycobacteria* 3종의 band가 다나와야 TB complex 383240131 Mustafa, 1995
TB complex의 다른 member들과M. tuberculosis를 구별 2 ① mtp40② IS986 ① M. tuberculosis② TB complex 396245 Sinclair, 1995
M. tuberculosis (3 band)와M. bovis (2 band)를 구별 3 ① groEL② IS6110③ mtp40 ① all Mycobacteria② TB complex③ M. tuberculosis 576317396 Herrera, 1996
복합 PCR과 혼성화반응 검사(hybridization assay)에 의한 마이코박테리아 종의 동정 2 ① 16S rDNA② IS6110 M. tuberculosis 208245 Kox, 1997
TB complex와 비마이코박테리아의 분리동정 3 ① 32kDa② IS6110③ MTP40 ① all Mycobacterium② TB complex③ M. tuberculosis 506984396 Portillo, 1996
검체에서 직접 마이코박테리아 DNA를탐지 3 ① 65kD Ag② 65kD Ag③ B-globingene(human) TB complexMycobacteriumControl 123383268 Totsch, 1994
* 참조:
Wilton, S., Cousins, D., Detection and Identification of Multiple Mycobacterial Pathogens by DNA Amplification in a Single Tube, PCR Methods Appl. May;1(4):269-273(1992)
Kulski, J. K., Pryce, T., Preparation of Mycobacterial DNA from Blood Culture Fluids by Simple Alkali Wash and Heat Lysis Method for PCR Detection, J. Clin. Microbiol., Aug;34(8):1985-1991(1996)
Plikaytis, B. B., Marden, J. L., Crawford, J. T., Woodley, C. L., Butler, W.R., Shinnick, T. M., Multiplex PCR Assay Specific for the Multidrug-Resistant Strain W of Mycobacterium tuberculosis., J. Clin. Microbiol., Jun;32(6):1542-1546(1994)
Cormican, M., Glennon, M., Riain, U. N., Flynn, J., Multiplex PCR for Identifying Mycobacterial Isolates, J. Clin. Pathol., Mar;48(3):203-205(1995)
Mustafa, A. S., Ahmed, A., Abal, A. T., Chugh, T. D., Establishment and Evaluation of a Multiplex Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacteria and Specific Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex, Tuber. Lung Dis., Aug;76(4):336-343(1995)
Sinclair, K., Challans, J. A., Kazwala, R. R., Hewinson, R. G., Sharp, J. M., A Multiplex Polymerase Chain Reaction for Distinguishing Mycobacterium Tuberculosis from Mycobacterium tuberculosis Complex, Mol. Cell. Probes, Oct;9(5):291-295(1995)
Herrera, E. A., Perez, O., Segovia, M., Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a Multiplex-polymerase Chain Reaction. J. Appl. Bacteriol., Jun;80(6):596-604(1996)
Kox, L. F., Jansen, H. M., Kuijper, S., Kolk, A. H., Multiplex PCR Assay for Immediate Identification of the Infecting Species in Patients with Mycobacterial Disease, J. Clin. Microbiol., Jun;35(6):1492-1498(1997)
Del Portillo, P., Thomas, M. C., Martinez, E., Maranon, C., Valladares, B., Patarroyo, M. E., Carlos Lopez M., Multiprimer PCR System for Differential Identification of Mycobacteria in Clinical Samples, J. Clin. Microbiol., Feb;34(2):324-328(1996)
Totsch, M., Schmid, K. W., Brommelkamp, E., Stucker, A., Puelacher, C., Sidoroff, G., Mikuz, G., Bocker, W., Dockhorn-Dworniczak B., Rapid Detection of Mycobacterial DNA in Clinical Samples by Multiplex PCR, Diagn. Mol. Pathol., Dec;3(4):260-264(1994)
전기한 16S rRNA, IS6110 외의 다른 유전자들도 같은 문제점이 있음이 알려지고 있다. 즉, 결핵균 특이성이 있는 것으로 알려진 MTP40 유전자도 모든 결핵균에서 보존되어 있지는 않으며(참조: Weil A., Plikaytis B. B., Butler W. R., Woodley C. L., Shinnick T. M., The mtp40 gene is not present in all strains of Mycobacterium tuberculosis., J. Clin. Microbiol., 34(9):2309-2311(1996); Liebana E., Aranaz A., Francis B., Cousins D., Assessment of genetic markers for species differentiation within the Mycobacterium tuberculosis complex., J. Clin. Microbiol., 34(4):933-938(1996)), 우형 결핵균에서 알려진 MPB70도 같은 문제점이 제기되고 있다(참조: Woolford A. J., Hewinson R. G., Woodward M., Dale J. W., Sequence heterogeneity of an mpb70 gene analogue in Mycobacterium kansasii., FEMS Microbiol. Lett., 148(1):43-48(1997)).
복합 PCR의 경우 수행상의 문제도 발생할 수 있어서, 증폭되는 산물의 수가 여럿인 경우, 예를 들면, M. tuberculosis 3개, M. bovis 2개 및 비결핵 항산성균 1개(참조: Del Portillo, 1996), 또는 M. tuberculosis 3개, M. bovis 2개(참조: Herrera, 1996)와 같은 경우, 그리고 혹시라도 검체내에 여러 마이코박테리아가 혼재(mixed infection)하는 경우에는 특정균을 감별하기 곤란한 상황이 예상된다. 또한, 서로 다른 유전자들을 표적으로 하기 때문에 민감도에도 문제가 생길 수 있다. 따라서, 안정성(stability)과 더불어 결과판독이 단순한 PCR(세균 탐지를 위한 PCR)의 표적이 되는 유전자의 확보가 절실히 요구되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 하기와 같은 보고들에 착안하고, RNA 중합효소 β 서브유닛을 암호화하는 rpoB 유전자가 결핵균 및 비결핵 항산성균의 감별-탐지에 유용한지를 검토하고자 하였다.
RNA 중합효소 β 서브유닛을 암호화하는 rpoB 유전자는 대장균의 리팜핀 내성과 관련되어 있다는 것이 알려져 있다(참조: Jin D. J., Gross C. A., Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance., J. Mol. Biol., 202(1):45-58(1989)). 아키박테리아(Archaebacteria)(참조: Klenk, H. P., Zillig W., DNA-dependent RNA polymerase subunit B as a tool for phylogenetic reconstructions: branching topology of the archaeal domain., J. Mol. Evol. Apr;38(4):420-432(1994); Iwabe N., Kuma K., Kishino H., Hasegawa M., Miyata T., Evolution of RNA polymerases and branching patterns of the three major groups of Archaebacteria., J. Mol. Evol., Jan;32(1):70-78(1991); Puhler G., Leffers H., Gropp F., Palm P., Klenk H. P., Lottspeich F., Garrett R. A., Zillig W., Archaebacterial DNA-dependent RNA polymerases testify to the evolution of the eukaryotic nuclear genome., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Jun;86(12):4569-4573(1989); Zillig W., Klenk H. P., Palm P., Puhler G., Gropp F., Garrett R. A., Leffers H., The phylogenetic relations of DNA-dependent RNA polymerases of archaebacteria, eukaryotes and eubacteria., Can. J. Microbiol., Jan;35(1):73-80(1989)), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(참조: Rowland G. C., Aboshkiwa M., Coleman G., Comparative sequence analysis and predicted phylogeny of theDNA-dependent RNA polymerase beta subunits of Staphylococcus aureus and other eubacteria., Biochem. Soc. Trans., Feb;21(1):40S(1993)) 및 말라리아(malaria)(참조: Gardner, M. J., Goldman N., Barnett P., Moore P. W., Rangachari K., Strath M., Whyte A., Williamson D. H., Wilson R. J., Phylogenetic analysis of the rpoB gene from the plastid-like DNA of Plasmodium falciparum., Mol. Biochem. Parasitol., Aug;66(2):221-231(1994))의 rpoB 유전자 염기서열이 알려져 있으며, 마이코박테리아 중 결핵균(참조: Telenti A., Imboden P., Marchesi F., Lowrie D., Cole S., Colston M. J., Matter L., Schopfer K., Bodmer T., Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis., Lancet., Mar 13;341(8846):647-650(1993), 나병균(참조: Honore N., Bergh S., Chanteau S., Doucet-Populaire F., Eiglmeier K., Garnier T., Georges C., Launois P., Limpaiboon T., Newton S., Niang K., Del Portillo P., Ramesh G. R., Reddi P., Ridel P. R., Sittisombut N., Wu-Hunter S. and Cole S. T., Nucleotide sequence of the first cosmid from the Mycobacterium leprae genome project: structure and function of the Rif-Str regions., Mol. Microbiol., Jan;7(2):207-214(1993) 및 치구균(M. smegmatis)(참조: Levin M. E., Hatfull G. F., Mycobacterium smegmatis RNA polymerase: DNA supercoiling, action of rifampicin and mechanism of rifampicin resistance., Mol. Microbiol., Apr;8(2):277-285(1993))의 리팜핀 내성과 관련이 있는 것으로 알려져 있고, 전기 3종의 염기서열만이 진뱅크(GenBank)에 등록되어 있는 상태이다.
본 발명자들은 전기 마이코박테리아 3균종을 제외한 28종 마이코박테리아의 rpoB DNA 분절(306-bp)의 염기서열을 최초로 확인하고, 전기 유전자를 이용한 rpoB 염기서열 분석 및 PCR-RFLP 분석으로 전기 유전자가 16S rRNA에 상응할 수 있는 계통분류 마커(phylogenetic marker)로 사용될 수 있음을 보인 바 있다(참조: 대한민국 특허출원 제 97-35501호).
이에, 본 발명자들은 마이코박테리아의 각 종마다 잘 보존되고(highly conserved), 안정된(stable) rpoB 유전자의 염기서열을 근거로, 임상적 의미가 큰 두 그룹, 즉 결핵균군과 MOTT를 단 한번의 PCR 수행으로 감별-탐지할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, rpoB 유전자 일부 분절(342 bp)의 특이 염기서열을 토대로 새로이 고안된 프라이머들을 동시에 사용하여, 검체내의 주형 DNA 종류(결핵균군 또는 MOTT)에 따라 각기 다른 크기의 결핵균군 또는 MOTT의 rpoB DNA 분절이 단일 밴드로 증폭되도록 하여, 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인함으로써, 결핵균군과 MOTT를 감별-탐지할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 결핵균군과 비결핵 항산성균의 rpoB 유전자 분절을 각기 다른 크기로 증폭시킬 수 있는 이중 중합효소 연쇄반응용 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 프라이머 쌍을 이용하여 결핵균군과 기타 MOTT의 rpoB 유전자 분절을 서로 다른 크기의 단일밴드로 증폭시켜, 이중중합효소 연쇄반응으로서 결핵균군과 MOTT를 감별-탐지할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 감별-탐지 방법으로서 결핵과 MOTT 감염 여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 이중 PCR에 사용한 프라이머들의 위치를 결핵균(M. tuberculosis) rpoB 유전자 상에 비교하여 나타낸 그림이다.
도 2는 결핵균군과 MOTT에 각기 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 이중 PCR을 수행함으로써, 서로 다른 크기의 rpoB 유전자 분절을 증폭시 켜 결핵균군과 MOTT를 탐지-감별하는 과정을 개략적으로 나타낸 그 림이다.
도 3a, 3b 및 3c는 마이코박테리움 속 42종(ATCC 균주)의 DNA를 주형으로 하 여, 결핵균군용 TM5-TRM3와 MOTT용 M1-RM3 프라이머를 동시에 사용 하는 이중 중합효소 연쇄반응을 수행한 후, 증폭산물을 3% 아가로 스 상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 마이코박테리움 속과 가까운 로도코커스(Rhodococcus), 노카디아 (Nocardia), 코리네박테리움(Corynebacterium) 등의 일반세균 DNA 를 주형으로 하여, 결핵균군용 프라이머 TM5-TRM3와 MOTT용 프라이 머 M1-RM3를 동시에 사용하는 이중 중합효소 연쇄반응을 수행한 후, 3% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 환자에서 분리-동정된 마이코박테리아의 DNA를 주형으로 하여 결핵균군용 TM5-TRM3와 MOTT용 M1-RM3 프라이머를 사용하는 이 중 중합효소 연쇄반응을 수행한 후, 3% 아가로스 젤 상에서 전기 영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6a, 6b 및 6c는 마이코박테리움 속 43종(ATCC 균주)의 DNA를 주형으로 하 여, 결핵균군용 Tbc1-TbcR5와 MOTT용 M5-RM3 프라이머를 동시에 사 용하는 이중 중합효소 연쇄반응을 수행한 후, 증폭산물을 3% 아가 로스 상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 마이코박테리움 속과 가까운 로도코커스(Rhodococcus), 노카디아 (Nocardia), 코리네박테리움(Corynebacterium) 등의 일반세균 DNA 를 주형으로 하여, 결핵균군용 프라이머 Tbc1-TbcR5와 MOTT용 프 라이머 M5-RM3를 동시에 사용하는 이중 중합효소 연쇄반응을 수행 한 후, 3% 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진 이다.
도 8은 환자에서 분리-동정된 마이코박테리아의 DNA를 주형으로하여, 결핵균 군용 프라이머 Tbc1-TbcR5와 MOTT용 프라이머 M5-RM3를 동시에 사 용하는 이중 중합효소 연쇄반응을 수행한 후, 3% 아가로스 젤 상에 서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하고자 한다.
우선, 본 발명의 발명자들은 결핵균군의 rpoB DNA만을 증폭시키는 결핵균군 특이 프라이머 쌍과 MOTT의 rpoB DNA를 증폭시키는 MOTT 특이 프라이머쌍의 두가지 조합을 결핵균을 포함한 28종의 마이코박테리아의 rpoB 유전자 분절(360-bp)의 염기서열(참조: 대한민국 특허출원 제 97-35501호)에 근거하여 고안하였다(참조: 도 1). 도 1에서 N 및 n은 균종간에 변화가 있는 염기를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 전기 프라이머쌍을 이용한 이중 중합효소 연쇄반응에 의하여, 서로 다른 크기의 rpoB 유전자 분절을 증폭시킴으로써, 결핵균군과 MOTT를 감별할 수 있는 과정을 요약하여 나타낸 그림이다. 그림에서 ■은 조합-1의 프라이머 쌍을 사용한 경우를 나타내며, ▲은 조합-2의 프라이머쌍을 사용한 경우를 나타낸다.
이에 따라, 전기 프라이머 쌍을 이용하여 마이코박테리아 표준균주, 일반세균 및 환자에서 분리동정된 마이코박테리아를 대상으로 이중 PCR을 수행하여 증폭산물을 확인한 결과, 조합-1의 프라이머쌍을 사용한 이중 PCR의 경우, 결핵균군에 속하는 M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG는 136-bp의 rpoB DNA 분절이 증폭되었고, MOTT에서는 204-bp의 rpoB DNA 분절이 증폭되었다.
그러나, 일반세균을 대상으로 조합-1의 프라이머쌍(TM5-TRM3와 M1-RM3)을 사용하여 이중 PCR을 수행한 결과, 마이코박테리아와 계통적으로 가까운 것으로 알려진 세 종류의 균속(Rhodococcus, Nocardia, Corynebacteriaum) 중 R. equi만이 비교적 강하게, 그리고 나머지 균종에서는 약하게 204-bp의 DNA가 증폭되었고, S. aureus, B. subtilis 및 E. coli 등의 일반세균에서는 증폭산물이 관찰되지 않았다.
상기와 동일한 방법으로, 환자로부터 분리배양하여 균종이 동정된 M. tuberculosis, M. avium complex 등 12개 균주(야생형)에 대하여 PCR을 수행한 결과, 결핵균으로 동정된 균주의 경우 136-bp의 DNA 분절이, MOTT로 동정된 균주의 경우에는 204-bp의 DNA 분절이 증폭됨으로써, 전기 조합-1의 프라이머쌍을 이용한 이중 PCR에 의하여 결핵균군과 MOTT를 간편하고, 효과적으로 감별-탐지할 수 있음을 확인하였다.
한편, 조합-2의 프라이머쌍(Tbc1-TbcR5와 M5-RM3)을 이용하여 이중 PCR을 수행하였을 경우, 마이코박테리아 균주중 결핵균군에 속하는 M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG에서는 235-bp의 rpoB DNA가 증폭되었고, MOTT에서는 136-bp의 rpoB DNA가 증폭되었다.
그러나, 일반세균을 대상으로 조합-2의 프라이머쌍을 사용하여 이중 PCR을 수행한 결과, 마이코박테리아와 계통적으로 가까운 것으로 알려진 세 종류의 균속(Rhodococcus, Nocardia, Corynebacteriaum) 중 Norcardia 2 균종과 R. equi가 비교적 강하게 136-bp의 DNA가 증폭되고, Corynebacterium에서는 증폭이 없었으며, S. aureus, B. subtilis 및 E. coli 등의 일반세균에서는 증폭산물이 관찰되지 않았다.
환자로부터 분리배양하여 균종이 동정된 M. tuberculosis, M. avium complex 등 12개 균주(야생형)에 대하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행한 결과, 결핵균으로 동정된 균주의 경우 235-bp의 DNA가, MOTT로 동정된 균주의 경우에는 136-bp의 DNA가 증폭됨으로써, 전기 조합-2의 프라이머쌍을 이용한 이중 PCR에 의하여 결핵균군과 MOTT를 간편하고, 효과적으로 감별-탐지할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 모든 마이코박테리아에 단일 복제수(single copy)로 존재하고, 매우 잘 보존되어 있는 rpoB 유전자를 근거로 고안된 프라이머쌍을 이용한 이중 PCR 방법은 기존의 어떤 방법보다도 간편하고 특이적으로 결핵균군과 MOTT를 감별-탐지할 수 있음을 확인하였다.
상기 이중 PCR 방법으로 감별-탐지될 수 있는 결핵균군에 속하는 미생물에는 Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis 또는 Mycobacterium microti이 있으며, 비결핵 항산성균(MOTT)에는 Mycobacterium abscessus, Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium aurum, Mycobacterium avium, Mycobacterium celatum Type 1, Mycobacterium celatum Type 2, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium chitae, Mycobacterium fallax, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium fortuitum 49403, Mycobacterium gastri, Mycobacterium genavense, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium interjectum, Mycobacterium intermedium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium marinum, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium phlei, Mycobacterium peregrinum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium senegalense, Mycobacterium shimoidei, Mycobacterium simiae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium terrae, Mycobacterium thermoresistibile, Mycobacterium triviale, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium vaccae 또는 Mycobacterium xenopi 등이 있다.
본 발명의 프라이머쌍을 이용하고 환자검체에 포함된 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 이들 마이코박테리아를 결핵균군과 비결핵 항산성균으로 구분하여 감별-탐지함으로서 결핵과 MOTT 감염증을 간편하게 진단할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 각 균종으로부터의 DNA 분리
게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하기 위하여 초자구를 이용하는 BB/P(bead-beater/phenol)법을 사용하였다: 즉, 균을 TEN 완충용액 Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 100mM) 200㎕에 부유시키고, 그 부유액에 초자구(직경 0.1mm, 유리구슬 11079-110; Biospec Products, Bartlesville, Okla., U.S.A.) 100㎕, PCI액(phenol:chloroform:isopropyl alcohol = 50:49:1(v/v/v)) 250㎕를 가하여 Mini beater(74005-0722, Biospec Products, Bartlesville, Okla., U.S.A.)로 1분간 진탕하였다. 균체 파쇄 후에 12000rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 수득하고, 그 상층액에 10㎕의 3M 아세트산 나트륨 및 250㎕의 에탄올을 가한 다음, -200C에 10분간 방치하여 DNA 침전물을 수득하였다. 이렇게 수득한 DNA는 TE buffer 60㎕에 용해시켜 농도 측정 후, 후술하는 실시예의 이중 PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였다.
상기에서, 게놈 DNA의 추출에 사용된 균은 대한결핵협회 결핵 연구원에서 분양 받거나, 미국의 ATCC에서 직접 입수한 43종의 ATCC 표준균주들과 결핵연구원이 국내 환자 검체로부터 순수 분리 배양하여 동정한 12종의 마이코박테리아 균종을 사용하였다. 대조군으로는, 계통상 마이코박테리아와 가까운 것으로 알려진 Rhodococcus, Nocardia, Corynebacterium의 3가지 비마이코박테리아(non-mtcobacteria)를 서울대학교 미생물연구소 미생물 균주센터에서 분양받아 사용하였으며, PCR용의 일반세균은 고초균, 대장균, 디프테리아균을 사용하였다.
rpoB 유전자를 표적으로 하는 이중 PCR에 사용한 마이코박테리아 (표준균주와 환자분리균주) 및 일반세균
1. 마이코박테리아 균종 (표준균주)
M. abscessus (CAP97E-03) M. africanum (ATCC 25420)M. asiaticum (ATCC 25276) M. aurum (ATCC 23366)M. avium (ATCC 25291) M. bovis (ATCC 19210)M. bovis BCG French strain 1173P2 M. celatum Type 1 (ATCC 51131)M. celatum Type 2 (ATCC 51130) M. chelonae (ATCC 35749)M. chitae (ATCC 19627) M. fallax (ATCC 35219)M. flavescens (ATCC 14474) M. fortuitum (ATCC 6841)M. fortuitum 49403 (ATCC 49403) M. gastri (ATCC 15754)M. genavense (ATCC 51233) M. gordonae (ATCC 14470)M. haemophilum (ATCC 29548) M. interjectum(ATCC 51457)M. intermedium (ATCC 51848) M. intracellulare (ATCC 13950)M. kansasii (ATCC 12478) M. malmoense (ATCC 29571)M. marinum (ATCC 927) M. neoaurum (ATCC 25795)M. nonchromogenicum (ATCC 19530) M. paratuberculosis (ATCC 19698)M. phlei (ATCC 11758) M. peregrinum (ATCC 14467)M. scrofulaceum (ATCC 19981) M. senegalense (ATCC 35796)M. shimoidei (ATCC 27962) M. simiae (ATCC 25275)M. smegmatis (ATCC 19420) M. szulgai (ATCC 35799)M. terrae (ATCC 15755) M. thermoresistibile (ATCC 19527)M. triviale (ATCC 23292) M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294)M. ulcerans (ATCC 19423) M. vaccae (ATCC 15483)M. xenopi (ATCC 19250)
2. 마이코박테리아 균종 (환자분리균주)*
M. tuberculosis M. avium complex M. scrofulaceumM. kansasii M. gordonae M. chelonaeM. fortuitum
3. 비마이코박테리아 균종
Corynebacterium diphtheriae(ATCC 27010)Corynebacterium glutamicum (ATCC 21196)Nocardia nova (ATCC 21197) Nocardia otitidiscaviarum (ATCC 21221 )Rhodococcus erythropolis (ATCC 21208) Rhodococcus equi (ATCC 20114)Rhodococcus rohdnii (ATCC 21249)Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus
* 환자 분리균주(마이코박테리아)는 순수 분리배양 후 기존의 생화학적, 혈 청학적 동정을 거쳐 확인된 균주들임.
실시예 2: 이중 중합효소 연쇄반응(duplex PCR)에 사용되는 프라이머의 제작
이중 중합효소 연쇄반응에 사용할 하기와 같은 서열을 가지는 두가지 조합의 프라이머를 결핵균을 포함한 28종 마이코박테리아의 rpoB 유전자(306bp) 염기서열(참조: 대한민국 특허출원 제 97-35501호)을 근거로 고안하였다(참조: 도 1).
한 쌍의 프라이머는 결핵균군의 rpoB DNA 증폭용, 그리고 다른 한 쌍은 MOTT의 rpoB DNA 증폭용이다.
A. 이중 PCR 프라이머 조합-1
① 결핵균군 rpoB DNA 증폭용 프라이머 쌍(TM5-TRM3):
TM5(정방향): 5´-GGAGCGGATGACCACCCAGGACGTG-3´
TRM3(역방향): 5´-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAT-3´
② MOTT rpoB DNA 증폭용 프라이머 쌍(M1-RM3):
M1(정방향): 5´-CGCACCGTGGGTGAGCTGATCCAG-3´
RM3(역방향): 5´-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAC-3´
B. 이중 PCR 프라이머 조합-2
① 결핵균군 rpoB DNA 증폭용 프라이머 쌍(Tbc1-TbcR5):
Tbc1(정방향): 5´-CGTACGGTCGGCGAGCTGATCCAA-3´'
TbcR5(역방향): 5´-CCGACAGTCGGCGCTTGTGGGTCAA-3´
② MOTT용 rpoB DNA 증폭용 프라이머 쌍(M5-RM3):
M5(정방향): 5´-GGAGCGGATGACCACCCAGGACGTC-3´
RM3(역방향): 5´-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAC-3´
실시예 3: 프라이머 조합-1을 이용한 이중 PCR
실시예 1에서 분리한 각 균종의 게놈 DNA 50ng, 실시예 2에서 제조한 프라이머 조합-1의 TM5-TRM3 각 20pmol, M1-RM3 각 10pmol 및 Pre-mix Top(주식회사바이오니아, 대한민국)을 혼합하고, 최종 용적이 20㎕가 되도록 증류수를 가하여 반응혼합물을 제조하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR은 열순환기(Thermocycler Model 9600, Cetus, USA)를 이용하여 1차 변성(first denaturation) 95℃에서 5분간 수행하고, 변성(denaturation) 94℃에서 30초, 결합(annealing) 74℃에서 30초, 연장(extention) 74℃에서 45초의 과정을 30회 진행시킨 후, 최종 연장(final extention) 74℃에서 5분의 과정을 수행하였다.
상기에서 증폭된 PCR 산물을 3% 아가로스 젤에 전기영동하였다(참조: 도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 4 및 도 5).
도 3a, 3b 3c는 마이코박테리아 속 표준균주(ATCC 균주 42종), 도 4는 마이코박테리아 속과 계통적으로 가까운 Rhodococcus, Nocardia, Corynebacterium 등의 일반세균, 도 5는 환자에서 분리-동정된 마이코박테리아의 DNA를 각각 주형으로 하여 상기의 방법으로 수행한 PCR 결과를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b에서, M은 Hae-Ⅲ로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제 1레인 내지 제 4레인은 결핵균군인 M. tuberculosis H37Rv, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum를 각각 나타내고; 도 3a의 제 5레인 내지 제 16레인은 MOTT인 M. avium, M. paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. intracellulare, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. triviale, M. gordonae, M. szulgai, M. kansasii, M. ulcerans, M. marinum를 각각 나타내고; 도 3b에서 제 5레인 내지 제 16레인은 MOTT인 M. simiae, M. xenopi, M. haemophilum, M. gastri, M. malmoense, M. fortuitum, M. chelonae, M. smegmatis, M. phlei, M. vaccae, M. celatum(Type 1), 16: M. genavense을 각각 나타내며, 도 3c에서 M은 Hae-Ⅲ로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제 1레인은 결핵균군인 M. tuberculosis H37Rv, 제 2레인 내지 제 15레인은 MOTT인 M. asiaticum, M. shimoidei, M. celatum(Type 2), M. interjectum, M. intermedium, M. fortuitum 49403, M. peregrinum, M. abscessus, M. aurum, M. neoaurum, M. flavescense, M. senegalense, M. fallax, M. chitae를 각각 나타낸다.
도 4에서, M은 Hae-Ⅲ로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제 1레인은 결핵균군인 M. tuberculosis H37Rv; 제 2레인 내지 제 12 레인은 M. tuberculosis 환자분리균, R. equi, R. erythropolis, R. rhodnii, N. nova, N. otitidiscaviarum, C. diphtheriae, C. glutamicum, B. subtilis, S. aureus, E. coli.를 각각 나타낸다.
또한, 도 5에서, M은 Hae-Ⅲ로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제 1레인 내지 제 4레인은 M. tuberculosis; 제 5레인 내지 제 6레인은 M. avium complex; 제 7레인 내지 제 8레인은 M. scrofulaceum; 제 9레인 내지 제 10레인은 M. kansasii; 제 11레인 내지 제 12레인은 M. gordonae; 제 13레인 내지 제 14레인은 M. chelonae; 제 15레인 내지 제 16레인은 M. fortuitum을 각각 나타낸다.
도 3a, 3b 및 3c에서 보듯이, 조합-1의 프라이머인 결핵균군용 TM5-TRM3와 MOTT용 M1-RM3을 사용하여 마이코박테리아 속(Mycobacteria genus) 표준균주(ATCC 균주 42종)에 대하여 PCR을 수행한 결과, 결핵균군에 속하는 M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG(참조: 도 3a, 3b 제 1레인 내지 제 4레인 및 도 3c 제 1레인)의 경우, 136-bp의 rpoB DNA 분절이 관찰되었고, M. avium을 비롯한 나머지 38종의 MOTT(참조: 도 3a, 3b 제 5레인 내지 제 16레인 및 도 3c 제 2레인 내지 제 15레인)의 경우에서는 204-bp의 rpoB DNA 분절이 관찰되었다.
도 4에서는 대조군으로 사용한 제 1레인 내지 제 2레인의 결핵균의 경우 136-bp의 DNA가, 세포벽 성분에 미콜산(mycolic acid)을 갖는 등 마이코박테리아와 계통적으로 가까운 것으로 알려진 세 종류의 균속(Rhodococcus, Nocardia, Corynebacteriaum)의 경우에는 R. equi만이 비교적 강하게 204-bp의 DNA가 증폭되고, 나머지 균종에서는 약하게 204-bp의 DNA가 증폭됨을 관찰하였다. S. aureus, B. subtilis 및 E. coli 등의 일반세균에서는 증폭산물이 관찰되지 않았다.
한편, 환자로부터 분리배양하여 균종이 동정된 M. avium complex 등 12개 균주 (야생형)에 대하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행한 결과, 표준균주(ATCC 균주)에서 확인한 결과와 동일하게 증폭되어, 제 1레인 내지 제 4레인의 결핵균의 경우 136-bp의 DNA가, 제 5레인 내지 제 16레인의 MOTT의 경우에는 204-bp의 DNA가 증폭됨을 확인하였다(참조: 도 5).
따라서, 상기 조합-1의 프라이머쌍 중 결핵균군 특이 프라이머 쌍은 전적으로 결핵균군의 rpoB DNA만을 증폭시키고, MOTT 특이 프라이머는 결핵균군을 제외한 마이코박테리아 균종, 그리고 마이코박테리아와 계통적으로 매우 가까운 균종 중 Rhodococcus equi의 rpoB DNA를 증폭시키나, 이들을 제외한 일반세균의 rpoB DNA는 증폭시키지 않음을 알 수 있었다.
실시예 4: 프라이머 조합-2를 이용한 이중 PCR
실시예 1에서 분리한 각 균종의 게놈 DNA 50ng, 실시예 2에서 제조한 프라이머 조합-2의 Tbc1-TbcR5 각 20pmol, M5-RM3 각 10pmol 및 Pre-mix Top(주식회사바이오니아, 대한민국)을 혼합하고, 최종 용적이 20㎕가 되도록 증류수를 가하여 반응혼합물을 제조하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR은 열순환기(Thermocycler Model 9600, Cetus, USA)를 이용하여 1차 변성(first denaturation) 94℃에서 5분간 수행한 다음, 변성(denaturation) 94℃에서 30초, 결합(annealing) 74℃에서 30초, 연장(extention) 74℃에서 30초의 과정을 30회 진행시키고, 최종 연장(final extention) 74℃에서 5분의 과정을 수행하였다.
상기에서 증폭된 PCR 산물을 3% 아가로스 젤에 전기영동하였다(참조: 도 6a, 도 6b, 도 6c, 도 7 및 도 8).
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 마이코박테리아 속 표준균주(ATCC 균주 43종), 도 7은 마이코박테리아 속과 계통적으로 가까운 Rhodococcus, Nocardia, Corynebacterium 등의 일반세균, 도 8은 환자에서 분리-동정된 마이코박테리아의 DNA를 각각 주형으로 하여 상기의 방법으로 수행한 PCR 결과를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b에서, M은 Hae-Ⅲ로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제 1레인 내지 제 4레인은 결핵균군인 M. tuberculosis H37Rv, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum를 각각 나타내고; 도 6a의 제 5레인 내지 제 16레인은 MOTT인 M. avium, M. paratuberculosis, M. scrofulaceum, M. intracellulare, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. triviale, M. gordonae, M. szulgai, M. kansasii, M. ulcerans, M. marinum를 각각 나타내고; 도 6b에서 제 5레인 내지 제 16레인은 MOTT인 M. simiae, M. xenopi, M. haemophilum, M. gastri, M. malmoense, M. fortuitum, M. chelonae, M. smegmatis, M. phlei, M. vaccae, M. celatum(Type 1), 16: M. genavense을 각각 나타내고, 도 6c에서 M은 Hae-Ⅲ로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제 1레인은 결핵균군인 M. tuberculosis H37Rv를, 제 2레인 내지 제 16레인은 MOTT인 M. asiaticum, M. shimoidei, M. celatum(Type 2), M. interjectum, M. intermedium, M. fortuitum 49403, M. peregrinum, M. abscessus, M. aurum, M. neoaurum, M. flavescense, M. senegalense, M. fallax, M. chitae, 를 각각 나타낸다.
도 7에서, M은 Hae-Ⅲ로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제 1레인은 결핵균군인 M. tuberculosis H37Rv; 제 2레인 내지 제 12 레인은 결핵 환자로부터 분리된 M. tuberculosis, R. equi, R. erythropolis, R. rhodnii, N. nova, N. otitidiscaviarum, C. diphtheriae, C. glutamicum, B. subtilis, S. aureus, E. coli.를 각각 나타낸다.
또한, 도 8에서, M은 Hae-Ⅲ로 절단된 ΦX174로서 DNA 크기마커; 제 1레인 내지 제 4레인은 환자에서 분리된 M. tuberculosis; 제 5레인 내지 제 6레인은 M. avium complex; 제 7 레인 내지 제 8레인은 M. scrofulaceum; 제 9레인 내지 제 10레인은 M. kansasii; 제 11레인 내지 제 12레인은 M. gordonae; 제 13레인 내지 제 14레인은 M. chelonae; 제 15레인 내지 제 16레인은 M. fortuitum을 각각 나타낸다.
도 6a, 도 6b 및 도 6c에서 보듯이, 조합-2의 프라이머인 결핵균군용 Tbc1-TbcR5와 MOTT용 M5-RM3을 사용하여 마이코박테리움 속(Mycobacterium genus) 표준균주(ATCC 균주 43종)에 대하여 PCR을 수행한 결과, 결핵균군에 속하는 M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG(참조: 도 6a, 6b 제 1레인 내지 제 4레인 및 도 6c 제 1레인)의 경우, 235-bp의 rpoB DNA 분절이 관찰되었고, M. avium을 비롯한 나머지 39종의 MOTT(참조: 도 6a, 6b 제 5레인 내지 제 16레인 및 도 6c 제 2레인 내지 제 16레인)의 경우에서는 136-bp의 rpoB DNA 분절이 관찰되었다.
도 7에서는, 대조군으로 사용한 제 1레인 내지 제 2레인의 결핵균의 경우 235-bp의 DNA가, 마이코박테리아와 계통적으로 가까운 것으로 알려진 세 종류의 균속(Rhodococcus, Nocardia, Corynebacteriaum)의 경우에서는 조합-1에서와 다르게 Nocardia 2 균종과 R. equi가 비교적 강하게 136-bp의 DNA가 증폭되고, Corynebacteriaum에서는 증폭산물이 없음을 관찰하였다. 그리고 S. aureus, B. subtilis 및 E. coli 등의 일반세균에서는 증폭산물이 관찰되지 않았다.
한편, 환자로부터 분리배양하여 균종이 동정된 M. tuberculosis 등 12개 균주 (야생형)에 대하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행한 결과, 표준균주(ATCC 균주)에서 확인한 결과와 동일하게 증폭되어, 제 1레인 내지 제 4레인의 결핵균의 경우 235-bp의 DNA가, 제 5레인 내지 제 16레인의 MOTT의 경우에는 136-bp의 DNA가 증폭됨을 확인하였다(참조: 도 8).
따라서, 상기 조합-2의 프라이머쌍 중 결핵균군 특이 프라이머 쌍은 전적으로 결핵균군의 rpoB DNA만을 증폭시키고, MOTT 특이 프라이머는 결핵균군을 제외한 마이코박테리아 균종, 그리고 마이코박테리아와 계통적으로 매우 가까운 Rhodococcus 속, Nocardia 속에 속한 일부 균종의 rpoB DNA를 증폭시키나, 이들을 제외한 일반세균의 rpoB DNA는 증폭시키지 않음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명에서는 표적 DNA로서 rpoB 유전자를 이용하여 간편하고 효과적으로 결핵균군과 비결핵 항산성균군을 감별하여 탐지할 수 있는 이중 PCR용 프라이머 쌍을 개발하였다. 전기 두 특이 프라이머 쌍을 이용하여 동시에 PCR을 수행함으로써, 검체에 존재하는 주형 DNA의 종류에 따라 결핵균군 또는, MOTT의 rpoB DNA가 각기 다른 크기의 단일밴드로 증폭되고, 그 크기에 따라 감염 균종을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 프라이머쌍을 이용한 이중 PCR 방법에 의하면, 모든 마이코박테리아에 단일 복제수(single copy)로 존재하면서, 매우 잘 보존되어 있는 rpoB 유전자 하나만을 표적으로 하여, 종래의 어떠한 방법보다도 간편하고 특이적으로 결핵균군과 MOTT를 감별-탐지할 수 있다. 또한, 원인균으로써 MOTT가 확인되면 증폭된 DNA를 두가지 DNA 제한효소로 절단하여 RFLP를 봄으로써 몇 종의 균종을 감별할 수도 있다.
이처럼, 본 발명의 프라이머에 의한 이중 PCR은 어떤 균종(species)이건 마이코박테리아의 DNA가 있으면 증폭시킴으로서, 환자 검체내 마이코박테리아(항산성균)의 존재를 탐지할 수 있으며, 동시에 그것이 결핵균군인지 MOTT인지를 일차적으로 감별하여, 장시간이 소요되는 마이코박테리아 분리-동정과정 (6-8주)을 단축시킬 수 있다.

Claims (4)

  1. 하기 각 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하며, 결핵균군(Mycobacterium Tuberculosis complex)의 경우, 136-bp의 DNA 분절, 비결핵 항산성균(Mycobacteria other than Tubercle bacilli)의 경우, 204-bp의 DNA 분절이 증폭됨을 확인함으로써, 결핵균군과 비결핵 항산성균을 감별-탐지하기 위한 진단시약:
  2. 하기 각 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하며, 결핵균군(Mycobacterium tuberculosis complex)의 경우, 235-bp의 DNA 분절, 비결핵 항산성균(Mycobacteria other than Tubercle bacilli)의 경우, 136-bp의 DNA 분절이 증폭됨을 확인함으로써 결핵균군과 비결핵 항산성균을 감별-탐지하기 위한 진단시약:
  3. 하기와 같은 염기 서열을 가지는 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하며, 환자의 객담, 혈액, 뇌척수액 등의 검체에 포함된 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 이중중합효소 연쇄반응(duplex polymerase chain reaction)을 수행함으로써, 생성된 각 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균군과 비결핵 항산성균의 감별-탐지방법으로서 결핵 및 MOTT 감염 여부를 감별-탐지하기 위한 진단 시약.
    ① 결핵균군 rpoB DNA 증폭용 프라이머 쌍(TM5-TRM3):
    TM5(정방향): 5´-GGAGCGGATGACCACCCAGGACGTG-3´
    TRM3(역방향): 5´-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAT-3´
    ② MOTT rpoB DNA 증폭용 프라이머 쌍(M1-RM3):
    M1(정방향): 5´-CGCACCGTGGGTGAGCTGATCCAG-3´
    RM3(역방향): 5´-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAC-3´
  4. 하기와 같은 염기 서열을 가지는 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하며, 환자의 객담, 혈액, 뇌척수액 등의 검체에 포함된 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 이중중합효소 연쇄반응(duplex polymerase chain reaction)을 수행함으로써, 생성된 각 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균군과 비결핵 항산성균의 감별-탐지방법으로서 결핵 및 MOTT 감염 여부를 감별-탐지하기 위한 진단 시약.
    ① 결핵균군 rpoB DNA 증폭용 프라이머 쌍(Tbc1-TbcR5):
    Tbc1(정방향): 5´-CGTACGGTCGGCGAGCTGATCCAA-3´
    TbcR5(역방향): 5´-CCGACAGTCGGCGCTTGTGGGTCAA-3´
    ② MOTT용 rpoB DNA 증폭용 프라이머 쌍(M5-RM3):
    M5(정방향): 5´-GGAGCGGATGACCACCCAGGACGTC-3´
    RM3(역방향): 5´-CAGCGGGTTGTTCTGGTCCATGAAC-3´
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