CN107709275B - 微生物菌剂组合物及其在农业中的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于促进植物生长、提高植物生产力和/或改善土壤质量的新型农业微生物菌剂组合物。所述新型微生物菌剂组合物包含一种或多种微生物物种、一种或多种脲酶抑制剂和/或一种或多种硝化抑制剂。本公开也提供了包含所述微生物菌剂组合物的肥料组合物。

Description

微生物菌剂组合物及其在农业中的用途
相关申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2015年6月2日的美国临时专利申请No.62/169,942的优先权，该专利申请全文据此以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于促进植物生长、提高植物生产力和/或改善土壤质量的新型农业微生物菌剂组合物。新型微生物菌剂组合物包含一种或多种微生物物种、一种或多种脲酶抑制剂和/或一种或多种硝化抑制剂。本公开也涉及包含所述微生物菌剂组合物的肥料组合物、制剂及其用途。
背景技术
使用肥料来提高植物和作物产量并改善贫瘠的土壤质量很普遍。最常用的可商购获得的含氮肥料为无机化学肥料(诸如脲)。脲的广泛使用通常与不良的环境后果相关，诸如径流水和地下水的硝酸盐污染以及释放氨气和一氧化二氮到大气环境中。对氮肥肥料应用的关注已经从提高作物产量作用转移到减轻环境污染。存在多种可提高氮气使用效率并减轻环境污染的新管理规范和技术。
广泛使用的技术之一是应用脲酶抑制剂与脲处理相结合。施用于土壤的肥料中的脲组分由于脲的脲酶(通过本领域技术人员熟知的多种真菌和细菌产生的酶)催化水解作用变成氨源。脲酶抑制剂可减慢脲转化成氨气的转化率，从而通过减少氨气挥发的量显著降低必须施用在土壤上的脲的量。最常见的脲酶抑制剂之一是正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)(参见例如，美国专利No.5,698,003)。
另一种广泛使用的技术是应用硝化抑制剂来显著降低硝酸盐淋失和气体氮气排放。大部分以市售肥料形式提供的氮气最终转化成氮气的硝酸盐形式。在存在足够氧气、高温和一些湿气的情况下，铵-N通过称为硝化的生物化学过程转化成硝酸盐-N，该过程需要两种形式的土壤细菌。第一细菌亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)将铵-N转化成亚硝酸盐-N。第二细菌硝化杆菌(Nitrobacter)将亚硝酸盐-N转化成硝酸盐-N。硝化抑制剂具有一种延缓硝化过程的主要方式，即抑制存在铵盐的区域中的细菌亚硝化单胞菌。可商购获得的一些广泛使用的硝化抑制剂包括2-氯-6-(三氯甲基)吡啶(氯啶)和双氰胺(DCD)。
除应用化学酶抑制剂(诸如脲酶抑制剂正丁基硫代磷酰三胺(NBPT))和硝化抑制剂(诸如双氰胺(DCD))之外，包含微生物的肥料组合物(所谓的“生物肥料”或“生物激活剂”)逐渐被视为传统化学肥料的替代形式。早已认识到特定菌种促进植物生长的能力。例如，固氮细菌(诸如根瘤菌(Rhizobium)菌种)为植物提供必要的含氮化合物。已证实固氮菌(Azotobacter)和固氮螺菌(Azospirillum)菌种可促进植物生长并提高作物产量，从而促进营养物质在植物中的积聚。但是，这些菌属的细菌通常不能与原生土壤和植物菌群有效竞争，从而需要应用特别大体积的菌剂。
发明内容
迄今为止，脲酶抑制剂和硝化抑制剂已经取得不同程度的成功，而生物肥料通常已经取得有限成功。因此，仍然需要有效提供植物生长的营养物质并且在环境上是安全且无害的改进肥料或肥料添加剂和方法。一种解决方案是提供脲酶抑制剂和/或硝化抑制剂与生物肥料的组合。然而，脲酶抑制剂和/或硝化抑制剂与生物肥料的组合不是直接的。首先，脲酶抑制剂和/或硝化抑制剂在组合时可弱化或杀死生物肥料。其次，脲酶抑制剂和/或硝化抑制剂通常分散在溶剂体系中(例如二醇、复合胺、芳基醇)，这样可也弱化或杀死生物肥料。
WO 2015/104698 A2公开了脲酶抑制剂与许多微生物杀虫剂的组合。但是，其未公开可为所列微生物杀虫剂提供适当活性的任何溶剂体系。此外，其未辨识任何溶剂耐受细菌。
溶剂耐受细菌可能可用于许多用于环境整治的微生物转化应用以及可用于生物技术过程。有机溶剂耐受性可具有物种特异性特性并且可能不容易预测。参见例如，Association of organic solvent tolerance and fluoroquinolone resistance inclinical isolates of Escherichia coli.Anbu,P.,Journal of AntimicrobialChemotherapy,(1998)41,111-114(“大肠杆菌(Escherichia coli)临床分离物的有机溶剂耐受性和氟喹诺酮抗性之间的联系”，Anbu,P.，《抗微生物化疗杂志》，1998年，第41卷，第111-114页)。文献记载且充分研究的大多数溶剂耐受性细菌为革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌的优势是具有附加外膜，该膜通过将有害溶剂的胞质浓度降低至可接受水平来保护细胞质膜。由于缺少外膜的固有缺点，已有报道只有少数革兰氏阳性生物体表现出溶剂耐受性。参见例如，Isolation and characterization of a novel organic solvent-tolerantAnoxybacillus sp.PGDY12,a thermophilic Gram-positive bacterium.Gao,Y.,Journalof Applied Microbiology,110,472-478(“新型有机溶剂耐受性厌氧芽胞杆菌属PGDY12(嗜热革兰氏阳性菌)的分离和表征”，Gao,Y.，《应用微生物学杂志》，第110卷，第472-478页)。
令人惊讶的是，为辨识溶剂耐受性细菌以促进植物健康、植物营养和/或土壤健康而不懈努力时，经鉴定，一些对农业有益的革兰氏阳性生物体在一些精选有机溶剂中具有活性而一些革兰氏阴性生物体在相同有机溶剂中没有活性。例如，所测试的革兰氏阳性生物体菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)在含有机溶剂丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油和二甲亚砜(DMSO)中至少一者的溶液中已经表现出从至少2小时到至少21天的活性时间范围。但是，所测试的对农业有益的革兰氏阴性菌种荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)没有一个在所测试有机溶剂中表现出活性。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含来自一个或多个微生物物种的至少一种微生物菌株以及至少一种活性剂，其中活性剂为脲酶抑制剂或硝化抑制剂或它们的组合，并且另外其中至少一种微生物菌株以有效量存在以在活性剂的存在下促进植物健康、植物营养和/或土壤健康。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌(Bacillus)菌种；以及
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌种；
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
iii.选自正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、正丁基磷酰三胺、硫代磷酰三胺、苯基磷二酰胺、环己基磷酰三胺、环己基硫代磷酰三胺、磷酰三胺、对苯二酚、对苯醌、六胺环三磷腈、巯基吡啶、巯基嘧啶、巯基吡啶-N-氧化物、N,N-二卤代-2-咪唑啉酮、N-卤代-2-噁唑烷酮、N-(2-硝基苯基)硫代磷酰三胺、N-(2-硝基苯基)磷酰三胺及它们的任意组合的脲酶抑制剂。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂试剂盒，该试剂盒包含：
A部分，其中A部分包含脲酶抑制剂和至少一种有机溶剂，其中所述脲酶抑制剂选自正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、正丁基磷酰三胺、硫代磷酰三胺、苯基磷二酰胺、环己基磷酰三胺、环己基硫代磷酰三胺、磷酰三胺、对苯二酚、对苯醌、六胺环三磷腈、巯基吡啶、巯基嘧啶、巯基吡啶-N-氧化物、N,N-二卤代-2-咪唑啉酮、N-卤代-2-噁唑烷酮、N-(2-硝基苯基)硫代磷酰三胺、N-(2-硝基苯基)磷酰三胺及它们的任意组合；并且其中所述有机溶剂选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合；以及
B部分，其中B部分包含至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的芽孢杆菌菌种，
其中A部分和B部分各自盛放在单独容器中。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂试剂盒，该试剂盒包含：
A部分，其中A部分包含至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
B部分，其中B部分包含至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的芽孢杆菌菌种，
其中A部分和B部分各自盛放在单独容器中。
在另一个实施方案中，本公开提供了相比于基准或对照植物的产量性状，改善受试植物的产量性状的方法，这种方法包括使受试植物、植物部分、植物种子或周围土壤与有效量的本公开微生物菌剂组合物接触。
脲酶抑制剂或硝化抑制剂可减轻径流水和地下水中的硝酸盐污染以及避免大量氨气和一氧化二氮排放到大气环境中。微生物物种还可促进植物健康、植物营养和土壤健康。两种化学酶抑制剂和微生物物种以合适组合物和制剂形式的组合可用作通过提高植物生产力、土壤质量和总体环境可持续性而提高氮基肥料使用效率的更好方法。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含来自一个或多个微生物物种的至少一种微生物菌株以及至少一种活性剂，其中活性剂为脲酶抑制剂或硝化抑制剂或它们的组合，并且另外其中至少一种微生物菌株在活性剂的存在下促进植物健康、植物营养和/或土壤健康。
在另一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含来自一个或多个微生物物种的至少一种微生物菌株以及至少一种活性剂，其中活性剂为脲酶抑制剂或硝化抑制剂或它们的组合，另外其中至少一种微生物菌株在活性剂的存在下促进植物健康、植物营养和/或土壤健康，其中一种或多种微生物物种选自以下组：
(1)产孢子细菌菌种；
(2)产孢子真菌菌种；
(3)菌根生物体，包括双色蜡蘑(Laccaria bicolor)、根内球囊霉(Glomusintraradices)和鹅膏菌(Amanita)菌种；
(4)放线菌菌种及其菌株，包括利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、灰绿链霉菌K61(Mycostop；AgBio development公司)和细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)AQ 6121；
(5)芽孢杆菌菌种及其菌株，包括：地衣芽孢杆菌(Bacillus itcheniformis)；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌；蔬菜芽胞杆菌(Bacillus oleronius)；巨大芽孢杆菌；莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)；短小芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)；圆孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)；坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)，苏云金芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，解淀粉芽孢杆菌菌株D747(Double Nickel；Certis公司)，坚强芽孢杆菌菌株I-1582(Votivo和Nortica；拜耳公司(Bayer))，地衣芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌菌株SB3086(EcoGuard；诺维信公司(Novozymes))，短小芽孢杆菌菌株GB34(YieldShield；拜耳公司)，QST2808(Sonata；拜耳公司)，枯草芽孢杆菌菌株GB03(Kodiak；拜耳公司)，MBI 600(Subtilex；贝克安德伍德公司(BeckerUnderwood))&QST 713(Serenade；拜耳公司)，枯草芽孢杆菌菌株GB122以及解淀粉芽孢杆菌菌株GB99(BioYield；拜耳公司)，短小芽孢杆菌菌株BU F-33，苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种菌株SDS-502，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克VBTS 2546，蜡状芽孢杆菌BP01，枯草芽孢杆菌菌株EB120，枯草芽孢杆菌菌株J-P13，枯草芽孢杆菌FB17，枯草芽孢杆菌菌株QST30002和QST3004(NRRL B-50421和NRRLB-50455)，枯草芽孢杆菌菌株QST30002和QST3004(NRRL B-50421和NRRLB-50455)砂纸突变体，苏云金芽孢杆菌亚种库尔斯塔克菌株VBTS 2477四倍肠毒素缺陷型突变体，简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)菌株03WN13、03WN23和03WN25，枯草芽孢杆菌菌株QST 713，蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)分离物BmJ NRRL B-30890，枯草芽孢杆菌菌株DSM 17231和地衣芽胞杆菌(B licheniformis)菌株DSM17236，阿氏芽胞杆菌(Bacillus aryabhattai)，弯曲芽孢杆菌(B.flexus)，尼氏芽抱杆菌(B.nealsonii)，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，巨大芽孢杆菌，死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)，解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)，地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)，地衣芽孢杆菌(B-642)，地衣芽孢杆菌(B-14368)，苏云金芽孢杆菌(ATCC 10792)，苏云金芽孢杆菌(HD-17)，苏云金芽孢杆菌(HD-1)和短小芽孢杆菌(NRS-272)；
(6)“植物根际促生细菌”(PGPR)菌种及其菌株，包括经报道能够固定氮的菌种，例如葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)菌种(如重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)，亦称重氮营养醋杆菌(Acetobacter diazotrophicus))、螺旋菌(Spirillum)菌种(例如产脂螺菌(Spirillum lipoferum))、固氮螺菌菌种、织片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)、固氮弓菌(Azoarcus)菌种、固氮菌菌种、伯克霍尔德菌(Burkholderia)菌种、伯克霍尔德菌菌种A396以及多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)；
(7)固N菌种及其菌株，包括根瘤菌种(例如慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)菌种，诸如慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti))；
(8)已知可提高营养物质使用效率的微生物物种及其菌株，包括青霉菌(Penicillium)菌种(例如百列氏青霉菌(Penicillium bilaii)、解磷青霉菌(Penicilliumbilaji))以及鹰嘴豆中生根瘤菌(Mesorhizobium cicero)；
(9)已知具有杀虫或驱昆虫效果的微生物物种及其菌株，包括等足黑卵蜂(Telenomus podisi)、黎豆叶蛾杆状病毒(Baculovirus anticarsia)；短管赤眼蜂(Trichogramma pretiosum)、棘孢木霉(Trichogramma galloi)、紫色色杆菌(Chromobacterium subtsugae)、顶孢木霉(Trichoderma fertile)JM41R、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、球孢白僵菌菌株NRRL 30976、球孢白僵菌菌株ATP02、DSM 24665、玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)、玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)CCM 8367(CCEFO.011.PFR)、蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium muscarium)、细黄链霉菌和白色麝香霉(Muscodor albus)；
(10)已知具有杀线虫作用的微生物物种及其菌株，例如疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)、巴斯德氏芽菌(Pasteuria)菌种及其菌株，包括西泽巴氏杆菌(Pasteurianishizawae)、肾形巴斯德氏芽菌(Pasteuria reneformis)菌株Pr-3、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、紫色色杆菌、巴斯德氏芽菌菌株ATCC SD-5832、绿僵菌(Metarhizium)菌种以及黄杆菌(Flavobacterium)菌种；
(11)已知具有抗真菌、抗微生物和/或植物生长促进作用的微生物物种及其菌株，例如粘帚霉(Gliocladium)菌种、假单胞菌(Pseudomonas)菌种(例如荧光假单胞菌、荧光假单胞菌D7、恶臭假单胞菌(P.putida)和绿针假单胞菌(P.chlororaphis))、荧光假单胞菌菌株NRRL B-21133、NRRL B-21053或NRRL B-21102、荧光假单胞菌VP5、产黄假单胞菌、嗜重氮假单胞菌(Pseudomonas diazotrophicus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株NRRLB-21050、木霉(Trichoderma)菌种、绿木霉(Trichoderma virens)，深绿木霉(Trichodermaatroviride)菌株、盾壳霉(Coniothyrium minitans)、粘帚霉菌种、绿色粘帚霉(Coniothyrium minitans)、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)菌株321U、哈茨木霉根瘤(Trichoderma harzianum)菌种、哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)、粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)菌株88-710、罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)FERM BP-10912、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)CCGG2742、浅黄隐球酵母(Cryptococcusflavescens)菌株OH 182.9、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)，芽枝状枝抱霉(Cladosporium cladosporioides)、壳聚糖酶产生菌(Mitsuaria)菌种、短矮鬼伞(Coprinus curtus)、嗜盐枝芽孢杆菌(Virgibacillus halophilus)、酵母菌(Saccharomyces)菌种、核果梅奇酵母(Metschnikovia fruticola)、假丝酵母(Candidaoleophila)、支顶孢(Acremonium)菌种、财虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)、寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、茎点霉(Phoma)属菌株I-4278、无色杆菌(Achromobacter)菌种、地丝霉(Geomyces)菌种、产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)菌株F30A、类短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis)菌株No 4；非产毒曲霉菌株NRRL50427、NRRL 50428、NRRL 50429、NRRL 50430和NRRL 50431；Sphaerodes mycoparasitica菌株IDAC 301008-01、301008-02或301008-03；白色麝香霉菌株NRRL 30547或NRRL30548；普城沙雷菌CCGG2742、韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)菌株10IL21、亚麻假单胞菌(P lini)菌株13IL01、成团泛菌(Pantoea agglomerans)菌株10IL31、深海链霉菌(Streptomycesscopuliridis)菌株RB72、支顶孢(Acremonium)属内生菌(endophytes)、链霉菌(Streptomyces)属BG76菌株、球形副球菌(Paracoccus kondratievae)、阴沟肠杆菌、浅黄隐球酵母、类螺丝乳杆菌(Lactobacillus parafarraginis)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、Lactobacillus rapi或玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、多粘类芽孢杆菌、普城沙雷菌(Serratia plymuthica)、茎点霉(Phoma)菌种、寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)、球腔菌(Mycosphaerella)菌种和贪噬菌(Variovorax)菌种；
(12)来自称为粉色粉末状兼性厌氧型亲甲基酵菌素(PPFM)的组的细菌菌种及其菌株，包括甲基杆菌(Methylobacterium)菌种在内；以及
(13)已知具有除草作用的微生物物种及其菌株，例如小麦不孕病菌(Pyrenophorasemeniperda)；
其中脲酶抑制剂选自正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、正丁基磷酰三胺、硫代磷酰三胺、苯基磷二酰胺、环己基磷酰三胺、环己基硫代磷酰三胺、磷酰三胺、对苯二酚、对苯醌、六胺环三磷腈、巯基吡啶、巯基嘧啶、巯基吡啶-N-氧化物、N,N-二卤代-2-咪唑啉酮、N-卤代-2-噁唑烷酮、N-(2-硝基苯基)硫代磷酰三胺、N-(2-硝基苯基)磷酰三胺、其衍生物及它们的任意组合；并且
其中硝化抑制剂选自2-氯-6-三氯甲基吡啶、5-乙氧基-3-三氯甲基-1,2,4-噻二唑、双氰胺、2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶、1,3-苯并噻唑-2-硫醇、4-氨基-N-1,3-噻唑-2-基苯磺酰胺、硫脲、胍、3,4-二甲基吡唑磷酸盐、2,4-二氨基-6-三氯甲基-5-三嗪、聚醚离子载体、4-氨基-1,2,4-三唑、3-巯基-1,2,4-三唑、叠氮化钾、二硫化碳、三硫代碳酸钠、二硫代氨基甲酸铵、2,3,-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰)-丙氨酸甲酯、硫代硫酸铵、1-羟基吡唑、3-甲基吡唑-1-氨甲酰胺、3-甲基吡唑、3,5-二甲基吡唑、1,2,4-三唑、G77硝化抑制剂(CAS登记号1373256-33-7)、其衍生物及它们的任意组合。
在一个实施方案中，本公开为本公开的任何微生物菌剂组合物提供了基于固体载体的制剂，其中固体载体选自矿物土，例如硅酸盐、二氧化硅凝胶、滑石、高岭土、石灰岩、石灰、白垩、黏土、白云石、硅藻土、膨润土、蒙脱石；无机盐，例如硫酸铝、硫酸钙、硫酸铜、硫酸铁、硫酸镁、硫酸硅、氧化镁；多糖，例如纤维素、淀粉；肥料，例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵；植物来源的产物，例如谷粉、树皮粉、木粉、坚果壳粉；适用于本公开的谷物面粉，例如玉米、稻、小麦、大麦、高粱、粟、燕麦、黑小麦、裸麦、荞麦、福尼奥和藜麦及它们的混合物的面粉。
在一个实施方案中，本公开为本公开的任何农业微生物菌剂组合物提供了基于溶剂的制剂，其中溶剂选自链烷醇胺，诸如三乙醇胺、二乙醇胺、单乙醇胺；烷基二乙醇胺、二烷基单乙醇胺，其中烷基为支链或非支链的C1-C24烷基链；二甲亚砜(DMSO)；烷基砜，诸如环丁砜(2,3,4,5-四氢噻吩-1,1-二氧化物)；烷基酰胺，诸如N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮或二甲基甲酰胺；一元醇，诸如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或苄醇；二醇，诸如乙二醇、丙二醇、二甘醇或双丙二醇；二醇衍生物和受保护二醇，诸如三甘醇单丁醚；甘油和甘油衍生物(三元醇)，包括受保护甘油，诸如异亚丙基甘油；二元酯及其衍生物；碳酸亚烷基酯，诸如碳酸亚乙酯或丙二醇碳酸酯；一元酯，诸如乳酸乙酯或乙酸乙酯；羧酸(诸如马来酸、油酸、衣康酸、丙烯酸或甲基丙烯酸)的聚合物；单烷基二醇醚和二烷基二醇醚；二醇酯；表面活性剂，诸如烷基苯磺酸盐、木质素磺酸盐、烷基酚乙氧基化物或聚乙氧基化胺。
在一个实施方案中，本公开为本公开的任何农业微生物菌剂组合物提供了封装的制剂。在土壤环境中，接种的微生物物种可能在天然存在的竞争者和掠食者生物体中难以生存。为了帮助存在于本公开微生物菌剂和肥料组合物中的微生物在施用于环境之后存活，可将一种或多种微生物物种菌株封装在例如合适的聚合物基质中。在一个示例中，封装可包括藻酸盐微珠，诸如Young et al,2006,Encapsulation of plant growth-promotingbacteria in alginate beads enriched with humid acid,Biotechnology andBioengineering 95:76-83(Young等人，2006年，促进植物生长的细菌在富含腐植酸的藻酸盐微珠中的封装，《生物技术和生物工程》，第95卷，第76-83页)所描述。本领域的技术人员应认识到，可以使用任何合适的封装材料或基质。封装可采用本领域技术人员已知的方法和技术实现。封装的微生物除包括微生物之外，还可包括营养物质或者菌剂或肥料组合物的其他组分。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌种；以及
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌种；
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
iii.选自正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、正丁基磷酰三胺、硫代磷酰三胺、苯基磷二酰胺、环己基磷酰三胺、环己基硫代磷酰三胺、磷酰三胺、对苯二酚、对苯醌、六胺环三磷腈、巯基吡啶、巯基嘧啶、巯基吡啶-N-氧化物、N,N-二卤代-2-咪唑啉酮、N-卤代-2-噁唑烷酮、N-(2-硝基苯基)硫代磷酰三胺、N-(2-硝基苯基)磷酰三胺及它们的任意组合的脲酶抑制剂。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌种；
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
iii.选自2-氯-6-三氯甲基吡啶、5-乙氧基-3-三氯甲基-1,2,4-噻二唑、双氰胺、2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶、1,3-苯并噻唑-2-硫醇、4-氨基-N-1,3-噻唑-2-基苯磺酰胺、硫脲、胍、3,4-二甲基吡唑磷酸盐、2,4-二氨基-6-三氯甲基-5-三嗪、聚醚离子载体、4-氨基-1,2,4-三唑、3-巯基-1,2,4-三唑、叠氮化钾、二硫化碳、三硫代碳酸钠、二硫代氨基甲酸铵、2,3,-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰)-丙氨酸甲酯、硫代硫酸铵、1-羟基吡唑、3-甲基吡唑-1-氨甲酰胺、3-甲基吡唑、3,5-二甲基吡唑、1,2,4-三唑、G77硝化抑制剂(CAS登记号1373256-33-7)及它们的任意组合的硝化抑制剂。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂试剂盒，该试剂盒包含：
A部分，其中A部分包含脲酶抑制剂和至少一种有机溶剂，其中所述脲酶抑制剂选自正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、正丁基磷酰三胺、硫代磷酰三胺、苯基磷二酰胺、环己基磷酰三胺、环己基硫代磷酰三胺、磷酰三胺、对苯二酚、对苯醌、六胺环三磷腈、巯基吡啶、巯基嘧啶、巯基吡啶-N-氧化物、N,N-二卤代-2-咪唑啉酮、N-卤代-2-噁唑烷酮、N-(2-硝基苯基)硫代磷酰三胺、N-(2-硝基苯基)磷酰三胺及它们的任意组合；并且其中所述有机溶剂选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合；以及
B部分，其中B部分包含至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的芽孢杆菌菌种，
其中A部分和B部分各自盛放在单独容器中。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂试剂盒，该试剂盒包含：
A部分，其中A部分包含至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
B部分，其中B部分包含至少一种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及它们的任意组合的芽孢杆菌菌种，
其中A部分和B部分各自盛放在单独容器中。
在一个实施方案中，农业微生物菌剂组合物或试剂盒中的至少一种对农业有益的芽孢杆菌菌种选自地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌及它们的任意组合。
在一个实施方案中，农业微生物菌剂组合物或试剂盒中的对农业有益的芽孢杆菌菌种包括选自解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)、地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)、地衣芽孢杆菌(B-642)、地衣芽孢杆菌(B-14368)、苏云金芽孢杆菌(ATCC 10792)、苏云金芽孢杆菌(HD-17)、苏云金芽孢杆菌(HD-1)、短小芽孢杆菌(NRS-272)及它们的任意组合的芽孢杆菌菌株。
在一个实施方案中，农业微生物菌剂组合物或试剂盒中的脲酶抑制剂(如若存在的话)为正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)。
在一个实施方案中，农业微生物菌剂组合物或试剂盒中的硝化抑制剂(如若存在的话)为双氰胺、G77硝化抑制剂(CAS登记号1373256-33-7)或它们的组合。
在一个实施方案中，农业微生物菌剂组合物或试剂盒中的溶剂包括丙二醇和N-甲基-2-吡咯烷酮。
在一个实施方案中，农业微生物菌剂组合物或试剂盒中的溶剂包括丙二醇、N-甲基-2-吡咯烷酮和三甘醇单丁醚。
在一个实施方案中，农业微生物菌剂组合物还包含水、甘油或它们的组合。
在一个实施方案中，农业微生物菌剂试剂盒的B部分还包含水、甘油或它们的组合。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌种；以及
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌种；
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
iii.正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂试剂盒，该试剂盒包含：
A部分，其中A部分包含正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)以及至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
B部分，其中B部分包含至少一种选自地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌及它们的任意组合的芽孢杆菌菌种，
其中A部分和B部分各自盛放在单独容器中。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)、地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)、地衣芽孢杆菌(B-642)、地衣芽孢杆菌(B-14368)、苏云金芽孢杆菌(ATCC 10792)、苏云金芽孢杆菌(HD-17)、苏云金芽孢杆菌(HD-1)、短小芽孢杆菌(NRS-272)及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌株；以及
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)、地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)、地衣芽孢杆菌(B-642)、地衣芽孢杆菌(B-14368)、苏云金芽孢杆菌(ATCC 10792)、苏云金芽孢杆菌(HD-17)、苏云金芽孢杆菌(HD-1)、短小芽孢杆菌(NRS-272)及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌株；
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
iii.正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂组合物，该组合物包含：
i.至少一种选自解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)、地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)、地衣芽孢杆菌(B-642)、地衣芽孢杆菌(B-14368)、苏云金芽孢杆菌(ATCC 10792)、苏云金芽孢杆菌(HD-17)、苏云金芽孢杆菌(HD-1)、短小芽孢杆菌(NRS-272)及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌株；
ii.至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
iii.双氰胺、G77硝化抑制剂(CAS登记号1373256-33-7)或它们的组合。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂试剂盒，该试剂盒包含：
A部分，其中A部分包含正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)以及至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
B部分，其中B部分包含至少一种选自解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)、地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)、地衣芽孢杆菌(B-642)、地衣芽孢杆菌(B-14368)、苏云金芽孢杆菌(ATCC10792)、苏云金芽孢杆菌(HD-17)、苏云金芽孢杆菌(HD-1)、短小芽孢杆菌(NRS-272)及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌株，
其中A部分和B部分各自盛放在单独容器中。
在一个实施方案中，本公开提供了农业微生物菌剂试剂盒，该试剂盒包含：
A部分，其中A部分包含至少一种选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)及它们的任意组合的有机溶剂；以及
B部分，其中B部分包含至少一种选自解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)、地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)、地衣芽孢杆菌(B-642)、地衣芽孢杆菌(B-14368)、苏云金芽孢杆菌(ATCC10792)、苏云金芽孢杆菌(HD-17)、苏云金芽孢杆菌(HD-1)、短小芽孢杆菌(NRS-272)及它们的任意组合的对农业有益的芽孢杆菌菌株，
其中A部分和B部分各自盛放在单独容器中。
在本公开的农业微生物菌剂组合物或试剂盒的任何实施方案中，脲酶抑制剂(诸如NBPT)(如若存在的话)的重量百分比在0.02％-80％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在0.02％-70％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在0.02％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在0.02％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在0.02％-40％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在0.02％-30％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在0.02％-20％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在0.02％-10％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在0.02％-5％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在5％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在5％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在5％-40％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在5％-30％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-40％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-30％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在15％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在15％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在15％-40％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在15％-30％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在30％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在30％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在40％-60％的范围内。所述重量百分比是基于整个微生物菌剂组合物而言的。
在本公开的农业微生物菌剂组合物或试剂盒的任何实施方案中，硝化抑制剂(诸如DCD)(如若存在的话)的重量百分比在1％-80％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在1％-70％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在1％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在1％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在1％-40％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在1％-30％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在1％-20％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在1％-10％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在1％-5％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-80％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-70％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-40％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在10％-30％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-80％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-70％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-40％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-30％的范围内。所述重量百分比是基于整个微生物菌剂组合物而言的。
在本公开的农业微生物菌剂组合物或试剂盒的任何实施方案中，有机溶剂(诸如丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)或它们的任何组合)的重量百分比在20％-99％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-90％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-80％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-70％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在20％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在30％-99％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在30％-90％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在30％-80％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在30％-70％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在30％-60％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在30％-50％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在40％-99％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在40％-80％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在40％-70％的范围内。在一个实施方案中，其重量百分比在40％-60％的范围内。所述重量百分比是基于整个微生物菌剂组合物而言的。
在一个实施方案中，本公开的农业微生物菌剂组合物或试剂盒包含重量百分比在40％-70％范围内的丙二醇、重量百分比在15％-40％范围内的N-甲基-2-吡咯烷酮、重量百分比在10％-30％范围内的NBPT以及重量百分比在0.1％-5％范围内的任选染料。所述重量百分比是基于整个微生物菌剂组合物而言的。
在一个实施方案中，本公开的农业微生物菌剂组合物或试剂盒包含重量百分比在10％-30％范围内的丙二醇、重量百分比在30％-60％范围内的N-甲基-2-吡咯烷酮、重量百分比在15％-40％范围内的NBPT、重量百分比在1％-5％范围内的三甘醇单丁醚以及重量百分比在0-1％范围内的任选染料。所述重量百分比是基于整个微生物菌剂组合物而言的。
在一个实施方案中，本公开微生物菌剂组合物中芽孢杆菌菌种的浓度为至少1.0×102个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×103个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×104个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×105个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×106个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×107个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×108个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×109个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×1010个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×1011个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度为至少1.0×1012个孢子/mL。在一个实施方案中，其浓度在1.0×102-1.0×1012个孢子/mL的范围内。在一个实施方案中，其浓度在1.0×103-1.0×1012个孢子/mL的范围内。在一个实施方案中，其浓度在1.0×104-1.0×1012个孢子/mL的范围内。在一个实施方案中，其浓度在1.0×105-1.0×1012个孢子/mL的范围内。在一个实施方案中，其浓度在1.0×106-1.0×1012个孢子/mL的范围内。在一个实施方案中，其浓度在1.0×107-1.0×1012个孢子/mL的范围内。在一个实施方案中，其浓度在1.0×108-1.0×1012个孢子/mL的范围内。在一个实施方案中，其浓度在1.0×109-1.0×1012个孢子/mL的范围内。
在本公开的一个实施方案中，农业微生物菌剂组合物自身可用作肥料。
染料也可被包含在本公开的农业微生物菌剂组合物中。包括食品染料在内的任何常用染料均可用于提供微生物菌剂组合物均匀度的视觉证明。总微生物菌剂组合物中染料的重量百分比为0-10％。在一个实施方案中，其重量百分比为0.1％-5％。
适用于本公开的染料的示例包括但不限于FD&C蓝色1号、FD&C蓝色1号、FD&C绿色3号、FD&C黄色5号、FD&C红色3号、FD&C红色40号、FD&C黄色6号和ULTRA绿色染料或它们的组合。
在另一个实施方案中，本公开提供了包含本公开任何实施方案中的任何农业微生物菌剂组合物的肥料组合物，其中肥料可为粒状肥料诸如粒状脲、液态肥料诸如脲铵硝酸盐(UAN)、含水脲和硝酸铵水溶液或无水氨气(NH3)。
在另一个实施方案中，本公开提供了相比于基准或对照植物的产量性状，改善受试植物的产量性状的方法，该方法包括使受试植物、植物部分、植物种子或周围土壤与有效量的本公开农业微生物菌剂组合物接触，其中所述微生物菌剂组合物包含：
i.来自一个或多个微生物物种的至少一种农业微生物菌株，以及
ii.至少一种活性剂，其中该活性剂为脲酶抑制剂、硝化抑制剂或它们的组合，
其中当受试植物与有效量的农业微生物菌剂组合物接触时，相比于基准或对照植物的产量性状，有效量的农业微生物菌剂组合物可有效改善受试植物的产量性状。
在另一个实施方案中，本公开提供了用改善植物产量性状的方法，诸如提高植物生长和/或生产力，其中该方法包括将本公开任何实施方案的有效量农业微生物菌剂组合物施用于植物、植物部分、植物种子或者施用于植物或植物种子所生长的土壤。
在另一个实施方案中，本公开提供了用于改善土壤质量的方法，其中该方法包括将如本公开任何实施方案中所公开的有效量农业微生物菌剂组合物施用于土壤或者施用于所述土壤中的植物或植物种子。
在本公开的任何实施方案中，添加到如本文所公开的微生物菌剂和肥料组合物中的每一农业微生物菌株的浓度取决于多种因素，这些因素包括所采用各个菌株的种类和数量、正在处理的植物物种、待处理土壤的性质和条件、待施用微生物菌剂或肥料组合物的确切性质、活性剂的类型和形式、菌剂或肥料所施用的形式和施用方式，以及施用所发生于植物生长期的阶段。对于任何给定情况，合适浓度应当在活性剂的存在下有效改善产量性状，并可由本领域的普通技术人员仅使用常规实验确定。仅以举例的方式，存在于菌剂或肥料组合物中的每一菌株的浓度可从每英亩约1.0×102菌落形成单位(CFU)/mL至约5.0×1012CFU/mL、从每英亩约1.0×102CFU/mL至约5.0×1010CFU/mL、从每英亩约1.0×102CFU/mL至约5.0×108CFU/mL、从每英亩约1.0×102CFU/mL至约5.0×106CFU/mL、或者从每英亩约1.0×102CFU/mL至约5.0×104CFU/mL。
在本公开的一个实施方案中，微生物食品来源诸如巨藻或甘油可包括在本公开的任何实施方案中。
术语“微生物物种”是指天然存在的或专门开发的微生物物种(诸如如本文所公开的细菌和真菌)的变体或突变体。变体或突变体可能具有或可能不具有与本文所例示的特定菌株相同的标识生物学特征，前提条件是它们在促进植物生长和在土壤中提供用于植物生长的营养物质方面共享类似的有利特性。某些微生物菌株的变体可包括但不限于通过基因整合技术开发的那些(诸如通过插入元件或转座子介导的那些)，或通过同源重组；用于修改、插入、缺失、活化或沉默基因的其他重组DNA技术；种内原生质体融合；通过用紫外线或X射线照射诱变或通过用化学诱变剂(诸如亚硝基胍、甲基甲烷磺酸酯、氮芥等)处理；以及噬菌体介导的转导所开发的那些。合适可行的方法在本领域中是熟知的，并在例如J.H.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1972)(J.H.Miller，“分子遗传学实验”，美国纽约州冷泉港，冷泉港实验室出版社，1972年)；J.H.Miller,A Short Course in BacterialGenetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1992)(J.H.Miller，细菌遗传学短期课程，美国纽约州冷泉港，冷泉港实验室出版社，1992年)；以及J.Sambrook,D.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(200l)(J.Sambrook、D.Russell，分子克隆：实验手册，第3版，美国纽约州冷泉港，冷泉港实验室出版社，2001年)中有所描述。
如本文所用术语“植物生产力”或“产量性状”是指植物生长或发育的任何方面，这些方面是植物为何生长的原因。因此，为了本公开的目的，改善的或提高的“植物生产力”或者“改善的产量性状”广义上是指生物质增加，或者收获或用于各种目的的叶、茎、谷粒、果实、蔬菜、花或其他植物部分的产量增大，以及包括茎、叶和根在内的植物部分生长加快。
术语“改善土壤质量”是指增加植物生长所需要或对植物生长有利的营养物质的量和/或可用性。仅以举例的方式，这类营养物质包括氮、磷、钾、铜、锌、硼和钼。术语“改善土壤质量”也涵盖降低或最小化对植物生长或发育可能有害的元素(例如铁和锰)的量。因此，通过使用本公开的微生物菌剂和肥料组合物来改善土壤质量，从而有助于并促进土壤中植物的生长。
术语“有效量”是指施用于土壤或植被的给定区域的足以促进例如在植物生长速率、作物产量或土壤中营养物质可用性方面的一种或多种有利或期望结果的微生物菌剂或肥料组合物的量。“有效量”可在一次或多次施用中提供。所需精确量根据多种因素而改变，诸如所采用各个菌株的种类和数量、正在处理的植物物种、待处理土壤的性质和条件、待施用微生物菌剂或肥料组合物的确切性质、菌剂或肥料所施用的形式和施用方式，以及施用所发生于植物生长期的阶段。对于任何给定情况，合适的“有效量”可由本领域的普通技术人员仅使用常规实验确定。
本公开中的术语“活性”是指微生物细胞在琼脂表面上重复分化产生可见菌落的能力。在本公开中用于活性评估的温度为约37℃。活性时间从将营养物质发酵液中刚刚制备的微生物培养物添加到有机溶剂或不止一种有机溶剂的混合物中的时刻算起。在将营养物质发酵液中的微生物培养物添加到有机溶剂或不止一种溶剂的混合物中之后，在某些时刻取出少量混合物，在约37℃下温育。在将营养物质发酵液中的微生物培养物添加到有机溶剂的时刻与取出混合物进行温育的时刻之间的时间段被定义为用于活性评估目的的活性时间。
含有机溶剂的溶液中的细菌活性测试
细菌活性测试的目的是评估对农业有益的细菌菌种在含有机溶剂的溶液中的活性。
对农业有益的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌菌种两者都可用于本测试。
对农业有益的细菌菌种获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)或美国农业研究培养物保藏中心。细菌菌种在合适培养基、LB发酵液、营养物质发酵液中生长，并采用革兰氏染色法在皮氏平皿上通过显微镜检查纯度。观察到纯细菌菌种，即无异常菌落。
所有测试样品均通过两步方法制备。
首先，所选对农业有益的细菌于37℃下在Luria-Bertani(LB)培养基中过夜生长，同时加以搅拌。用Bausch and Lomb Spectronic分光光度计在600nm(OD600)处测量生长以提供在600nm(OD600)下细胞光密度在1.2和1.5之间的样品。过夜培养物通常包含1.6×108至3.4×108菌落形成单位/mL(CFU/mL)。
其次，将0.5mL LB培养基中的所制备细菌菌种样品添加到有机溶剂或有机溶剂的混合物(4.5mL)中。
立即取出10μL含细菌菌种的有机溶剂溶液样品，进行细菌活性评估(T＝0)。
将剩余含细菌菌种的有机溶剂溶液在37℃下温育，以便进一步测试。在T＝2小时、4小时、1天、2天、5天、7天、9天、12天、15天、18天和21天时，从温育过的含细菌菌种的有机溶剂溶液中取出10μL体积样品，进行细菌活性评估。
每次将取出进行活性评估的样品(10μL)置于琼脂板上，该样品在37℃下过夜温育。存在于板上的细菌菌落表明，细菌已经耐受溶剂，因此具有活性。如果细菌菌落未生长，则细菌不表现对溶剂的耐受性。
具有从将细菌样品添加到有机溶剂的时刻起至少两个小时活性的对农业有益的细菌被视为在本发明的有机溶剂溶液中具有活性。
解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)提供了在NMP中至少两个小时的活性以及在甘油中至少5天的活性。
地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)提供了在三甘醇单丁醚中至少一天的活性、在PG中至少5天的活性、在NMP中至少5天的活性、在甘油中至少21天的活性以及在DMSO中至少21天的活性。
地衣芽孢杆菌(B-642)和地衣芽孢杆菌(B-14368)各自提供了在PG中至少21天的活性、在NMP中至少21天的活性、在三甘醇单丁醚中至少21天的活性、在甘油中至少21天的活性以及在DMSO中至少21天的活性。
苏云金芽孢杆菌(ATCC 10792)提供了在PG中至少2小时的活性、在NMP中至少2小时的活性、在三甘醇单丁醚中至少2小时的活性、在甘油中至少21天的活性以及在DMSO中至少21天的活性。
苏云金芽孢杆菌(HD-17)和苏云金芽孢杆菌(HD-1)各自提供了在PG中至少21天的活性、在NMP中至少21天的活性、在三甘醇单丁醚中至少21天的活性、在甘油中至少21天的活性以及在DMSO中至少21天的活性。
短小芽孢杆菌(NRS-272)提供了在PG中至少21天的活性、在三甘醇单丁醚中至少21天的活性、在甘油中至少21天的活性以及在DMSO中的至少21天的活性。
令人惊讶的是，当将营养物质发酵液中OD600介于1.3和1.5之间的所制备细菌样品添加到除甘油之外的所有所测试有机溶剂中时，所有三种所选对农业有益的革兰氏阴性菌种荧光假单胞菌(ATCC 53958)、恶臭假单胞菌(ATCC 49128)和绿针假单胞菌(ATCC 55670)(预期这些菌种具有更好的溶剂耐受性)几乎立即失去活性。
在含本公开有机溶剂的溶液中的细菌活性测试表明，地衣芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的所有示例提供在含有机溶剂PG、NMP、三甘醇单丁醚、甘油和DMSO中至少一者的溶液中从至少2小时到至少21天的活性时间范围。
在含本公开有机溶剂的溶液中的细菌活性测试表明，芽孢杆菌菌株解淀粉芽孢杆菌(ATCC 23842)、地衣芽孢杆菌(ATCC 14580)、地衣芽孢杆菌(B-642)、地衣芽孢杆菌(B-14368)、苏云金芽孢杆菌(ATCC 10792)、苏云金芽孢杆菌(HD-17)、苏云金芽孢杆菌(HD-1)和短小芽孢杆菌(NRS-272)各自提供在含有机溶剂PG、NMP、三甘醇单丁醚、甘油和DMSO中至少一者的溶液中从至少2小时到至少21天的活性时间范围。
实施例
表1：在有机溶剂PG、NMP、三甘醇单丁醚、甘油或DMSO的至少一者中具有至少2小时 活性的实施例
实施例编号 芽孢杆菌菌种 芽孢杆菌菌株 溶剂
1 解淀粉芽孢杆菌 ATCC 23842 NMP
2 解淀粉芽孢杆菌 ATCC 23842 甘油
3 地衣芽孢杆菌 ATCC 14580 三甘醇单丁醚
4 地衣芽孢杆菌 ATCC 14580 PG
5 地衣芽孢杆菌 ATCC 14580 NMP
6 地衣芽孢杆菌 ATCC 14580 甘油
7 地衣芽孢杆菌 ATCC 14580 DMSO
8 地衣芽孢杆菌 B-642 PG
9 地衣芽孢杆菌 B-642 NMP
10 地衣芽孢杆菌 B-642 三甘醇单丁醚
11 地衣芽孢杆菌 B-642 甘油
12 地衣芽孢杆菌 B-642 DMSO
13 地衣芽孢杆菌 B-14368 PG
14 地衣芽孢杆菌 B-14368 NMP
15 地衣芽孢杆菌 B-14368 三甘醇单丁醚
16 地衣芽孢杆菌 B-14368 甘油
17 地衣芽孢杆菌 B-14368 DMSO
18 苏云金芽孢杆菌 ATCC 10792 PG
19 苏云金芽孢杆菌 ATCC 10792 NMP
20 苏云金芽孢杆菌 ATCC 10792 三甘醇单丁醚
21 苏云金芽孢杆菌 ATCC 10792 甘油
22 苏云金芽孢杆菌 ATCC 10792 DMSO
23 苏云金芽孢杆菌 HD-17 PG
24 苏云金芽孢杆菌 HD-17 NMP
25 苏云金芽孢杆菌 HD-17 三甘醇单丁醚
26 苏云金芽孢杆菌 HD-17 甘油
27 苏云金芽孢杆菌 HD-17 DMSO
28 苏云金芽孢杆菌 HD-1 PG
29 苏云金芽孢杆菌 HD-1 NMP
30 苏云金芽孢杆菌 HD-1 三甘醇单丁醚
31 苏云金芽孢杆菌 HD-1 甘油
32 苏云金芽孢杆菌 HD-1 DMSO
33 短小芽孢杆菌 NRS-272 PG
34 短小芽孢杆菌 NRS-272 三甘醇单丁醚
35 短小芽孢杆菌 NRS-272 甘油
36 短小芽孢杆菌 NRS-272 DMSO

Claims (28)

1.一种基于载体的农业微生物菌剂组合物，包含：
i.至少一种对农业有益的芽孢杆菌(Bacillus)菌种，所述芽孢杆菌菌种选自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)以及它们的任意组合；
ii.至少一种有机溶剂，所述有机溶剂选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)以及它们的任意组合，其中基于所述微生物菌剂组合物的总重量计，所述至少一种有机溶剂以20重量％至99重量％的量存在；以及
iii.脲酶抑制剂，所述脲酶抑制剂选自正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、正丁基磷酰三胺、硫代磷酰三胺、苯基磷二酰胺、环己基磷酰三胺、环己基硫代磷酰三胺、磷酰三胺、对苯二酚、对苯醌、六胺环三磷腈、巯基吡啶、巯基嘧啶、巯基吡啶-N-氧化物、N,N-二卤代-2-咪唑啉酮、N-卤代-2-噁唑烷酮、N-(2-硝基苯基)硫代磷酰三胺、N-(2-硝基苯基)磷酰三胺以及它们的任意组合。
2.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，其中所述对农业有益的芽孢杆菌菌种选自地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌以及它们的任意组合。
3.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，其中所述对农业有益的芽孢杆菌菌种选自由下列组成的菌株的组：解淀粉芽孢杆菌ATCC 23842、地衣芽孢杆菌ATCC 14580、地衣芽孢杆菌B-642、地衣芽孢杆菌B-14368、苏云金芽孢杆菌ATCC 10792、苏云金芽孢杆菌HD-17、苏云金芽孢杆菌HD-1、短小芽孢杆菌NRS-272以及它们的任意组合。
4.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，其中所述脲酶抑制剂为正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)。
5.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，还包含硝化抑制剂，所述硝化抑制剂选自2-氯-6-三氯甲基吡啶、5-乙氧基-3-三氯甲基-1,2,4-噻二唑、双氰胺、2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶、1,3-苯并噻唑-2-硫醇、4-氨基-N-1,3-噻唑-2-基苯磺酰胺、硫脲、胍、3,4-二甲基吡唑磷酸盐、2,4-二氨基-6-三氯甲基-5-三嗪、聚醚离子载体、4-氨基-1,2,4-三唑、3-巯基-1,2,4-三唑、叠氮化钾、二硫化碳、三硫代碳酸钠、二硫代氨基甲酸铵、2,3,-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰)-丙氨酸甲酯、硫代硫酸铵、1-羟基吡唑、3-甲基吡唑-1-氨甲酰胺、3-甲基吡唑、3,5-二甲基吡唑、1,2,4-三唑、G77硝化抑制剂(CAS登记号1373256-33-7)以及它们的任意组合。
6.根据权利要求5所述的农业微生物菌剂组合物，其中所述硝化抑制剂为双氰胺、G77硝化抑制剂(CAS登记号1373256-33-7)或它们的组合。
7.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，其中基于所述农业微生物菌剂组合物的总重量计，所述脲酶抑制剂的重量百分比在0.02％-80％的范围内。
8.根据权利要求7所述的农业微生物菌剂组合物，其中所述脲酶抑制剂的重量百分比在10％-60％的范围内。
9.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，其中从所述对农业有益的芽孢杆菌菌种接触所述有机溶剂的时刻起，所述对农业有益的芽孢杆菌菌种具有至少2小时的活性。
10.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，其中所述对农业有益的芽孢杆菌菌种浓度在1.0×102至1.0×1012个孢子/mL的范围内。
11.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，还包含染料。
12.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，包含丙二醇和N-甲基-2-吡咯烷酮。
13.根据权利要求12所述的农业微生物菌剂组合物，其中基于所述农业微生物菌剂组合物的总重量计，所述丙二醇的重量百分比在40％-70％的范围内，基于所述农业微生物菌剂组合物的总重量计，所述N-甲基-2-吡咯烷酮的重量百分比在15％-40％的范围内，所述脲酶抑制剂为NBPT，并且基于所述微生物菌剂组合物的总重量计，所述NBPT的重量百分比在10％-30％的范围内。
14.根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物，包含丙二醇、N-甲基-2-吡咯烷酮和三甘醇单丁醚。
15.根据权利要求14所述的农业微生物菌剂组合物，其中基于所述农业微生物菌剂组合物的总重量计，所述丙二醇的重量百分比在10％-30％的范围内，基于所述农业微生物菌剂组合物的总重量计，所述N-甲基-2-吡咯烷酮的重量百分比在30％-60％的范围内，基于所述农业微生物菌剂组合物的总重量计，所述三甘醇单丁醚的重量百分比在1％-5％的范围内，所述脲酶抑制剂为NBPT，并且基于所述农业微生物菌剂组合物的总重量计，所述NBPT的重量百分比在15％-40％的范围内。
16.一种肥料组合物，包含根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物。
17.一种用于促进植物生长、提高植物生产力和/或改善土壤质量的方法，其中所述方法包括向植物、植物部分、植物种子或土壤施用有效量的根据权利要求1所述的农业微生物菌剂组合物。
18.一种农业微生物菌剂试剂盒，包含：
A部分，其中A部分包含脲酶抑制剂和至少一种有机溶剂，
其中所述脲酶抑制剂选自正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、正丁基磷酰三胺、硫代磷酰三胺、苯基磷二酰胺、环己基磷酰三胺、环己基硫代磷酰三胺、磷酰三胺、对苯二酚、对苯醌、六胺环三磷腈、巯基吡啶、巯基嘧啶、巯基吡啶-N-氧化物、N,N-二卤代-2-咪唑啉酮、N-卤代-2-噁唑烷酮、N-(2-硝基苯基)硫代磷酰三胺、N-(2-硝基苯基)磷酰三胺以及它们的任意组合；并且
其中所述有机溶剂选自丙二醇(PG)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、三甘醇单丁醚、甘油、二甲亚砜(DMSO)以及它们的任意组合；以及
B部分，其中B部分包含至少一种芽孢杆菌菌种，所述芽孢杆菌菌种选自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌以及它们的任意组合，
其中A部分和B部分各自盛放在单独的容器中，并且
其中基于所述A部分和B部分的总重量计，所述至少一种有机溶剂以20重量％至99重量％的量存在。
19.根据权利要求18所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中B部分包含至少一种芽孢杆菌菌种，所述芽孢杆菌菌种选自地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌以及它们的任意组合。
20.根据权利要求18所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中B部分包含至少一种对农业有益的芽孢杆菌菌株，所述芽孢杆菌菌株选自解淀粉芽孢杆菌ATCC 23842、地衣芽孢杆菌ATCC 14580、地衣芽孢杆菌B-642、地衣芽孢杆菌B-14368、苏云金芽孢杆菌ATCC 10792、苏云金芽孢杆菌HD-17、苏云金芽孢杆菌HD-1、短小芽孢杆菌NRS-272以及它们的任意组合。
21.根据权利要求18所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中所述脲酶抑制剂为正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)。
22.根据权利要求21所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中A部分包含丙二醇和N-甲基-2-吡咯烷酮。
23.根据权利要求22所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中基于所述A部分的总重量计，所述丙二醇的重量百分比在40％-70％的范围内，基于所述A部分的总重量计，所述N-甲基-2-吡咯烷酮的重量百分比在15％-40％的范围内，并且基于所述A部分的总重量计，所述NBPT的重量百分比在10％-30％的范围内。
24.根据权利要求21所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中A部分包含丙二醇、N-甲基-2-吡咯烷酮和三甘醇单丁醚。
25.根据权利要求24所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中基于所述A部分的总重量计，所述丙二醇的重量百分比在10％-30％的范围内，基于所述A部分的总重量计，所述N-甲基-2-吡咯烷酮的重量百分比在30％-60％的范围内，基于所述A部分的总重量计，所述三甘醇单丁醚的重量百分比在1％-5％的范围内，并且基于所述A部分的总重量计，所述NBPT的重量百分比在15％-40％的范围内。
26.根据权利要求18所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中从B部分中的所述对农业有益的芽孢杆菌菌种接触A部分中的所述有机溶剂的时刻起，所述对农业有益的芽孢杆菌菌种具有至少2小时的活性。
27.根据权利要求18所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中基于所述A部分的总重量计，所述脲酶抑制剂的重量百分比在0.02％-80％的范围内。
28.根据权利要求18所述的农业微生物菌剂试剂盒，其中在将A部分与B部分混合之后，所述对农业有益的芽孢杆菌菌种浓度在1.0×102至1.0×1012个孢子/mL的范围内。
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